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Mémoire
Pour l’obtention du diplôme de master en biologie
Option : « Microbiologie »
Thème
Etude des paramètres cinétiques de l’invertase extraite
de Saccharomyces cerevisiae
Je tiens à remercier tous ceux qui, d'une façon ou d'une autre, m'ont aidé pendant mon
travail de fin d'études. Certaine par leurs conseils et leurs connaissances scientifiques, d’autres
par Leur soutien et leur présence dans les moments les plus pénibles.
Mes premiers remerciements vont à mon promoteur Mme SEBAA née LEMERINI.W,
pour avoir accepté de nous encadrer et de nous suivre tout au long de la réalisation de ce
mémoire.
Merci à tous les membres de jury qui ont accepté de juger ce travail, tous ceux qui nous
ont accueilli et aidé tout au long de la réalisation de ce modeste travail. Je leur en sais gré.
A ma grand-mère
A mes sœurs : Nora, Salima, Souad et son mari Samir ainsi que leur enfants Ayman,
Roumaissa et Ritadj
A mon encadreur Mme Sebaa née Lemerini wafaa que j’admire beaucoup
B.Lamia
Dédicace
A celle qui m’a ouvert les portails et m’a donné la tendresse et le courage, a celle qui
endeuiller pour me rendre heureuse, a celle qui attend chaleureusement ce jour « ma chère
mère »
A celui qui a fait des grands efforts pour mon bonheur, à celui qui a rêvé de voir cette
journée, a celui qui m’a orienté et m’a appris les secrets de la vie « mon père »
A ma belle-sœur : Hanane
A mon encadreur : Mme Sebaa née Lemerini wafaa qui nous a permis de mener à bien ce
B.Khadîdja
Table de matière
Introduction………………………………………………………………...………….. 2
Rappelle théorique……………………………………………………………………... 4
I. Saccharomyces cerevisiae
Annexe…………………………………………………………………………………... 62
I. Préparation du tampon acéto-acétique ………………………………………….. 63
II. Composition de réactif de biuret ………………………………………………... 63
III. Composition de réactif de l’acide 3,5-dinitosalicyclique(DNSA)……………… 64
Résumé………………………………………………………………………………….. 65
Liste des abréviations
% : pourcentages
Asn : Asparagine
Asp : Aspartate
Β : Bêta
DO : Densité optique
g : gramme
kb : kilobase
KDa : kilodalton
Ln : logarithme népérienne
ml : millilitre
T : Température (°C)
Tr : Tour
μm : Micro-mètre
UV : Ultraviolet
Figure 7 : Droite d’étalonnage pour le dosage des protéines par la méthode du biuret…….. 30
Figure 8 : Réaction d’oxydation des sucres réducteurs par l’acide 3,5 Dinitro-salicylique
(DNSA)………………………………………………………………………………………... 33
enzymatique…………………………………………………………………………………… 42
l’invertase……………………………………………………………………………………… 50
Liste des tableaux
l’ultraviolet)..……………………………............................................................................…... 32
de nombreuses substances.
l'objet d'une production de masse pour servir soit de levure de boulangerie soit
(Bousmaha et al., 2014). L'invertase est une hydrolase qui catalyse l'hydrolyse du
suit :
2
Introduction
dans l’ultra-violet).
l’invertase.
3
Rappels Théoriques
Chapitre I.
Saccharomyces cerevisiae
Rappels théoriques
I. Saccharomyces cerevisiae
I.1. Définition
hétérotrophes, faisant partie du groupe des champignons dont on les distingue par
«sucre» et myces qui signifie « champignon », tandis que cerevisiae fait référence
à «cervoise», qui veut dire bière (Tortora et al., 2003). Ce sont des cellules
plus spécifiques (Bourgeois et Larpent, 1996), avec une taille très variable, de 3
1996).
6
Rappels théoriques
I.2. Classification
Règne Protistes-Eucaryotes
Classe Ascomycetes
Sous-classe Hemiascomycetes
Ordre Endomycetales
Famille Saccharomycetaceae
Sous-famille Saccharomycetoideae
Genre Saccharomyces
Espèce Saccharomyces cerevisiae
I.3. Reproduction
plus courant chez les levures. A l’exception de quelque genre, les bourgeons
apparaissent dans les zones situées aux extrémités des grands axes des cellules
7
Rappels théoriques
forme de sac appelées asque. La fusion des noyaux et la méiose subséquente ont
heures après la mise en présence des deux types sexuels (Larpent, 1991).
8
Rappels théoriques
levure a était le premier organisme eucaryote à être séquencé. Son génome est
(ORFs) à partir des quels 5,800 sont prédits correspondre à des gènes codant pour
9
Rappels théoriques
Caractéristiques Utilisation
Nitrate Négative
Urée Négative
Fermentation Positive
Glucose +F
Galactose X
Saccharose +F
Maltose X
Therhalose X
Lactose -
Cellobiose X
Melibiose -
Raffinose +F
Xylose -
Ethanol X
10
Rappels théoriques
Gourgaud, 1985).
forment dans la pâte à pain et confère au produit final sa texture allégée. L’éthanol
et le dioxyde de carbone sont tous deux retenus dans la bière, mais disparaissent du
11
Rappels théoriques
initial élevée de sucre et le stress induits par les produits finaux de fermentation
12
Rappels théoriques
depuis des siècles pour la production d'aliments fermentés tels que le cidre, la bière
13
Chapitre II. L’invertase
Rappels théoriques
II. L’invertase
II.1. Généralités
Les enzymes sont des protéines dont le rôle biologique est de catalyser
Costes, 1985).
métabolismes, en effet, lorsque leur fonctionnement est perturbé, elles peuvent être
Les enzymes sont présentes chez toutes les espèces vivantes et peuvent,
15
Rappels théoriques
II.2. Définition
glucose par l’invertase (Figure 4) est appelé sirop de sucre inversé qui a un pouvoir
16
Rappels théoriques
commerciale.
espèces végétales tels que le poire japonais, le pois, l'avoine et le riz (Kulshrestha
et al., 2013; Hsaia et al., 2002), mais généralement les microorganismes comme
d'énergie pour la levure (Kaiser et Botstein, 1986). Les deux formes intra et
extracellulaires de cette enzyme ayant une structure de gêne commune, mais une
(Allnajar, 2001).
17
Rappels théoriques
II.4. Structure
Kern et al, 1993 ), tandis que la forme intracellulaire est un dimère d’un poids
moléculaire de 135000 daltons, cette forme mineur est non glycosylée (Reddy
18
Rappels théoriques
ne contiennent pas de cystéine. Les deux enzymes sont inhibées par l'iode et
(Mouranche, 1985).
donneur de proton (cystéine 205), suivie par l'attaque nucléophile sur le carbone
19
Rappels théoriques
liaison glycosidique.
20
Rappels théoriques
II.6.1.1. La température
sous la forme :
−𝑬𝒂
K=Z exp ( )
𝑹𝑻
Avec :
Z : Constante,
T : Température en Kelvin,
R : Constante des gaz parfaits,
Ea: Energie d’activation de la réaction.
important puisque la façon dont les enzymes réagissent à une température donnée
21
Rappels théoriques
II.6.1.2. Le pH
charges des chaines latérales des acides aminés peut entrainer la dénaturation et
Les réactions enzymatiques sont traitées comme s’il n’y avait qu’un seul
substrat et un seul produit. Bien que cela soit le cas de quelque réaction catalysée
par des enzymes, la plupart de ces réactions comportent deux substrats ou plus et
valable.
toutes les autres conditions, la vitesse initiale mesurée (Vin : vitesse mesurée quand
une très petites quantité du substrat réagit) augmente jusqu’à une valeur maximale
substrat jusqu’à un point où l’enzyme est dite « saturée » par le substrat, la vitesse
22
Rappels théoriques
initiale mesuré atteint alors une valeur maximale qui ne peut pas être modifiée par
catalyse cette hydrolyse est appelée « invertase » (Voet et Voet, 2004; Durand et
Monsan, 1982).
Lorsque ces derniers se situent dans ou au voisinage du site actif, l’enzyme est
23
Rappels théoriques
engendre son inactivation partielle ou totale, ce qui se traduit par une diminution
de la vitesse de la réaction.
1990).
Le sirop inversé a des propriétés hygroscopiques plus élevées qui le rendent utile
produits de beauté.
24
Matériels et méthodes
Matériel et Méthodes
- Acétate de sodium.
- Bicarbonate de sodium.
- Acide acétique.
- D (+) saccharose.
- D (+) glucose.
- D (-) fructose.
- Sulfate de cuivre.
- Hydroxyde de sodium.
- Iodure de Potassium.
- Réactif DNSA.
- 3,5 Dinitro-salicylique
26
Matériel et Méthodes
(Kati, 2012).
source d’enzyme pour cette étude. Elle est achetée dans le commerce. L'extraction
dissolution de la levure.
27
Matériel et Méthodes
conservé à 4°C.
II.2.1. 1. Principe
liaison peptidique par les ions Cu2+ en milieu alcalin en présence d’un complexant
extraite enzymatique implique d’y doser les protéines. En milieu alcalin, le cuivre
divalent réagit avec les liaisons peptidiques des protéines pour former le complexe
du biuret, de coloration bleu violet, dont le pic d’absorption se situe à 540nm. Les
étalon).
Dans une série de 18 tubes à essais (3 tubes pour chaque essai), on effectue
Numéro de tube 1 2 3 4 5 6 7
Volume de la solution mère de BSA (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
29
Matériel et Méthodes
0,6
0,5
Absorbance à 540 nm
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
[Albumine du sérum bovin (BSA)] (g/l) )
30
Matériel et Méthodes
spectrophotomètre.
l'aide de la courbe d'étalonnage obtenue. Elle est calculée par la formule suivante:
II.2.2. 1. Principe
à 280 nm, due aux chaînes latérales de leurs acides aminés aromatiques (tyrosine et
(1941) ont étudié les propriétés spectrales des deux macromolécules, protéines et
(280 nm pour les protéines et 260 nm pour les acides nucléiques). Ces valeurs
Avec :
A : absorbance.
sensible et est abondamment utilisée pour le suivi des fractions protéiques dans les
32
Matériel et Méthodes
III.1. Principe
produit de couleur jaune orangé, selon la figure 8. Ce dosage est mis au point pour
Figure 8: Réaction d’oxydation des sucres réducteurs par l’acide 3,5 Dinitro-
salicylique (DNSA).
Dans une série de tubes à essais à vis, on met à raison de 0,75ml par tube les
33
Matériel et Méthodes
bouillant pendant 5 min, ensuite il faut refroidir les tubes rapidement dans un
récipient d’eau glacée puis ajouter 10 ml d'eau distillée dans chaque tubes.
acéto-acétique.
0,3
0,25
Absorbance à 530 nm
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 1 2 3 4 5 6
[Sucre inverti ] (mmol/l)
34
Matériel et Méthodes
d’enzyme dans un milieu donné, car cette dernière se trouve rarement à l’état pure,
substrat transformée au cours du temps, qui s’exprimé par des Unité international
l’invertase est effectuée après avoir fait réagir une dilution (1/150) de la
Dans une série de tubes à vis, on fait réagir 0,75ml de saccharose et 0,25ml
durées d'incubation suivantes : 0- 30- 60- 90- 120- 150- 180- 210- 240- 270-
300 secondes.
Le réactif d’arrêt de la réaction DNSA est ajouté à raison de 1ml par tube.
Remarque: Pour le temps 0 (blanc réactif), mettre dans l’ordre, le réactif DNSA,
35
Matériel et Méthodes
pendant 5 min, ensuite les tubes sont refroidis rapidement dans un récipient
densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre à 530 nm, contre un blanc réactif
correspondant au temps « 0 ».
initiale de la réaction, cette vitesse doit être exprimée par la quantité de substrat
transformé par unité de temps et par unité de volume du milieu réactionnel. Elle est
𝒃. 𝟏𝟎ᶾ
𝑽𝒊𝒏 =
𝟐. ƅ`
Avec :
𝑽𝒊𝒏: Vitesse initiale d'hydrolyse du saccharose (μmol.l-¹.min-¹).
𝒃: Pente de la droite « absorbance du milieu réactionnel en fonction du temps »
(unités d’absorbance. Min-¹).
b`: Pente de la droite d'étalonnage.
36
Matériel et Méthodes
d’une µmole de substrat par minute dans des conditions définies et si possible
𝑽𝒊𝒏. 𝑽ᵣ. 𝑭
𝑨𝑽 =
𝟏𝟎ᶾ. 𝑽ᵨ
Avec :
𝑽𝒊𝒏 : Vitesse initiale d'hydrolyse du saccharose (μmol.l-¹.min-¹).
𝑨𝑽: Activité volumique (UI/ml).
𝑽ᵣ : Volume du milieu réactionnel (1 ml).
𝑽ᵨ: Volume d'enzyme (0,25 ml).
𝑭: Facteur de dilution.
(Pelmont, 1993). L’activité spécifique est une mesure de pureté d’un échantillon
formule suivante :
37
Matériel et Méthodes
𝑨𝑽
𝑨𝒔 =
[𝐏𝐫𝐨𝐭é𝐢𝐧𝐞]
Avec :
As : Activité spécifique (UI/mg).
AV : Activité volumique (UI/ml).
[Protéine] : Concentration en protéine (mg/ml).
pH testée (3,2 - 3,4 - 3,8 - 4,2 - 4,4 - 4,6 - 4,8 - 5,2 - 5,6 ), on prépare une solution
Agiter les tubes et incuber 4 min à 25°C puis ajouter dans chacun 1 ml de
DNSA.
pendant 5 min.
Pendre une série de tubes à essais (correspondant aux températures : 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80°C) contenant 0,75 ml du substrat
Dans un bain-Marie, faire bouillir les tubes pendant 5 min, puis les refroidir
temps « 0 ».
39
Matériel et Méthodes
enzymatique dilué 150 fois dans de tampon acéto-acétique 0,1M-pH 4,6 est mis en
0,2- 0,3M.
40
Résultats et discussion
Résultats et discussion
vraisemblable que l’enzyme contenue dans l’extrait soit une invertase. Selon
cette enzyme.
1,2
1
Absorbance à 530 nm
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6
Temps (min)
42
Résultats et discussion
dans le tableau 6 est obtenue par la méthode du biuret. Cette méthode a donné des
résultats du même ordre de grandeur mais supérieure à ceux obtenus par absorption
biuret a donc été adoptée dans cette étude pour le dosage des protéines en raison de
43
Résultats et discussion
substrat (le substrat doit être sous une certaine forme, qui n’est pas nécessairement
44
Résultats et discussion
105
100
Activité relative (%) 95
90
85
80
75
70
65
60
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
pH
température. les choque entre les molécules de saccharose et l’invertase sont donc
à 65°C.
45
Résultats et discussion
enzymatique. Elle est due à l’agitation moléculaire qui détruit les liaisons faibles
120
100
Activité relative ( % )
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Température (°c)
46
Résultats et discussion
parfaits.
9,5
y = -4127,8x + 21,471
9 R² = 0,9341
8,5
Ln (Vin )
7,5
6,5
6
0,0029 0,003 0,0031 0,0032 0,0033 0,0034 0,0035
1/T (1/K)
47
Résultats et discussion
Vmax x [S]
Vin =
Vmax + [S]
Avec:
Vin : Vitesse initiale d’oxydation (μmol.l-1.min-1);
Vmax : Vitesse maximale d’oxydation (μmol.l-1.min-1);
[S] : Concentration en substrat (Saccharose) (mol.l-1);
Km : Constante de Michaelis (mol.l-1); elle correspond à la valeur de [S] pour
laquelle Vin= Vmax/2.
48
Résultats et discussion
3500
3000
Vin (μmol.l-1.min-1)
2500
2000
1500
1000
500
0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
[Saccharose] mol/l
1 Km 1 1
= . +
Vin Vmax S Vmax
49
Résultats et discussion
y = 1E-05x + 0,000
0,0007
R² = 0,991
0,0006
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0
-30 -20 -10 0 10 20 30
coordonnées inverses.
r² = 0,991
1 Km 1 1
= . + 3333,33 0,033 0,991
Vin Vmax S Vmax
50
Résultats et discussion
Km = 0,011 mol.l-1
51
Conclusion
Conclusion
54
Références
bibliographiques
Références bibliographique
56
Références bibliographique
20.Hsaia, C.C; Fu, R.H; Sung, H.Y. A novel bound form of plant invertase in
rice suspension cells. 2002, Bot. Bull. Acad. Sin., 43, pp. 115-122.
59
Références bibliographique
60
Références bibliographique
61
Annexes
Annexes
solutions suivantes :
à 200 ml avec de l’eau distillée pour obtenir une solution tampon à 0,1M de
pH 4,6.
63
Annexes
mélange).
Le réactif DNSA doit être conservé dans un flacon bien fermé et à l'abri de la
lumière.
64
Résumés
Résumé
Nous avons constaté que l’activité enzymatique est maximale sur une gamme de
pH allant de « 4,2 à 4,6 », avec un pic d’activité caractérisé par une activité
comparable à pH= 4,6.
L’influence de la température sur la vitesse d’hydrolyse du saccharose
par l’invertase a été étudiée dans un intervalle de température allant de 15°C à
80°C. L’activité maximale a été mesurée à 60°C. L’énergie d’activation de la
réaction enzymatique d’hydrolyse de saccharose a été estimée à 34,32 K.J.mol-1
dans l’intervalle de 15 à 60°C.
66
Summary
The objective of our work was to demonstrate the enzymatic activity and to
determine the kenotic parameters of the invertase (E C.2.1.26) extracted of
Saccharomyces cerevisiae.
pH = "4,6".
Keywords:
Saccharomyces cerevisiae, extraction, invertase, enzymatic activity, kinetic
parameters.
67
ملخص
الهدف من عملنا هو إظهار النشاط األنزيمي وتحديد الثوابت اآللية لإلنفرتاز -βفريكتوزيداز
) (E C.2.1.26من خميرة الخبز.
وكان عملنا في المقام األول هو الحصول على المستخلص الخام لالنفرتاز من خميرة البيرة ودراسة تأثير
بعض العوامل الفيزيائية والكيميائية على نشاط اإلنزيم.
وجدنا أن نشاط اإلنزيم هو أقصى مدى على نطاق واسع من درجة الحموضة تتراوح من (،)4،6-4،2
وفي هذا النشاط هناك دورة النشاط التي تميز هدا النشاط للمقارنة .الحموضة المقابلة هي "."4،6
تمت دراسة تأثير درجة الحرارة على سرعة اماهة السكاروز بواسطة االنفرتاز ما بين 51م08 –°م.°
تم قياس النشاط األقصى عند 68م °بلغت طاقة التنشيط 44،45كج/مول إلماهة السكاروز بوجود االنفرتاز
(ما بين 51م68- °م.)°
الثوابت اآللية تقاس في وجود تراكيز مختلفة للسكاروز مع احترام ظروف التشغيل القياسية.
الكلمات المفتاحية :خميرة الخبز ،استخراج ،االنفرتاز ،النشاط اإلنزيمي ،الثوابت اآللية.
68