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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA

MARÍA
Facultad de Arquitectura, Ingeniería Civil y del Ambiente
Programa Profesional de Ingeniería Ambiental

Alumna:
Lizarraga Rosas María Fernanda
Tema:
Medida de la actividad Nitrogenasa
Docente:
Ing. Yenny Candelaria López Valencia

Arequipa – 2017
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD NITROGENASA

1. Objetivos:
- Medir de la actividad nitrogenásica en nódulos de raíz de haba y/o alfalfa.
- Elaborar la Curva de Calibración para la medida de la actividad nitrogenásica.

2. Marco Teórico:
La capacidad de la nitrogenasa para reducir compuestos con triples enlaces se utiliza desde
finales de los 60 para medir esta actividad enzimática. Para ello sólo basta colocar el cultivo
bacteriano en microaerobiosis y sustituir el 10 por ciento de su atmósfera por acetileno.
Transcurrido un tiempo (unos minutos) se toma una muestra y se inyecta en un cromatógrafo
de gases equipado con una columna de Porapak Q y trabajando en las condiciones adecuadas
para la correcta resolución entre el acetileno y etileno. Si hay actividad nitrogenasa
aparecerán los picos correspondientes al acetileno y etileno.

La actividad es proporcional al etileno producido y haciendo medidas a varios tiempos se


puede conocer la cinética de la reducción, así como la actividad específica expresada por mg
de proteína, número de células, etc. En el caso de utilizar esta técnica para la medida de
actividad nitrogenasa en nódulos, se coloca la planta entera, su raíz o nódulos separados en
un recipiente cerrado en el que se substituye el 10 por ciento de su atmósfera por acetileno.
Al cabo del tiempo se toman muestras para el cromatógrafo. En este caso no es necesario la
miroaerobiosis pues la propia estructura del nódulo crea el ambiente adecuado. La actividad
específica se expresa por planta, peso nódulos, etc.

Hay que tener en cuenta que esta técnica sólo es útil para conocer si un organismo o sistema
está provisto de o expresa la capacidad fijadora, pero al ser medidas puntuales, los estudios
comparativos, sobre todo en caso de plantas, no son muy fiables dada la cantidad de factores
que afectan el proceso. El valor más fiel y valioso en estudios comparativos es la integral del
nitrógeno fijado, esto es, el nitrógeno total en planta al cabo del tiempo. Por otra parte, el uso
de ARA en plantas, para que pudiera dar valores más reales habría que hacerla en atmósfera
en flujo continuo para evitar la inhibición de la nitrogenasa y la disminución de la cantidad
de oxígeno presente, lo que requiere sistemas complicados y poco prácticos.
La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción de N2 a
NH4+ por la enzima nitrogenasa, es, después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más
importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Este proceso crucial tiene al
oxígeno como mayor inhibidor y sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de
seres vivos, todos ellos procariotas, que pueden generar un ambiente micro aerobio donde
realizar la fijación biológica de nitrógeno en forma libre o estableciendo relaciones
simbióticas con otros organismos. Dentro de esta última opción, el sistema rizobiáceas–
leguminosas es el que ha sido estudiado ampliamente y en mayor profundidad. A diferencia
de otros fijadores de N2, las rizobiáceas sólo pueden realizar este proceso tras una serie de
interacciones con leguminosas, que originan el desarrollo de un órgano mixto, normalmente
en la raíz, el nódulo simbiótico, en el que se proporciona un entorno de oxígeno controlado,
así como los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación.

El objeto de este módulo es la utilización de diversas técnicas bioquímicas y de biología


molecular para estudiar el proceso de fijación de N2 en la simbiosis Rhizobium-guisante
(Pisum sativum L.). Asimismo, puesto que las leguminosas, como el guisante, son plantas
sensibles a la salinidad, especialmente cuando dependen de la simbiosis para la obtención del
nitrógeno, el empleo de dichas técnicas permitirá analizar los efectos del estrés salino sobre
la fijación de N2.

El desarrollo de esta práctica consiste en el estudio de la enzima nitrogenasa encargada de


fijar nitrógeno dentro del nódulo formado en la simbiosis Rhizobium-guisante. Se llevará a
cabo a nivel de la transcripción, síntesis de proteínas y actividad enzimática, en dos
situaciones fisiológicas: cultivo control y estrés salino.

La fijación biológica del Nitrógeno (FBN) representa una alternativa a la fertilización


nitrogenada ya que puede tener muchos de los efectos negativos que dicha fertilización
produce tanto a nivel medioambiental, como a nivel sanitario. La FBN está relegada a
organismos procariontes que son capaces de reducir el nitrógeno molecular a amoniaco tanto
en vida libre como en simbiosis.

La mayor parte del nitrógeno fijado en los ecosistemas terrestres se realiza mediante la
asociación simbiótica de bacterias de los genero Rhrizobium, Bradyrhizobium,
Sinorhizobium, Azorhizobium y Mesorhizobium; todas ellas son plantas leguminosas. Gran
parte de estas asociaciones simbióticas tiene interés para la agricultura, sin embargo, aunque
los rendimientos de la FBN se han incrementado considerablemente en los últimos años, al
trasladar estos conocimientos a la agricultura práctica, se detectan limitaciones a la fijación
biológica en la simbiosis a nivel medioambiental, biológico, metódico y a nivel de
producción.

En este trabajo se analiza el efecto de alguno de estos factores sobre la fijación del nitrógeno
y la producción final del grano, desde el punto de vista fisiológico, bioquímico y estructural
en la simbiosis Rhizobium- leguminosa.

El nitrógeno, después del agua, es el principal factor limitante para el desarrollo de las
plantas; precisamente por esta razón en el periodo de los años 90 se incrementó 10 veces el
uso de fertilizantes nitrogenados lo cual llevó a un amento sin precedentes de la productividad
en los cereales. Sin embargo, la aplicación de estos fertilizantes y otras acciones industriales
y antrópicas han alterado las condiciones básicas del ciclo natural del nitrógeno y han
contribuido a la contaminación por nitratos de los ecosistemas terrestres y acuáticos con
grave riesgo para la salud humana. Los efectos sobre la salud han sido expuestos de
manifiesto en diversos estudios epidemiológicos y clínicos. La fijación biológica de
nitrógeno representa una alternativa a la fertilización nitrogenada. Por fijación de nitrógeno
se entiende la combinación de nitrógeno molecular o dinitrógeno con oxígeno o hidrógeno
para dar óxidos o amonio que pueden incorporarse a la biosfera.
El nitrógeno molecular, que es el componente mayoritario de la atmósfera, es inerte y no
aprovechable directamente por la mayoría de los seres vivos. La fijación de nitrógeno puede
ocurrir de manera abiótica (sin intervención de los seres vivos) o por acción de
microorganismos (fijación biológica de nitrógeno). La fijación en general supone la
incorporación a la biosfera de una importante cantidad de nitrógeno, que a nivel global puede
alcanzar unos 250 millones de toneladas al año, de las que 150 corresponden a la fijación
biológica.
Fijación abiótica del nitrógeno:

Estas reacciones ocurren de forma abiótica en condiciones naturales como consecuencia de


las descargas eléctricas o procesos de combustión y el agua de lluvia se encarga de arrastrar
al suelo los compuestos formados. También se derivan de la síntesis química realizada en la
industria de fertilizantes con un alto consumo de energía.
Fijación biológica del nitrógeno:

La reducción de nitrógeno a amonio llevada a cabo por bacterias de vida libre o en simbiosis
con algunas especies vegetales (leguminosas y algunas leñosas no leguminosas), se conoce
como fijación biológica de nitrógeno (FBN). Los organismos capaces de fijar nitrógeno se
conocen como diazótrofos.

Esta propiedad está restringida sólo a procariotas y se encuentra muy repartida entre los
diferentes grupos de bacterias y algunas arqueobacterias. Es un proceso que consume mucha
energía que ocurre con la mediación de la enzima nitrogenasa según la siguiente ecuación:

El amonio, primer compuesto estable del proceso, es asimilado por los fijadores libres o
transferido al correspondiente hospedador en el caso de la asociación con plantas. Aunque el
amoníaco (NH3) es el producto directo de esta reacción, se ioniza rápidamente a amonio
(NH4). En diazótrofos de vida libre, el amonio de la nitrogenasa es asimilada en glutamato a
través del ciclo de síntesis glutamina sintetasa/glutamato.
La nitrogenasa, formada por dos metaloproteínas, ferroproteína y molibdoferroproteína, está
bastante bien conservada en todos los microorganismos fijadores. Presenta un rango de
actividad extendido frente a otras moléculas que contienen triples enlaces lo que ha dado
base a un práctico método de detección y medida de la capacidad fijadora, y a pensar en el
posible papel detoxificador de esta enzima en el ambiente primigenio de la tierra.

En muchas bacterias, la nitrogenasa es muy susceptible a la destrucción por oxígeno (muchas


bacterias dejan de producir fijar nitrógeno en presencia de oxígeno). Tensiones bajas de
oxígeno son aprovechadas por diferentes bacterias que viven en anaerobiosis, respirando
niveles bajos de oxígeno, u obteniendo el oxígeno con una proteína (p. ej. leghemoglobina).

La fijación de nitrógeno presenta un gran interés económico y ecológico. De hecho, y como


ejemplo, las altas producciones de soja a nivel mundial son debidas a este proceso a través
de la aplicación de inoculante microbianos de calidad. Se da en todos los hábitats y equilibra
el ciclo biogeoquímico del nitrógeno al recuperar para la biosfera el que se pierde por
desnitrificación.

La implicación en la fijación simbiótica de plantas tan importantes en alimentación humana


y animal como las leguminosas, y la posibilidad de extender esta propiedad a otras especies
vegetales de interés agrícola, con la consiguiente eliminación de la necesidad de usar
fertilizantes nitrogenados, ha hecho de la FBN un tema de intensa investigación a lo largo de
los años.
3. Materiales y métodos:
Materiales:
- NFb
- Nódulos de alfalfa o haba
- Acetileno (C2H2)
- Etileno (C2- H4)
- KMnO4
- NaIO4
- Formaldehido
- Agua destilada
- Solución Nash ya preparada
Procedimiento:
a) En un tubo vacutainer de 10 ml., se miden 3 ml. de medio NFb (libre de Nitrógeno)
en el cual se coloca 3r gramos de nodulos de alfalfa o haba.
b) Luego con una jeringa se extrajo 7 ml de aire y luego se agregó al mismo tubo 7 ml
de acetileno (C2H2) y se deja reposar por 60 minutos.
c) Transcurrido el tiempo de incubación, se procedió a extraer 7 ml. de volumen de
dicho tubo con etileno (C2-H4) formado y se lo agrega a un nuevo tubo vacutainer el
cual contiene 1.5 ml de solución oxidante (KMnO4, NaIO4 y H20).
d) Se agita por 20 minutos en un bortex; luego se le añade 0.25 ml. de NaAsO2, 0.25 ml
de H2SO4 y 1 ml de solución Nash (Acetato de Amonio, Ácido acético, Acetil
acetona) y se deja reposar por 60 minutos.
e) Proceder luego a leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 412 nm.
Elaboración de la Curva de Calibración.

a) Para este efecto se prepararon soluciones stock de 1 μmol, 0.5 μmol, 0.1 u, mol y 0
μmol de formaldehido a partir de formaldehido comercial al 37 %.
b) Se rotularon 4 tubos de ensayo a les cuales se agregó 8 μl de cada solución stock
respectivamente, más 1.5 ml de solución oxidante, 0.25 ml. de NaAsO2 4M, 0.25 ml.
de H2SO4 4M y 1 ml de solución Nash.
c) Luego de mezclar se procede a leer la absorbancia de cada tubo a 412 nm en el
espectrofotómetro.
4. Resultados y discusiones:

La medida de la actividad nitrogenasa se realiza a través del método colorimétrico basado en


la reducción del acetileno. Es un método sensible y muy económico (Hardy y col. 1975; la
Rue y Kurs, 1973). La obtención de acetileno se obtuvo a través de la reacción del Carburo
de Calcio (CaC2) con agua, de acuerdo a la siguiente reacción:

𝐶𝑎𝐶2 + 𝐻2 𝑂 → 𝐶2 𝐻2 + 𝐶𝑎 (𝑂𝐻)2

Elaboración de la Curva de Calibración

CUADRO Nº 1 Datos para la elaboración de la curva de calibración.


Concentración de formaldehido y absorbancias a 412 nm.

Concentración de Absorbancia D.O


Formaldehído

1 1.78
0.5 0.92
0.1 0.225
0 0

A continuación se muestra la grafica correspondiente a la curva de calibración:


Gráfica N°1 Curva de Calibración

y = 1.7621x + 0.0264
Curva de Calibración R² = 0.9993
2
1.8
1.6
1.4
Absorbancia

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Concentración de formadehído

El coeficiente de correlación R de regresión al cuadrado es 0.993 el cual es correcto porque


este debe ser menor a la unidad.
La pendiente (m) es igual a 1.7621; esta corresponde a el coeficiente de extinción por el
ancho que recorre la luz en la solución.
m = E*I
Donde:
E coeficiente de extinción
I ancho de la solución que
atraviesa la luz

El intercepto (n) es igual a 0.0264.


La absorbancia no tiene unidades porque es adimensional.
Por lo tanto la ecuación de la curva es:
𝒚 = 𝟏. 𝟕𝟔𝟐𝟏𝒙 + 𝟎. 𝟎𝟐𝟔𝟒
5. Conclusiones:

Interpretando los resultados de las tablas y los datos de la curva nos dimos cuenta que
efectivamente con un coeficiente de regresión lineal de 0.993 se cumple la ley de beer que es
una línea recta, calculando la pendiente de esta línea recta pudimos obtener el coeficiente de
absortividad molar es de 1.7621. También se puede decir que, por un lado, el método
utilizado para medir la actividad nitrogenásica es factible ya que aumenta la fiabilidad de la
determinación al no modificar el medio en que se encuentran los microorganismos fijadores
de nitrógeno, a la vez que disminuye el tiempo de incubación necesario.

6. Cuestionario:

a) Describa la estructura de la Nitrogenasa, ¿Qué otras nitrogenasas existen?

La fijación de nitrógeno se lleva a cabo en complejo de la nitrogenasa que está conformada


por dos componentes que son:

- Dinitrogenasa reductasa: Es un dímero formado por dos sub unidades idénticas,


con un centro metálico de [Fe4S4] con un peso de 60-66KDa. Es una proteína
constituda por Fe y su función consiste en transferir electrones de un agente
reductor como lo son la ferridoxina, flavodoxina a la dinitrogenasa reductasa,
requeriendo de energia que proviene de la hidrolisis de ATP, la tranferencia de
electrones se ve facilitada debido a la distorcion de la estructura al acercar los dos
componentes lo más posible por lo que puede ser oxidado y reducido y
principalmente es donde se une el ATP.
- Dinitrogenasa: Es un heterotretamero que consiste de dos unidades con un peso
de 240-250kDa conteniendo dos clusters Fe-S que se les conoce como P-cluster,
contiene hierro y molbdeno el cual su centro redox lo forman 2 Mo, 32Fe y 30 S
por tetramero, dando en conjunto al factor hierro y azufre.
- P-cluster: Está formado por (Fe8S7) dividido en dos estructuras cubicas de
[Fe4S3] unido a un enlace de sulfuro y 6 cisteinas.
- Cofactor FeMoCo: El conjunto de las dos componentes forman el cofactor FeMo
y es donde cataliza la conversion de nitrógeno molecular a amoniaco. Los
electrones del Fe entran al componente FeMo que están unidos por tres ligantes
sulfuro dado el himidazole de una histidina resultante al que se une por un ligante
bidentado de homocitrato. Las distanciancias entre Fe –S es 2.32Å, Fe-Fe es
2.64Å y Fe- Mo es 2.73Å
En cuanto a los diferentes tipos de nitrogenasas: Las tres subunidades de la nitrogenasa
exhiben una secuencia significativamente similar a las tres subunidades de la protoclorófilida
reductasa independiente de la luz, que realiza la conversión de protoclorófilida a clorofila.
Esta proteína se encuentra presente en las gymnospermas, algas, y bacterias fotosintéticas,
pero se ha perdido en las angiospermas durante la evolución.
b) ¿Qué condiciones requiere la nitrogenasa para su actividad?

La incorporación de nitrógeno a la biosfera ocurre gracias a la existencia en las bacterias


fijadoras de la enzima nitrogenasa, capaz de realizar en las condiciones ambientales
normales, una reacción química que requiere más de 800o de temperatura y bastantes
atmósferas de presión en el procedimiento industrial Haber Bosch por el que se producen
unos 70 millones de Tn de amonio al año. Este dato es fácil de conocer, mientras que la
cantidad global de nitrógeno fijado biológicamente es pura especulación, aunque se estima
razonablemente que puede estar alrededor de unos 170 millones de Tn año. La dificultad de
una estimación fiel deriva de la gran variedad de microorganismos fijadores y de los
diferentes ecosistemas posibles. Una parte importante de esa cifra global corresponde al
nitrogeno fijado en el mar por las cianobacterias que allí se desarrollan, y algo más de la
mitad se debe a la llamada fijación simbiótica, que, en contraposición con la libre, se da en
íntima asociación de los organismos fijadores con su correspondiente planta hospedadora.
c) ¿Por qué se usa formaldehido, para la preparación de la curva de calibración?
El formol no se comercializa como una droga pura, sino en soluciones de 32 a 37 % p/v
estabilizadas con metanol para evitar que polimericen fundamentalmente a la solución para
el formaldehído. Se usa para neutralizar a la muestra.

d) Escriba como se forma el complejo de color durante la determinación de la actividad


nitrogenásica.

Hay que tener en cuenta que esta técnica sólo es útil para conocer si un organismo o sistema
esta provisto de o expresa la capacidad fijadora, pero al ser medidas puntuales, los estudios
comparativos, sobre todo en caso de plantas, no son muy fiables dada la cantidad de factores
que afectan el proceso. El valor más fiel y valioso en estudios comparativos es la integral del
nitrógeno fijado, esto es, el nitrógeno total en planta al cabo del tiempo. Por otra parte, el uso
de ARA en plantas, para que pudiera dar valores más reales habría que hacerla en atmósfera
en flujo continuo oara evitar la inhibición de la nitrogenasa y la disminución de la cantidad
de oxígeno presente, lo que requiere sistemas complicados y poco prácticos.
e) ¿Qué otros métodos para medir la actividad nitrogenásica existen? Describalos.
Existe un nuevo método con la preparación de la cámara de incubación. El modelo ha sido
diseñado para determinar la fijación de N2 en sistemas palustres como arrozales u otros; el
modelo consiste en una cámara de incubación a la que se aplica el método de reducción de
acetileno. La cámara de incubación Figura 1 se basa en una botella de plástico rígido y
transparente de 5.1 de volumen a la que se ha eliminado el fondo, el modelo además
comprende un sistema de agitación consistente en un motor provisto de una hélice y una
batería, este motor está sujeto a una varilla por medio de una pinza especialmente diseñada
para este fin, que permite sumergir de forma constante la hélice a una profundidad de 2 a 5
mm evitando así la turbidez del agua.

Finalmente hay un sistema que recoge las muestras mediante una doble aguja de jeringuilla
y una serie de tubos vacutainer a los que se les hizo el vacío, tapados con un jabón de goma.

El modelo diseñado permite un rápido montaje de la cámara de incubación con su sistema de


agitación y una cómoda manera de recoger las muestras.
f) Describa en qué consiste la fijación abiótica del nitrógeno.

Estas reacciones ocurren de forma abiótica en condiciones naturales como consecuencia de


las descargas eléctricas o procesos de combustión y el agua de lluvia se encarga de arrastrar
al suelo los compuestos formados. También se derivan de la síntesis química realizada en la
industria de fertilizantes con un alto consumo de energía.
7. Bibliografía:

a. Skoog A. D, Holler J. F, Nieman T .A. Principios de Análisis instrumental,


5a edición, pp. 11-16 Grupo editorial Mc Graw Hill/ Interamericana de
España, Aravaca (Madrid), 2001.

b. Skoog, D. A.: Química Analítica, ED,.MC GRAW-HILL, ED.7ª, México


2004. pp. 629,630
c. http://www.winesfromspain.com/icex/cda/controller/pageGen/
d. www1.unne.edu.ar/cyt/2002/08-Exactas/E-045.pdf
e. www.ugr.es/~clinares/webfarm/Practicas/practica3.doc