INDICE

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................................... 2
2. RESUMEN................................................................................................................................................... 3
3. DETALLES EXPERIMENTALES...................................................................................................................... 4
3.1. Solución de enzima alfa-amilasa bacteriano: Bacillus subtilis. .......................................................... 4
3.2. Efecto de la variación de pH sobre la velocidad de reacción de alfa-amilasa, en la hidrolisis del
almidón. ......................................................................................................................................................... 4
3.3. Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad enzimática de alfa-amilasa en hidrolisis
del almidón. ................................................................................................................................................... 5
4. RESULTADOS .............................................................................................................................................. 6
4.1. Efecto de la temperatura en la hidrolisis del almidón....................................................................... 6
4.2. Efecto del pH en la hidrolisis del almidón ......................................................................................... 7
5. DISCUSION DE RESULTADOS ..................................................................................................................... 8
6. CONCLUSIONES.......................................................................................................................................... 9
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................................................... 10
8. BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................................... 10
9. CUESTIONARIO ........................................................................................................................................ 11

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 1. INTRODUCCIÓN

Se dice que las enzimas son proteínas “especialistas” y controlan la mayoría de las reacciones

químicas de nuestro cuerpo. Hay enzimas en todo lo que está vivo. También se dice que

son catalizadores, porque cada reacción química necesita una enzima para que se realice, es

decir, todo lo que se transforma se hace gracias a una enzima.

La cinética enzimática es un principio que estudia la velocidad en las reacciones químicas en

las que intervienen enzimas. El estudio de las propiedades como la velocidad y de la dinámica

de la enzima, nos permite conocer a fondo el mecanismo de acción de dicha enzima, el rol que

cumple en el metabolismo como su especificidad. La velocidad de una reacción catalizada

por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario

purificar o aislar el enzima. Para medir la cinética enzimática es necesario condiciones

optimas de temperatura, presencia de cofactores, pH, entre otros y se utiliza concentraciones

saturadas de sustrato es decir que todos los sustratos en el medio presentan su enzima. En estas

condiciones favorables la velocidad de la reacción observada será la velocidad máxima. La

velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición

de los reactivos.

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la

conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto, su unidad es el katal(kat). La actividad

específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por

mililitro de disolución (U/ml).

Cada enzima actúa sobre una sustancia concreta, como una llave y una cerradura, esta es la

razón por la cual en esta práctica N°5 analizaremos dos de los múltiples factores que afectan

en la velocidad de las reacciones enzimáticas que son el pH y la temperatura.

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 2. RESUMEN

La cinética enzimática permite estudiar propiedades como la velocidad y la dinámica de las

enzimas permitiéndonos conocer el mecanismo de acción de cada una de las enzimas. En esta

prueba, primeramente, estudiamos el efecto del pH del medio sobre la enzima Alfa- amilasa

sobre una solución de almidón que, en este caso, usamos la solución de Buffer Fosfato- Citrato

con diferentes valores de pH: 5,5; 6;6,5;7 y 8 y los rotulamos. Añadimos a cada uno 2mL de

reactivo Benedict y se colocó a baño maría a 100 por 5 minutos donde a temperatura ambiente

presento una mayor presencia de almidón. Luego, estudiamos el efecto de la variación de la

temperatura sobre la enzima Alfa- amilasa en la hidrolisis del almidón donde se colocó 25mL

se solución de enzima en cada uno de los 3 tubo de ensayo, rotulados previamente, y se dispuso

a diferentes temperaturas, posteriormente se procedió a adicionar 1mL de almidón para

colocarlo en la incubadora. A continuación, le añadimos 2mL de reactivo Benedict

colocándolo a baño maría a 100 por 5 minutos donde a mayor pH presento una mayor

presencia de azucares reductores. Es necesario utilizar una mayor muestra de la solución para

que los cambios sean más significativos.

3
 3. DETALLES EXPERIMENTALES

3.1. Solución de enzima alfa-amilasa bacteriano: Bacillus subtilis.

A partir del cultivo de la bacteria amilolítica Bacillus subtilis de 48 horas de edad se obtuvo
sobrenadante libre de células (SLC) colocando el cultivo en centrifugación a 9000 rpm por 10
minutos. Separar el sobrenadante del pellet celular. El sobrenadante libre de células contiene
la enzima alfa-amilasa que se utilizó en esta práctica.

3.2. Efecto de la variación de pH sobre la velocidad de reacción de alfa-

amilasa, en la hidrolisis del almidón.
Se estudió el pH del medio sobre la enzima alfa-amilasa sobre una solución de almidón. Para
esto disponemos de soluciones Buffer Fosfato –Citrato, con valores de pH: 5; 6; 6,5; 7; 8.

En cinco tubos de ensayo, rotulados previamente, se completó en la siguiente forma:

Tabla N°1

Tubo N° pH Sol. Buffer Vol. (gts) Sol. Vol. (mL) Sol. Vol. (gts)
Fosfato-Citrato Buffer Fosfato- Enzima Sol sustrato
Citrato Alfa-amilasa almidón 1%
1 5 20 2.5 2
2 6 20 2.5 2
3 6.5 20 2.5 2
4 7 20 2.5 2
5 8 20 2.5 2
Incubar a 37°C por 25 minutos

Se añadió a cada uno de ellos 2 ml del reactivó de Benedict, luego se colocó en baño maría
de agua a 100°C por 5 minutos.

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 3.3. Efecto de la variación de la temperatura sobre la actividad enzimática de
alfa-amilasa en hidrolisis del almidón.
En tres tubos que previamente fueron rotulados, se procedió según indica en el siguiente
cuadro:

Tabla N°2
Tubo N° Sol. Enzima (mL) Acción de temperatura
1 2.5 Hervir en baño de agua por
5 minutos
2 2.5 No hervir (Temperatura
ambiente)
3 2.5 No hervir (Temperatura
ambiente)

Después se prosiguió de las siguientes adiciones y efectos a los tubos respectivos, según
indica la siguiente tabla:
Tabla N°3
Adición del sustrato
Temperatura de Tiempo de
Tubo N° (ml) de sol.
incubación incubación
almidón
1 2 37°C 20 minutos
2 2 37°C 20 minutos
Baño de agua
3 2 5 minutos
helada

Luego, se añadió a cada tubo 2ml de reactivo de Benedict, después se colocó en baño maría
de agua a 100°C por 10 minutos.

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 4. RESULTADOS

Luego de realizada la experimentación se obtuvieron los siguientes resultados:

4.1. Efecto de la temperatura en la hidrolisis del almidón

Tabla N°4
Tubo Enzima Sustrato Intensidad Temperatura
(Almidón)
1 Alfa- Almidón Nivel 1(bajo) Baño María
amilasa
2 Alfa- Almidón Nivel 3(alto) Temperatura
amilasa ambiente
3 Alfa- Nivel Baño de agua fría
Almidón 2(intermedio)
amilasa

T vs Nivel de intensidad
3.5

2.5
INTENSIDAD

1.5

0.5

0
Temperatura

Baño Maria Temperatura ambiente Baño de agua helada

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4.2. Efecto del pH en la hidrolisis del almidón
Tabla N°5
Tubo pH Intensidad (Azucares
reductores)
1 5 Nivel 1(bajo)

2 6 Nivel 2(intermedia)

3 6.5 Nivel 2(intermedia)

4 7 Nivel 3(alto)

5 8 Nivel 3(alto)

pH vs Nivel de intensidad
3.5

2.5
INTENSIDAD

1.5

0.5

0
PH

5 6 6.5 7 8

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 5. DISCUSION DE RESULTADOS

En este experimento se toma a la hidrolisis del almidón como reacción enzimática a observar

y al reactivo de Lugol como indicador de almidón en las respectivas soluciones. Como

sabemos la velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura, es decir,

la velocidad de una reacción enzimática se incrementa al aumentar la temperatura dentro de

un determinado rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura óptima. A

valores que superan la actividad disminuye debido a que la enzima, sufre procesos de

desnaturalización y, por lo tanto, de inactivación (Tena Aldave & Jorrin Novo).Esto se

observó en la primera experimentación, en la que los tubos se diferenciaban por la intensidad

de la coloración negruzca que poseían esto debido al reactivo Lugol agregado en la parte final.

El tubo que presentaba mayor intensidad de coloración fue el expuesto a altas temperaturas,

su coloración indicaba la presencia de una gran cantidad de almidón con pocos azucares

reductores, esto debido a la acción de la temperatura la cual ralentiza la hidrolisis del almidón.

Por otro lado, el tubo de menor intensidad indicaba mayor presencia de azucares reductores

que de almidón lo que quiere decir que la hidrolisis ha casi culminado.

La mayoría de los enzimas presentan un pH óptimo para el cual su actividad es máxima; por

encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye bruscamente. Este efecto se debe a que,

al ser los enzimas de naturaleza proteica, al igual que otras proteínas, se desnaturalizan y

pierden su actividad si el pH varía más allá de unos límites estrechos (Bionova).Esto se

observó en la segunda experimentación, en la que la solución en un medio más acido

presentaba baja intensidad en la coloración rojo-ladrillo ,esto debido al reactivo de Benedict

agregado en la parte final, lo cual indica poca presencia de azucares reductores eso quiere

decir que la reacción fue ralentizada por acción del pH, situación que no ocurre cuando el pH

es básico ,esto ocurrió en la solución con mayor intensidad de coloración.

8
 6. CONCLUSIONES

Para el caso de pH:

Niveles según el grado de intensidad del color:

1) No hay reacción (no hay presencia de color).

2) Formación de color (no es intenso).
3) Abundante formación de color (intenso).

4) Tabla N°6

Resultados
Tubo N° pH

No se observó ninguna reacción por lo

1 5
2 6
3 6.5
4 7
5 8
tanto pertenece al nivel 1
Tiene una intensidad intermedia, por lo
tanto, pertenece al nivel 2.
Tiene una intensidad intermedia con
poca más intensidad, pertenece al nivel
2.
La intensidad de color es más fuerte,
por lo tanto, pertenece al nivel 3.
La intensidad de color es más fuerte,
por lo tanto, pertenece al nivel 3

Se puede llegar a la conclusión de que el rango óptimo de pH para la enzima alfa-amilasa es

desde: 6.5; 7; 8, pH inferiores a ese rango no favorece la reacción, en el rango óptimo de pH
la enzima alfa-amilasa puede hidrolizar al almidón.

Variación de temperatura:

Niveles según el grado de intensidad del color:

1) No hay reacción (no hay presencia de color).

2) Formación de color (no es intenso).
3) Abundante formación de color (intenso).

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Tubo 1: sometido a baño maría a durante 5 minutos se observó una en alta intensidad de
Lugol, esto se debe a que hay poca producción de azucares reductores, se concluye que la
temperatura si afecta en las propiedades cinéticas de la enzima alfa-amilasa de Bacillus subtilis
al hidrolizar. Se le considera nivel 1

Tubo 2: sometido a temperatura ambiente se observó poca intensidad del Lugol, esto se debe
a la alta presencia de cantidades de azucares reductores, se concluye que a temperatura
ambiente es el óptimo para que la enzima pueda hidrolizar al almidón. Se le considera nivel
3.

Tubo 3: sometido a baño de agua helada durante 5 minutos, si hubo una reacción intermedia,
podemos concluir que a baño de agua helada no desnaturaliza las enzimas, por lo cual se
considera un medio apto para la hidrolisis del almidón. Se le considera nivel 2.

7. RECOMENDACIONES

 Agitar constante mente la solución de sustrato de almidón, para que se homogenice y no nos
cause errores en la práctica.
 Usar 2ml de la solución de almidón ya que 1 ml no se puede apreciar las reacciones.
 Rotular cada tubo para evitar confusiones y errores en la práctica.
 Evaluar los efectos del pH en las propiedades cinéticas en la actividad de la enzima alfa-amilasa.
 Tener cuidado en el baño maría, para evitar quemaduras.
 Tener cuidado de contaminar los reactivos, para lo cual se recomienda usar una pipeta para
cada reactivo.

8. BIBLIOGRAFIA

Beatriz, L. (8 de junio de 2019). LIFEDER. Obtenido de https://www-lifeder-

com.cdn.ampproject.org/v/s/www.lifeder.com/bacillus-
subtilis/amp_js_v=a2&amp_gsa=1&usqp=mq331AQCKAE%3D#aoh=15714683033
576&referrer=https%3A%2F%2Fwww.google.com&amp_tf=De%20%251%24s&a
mpshare=https%3A%2F%2Fwww.lifeder.com%2Fbacillus-subtillis%2F
Bionova. (s.f.). Obtenido de http://www.bionova.org.es/biocast/documentos/tema14.pdf
Tena Aldave, M., & Jorrin Novo, J. (s.f.). Obtenido de
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CINETICA.pdf

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 9. CUESTIONARIO

a.- Efectuar un breve estudio sobre las características más importantes de la enzima
Alfa-amilasa.

Las α-amilasas que se encuentran en la naturaleza pueden tener rangos óptimos de pH muy
diferentes para su funcionamiento; por ejemplo, el óptimo para las α-amilasas animales y
vegetales está entre 5.5 y 8.0 unidades de pH, pero algunas bacterias y hongos tienen enzimas
más alcalinas y más otras acídicas.

Las enzimas presentes en la saliva y el páncreas de mamíferos trabajan mejor a pH cercanos

a 7 (neutros) además.

Una característica compartida entre las enzimas del grupo de la α-amilasa es que estas, al igual
que otras amilasas, pueden ser inhibidas por iones metálicos pesados como el mercurio, el
cobre, la plata y el plomo.

las α-amilasa son empleadas para la producción de glucosa y fructosa.

b.-Describir el tipo de enlace presente en el almidón que ha sido hidrolizado por la Alfa-
amilasa bacteriana (procedente de Bacillus subtilis).

La -amilasa, también conocida como -1,4glucanohidrolasa; EC 3.2.1.1 es una glucanasa

endoactiva que catalizan la hidrólisis al azar de los enlaces -(1,4) y/o - (1,6) glicosídicos
de la región central de las cadenas de amilosa y amilopectina excepto en las proximidades de
los puntos de ramificación.

c.-Señale los tipos de productos agroindustriales que pueden ser tratados por hidrolisis
con enzimas amilolíticos, a nivel industrial y que productos importantes se obtienen en
cada caso.

Los almidones representan un componente importante en un largo número de productos

agroindustriales como el cereal (maíz, arroz, trigo) cuyo contenido de polisacáridos varía de
30 a 80%; legumbres (frijol, guisantes, haba) con 25– 50%; tubérculos (papa, tapioca) con
60–90%, como también algunas frutas tropicales como el banano con 70-75%.

Los hidrolizados de pescado han venido siendo una fuente con importante potencial para el
mejoramiento de los productos y los procesos a nivel tecnológico. El hidrolizado de proteínas
de hueva de atún ha sido utilizado para mejorar las propiedades emulsionantes de las
salchichas de bagre, su adición por ejemplo, mejora las propiedades físico-mecánicas del
11
producto, aumentando su firmeza, su cohesión y su resistencia, además genera glóbulos de
grasa más finos, haciendo la emulsión más estable y sin ningún efecto sobre las propiedades
organolépticas, ya que podría prevenir el desarrollo de rancidez debido a que también posee
propiedades antioxidantes.

En la producción de jarabes, que contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa, donde la

composición precisa de los productos finales puede ser controlados en los procesos
fermentativos. La mayoría de los productos agroindustriales está integrada por la mezcla de
la acción de enzimas diferentes.

d.- Describa las características morfológicas de la bacteria B. subtilis, así también, la

importancia del uso que tiene este microorganismo en las diferentes industrias.
Mencione varios ejemplos.

CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS:

Las células de las Bacillus subtilis tienen forma de barra con bordes redondeados, las cuales
miden aproximadamente 1 micra de ancho por 2-3 micras de largo. Estas se encuentran
individualmente formando cadenas.

Con algunos cultivos forman colonias que tienen aspecto rugoso, liso o mucoide

El tamaño promedio de las colonias es de 2-4 mm de diámetro

Su pared celular es gruesa y contiene peptidoglucano(mureína).

Posee un cromosoma circular con 4100 genes aproximadamente los cuales codifican a ciertas
proteínas.

Se movilizan con la ayuda de los flagelos que poseen.

IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA

La bacteria Bacillus subtilis es importante en varios sectores industriales, esto debido a lo

beneficiosa que ha resultado, aunque sus propiedades no han sido determinadas por completo
por lo que siguen en estudio.

Algunas de las industrias en la que hay presencia de esta bacteria son:

En la agricultura es utilizado como un mecanismo de control de plagas en los cultivos, esto

debido a la propiedad antifúngica (ocasiona la lisis de las células de los hongos) que posee.

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En la industria de artículos de limpieza esta bacteria es utilizada en la elaboración de
detergente, ya que esta produce una enzima llamada proteasa (degrada sustancias proteicas),
la cual es usada como aditivo en la elaboración causa por la que elimina manchas.

En la industria farmacéutica es utilizada para producir sustancias antibióticas que degraden

bacterias patógenas, así como la bacitricina la cual es utilizado como ungüento.

En la gastronomía es utilizado para llevar a cabo el proceso de fermentación.

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