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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Apostila de aulas experimentais

DISCIPLINAS DE:
• ANÁLISE INSTRUMENTAL EXPERIMENTAL APLICADA À ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
• LABORATÓRIO DE ANÁLISE INSTRUMENTAL

Roteiro de aula prática

Professor: Vagner Fernandes Knupp

OURO BRANCO - MG
Versão 2017
CONTEUDO

Data
Dias Mês Aulas Tópicos abordados

Introdução –
• Conhecendo os equipamentos e o laboratório
• Relatórios
1
• Avaliações
• Cronograma
Curvas analíticas, Regressão Linear e ANOVA
2 Uso do programa Proj.Lin do Ecxel
3 Preparo de curvas analíticas – Curva de padronização externa.
1 - Avaliação sobre a padronização externa
4 Preparo de curvas analíticas – Curva de padronização interna.
2 - Avaliação sobre a padronização interna
5 Preparo de curvas analíticas – Curva de adição de padrão
3 - Avaliação sobre a adição de padrão
Aula de revisão das três formas de tratamento de dados das curvas
6
analíticas
7 1ª. Entrevista sobre a matéria ministrada
8 Determinação do pka de um indicador ácido base
Determinação da concentração de Fe(II) por espectrometria de absorção
9
no visível. Parte 1.
Determinação da concentração de Fe(II) por espectrometria de absorção
10
no visível. Parte 2.
Determinação da concentração de Fe(II) por espectrometria de absorção
11
no visível. Parte 3.
12 Tratamento dos dados das aulas 12 a 14
4 - Avaliação das aulas de determinação de Fe(II).
Dosagem de ácido acetilsalicílico (AAS) em medicamentos por
13
potenciometria indireta.
5 - Avaliação sobre as aulas determinação de pKa e AAS.
14 Avaliação da eficiência cromatográfica na separação de alcoóis voláteis
2ª. Entrevista sobre a matéria lecionada
Determinação de BTEX em amostras de água (dados virtuais para
15
elaboração do relatório)
6 - Avaliação das aulas de cromatografia 1
16 Extração líquido-líquido de cafeína de refrigerantes.
Análise de cafeína em refrigerantes por espectrometria de absorção no
17
ultravioleta e cromatografia a gás
7 - Avaliação das aulas de cromatografia 2
18 3ª. Entrevista sobre a matéria lecionada
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Preparo de curvas analíticas – Padronização externa

INTRODUÇÃO

Várias são as técnicas de quantificação de analitos, dentre elas pode-se destacar a padronização externa, a
padronização interna e a adição de padrão. Na padronização externa uma relação é estabelecida preparando
padrões de concentrações conhecidas e medindo alguma propriedade física que aumenta ou diminui
proporcionalmente a a quantidade de matéria de interesse. A medida física pode ser a massa de um
precipitado, ou a altura deste dentro de um tubo de ensaio, ou ainda a intensidade de cor em um escala visual
e etc. Quando usamos um instrumento para gerar um número em relação a uma propriedade física dizemos
que estamos usando um método instrumental.

Como temos números podemos montar gráficos com escalas e a relação entre a concentração e a
propriedade física pode obedecer a um modelo matemático que pode ser linear, quadrático, exponencial e
outros. Em química e suas áreas correlatas adotamos preferencialmente o modelo linear por apresentar
diversas características favoráveis e simples ao tratamento de dados como um desvio simétrico em relação
resposta e outros.

Para obtenção do modelo pede-se normalmente que seja utilizado pelo menos cinco níveis de calibração, ou
seja, cinco concentrações diferentes do analito. Alem disto se pede que em cada nível (ou concentração)
replicatas sejam feitas, normalmente três. Estes parâmetros podem ser reduzidos a critério do analista assim
o que vamos apresentar aqui seriam tratamentos segundo a IUPAC.

A curva analítica de padronização externa então é um gráfico obtido plotando-se a concentraçãod e soluções
conhecidas pelo sinal de um instrumento.
A obtenção da relação linear é normalmente feita por uso da feramenta matemática para regressão linear. Os
parâmetros para esta regressão são apresentados no Capitulo 8 do livro texto Skoog. Observe que o modelo
ajustado é proposto. Podemos ajustar o modelo a qualquer conjunto de dados e teremos uma resposta. O
que acontece é que o modelo pode ou não ser adequado.

Assim o gráfico é montado usando soluções de concentrações conhecidas (geralmente o mínimo de cinco
concentrações diferentes) e mede-se a resposta analítica, traçando-se um gráfico com a relação entre estes
valores. No eixo x deste gráfico colocam se as concentrações conhecidas e no eixo y as respectivas
respostas. Se o gráfico obtido representa uma reta torna-se mais fácil obter os parâmetros desta correlação,
por regressão linear, e definir uma equação matemática que descreva o relacionamento entre x e y,
encontrando os coeficientes angular (a) e linear (b). Os coeficientes da reta y = ax + b, são calculados com a
regressão linear e são utilizados para calcular a concentração de soluções desconhecidas que apresentam
uma resposta analítica obtida da mesma forma que as soluções conhecidas.

Uma das maneiras de verificar se o modelo linear é adequado é utilizar o valor de coeficiente de correlação
(r). Quanto mais próximo a 1 for o coeficiente de correlação, melhor é a reta. Entretanto, essa não é a
maneira mais confiável de verificar a linearidade dos dados, em muitos casos é necessário o uso de ANOVA.

OBJETIVO

Preparar curvas analíticas por diferentes métodos e comparar o resultado obtido entre eles através de
tratamentos matemáticos.

MATERIAIS E MÉTODOS

- Materiais e reagentes:

• Permanganato de potássio
• Dicromato de potássio
• Ácido sulfúrico 1 mol/L
• Balões volumétricos de 50 mL
• Balão volumétrico de 1 L
• Espátula
• Béquer de 100 mL
• Bastão de vidro
• Pipetas volumétricas de 1, 2 e 5 mL
• Pipeta graduada de 10 mL
• Pipeta automática de 200 µL

- Instrumentos:

• Balança analítica
• Espectrofotometro UV/Vis

PROCEDIMENTO

Preparo da amostra

1. Dissolver uma amostra de permanganato de potássio para uso adulto e pediátrico, pela dissolução da
amostra (100 mg) em aproximadamente 100 mL de água destilada. Transferir para o balão volumétrico de 1L,
100 mL de uma solução 1 mol/L de ácido sulfúrico previamente preparada em seguida a solução de
permanganato e completar o volume com água destilada.

Preparo da curva analítica de padronização externa

2. Preparar 100,0 mL de uma solução estoque de permanganato de potássio 0,0006 mol L-1(ou 60 x 10-5 mol
L-1). Calcule a massa a ser pesada.

É razoável pesar esta massa?

Qual a alternativa de preparo?

Qual a massa pesada?

Corrija as concentrações na tabela do item 8.

3. Calcular os volumes necessários da solução preparada, para a preparação das soluções padrões com
concentrações de 1,2 x 10-5 ; 2,4 x 10-5 ; 4,8 x 10-5 ; 7,2 x 10-5 e 12 x 10-5 mol L-1 mol/L em balões
volumétricos de 100,0 mL.

Você acha razoável medir estes valores?


Proponha uma alternativa.

4. Adicionar os volumes calculados de solução estoque a cinco balões volumétricos de 100,0 mL, adicione 10
mL de solução de ácido sulfúrico 1 mol/L e aferir a solução com água. Prepare as soluções em duplicata. (11
balões).
5. Diluir a solução da amostra preparada no item 1 medido 8,00 mL com a pipeta graduada e diluindo em
balão volumétrico de 100,0 mL, adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e complete com água destilada.

6. Compare visualmente e identifique pela tonalidade qual será a concentração aproximada da amostra.

7. O permanganato possui cor púrpura e a sua cor complementar é o verde cuja absorção esta na faixa de
500 – 560 nm. Usando a solução mais diluída (1,2 x 10-5 mol/L) preparada no item 3 faça uma varredura e
plote o espectro do permanganato (Abs x ) na região de 300 a 700 nm. Escolha o comprimento de onda a
ser usado na construção da curva.

8. Monte a curva analítica Ab x Conc lendo os padrões preparados no item 3. Registre o resultado na tabela
abaixo.

Número Vol Solução padrão de Absorbância


Balão MnO4 (mL) (λ= )
1 (branco) 0,00
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6

9. Faça a leitura da solução da amostra preparada no item 5 na curva e anote as absorbâncias.


10. Faça a regressão linear dos pontos ajustando como uma reta.
11. Calcule o erro da inclinação e do intercepto.
12. Calcule a Análise de Variância da Regressão.
24. Faça o gráfico da regressão linear.
13. Qual a absortividade molar do permanganato neste comprimento de onda?
14. Qual o erro na medida da absortividade molar?
15. Calcule a massa da amostra e o erro da medida considerando a incerteza da curva
analítica e compare com a massa indicada no rotulo do medicamento. Qual o erro
relativo considerando o valor obtido pelo experimento como verdadeiro?
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a Edição,
São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.

HARRIS, D.C. Análise Química Quantitativa. 6ª edição, Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.
Tutorial de tratamento de dados da Preparo de curvas analíticas - padronização externa

Dados do experimento
Conc Abs
exp
umol/L 525 nm
12 0,045
12 0,048
12 0,055
24 0,102
24 0,109
24 0,112
48 0,203
48 0,213
48 0,205
72 0,275
72 0,265
72 0,298
120 0,456
120 0,426
120 0,444

Amostras 0,158 0,168


Fazendo regressão linear temos:
Observe que em química o primeiro modelo matemático que ajustamos é o linear, mas se este não for
adequado podemos usar outros.

Podemos então calcular os resíduos:


Fazemos este calculo fazendo uso da equação da reta, onde substituímos no lugar do X o valor da
concentração preparada e obtendo o valor do Y teórico. O resíduo é calculado então pela diferença do Y
experimental – Y teórico.
Conc Abs
exp
umol/L 525 nm Y resíduo
teórico
12 0,065 0,0627 0,0177
12 0,058 0,0627 0,0147
12 0,067 0,0627 0,0077
24 0,102 0,1055 0,0035
24 0,109 0,1055 -0,0035
24 0,112 0,1055 -0,0065
48 0,203 0,1913 -0,0117
48 0,213 0,1913 -0,0217
48 0,205 0,1913 -0,0137
72 0,275 0,2771 0,0021
72 0,265 0,2771 0,0121
72 0,298 0,2771 -0,0209
120 0,456 0,4487 -0,0073
120 0,426 0,4487 0,0227
120 0,444 0,4487 0,0047
Soma= 0,000
A soma dos resíduos deu um valor igual a zero ou próximo isto demonstra sua consistência.
Gráfico de Resíduos
O gráfico de resíduos mostra uma dispersão homogênea dos dados e demonstra que não existe
homostaticidade (quando a dispersão dos dados aumenta com aumento da concentração - abaixo).

Teste Q para consistência dos dados


Caso o gráfico de resíduos apresente um ponto anômalo ao padrão como no exemplo abaixo:

Devemos testar se o ponto é uma variação normal (devendo ser mantido) ou não(devendo ser excluído). Para
tal, usa-se o teste Q.
Olhando o gráfico de resíduos não existe ponto anômalo, mas iremos testar o ponto mais extremo para
demonstrar o uso do teste.
Conc Abs
exp
umol/L 525 nm Y resíduo
teórico
12 0,045 0,0627 0,0177
12 0,048 0,0627 0,0147
12 0,055 0,0627 0,0077
24 0,102 0,1055 0,0035
24 0,109 0,1055 -0,0035
24 0,112 0,1055 -0,0065
48 0,203 0,1913 -0,0117
48 0,213 0,1913 -0,0217
48 0,205 0,1913 -0,0137
72 0,275 0,2771 0,0021
72 0,265 0,2771 0,0121
72 0,298 0,2771 -0,0209
120 0,456 0,4487 -0,0073
120 0,426 0,4487 0,0227
120 0,444 0,4487 0,0047

Temos então a faixa de dispersão de 0,0227 –(-0,0217) = 0,0444


Podemos testar o ponto mais extremo

Teste Q = 0,0227 – 0,0117 / 0,0444 = 0,113

Como são 15 pontos o N= 15 assim temos a 95% de confiança um valor de 0,473

Como Q tabelado 0,473 > 0,113 Q calculado o ponto deve ser mantido. Observe que se olharmos a
dispersão não seria necessário fazer o teste uma vez que não há duvida. O teste Q é um teste que aplicamos
quando temos duvida se o ponto deve ser retirado do conjunto, ou seja, se o ponto foge do conjunto (out lier
ou ponto anômalo).
ANOVA
A análise de Variancia é um teste que deve ser realizado para mostrar que o modelo matemático escolhido
(linear) é adequado para representar os pontos apresentando alta correlação. Ou seja o modelo prevê bem o
resultado.
O teste F é um teste usado para testar se grupos diferentes apresentam a mesma variância de seu resultado.
Aqui ele é usado para demonstrar que os resíduos em relação ao modelo matemático, não explicáveis, são
pequenos,
Para tal, usamos o programa do ecxel Proj.Line (para ver como usar o programa veja no capítulo 8 do scoog).
y= m x + b

m (inclinação)= 0,00357 0,01976 b=


sm= 0,00010 0,00642 sb=
R^2 0,99081 0,01420 sr=
Graus de
Valor F 1402 13 liberdade
SSresiduos= 0,28260 0,00262 SSregressão

Como resposta o programa retorna os números marcados em verde.


Para avaliação destes dados devemos avaliar em primeiro lugar os parâmetros associados:
1- Inclinação e seu desvio
Neste caso é desejável que a variação de m seja pequeno assim esperamos que a razão (Sm/m) x 100 seja
inferior a 5% (para dados de regressão de curvas analíticas para outras áreas da ciência).
b – Intercepto e seu desvio

Neste caso (quando estamos fazendo uma padronização externa ou no caso de fazermos uma
padronização interna) esperamos que o valor de sb seja pelo menos 1/3 do valor de b (já quando fazemos
uma adição de padrão o b será diferente de zero e não vamos desejar ou esperar tal situação). Se isto
ocorrer podemos dizer que o valor b é estatisticamente 0 (zero) ou que passa pela origem do gráfico.
Como podemos demonstrar isto?
Graficamente:
O valor de b pode ser aproximado em 0,019 e Sb em 0,06 assim 3 x Sb é 0,018 como podemos ver:
Observe que neste caso o desvio normal não inclui o 0 (zero) com 99,7 % de confiança e podemos dizer que
a reta não passa pela origem. Se englobasse o 0 (zero) diríamos que estatisticamente o reta passa pela
origem.
c- Coeficiente de variação e de correlação

Podemos ver R2 é 0,992 então r será 0,9842 e SR será 0,01311 e portanto o desvio relativo de R é 1,33%
assim a incerteza em R é pequena o que é desejável.
d- O ultimo teste é o teste F que temos um valor calculado de 1636. Para compararmos com o valor tabelado
a 95% ( confiança padrão usada o que não quer dizer que não possamos usar outros valores) devemos
determinar os graus de liberdade (GL) do numerador e do denominador da equação:

Observe que o GL do numerador = N-I e GL do denominador = I-1, portanto temos:

K-1 N-K
5-1 15-5
GL Numerador GL Denominador
= 4 = 10

Para compararmos com o valor F tabelado devemos buscar uma tabela com o nível de confiança desejado
(aqui 95%):
Aqui será o número 10 e 4 que corresponde a 3,48. Para comparar com o F calculado multiplicamos o valor
de F tabelado por 10 x ficando 34,8. Assim podemos ver que o F calculado, 1636 é cerca de 47 vezes maior
indicando uma alta correlação dos dados de entrada com os dados de saída e indicando que o modelo
representa bem os pontos.
Calculo da concentração da amostra

A equaçãod a reta é :

Y= 0,00357 * X + 0,01976

Assim podemos achar a concentração substituindo os valores de absorbância das amostras em Y:


0,158 = 0,00357 * X + 0,01976 assim X = (0,158 - 0,01976) / 0,00357 =38,7223 µmol/L

0,168 = 0,00357 * X + 0,01976 assim X = (0,168 - 0,01976) / 0,00357 =41.5238 µmol/L

Assim o valor é de (38,7223 + 41.5238)/2 = 40,12305 µmol/L


Calculo do desvio da medida

Como usamos uma curva de calibração esta irá contribuir para o desvio da medida, assim devemos utilizar a
formula:

Assim temos do ProjLine os dados de:


y= m x + b

m (inclinação)= 0,00357 0,01976 b=


sm= 0,00010 0,00642 sb=
R^2 0,99081 0,01420 sr=
Graus de
Valor F 1402 13 liberdade
SSresiduos= 0,28260 0,00262 SSregressão

Assim Temos:
Sr = 0,01420
m = 0,00357
M = número de medidas da amostra (neste caso 2)
N = número de medidas usadas para construir a curva analítica (neste caso 15)
Yc = média de 0,158 e 0,168 sendo 0,163
Y = Média das 15 medidas: 0,217067
Abs
exp
525 nm
0,045
0,048
0,055
0,102
0,109
0,112
0,203
0,213
0,205
0,275
0,265
0,298
0,456
0,426
0,444
y med= 0,217067

Sxx = Sr2 / Sm2 = (0,01420)2 / (0,00010)2 = 22118,4

Assim temos:

Sc = (0,01420/0,00357) Raiz (1/2+1/15+ ((0,163-0,217067)2/((0,00357)2 x 22118,4))


Sc= 3,018 µmol/L
Assim a concentração da amostra é (40 ± 3) µmol/L
Para terminar calcula-se a massa de MnO4 na amostra compensando as diluições.
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CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Preparo de curvas analíticas – Padronização interna

INTRODUÇÃO

Várias são as técnicas de quantificação de analitos, dentre elas pode-se destacar a padronização externa, a
padronização interna e a adição de padrão. Na padronização externa uma relação é estabelecida preparando
padrões de concentrações conhecidas e medindo alguma propriedade física que aumenta ou diminui
proporcionalmente a a quantidade de matéria de interesse. A medida física pode ser a massa de um
precipitado, ou a altura deste dentro de um tubo de ensaio, ou ainda a intensidade de cor em um escala visual
e etc. Quando usamos um instrumento para gerar um número em relação a uma propriedade física dizemos
que estamos usando um método instrumental.

Como temos números podemos montar gráficos com escalas e a relação entre a concentração e a
propriedade física pode obedecer a um modelo matemático que pode ser linear, quadrático, exponencial e
outros. Em química e suas áreas correlatas adotamos preferencialmente o modelo linear por apresentar
diversas características favoráveis e simples ao tratamento de dados como um desvio simétrico em relação
resposta e outros.

Para obtenção do modelo pede-se normalmente que seja utilizado pelo menos cinco níveis de calibração, ou
seja, cinco concentrações diferentes do analito. Alem disto se pede que em cada nível (ou concentração)
replicatas sejam feitas, normalmente três. Estes parâmetros podem ser reduzidos a critério do analista assim
o que vamos apresentar aqui seriam tratamentos segundo a IUPAC.

A curva analítica de padronização interna é usada quando o procedimento não é bem controlado. Ou seja, o
método não possui precisão adequada porque em alguma etapa do processamento da amostra ou o
instrumento oscila e não conseguimos controlar esta oscilação. São exemplos de processos de preparo de
amostra, processos onde os passos de preparo são longos, como em processos de extração ou digestão de
amostras. Ou em instrumentos, por exemplo, na cromatografia gasosa onde a amostra é inserida no
equipamento por meio de uma seringa que injeta a amostra líquida no “injetor” do GC , que esta quente e
pressurisado através de um septo que é furado. É de se esperar um vazamento de parte do material (perda)
que a cada injeção ocorre de uma forma não sendo reprodutível e afetando a precisão do procedimento
analítico. Para corrigir este tipo de problema a técnica de padronização interna pode ser usada, desde que: -
Exista uma substância diferente do analito que responda química e fisicamente ao analito tendo perdas muito
similares ao analito quando submetido ao mesmo processamento; - A técnica instrumental seja capaz de
distinguir entre o sinal do analíto e do padrão interno.

A curva analítica de padronização interna então é um gráfico obtido pela concentração de soluções
conhecidas pela razão do sinal do analito dividido pelo sinal do padrão interno. Observe que a interferência
espectral (o analito e o padrão interno tem de ter sinais independentes). A interferência espectral é um
problema neste tipo de técnica.

A obtenção da relação linear é normalmente feita por uso da ferramenta matemática para regressão linear.
Os parâmetros para esta regressão são apresentados no Capitulo 8 do livro texto Skoog. Observe que o
modelo ajustado é proposto. Podemos ajustar o modelo a qualquer conjunto de dados e teremos uma
resposta. O que acontece é que o modelo pode ou não ser adequado.

Assim o gráfico é montado usando soluções de concentrações conhecidas (geralmente o mínimo de cinco
concentrações diferentes) e mede-se a resposta analítica, traçando-se um gráfico com a relação entre estes
valores. No eixo x deste gráfico colocam se as concentrações conhecidas e no eixo y as respectivas
respostas. Se o gráfico obtido representa uma reta torna-se mais fácil obter os parâmetros desta correlação,
por regressão linear, e definir uma equação matemática que descreva o relacionamento entre x e y,
encontrando os coeficientes angular (a) e linear (b). Os coeficientes da reta y = ax + b, são calculados com a
regressão linear e são utilizados para calcular a concentração de soluções desconhecidas que apresentam
uma resposta analítica obtida da mesma forma que as soluções conhecidas.

Uma das maneiras de verificar se o modelo linear é adequado é utilizar o valor de coeficiente de correlação
(r). Quanto mais próximo a 1 for o coeficiente de correlação, melhor é a reta. Entretanto, essa não é a
maneira mais confiável de verificar a linearidade dos dados, em muitos casos é necessário o uso de ANOVA.

OBJETIVO

Preparar curvas analíticas por diferentes métodos e comparar o resultado obtido entre eles através de
tratamentos matemáticos.

MATERIAIS E MÉTODOS

- Materiais e reagentes:
• Permanganato de potássio
• Dicromato de potássio
• Ácido sulfúrico 1 mol/L
• Balões volumétricos de 50 mL
• Balão volumétrico de 1 L
• Espátula
• Béquer de 100 mL
• Bastão de vidro
• Pipetas volumétricas de 1, 2 e 5 mL
• Pipeta graduada de 10 mL
• Pipeta automática de 200 L

- Instrumentos:

• Balança analítica
• Espectrofotometro UV/Vis

PROCEDIMENTO

Preparo da amostra

1. Dissolver uma amostra de permanganato de potássio para uso adulto e pediátrico, pela dissolução da
amostra (100 mg) em aproximadamente 100 mL de água destilada. Transferir para o balão volumétrico de 1L,
100 mL de uma solução 1 mol/L de ácido sulfúrico previamente preparada em seguida a solução de
permanganato e completar o volume com água destilada.

Preparo da curva analítica de padronização interna

2. Usar os volumes calculados para preparar as soluções padrões com concentrações de 1,2 x 10-5 ; 2,4 x 10-
5
; 4,8 x 10-5 ; 7,2 x 10-5 e 12 x 10-5 mol/L em balões volumétricos de 100,0 mL.
3. Adicionar os volumes calculados de solução estoque a cinco balões volumétricos de 100,0 mL, adicione 10
mL de solução de ácido sulfúrico 1 mol/L; 4,0 mL de solução de dicromato de potássio 0,0005 mol/L e aferir a
solução com água ultrapura. Prepare as soluções em duplicata. (10 balões).
• Prepare um branco pela adição de 10 mL de solução de ácido sulfúrico 1 mol/L em balão volumétrico
de 100,0 mL e aferir a solução com água ultrapura.
4. Prepare uma solução de dicromato de potássio pela adição de 4,0 mL da uma solução estoque 0,0005
mol/L e 10 mL de solução de ácido sulfúrico 1 mol/L a um balão de 100,0 mL e aferir a solução com água
ultrapura.
• Prepare uma solução de permanganato de potássio pela adição de 2,0 mL (1,2 x 10-5 mol/L) da uma
solução estoque 0,0006 mol/L e 10 mL de solução de ácido sulfúrico 1 mol/L a um balão de 100,0 mL
e aferir a solução com água ultrapura.
5. Diluir a solução da amostra preparada no item 1 medido 8,00 mL com a pipeta graduada e diluindo em
balão volumétrico de 100,0 mL, adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L; 4,0 mL de solução de dicromato de
potássio 0,0005 mol/L e aferir a solução com água ultrapura.
6. Determinação dos comprimentos de onda para o analíto e o padrão interno.
• Após preparar o equipamento faça um branco do mesmo sem colocar cubetas.
• Coloque a solução branco (item 3) em duas cubetas no equipamento e faça o branco.
• Troque a solução da posição frontal pela solução de permanganato preparada no item 4 faça uma
varredura no espectro do permanganato na faixa pesquisada de 800 a 300 nm e plote (Abs x ).
• Troque a solução da posição frontal pela solução de cromato preparada no item 4 faça uma varredura
no espectro do permanganato na faixa pesquisada de 800 a 300 nm e plote (Abs x ).
• Avalie os dois espectros sobrepondo-os e verifique as interferências espectrais.
• Escolha então os comprimentos de onda para montar o método espectrofotométrico.
7. Monte o método com os comprimentos de onda escolhidos e monte a curva analítica Ab x Conc lendo os
padrões preparados no itens 3. Registre o resultado na tabela 1.

8. Faça a leitura da solução da amostra preparada no item 5 na curva e anote as absorbâncias.


9. Faça a regressão linear dos pontos ajustando como uma reta de Razão x Conc de MnO4.
10. Calcule o erro da inclinação e do intercepto.
11. Calcule a Análise de Variância da Regressão.
12. Faça o gráfico da regressão linear.
13. Calcule a massa da amostra e o erro da medida considerando a incerteza da curva
analítica e compare com a massa indicada no rotulo do medicamento. Qual o erro relativo considerando o
valor obtido pelo experimento como verdadeiro?
14. Com os espectros de absorção do cromato e do permanganato discuta o efeito da interferência espectral
de um composto no outro.

Tabela 1 - Registro dos resultados.


Vol Solução Vol Solução MnO4 CrO4 Razão
Número padrão de padrão de CrO4 Absorbância Absorbância Sinal MnO4
Balão MnO4 (mL) (mL) (λ= ) (λ= ) Sinal CrO4
1 (branco) 0,00 4,00
2 4,00
2 4,00
3 4,00
3 4,00
4 4,00
4 4,00
5 4,00
5 4,00
6 4,00
6 4,00
Amostra
Amostra

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a Edição,
São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
HARRIS, D.C. Análise Química Quantitativa. 6ª edição, Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.
Tutorial de tratamento de dados da Preparo de curvas analíticas - padronização interna

Dados do experimento
Conc
Abs Abs
mmol/L Razão 525 450
12 0,429 0,045 0,105
12 0,444 0,048 0,108
12 0,539 0,055 0,102
24 0,927 0,102 0,110
24 0,948 0,109 0,115
24 0,896 0,112 0,125
48 1,493 0,203 0,136
48 1,555 0,213 0,137
48 1,475 0,205 0,139
72 1,858 0,275 0,148
72 1,866 0,265 0,142
72 1,987 0,298 0,150
120 2,698 0,456 0,169
120 2,582 0,426 0,165
120 2,596 0,444 0,171

Amostras 525 0,130 0,128


450 0,128 0,131
Razão 1,02 0,98
Conc = 30,79 28,79

Fazendo regressão linear temos:


Observe que em química o primeiro modelo matemático que ajustamos é o linear, mas se este não for
adequado podemos usar outros.

Podemos então calcular os resíduos:


Fazemos este calculo fazendo uso da equação da reta, onde substituímos no lugar do X o valor da
concentração preparada e obtendo o valor do Y teórico. O resíduo é calculado então pela diferença do Y
experimental – Y teórico.
A soma dos resíduos deu um valor igual a zero ou próximo isto demonstra sua consistência.

Gráfico de Resíduos

O gráfico de resíduos mostra uma dispersão heterogênea mostrando claramente que o modelo não é linear.
Isto já era esperado uma vez que sabemos que o permanganato absorve na região de 350 nm interferindo no
sinal do PI.
Teste Q para consistência dos dados
Olhando o gráfico de resíduos não existe ponto anômalo, mas iremos testar o ponto mais extremo para
demonstrar o uso do teste.

ANOVA
A análise de Variancia é um teste que deve ser realizado para mostrar que o modelo matemático escolhido
(linear) é adequado para representar os pontos apresentando alta correlação. Ou seja o modelo prevê bem o
resultado.
O teste F é um teste usado para testar se grupos diferentes apresentam a mesma variância de seu resultado.
Aqui ele é usado para demonstrar que os resíduos em relação ao modelo matemático, não explicáveis, são
pequenos,
Para tal, usamos o programa do ecxel Proj.Line (para ver como usar o programa veja no capítulo 8 do scoog).
y= m x + b

m (inclinação)= 0,01927 0,42226 b=


sm= 0,00098 0,06569 sb=
R^2 0,96768 0,14529 sr=
Graus de
Valor F 389 13 liberdade
SSresiduos= 8,21697 0,27440 SSregressão

Como resposta o programa retorna os números marcados em verde.


Para avaliação destes dados devemos avaliar em primeiro lugar os parâmetros associados:
1- Inclinação e seu desvio
Neste caso é desejável que a variação de m seja pequeno assim esperamos que a razão (Sm/m) x 100 seja
inferior a 5% (para dados de regressão de curvas analíticas para outras áreas da ciência). Neste caso foi
5,06%
b – Intercepto e seu desvio
Neste caso (quando estamos fazendo uma padronização externa ou no caso de fazermos uma
padronização interna) esperamos que o valor de sb seja pelo menos 1/3 do valor de b (já quando fazemos
uma adição de padrão o b será diferente de zero e não vamos desejar ou esperar tal situação). Se isto
ocorrer podemos dizer que o valor b é estatisticamente 0 (zero) ou que passa pela origem do gráfico.
Observe que neste caso o desvio normal não inclui o 0 (zero) com 99,7 % de confiança e podemos dizer que
a reta não passa pela origem, pois 3 x Sb = 0,18 que esta longe de 0,42.

c- Coeficiente de variação e de correlação


Podemos ver R2 é 0,96 então r será 0,98 e SR será 0,14 e portanto o desvio relativo de R é 14%% assim a
incerteza em R é grande.
d- O ultimo teste é o teste F que temos um valor calculado de 1636. Para compararmos com o valor tabelado
a 95% ( confiança padrão usada o que não quer dizer que não possamos usar outros valores) devemos
determinar os graus de liberdade (GL) do numerador e do denominador da equação:

Observe que o GL do numerador = N-I e GL do denominador = I-1, portanto temos:

K-1 N-K
5-1 15-5
GL Numerador GL Denominador
= 4 = 10

Para compararmos com o valor F tabelado devemos buscar uma tabela com o nível de confiança desejado
(aqui 95%):
Aqui será o número 10 e 4 que corresponde a 3,48. Para comparar com o F calculado multiplicamos o valor
de F tabelado por 10 x ficando 34,8. Assim podemos ver que o F calculado, 386 é maior indicando uma
correlação dos dados de entrada com os dados de saída e indicando que o modelo representa bem os pontos
apesar dos defeitos.
Calculo da concentração da amostra

A equação da reta é :

Y= 0,01927 * X + 0,42
Para amostra temos:
Amostras 525 0,130 0,128
450 0,128 0,131
Razão 1,02 0,98
Conc = 30,79 28,79
Mádia 1,00
Assim podemos achar a concentração substituindo os valores de absorbância das amostras em Y:
1 = 0,01927 * X + 0,42
assim X = (1 - 0,42) / 0,01927 = 30,09 µmol/L

Calculo do desvio da medida

Como usamos uma curva de calibração esta irá contribuir para o desvio da medida, assim devemos utilizar a
formula:

Assim temos do ProjLine os dados de:


y= m x + b

m (inclinação)= 0,01927 0,42226 b=


sm= 0,00098 0,06569 sb=
R^2 0,96768 0,14529 sr=
Graus de
Valor F 389 13 liberdade
SSresiduos= 8,21697 0,27440 SSregressão

Assim Temos:
Sr = 0,14
m = 0,01927
M = número de medidas da amostra (neste caso 2)
N = número de medidas usadas para construir a curva analítica (neste caso 15)
Yc = média de 1,02 e 0,98 sendo 1
Y = Média das 15 medidas: 1,486

Razão
0,429
0,444
0,539
0,927
0,948
0,896
1,493
1,555
1,475
1,858
1,866
1,987
2,698
2,582
2,596
1,486

Sxx = Sr2 / Sm2 = (0,00098)2 / (0,14529)2 = 22118,4

Assim temos:

Sc = (0,14/0,019) Raiz (1/2+ 1/15+ (((1-1,486)2/((0,019)2 x 22118,4))


Sc= 5,82 ≈ 6 µmol/L
Assim a concentração da amostra é (30 ± 6) µmol/L
Para terminar calcula-se a massa de MnO4 na amostra compensando as diluições.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Preparo de curvas analíticas – Adição de padrão

INTRODUÇÃO

Várias são as técnicas de quantificação de analitos, dentre elas pode-se destacar a padronização externa, a
padronização interna e a adição de padrão. Na padronização externa uma relação é estabelecida preparando
padrões de concentrações conhecidas e medindo alguma propriedade física que aumenta ou diminui
proporcionalmente a a quantidade de matéria de interesse. A medida física pode ser a massa de um
precipitado, ou a altura deste dentro de um tubo de ensaio, ou ainda a intensidade de cor em um escala visual
e etc. Quando usamos um instrumento para gerar um número em relação a uma propriedade física dizemos
que estamos usando um método instrumental.

Como temos números podemos montar gráficos com escalas e a relação entre a concentração e a
propriedade física pode obedecer a um modelo matemático que pode ser linear, quadrático, exponencial e
outros. Em química e suas áreas correlatas adotamos preferencialmente o modelo linear por apresentar
diversas características favoráveis e simples ao tratamento de dados como um desvio simétrico em relação
resposta e outros.

Para obtenção do modelo pede-se normalmente que seja utilizado pelo menos cinco níveis de calibração, ou
seja, cinco concentrações diferentes do analito. Alem disto se pede que em cada nível (ou concentração)
replicatas sejam feitas, normalmente três. Estes parâmetros podem ser reduzidos a critério do analista assim
o que vamos apresentar aqui seriam tratamentos segundo a IUPAC.

A curva analítica de adição de padrão é usada quando:


• não podemos fazer um ajuste de matriz (padronização externa) e
• não conseguimos uma amostra sem o analito.
• e, alem disto, existe efeito matriz na amostra impedindo o uso de um método de padronização na
amostra
A curva é construída pela adição de concentrações conhecidas do padrão a amostra. Assim construímos uma
curva analítica para cada amostra com cada qual com seu efeito matriz específico.
A concentração é então obtida pela tomando-se y como zero e achando o valor da concentração na amostra
diluída.

A obtenção da relação linear é normalmente feita por uso da ferramenta matemática para regressão linear.
Os parâmetros para esta regressão são apresentados no Capitulo 8 do livro texto Skoog. Observe que o
modelo ajustado é proposto. Podemos ajustar o modelo a qualquer conjunto de dados e teremos uma
resposta. O que acontece é que o modelo pode ou não ser adequado.

Assim o gráfico é montado usando soluções de concentrações conhecidas (geralmente o mínimo de cinco
concentrações diferentes) e mede-se a resposta analítica, traçando-se um gráfico com a relação entre estes
valores. No eixo x deste gráfico colocam se as concentrações conhecidas e no eixo y as respectivas
respostas. Se o gráfico obtido representa uma reta torna-se mais fácil obter os parâmetros desta correlação,
por regressão linear, e definir uma equação matemática que descreva o relacionamento entre x e y,
encontrando os coeficientes angular (a) e linear (b). Os coeficientes da reta y = ax + b, são calculados com a
regressão linear e são utilizados para calcular a concentração de soluções desconhecidas que apresentam
uma resposta analítica obtida da mesma forma que as soluções conhecidas.

Uma das maneiras de verificar se o modelo linear é adequado é utilizar o valor de coeficiente de correlação
(r). Quanto mais próximo a 1 for o coeficiente de correlação, melhor é a reta. Entretanto, essa não é a
maneira mais confiável de verificar a linearidade dos dados, em muitos casos é necessário o uso de ANOVA.

OBJETIVO

Preparar curvas analíticas por diferentes métodos e comparar o resultado obtido entre eles através de
tratamentos matemáticos.

MATERIAIS E MÉTODOS

- Materiais e reagentes:

• Permanganato de potássio
• Ácido sulfúrico 1 mol/L
• Balões volumétricos de 100 mL
• Balão volumétrico de 1 L
• Espátula
• Béquer de 100 mL
• Bastão de vidro
• Pipetas volumétricas de 1, 2 e 5 mL
• Pipeta graduada de 10 mL
• Pipeta automática de 200 L

- Instrumentos:

• Balança analítica
• Espectrofotometro UV/Vis

PROCEDIMENTO

Preparo da amostra

1. Dissolver uma amostra de permanganato de potássio para uso adulto e pediátrico, pela dissolução da
amostra (100 mg) em aproximadamente 100 mL de água destilada. Transferir para o balão volumétrico de 1L,
100 mL de uma solução 1 mol/L de ácido sulfúrico previamente preparada em seguida a solução de
permanganato e completar o volume com água destilada.

Preparo da curva analítica de adição de padrão

2. Preparar 100,0 mL de uma solução estoque de permanganato de potássio 0,0006 mol/L (ou 60 x 10-5 mol
L-1) como feito na padronização externa.
• Prepare o branco em um balão volumétrico de 100,0 mL,adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e
completar com água destilada. Coloque no equipamento e faça o auto zero. Em seguida leia
absorbância esta deve oscilar próximo do zero.

3. Dilua a amostra medindo 8,00 mL da solução item 1 e desta e transferindo para um


balão volumétrico de 100,0 mL,adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e completar com água destilada
(duplicata). Faça as leituras no mesmo comprimento de onda da padronização externa e anote na tabela 1.

4. Dilua a amostra medindo 8,00 mL da solução item 1 e desta e transferindo para um balão volumétrico de
100,0 mL, adicionar 2,50 mL da solução preparada no item 2 (e usada para preparar a curva de padronização
externa), adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e completar com água destilada (duplicata). Faça as
leituras no mesmo comprimento de onda e anote na tabela 1.

5. Dilua a amostra medindo 8,00 mL da solução item 1 e desta e transferindo para um balão volumétrico de
100,0 mL, adicionar 5,00 mL da solução preparada no item 2 (e usada para preparar a curva de padronização
externa), adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e completar com água destilada (duplicata). Faça as
leituras no mesmo comprimento de onda e anote na tabela 1.
6. Dilua a amostra medindo 8,00 mL da solução item 1 e desta e transferindo para um balão volumétrico de
100,0 mL, adicionar 7,50 mL da solução preparada no item 2 (e usada para preparar a curva de padronização
externa), adicione 10 mL de ácido sulfúrico 1 mol/L e completar com água destilada (duplicata). Faça as
leituras no mesmo comprimento de onda e anote na tabela 1.

Tabela 1 – Dados da curva de adição de padrão

Número Volume de Volume de Concentração Absorbância


do amostra item 1 padrão Iten 2 mol/L (525 nm)
balão (mL) (mL)
1 8,00 0,00
1 8,00 0,00
2 8,00 2,50
2 8,00 2,50
3 8,00 5,00
3 8,00 5,00
4 8,00 7,50
4 8,00 7,50

8. Monte a curva analítica Ab x Conc lendo os padrões preparados no itens 3 a 6. Registre o resultado na
tabela 1. Faça o gráfico da regressão linear.

9. Por extrapolação da curva de adição de padrão determine a concentração na solução da amostra.

10. Calcule o erro da inclinação e do intercepto.

11. Calcule a massa da amostra e o erro da medida considerando a incerteza da curva analítica e compare
com a massa indicada no rotulo do medicamento. Qual o erro relativo considerando o valor obtido pelo
experimento como verdadeiro?

Comparação entre as técnicas

12. Com os resultados discuta as particularidades vantagens e desvantagens de cada técnica e diga qual a
técnica seria mais indicada para controle de qualidade deste medicamento.

13. Usando a absortividade molar calcule a concentração da solução do item 1 e a massa do permanganato.
Existe diferença entre os resultados? Justifique?
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a Edição,
São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.

HARRIS, D.C. Análise Química Quantitativa. 6ª edição, Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.
Tutorial de tratamento de dados da Preparo de curvas analíticas – Adição de padrão

Dados do experimento
Conc Conc
mol/L umol/L Abs exp
Volume Volume mL Volume conc
amostra Padrão mL Final mol/L
8,00 0,0 100,0 0,0006 0,0000000 0 0,100
8,00 0,0 100,0 0,0006 0,0000000 0 0,090
8,00 2,5 100,0 0,0006 0,0000150 15 0,150
8,00 2,5 100,0 0,0006 0,0000150 15 0,157
8,00 5,0 100,0 0,0006 0,0000300 30 0,225
8,00 5,0 100,0 0,0006 0,0000300 30 0,215
8,00 7,5 100,0 0,0006 0,0000450 45 0,275
8,00 7,5 100,0 0,0006 0,0000450 45 0,280

Fazendo regressão linear temos:


Observe que em química o primeiro modelo matemático que ajustamos é o linear, mas se este não for
adequado podemos usar outros.

Na adição de padrão observe que a reta ajustada não passa na origem do gráfico.
Podemos então calcular os resíduos:
Fazemos este calculo fazendo uso da equação da reta, onde substituímos no lugar do X o valor da
concentração preparada e obtendo o valor do Y teórico. O resíduo é calculado então pela diferença do Y
experimental – Y teórico.
A soma dos resíduos deu um valor igual a zero ou próximo isto demonstra sua consistência.

Gráfico de Resíduos

O gráfico de resíduos mostra uma dispersão homogênea sem homostaticidade e sem pontos anômalos ou
suspeitos.

Teste Q para consistência dos dados


Não é necessário uma vez que graficamente não temos nenhum ponto distorcendo da dispersão geral.

ANOVA
A análise de Variancia é um teste que deve ser realizado para mostrar que o modelo matemático escolhido
(linear) é adequado para representar os pontos apresentando alta correlação. Ou seja o modelo prevê bem o
resultado.
O teste F é um teste usado para testar se grupos diferentes apresentam a mesma variância de seu resultado.
Aqui ele é usado para demonstrar que os resíduos em relação ao modelo matemático, não explicáveis, são
pequenos,
Para tal, usamos o programa do ecxel Proj.Line (para ver como usar o programa veja no capítulo 8 do scoog).
Como resposta o programa retorna os números da tabela acima.
Para avaliação destes dados devemos avaliar em primeiro lugar os parâmetros associados:
1- Inclinação e seu desvio
Neste caso é desejável que a variação de m seja pequeno assim esperamos que a razão (Sm/m) x 100 seja
inferior a 5% (para dados de regressão de curvas analíticas para outras áreas da ciência). Neste caso foi
2,71%
b – Intercepto e seu desvio
Como se trata de uma adição de padrão o valor de b deverá ser diferente de zero. Assim esperamos que a
razão (Sb/b) x 100 seja inferior a 5% (para dados de regressão de curvas analíticas para outras áreas da
ciência). Neste caso foi 3,3%
c- Coeficiente de variação e de correlação
Podemos ver R2 é 0,995 então r será 0,9978 e SR será 0,005 e portanto o desvio relativo de R é 0,5% assim a
incerteza em R é pequena e desejável.
d- O ultimo teste é o teste F
O que temos um valor calculado de F de 1359. Para compararmos com o valor tabelado a 95% (confiança
padrão usada o que não quer dizer que não possamos usar outros valores) devemos determinar os graus de
liberdade (GL) do numerador e do denominador da equação:

Observe que o GL do numerador = N-I e GL do denominador = I-1, portanto temos:

K-1 N-K
4-1 8-4
GL Numerador GL Denominador
= 3 = 4
Para compararmos com o valor F tabelado devemos buscar uma tabela com o nível de confiança desejado
(aqui 95%):

Aqui será o número 10 e 4 que corresponde a 6,59. Para comparar com o F calculado multiplicamos o valor
de F tabelado por 10 x ficando 65,9. Assim podemos ver que o F calculado, 1359 é maior indicando uma
correlação dos dados de entrada com os dados de saída e indicando que o modelo representa bem os pontos
apesar dos defeitos.
Calculo da concentração da amostra

A equação da reta é : y = 0,0040933 x C + 0,0994


Para calcularmos a concnetração na amostra fazemos Y= 0 e...
Assim: 0 = 0,0040933 x C + 0,0994 e C = -0,0994 / 0,0040933 = 23,06 µmol/L
Calculo do desvio da medida
Sc = C x ( (Sa/a)2 + (Sb/b)2 )1/2 = 23,06 x ((0,00011/0,0040933)2 +(0,00312/0,0944)2)1/2 =
Sc = 0,99
Assim a concentração da amostra é (23,06 ± 0,99) µmol/L
Para terminar calcula-se a massa de MnO4 na amostra compensando as diluições.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Determinação espectrofotométrica do pKa de um indicador

INTRODUÇÃO

A espectrometria de absorção molecular no visível pode ser aplicada à análise de compostos absorventes ou
não absorventes. No caso de espécies absorventes pode ocorrer variação da cor em função do pH do
sistema, como é o caso de um indicador ácido-base. Esse fato permite a determinação espectrofotométrica
do pKa do indicador. A comparação dos espectros de absorção de um indicador em suas formas ácida,
básica e neutra mostra um ponto coincidente, que é chamado ponto isosbésticos ou isoabsortivo. Através de
leituras de absorbância em dois comprimentos de onda situados à esquerda e a direita do ponto isosbéstico
pode-se construir gráficos contendo curvas A x pH. O ponto de intercessão das curvas corresponde a
concentrações iguais da forma ácida e da forma básica, indicando o pH que corresponde ao pKa do
indicador.

OBJETIVO

Determinar o pKa do indicador azul de bromotimol por espectrofotometria de absorção molecular na região do
visível.

MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e reagentes:
- Balões volumétricos de 25 mL
- Pipeta graduada de 10,00 mL
- Pipeta Pasteur
- Solução de azul de bromotimol 0,1%
- Solução de HCl 4 mol L-1
- Solução de fosfato de sódio dibásico 0,1 mol L-1
- Solução de fosfato de potássio monobásico 0,1 mol L-1
- Solução de NaOH 4 mol L-1
- Fita indicadora de pH

PROCEDIMENTO

Numerar 9 balões volumétricos de 25 mL e Preparar as soluções conforme a seguinte tabela.

Número Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. pH Abs Abs
balão indicador NaOH HCl KH2PO4 Na2HPO4 calculado λ λ
(mL) 4 mol L- 4 mol L- 0,1 mol/L 0,1 mol/L
1 1 (mL) (mL)
(Gotas) (Gotas)

1 1,00 12 ---
2 1,00 5
3 1,00 9 1
4 1,00 7 3
5 1,00 5 5
6 1,00 3 7
7 1,00 1 9
8 1,00 5
9 1,00 12 ---

Completar os volumes dos balões com água deionizada, agitar, verificar o pH e anotar.
Fazer varreduras das soluções 1 e 9 de azul de bromotimol e determinar os máximos de absorção de cada
comprimento de onda. Em seguida fazer a varredura para solução 5. Verifique se há interferências.

Fazer as leituras nos dois comprimentos de onda (λ) selecionados tendo o cuidado de zerar o equipamento
com água.

Construir um gráfico no Excel® colocando na abscissa o pH calculado e na ordenada as absorbâncias de


cada uma das soluções. O ponto em que a curva da forma ácida corta a curva da forma básica fornece o pH,
que permite calcular o pKa.

Comparar com o valor de pKa do indicador apresentado pela literatura.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5a Ed. Bookman, 2002.
1055 p.
2. SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a
Edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
Tutorial de tratamento de dados da determinação espectrofotométrica do pKa de um indicador

Dados do experimento

Número balão Absorbância


λ = 615 λ = 435
1 _ _
2 0,139 0,884
3 0,280 1.055
4 0,436 0,659
5 0,946 0,735
6 1,033 0,416
7 1,545 0,311
8 1-558 0,156
9 _ _
Do roteiro temos:

Número Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. Vol. sol. pH
balão indicador NaOH HCl KH2PO4 Na2HPO4 calculado
(mL) 4 mol L-1 4 mol L-1 0,1 mol/L 0,1 mol/L
(Gotas) (Gotas) (mL) (mL)

1 1,00 12 ---
2 1,00 5
3 1,00 9 1
4 1,00 7 3
5 1,00 5 5
6 1,00 3 7
7 1,00 1 9
8 1,00 5
9 1,00 12 ---

Desta tabela podemos calcular o pH das soluções de de 2 a 8 pelos volumes adicionados dos sais fosfatos.

Calculo do pH das soluções

PARA SOLUÇÕES TAMPÃO


Nas soluções de 3, 4, 5, 6 e 7 usaremos a formula de tampão deduzida no livro do autor Skoog cap 9.
(9-27)

Assim como exemplo calcularemos a pH da solução 2:

O primeiro passo é definir qual do Ka do ácido fosfórico será usado.


Como usamos o sal monobásico e o dibásico iremos usar o Ka2.
Assim:

Podemos calcular a concentração do CHA na formula, por exemplo no tampão 3:


CHA = CNaH2PO4 x V NaH2PO4 / Vfinal = 0,1 molL-1 x 1 mL / 25 mL = 0,036 molL-1
Podemos também calcular a concentração do CA- na formula:
CA- = CNa2HPO4 x V Na2HPO4 / Vfinal = 0,1 molL-1 x 1 mL / 25 mL = 0,004 molL-1
Aplicando na formula 9-27 temos:

[H+] = Ka2 x CHA / CA´ = 6,32 X 10-8 X 0,036 molL-1/0,004 molL-1 = 5,688 x 10-7 molL-1
pH = 6,24

Aplicando as outras soluções temos:


Solução vHA VA-
CHA CA- C H+ pH
3 9 1 0,0360 0,0040 5,69E-07 6,25
4 7 3 0,0280 0,0120 1,47E-07 6,83
5 5 5 0,0200 0,0200 6,32E-08 7,20
6 3 7 0,0120 0,0280 2,71E-08 7,57
7 1 9 0,0040 0,0360 7,02E-09 8,15

PARA SOLUÇÕES DE SAIS ANFIPRÓTICOS


Nas soluções de 2 e 8 usaremos a formula de tampão deduzida no livro do autor Skoog cap 15

.
Assim para solução 2 o sal usado é NaH2PO4 e assim usaremos Ka1 e Ka2 do ácido fosfórico e CNaH2PO4 será
0,1 molL-1 x 5 mL / 25 mL = 0,02 molL-1. A equação ficará:
[H+] = 2,075 x 10-5 pH = 4,68
DADOS DO GRÁFICO

Balão pH λ = 615 λ = 435


2 4,68 0,139 0,884
3 0,280 1.055
6,25
4 0,436 0,659
6,83
5 0,946 0,735
7,20
6 1,033 0,416
7,57
7 1,545 0,311
8,15
8 9,61 1-558 0,156

Refinado regi]ao de interesse:


Quando igualamos os y das retas temos o valor de X onde elas se crusam:

Assim : - 0,335 X + 3,148 = 1,378 X – 8,978 e


(1,378 + 0,335 ) X = 3,148 + 8,978 e
X = pH = PKaind = 12,126 / 1,713 = 7,07

Ou seja pKa de 7,07.

Da tabela 14-1

Temos que o valor tabelado para pKa do Azul de bromo timol é 7,10 indicando um erro na exatidão de 0,03
unidade de pKa. Ou seja, um erro % na exatidão de (0,03/7,1 0) x 100 = 0,42% em termos de pKa
Já convertendo para Ka temos o valor 0,851 x 10-7 experimental sendo o tabelado de 0,794 x 10-7 .
Assim 0,794 - 0,851 que denota um erro de -0,057 x 10-7 no Ka.
E um erro % na exatidão de (-0,057 / 0,794) x 100 = 7,17 %
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Determinação da concentração de Fe(II) por espectrometria de absorção


no visível

INTRODUÇÃO:

A espectrometria de absorção molecular no visível pode ser aplicada à análise de compostos absorventes ou
não absorventes. Nestes últimos é necessária a ocorrência de uma reação química, cujo produto absorve no
visível. Um exemplo deste tipo de análise é a dosagem de Fe(II). O Fe(II) não apresenta cor suficiente para
produzir uma
absorção diferenciada a concentrações diversas. Portanto, sua determinação exige o uso de um reagente
seletivo. Para quantificação do Fe(II), o íon reage com a 1,10- fenantrolina para formar o complexo de cor
vermelho-alaranjado [(C12H8 N2)3 Fe2+], que no intervalo de pH de 2 a 9, é estável por longos períodos. O
Fe(III), principal interferente dessa análise, pode ser reduzido com cloreto de hidroxilamônio ou com
hidroquinona.

Quando trabalhamos com ensaios de rotina que levam vários dias é interessante não termos de construir uma
curva analítica todo dia. Para tal podemos usar técnicas de carta de controle para determinarmos a validade
da curva entre dias. Neste experimento iremos explorar esta técnica e será feito em dois dias: No primeiro
iremos construir a curva analítica e construir as cartas de controle e no segundo fazer a validação da curva
baseada na carta controle e proceder as análises das amostras.

Outro fator que iremos explorar é os conceitos intrínsecos a espectroscopia óptica. Temos que a Absorção de
uma solução esta relacionado a transmitância e que a absorbância é uma propriedade aditiva. Assim a perda
de potencia de um feixe luz ao atravessar uma solução é o somatório da absorção do cromóforo de interesse,
mais a absorbância de outras espécies interferentes mais as alterações de refração do meio. Assim quando
construímos uma curva analítica procuramos adaptá-la da melhor forma a reproduzir as condições da
amostra. Na maioria dos casos, esta adaptação é bem sucedida, mas existem casos em que a amostra é
muito complexa. Nestes casos e quando existe o uso de uma reação para produzir cor é possível descontar
os efeitos da matriz, para corrigir os erros relacionados absorbância de outras espécies interferentes mais as
alterações de refração do meio. Este tipo de correção é conhecido em alguns meios como correção por meio
de branco testemunha.

Como o equipamento de absorção molecular no UV/Vis funciona


A transmitância e dada por T= P/P0 e a absorbância é dada por A= -log T=log P0/P.
Observe que o equipamento de absorção molecular no UV/Vis não mede a luz absorvida e sim a luz
transmitida, por inferência ele admite que toda luz perdida na potencia do feixe incidente ocorre devido a
absorção do cromóforo.
Quando um feixe de radiação monocromática atravessa uma solução contendo uma espécie padrão
absorvedora, gerada por uma reação especifica com um reagente que gera cor a partir do analito, uma parte
dessa energia é absorvida pelos cromóforos de interesse, parte e refletida e refratada, enquanto o restante é
transmitido sendo detectada.
Ou seja podemos interpretar a Abstotal = Abs cromf + Abs Refl + Abs Refr .
Ao zerar o equipamento com a cubeta cheia com a solução do branco, dizemos artificialmente, que Absbranco =
Abs Refl + Abs Refr ou seja e a Abs = Abs cromf . Estamos artificialmente mudando o zero de posição e
descontando os efeitos das perdas por refração e reflexão.

Figura1 - Esquema monstranto o feixe incidente P0 e o feixe emergente P.


Portanto ao analisarmos amostras acreditamos que o branco feito foi de forma adequada.
Influencia de amostras reais
Agora quando analisamos amostras reais existem substâncias que não estão presentes no branco que
podem produzir alterações na composição do meio implicando em aumento ou diminuição das reflexões e
refrações alem de cromóforos interferentes.
Observe que a nossa curva foi feita sobre a seguinte proposição:
Abstotal = Abs cromf + Abs Refl + Abs Refr
Onde Abs Refl + Abs Refr = AbsBranco foram compensadas artificialmente. Ou seja, o equipamento faz:

Abs cromf = Abstotal - Abs Refl - Abs Refr


Ou
Abs cromf = Abstotal – AbsBranco
Mas nossa amostra pode conter substâncias que podem introduzir novas componentes a equação:
Abstotal = Abs cromf + Abs Refl + Abs Refr + Abs Novas Refl + Abs Novas Refr + Abs interf
Onde as substâncias introduzem três novos termos. Assim:
Abs cromf = Abstotal - Abs Refl - Abs Refr - Abs Novas Refl - Abs Novas Refr - Abs interf
Termos 1 2 3 4 5 6
Observe que os termos 2 e 3 foram compensados como branco, mas os novos termos que só aparecem na
hora da análise da amostra não. Estas alterações devem ser compensadas. Uma forma de compensar estas
alterações é com o uso do chamado “Branco Testemunha”. O uso do branco testemunha só é possível
quando a espectrometria de absorção no UV/Vis faz uso de um reagente para formar a cor. Assim em um
determinado comprimento de onda usado na análise para determinar a concentração da espécie cromófora
gerada pela reação específica, a amostra devidamente diluída, irá apresentar uma perda de potencia do feixe
que corresponde a soma das absorções do cromóforo, mais a perda devido as alterações nos índices de
refração e reflexão alterando a refração e reflexão e outras substâncias que absorvam neste comprimento de
onda. Se preparamos outra amostra sem adicionar o reagente que gera o cromóforo iremos poder medir a
perda de potencia do feixe referente à perda devido a refração e reflexão e outras substâncias que absorvam
neste comprimento de onda. Assim:
Absbranco testemunha = Abs Novas Refl + Abs Novas Refr + Abs interf
E
Abs cromf = Abstotal - Abs Refl - Abs Refr - Abs Nova Refl - Abs Nova Refr - Abs interf
Ou
Abs cromf = Abstotal - Abs Branco - Abs Branco TestemunhaRefr

Diminuindo a absorção da amostra da absorção do branco testemunha teremos o valor da absorção devido a
espécie cromófora e poderemos calcular a concentração do cromóforo.

Sinais da absorção.
Os sinais quando construídos adequadamente serão sempre positivos, mas podemos ter sinais de absorção
negativa dependendo da situação. Isto não significa uma absorção negativa e sim uma má interpretação dos
sinais pelo equipamento.
Observando a equação:
Abs cromf = Abstotal - Abs Refl - Abs Refr - Abs Nova Refl - Abs Nova Refr - Abs interf
Ou
Abs cromf = Abstotal - Abs Branco - Abs Nova Refl - Abs Nova Refr - Abs interf
A Abs interf sempre irá ter uma contribuição positiva aumentando o sinal Abs cromf indevidamente e portanto
sempre terá o sinal negativo na expressão.
Mas Abs Nova Refl e Abs Nova Refr pode ter um sinal trocado invertendo o sinal na expressão e teremos de somar
valores dependendo da situação. A seguir iremos apresentar explicações para melhor esclarecer estas duas
condições.
Contribuições adicionadas
Imagine que todas as Abs sejam positivas contribuindo para o sinal da AbsTotal .

Figura 2 - Gráfico mostrando as contribuições individuais para absorção total.

Em uma análise de uma amostra real em contraste com os padrões o branco irá compensar apenas os
efeitos de refração e reflexão do solvente e da cubeta e dos reagentes adicionados. Neste caso, os
interferentes que podem alterar as condições experimentais são desconhecidos e seus efeitos não podem ser
previstos e neutralizados no branco. Em uma situação como esta em que os interferentes alteram a absorção
real iremos ter uma absorção referente aos interferentes que absorvem naquele comprimento de onda, mas
teremos também uma componente referente aos interferentes que alteram os índice de refração e reflexão,
aumentando e por conseqüência aumentando as perdas de potência do feixe de luz. O que leva o
equipamento a registrar, equivocadamente, esta perda como aumento de Absorbância que identificamos na
figura 2. Como AbsRefr e AbsRefl .
Observe que nesta situação a absorção sempre será maior que o real e se não for feita a compensação pelo
uso do Branco Testemunha iremos incorrer em resultados maiores que o real.
A forma de conhecer estas contribuições é preparar o branco testemunha que tem por objetivo medir os
efeitos das contribuições da matriz da amostra sobre a absorção no comprimento de onda da análise e a
influencia sobre os índices de refração e reflexão do conjunto solvente e cubeta.
Contribuições subtraídas
Agora imagine uma situação onde o interferente presente em vez de aumentar o índice de refração e reflexão
o faça diminuir fazendo com que a potencia do feixe transmitido seja maior.

Figura 3 - Gráfico mostrando as contribuições individuais para absorção total.

Observe que na situação proposta na figura 1-??, embora os interferentes tenham um efeito de melhora nos
índices de refração e reflexão ele irá causar um processo de aumento da incerteza por não conhecermos seu
valor. De qualquer forma o valor deverá ser corrigido com base na absorção do branco testemunha.
Observe que se a AbsInterf for nula ou tiver valor menor que a AbsRefl + AbsRefr o sinal de absorbância irá ter um
sinal negativo (Figura 1-???).

Figura 4 - Gráfico mostrando as contribuições individuais para absorção total.


Neste caso devemos ter o cuidado de lembrar que a absorção negativa é fruto de um processo matemático,
pois houve uma mudança de referencial do zero quando zeramos o equipamento com o branco. Ou seja,
dizemos para maquina que aquele valor de perda de potencia é o zero. Só que ao introduzirmos uma amostra
esta pode ter substâncias que irão melhorar (diminuir a refração e reflexão) do caminho óptico aumentando a
luz transmitida e levando a uma interpretação de que a absorção é negativa em relação ao zero artificial.
Neste caso o branco testemunha é produzido não se adcionando o reagente que produz a cor. Se produz um
branco que terá uma absorbância que é constituído pelos efeitos relacionados absorbância de outras
espécies interferentes mais as alterações de refração do meio. Assim este branco pode ser descontado da
absorbância da amostra com cor obtendo o valor de absorbância devido apenas ao cromóforo.

OBJETIVO:

Determinar a concentração de Fe (II) em antianêmicos por espectrometria de absorção


molecular na região visível do espectro.

MATERIAIS E MÉTODOS:

- Materiais e reagentes:
Balões volumétricos de 500; 250 e 100 mL
Balões volumétricos de 50,00 mL
Béqueres de 250 mL
Pipeta volumétrica de 10,00 mL
Pipeta volumétrica de 1,0 mL
Ácido sulfúrico concentrado P.A
Ácido nítrico concentrado P.A.
Acetato de sódio P.A.
Sulfato ferroso amoniacal P.A. - ([Fe(NH4)2(SO4)2].6H2O)
Cloridrato de hidroxilamina P.A. (NH2OH.HCl)
1,10-fenantrolina P.A.
Água destilada.

- Instrumentos:
Espectrômetro de absorção no UV/VIS, marca Shimadzu, modelo UV 3600.
Procedimento:

Atenção :

• Para evitar contaminação, tomar o cuidado de usar uma pipeta para cada reagente que não
deve ser pipetado diretamente do frasco.

• Compare a vidraria da bancada com a descrita no roteiro. Caso não tenha veja se é possível
adaptar o procedimento.
• Devido ao tamanho desta prática a turma será dividida em três grupos:
1. Um grupo prepara curva analítica e o branco.
2. O segundo grupo prepara três soluções 2 e quatro soluções 6.
3. O terceiro grupo prepara três soluções 6 e quatro soluções 2.

Primeira Parte

Preparo dos reativos (Verifique quais soluções estão prontas)


1. Solução padrão de Fe2+: Pesar exatamente 0,7 g de sulfato ferroso amoniacal padrãoprimário
[Fe(NH4)2(SO4)2].6H2O e transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 500 mL. Acidificar com
gotas de ácido sulfúrico concentrado, dissolver e completar o volume com água deionizada. Nesta solução, 1
mL = 0,21mg de Fe(II).

2. Solução padrão diluída de Fe2+: Pipetar 10 mL de solução padrão de Fe2+ em um balão volumétrico de
100 mL e completar o volume com água deionizada. Nesta solução, 1 mL = 0,020 mg de Fe(II) ou 20,0 mg de
Fe(II)

3. Solução de cloridrato de hidroxilamina 5% (m/v): Dissolver 5 g de NH2OH.HCl em 100 mL de água


destilada.

4. Solução de acetato de sódio 2 mol L-1: Pesar cerca de 41 g de acetato de sódio anidro, transferir para
balão de 250 mL e completar o volume com água deionizada.

5. Solução a 0,25% (m/v) de 1,10-fenantrolina: Pesar 0,25 g de 1,10-fenantrolina, transferir para um balão
volumétrico de 100 mL. Adicionar cerca de 50 mL de água deionizada, 5 gotas de ácido nítrico concentrado,
agitar e completar o volume com água deionizada.

Confecção da curva analítica:

6. Numerar 6 balões volumétricos de 100 mL.


7. Adicionar nos balões de números 2, 3, 4, 5 e 6, os seguintes volumes de solução padrão de ferro contendo
21,0 g mL-1 de Fe (II) (solução 2), de acordo com a tabela 3.1:
8. Fazer as seguintes adições, em todos os balões, inclusive no branco, na ordem indicada:
Sol 3 - 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5% (m/v);
Sol 4 - 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
Sol 5 - 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina a 0,25% (m/v).
9. Completar os volumes dos 6 balões com água destilada. Homogeneizar as soluções.
10. Deixar as soluções em repouso por 10 minutos antes de fazer as leituras.
11. Escolher o comprimento de onda com a solução do balão de nº 3, fazendo uso da
solução do balão de nº 1 como branco. Fazer a varredura plotando o gráfico de Abs x
comprimento de onda na faixa de 400 a 600 nm. O comprimento de onda máximo de absorção é em torno de
510 nm.
12. Zerar o equipamento usando a solução 1 (branco) e medir as absorbâncias de todas as soluções usando
a solução do balão de nº 1 como branco.
13. Fazer a leitura da absorbância no espectrofotômetro, no comprimento de onda previamente selecionado e
faça o tratamento estatístico/matemático para curva de padronização externa
• Faça a regressão linear dos pontos ajustando como uma reta. Verifique se os resíduos estão
adequados.
• Calcule o erro da inclinação e do intercepto.
• Calcule a Análise de Variância da Regressão.
14. Calcular e registrar as concentrações das soluções na tabela 1 junto com as absorções medidas de cada
solução.

Tabela 1 - Dados da curva analítica.


Número Sol 2 (mL) Sol 3 Sol 4 Sol 5 Conc Absorção
Balão 20,0µg/mL) (mL) (mL) (mL) (µg/mL)
1 0,00 4,00 4,00 8,00
Branco
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
3 2,00 4,00 4,00 8,00
3 2,00 4,00 4,00 8,00
4 3,00 4,00 4,00 8,00
4 3,00 4,00 4,00 8,00
5 4,00 4,00 4,00 8,00
5 4,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00

15. Trate a curva analítica de padronização externa como feito na prática de padronização externa.
Carta de controle

Em varias situações de rotina uma mesma metodologia analítica pode ser usada por vários dias seguidos.
Nestes casos pode ser inviável o diminuir à produtividade se temos de fazer a curva analítica todos os dias.
Uma alternativa e a construção de curvas analíticas é a construção de cartas de controle. Estas cartas de
controle podem envolver o controle da curva analítica ou o controle do processo com amostras certificadas.

16. Neste experimento o objetivo é construir cartas de controle da curva analítica. Assim iremos construir
cartas de controle para o ponto superior e para o ponto inferior.
17. Repita em sete replicatas os pontos 2 e 6 é registre as concentrações e absorbâncias na tabela 2

Tabela 2 - Dados de replicatas dos pontos 2 e 6


Número Sol 2 (mL) Sol 3 Sol 4 Sol 5 Conc Absorção
Balão 20,0µg/mL) (mL) (mL) (mL) (µg/mL)
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
2 1,00 4,00 4,00 8,00
Média= --------------
Desvio padrão= --------------

6 5,00 4,00 4,00 8,00


6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
6 5,00 4,00 4,00 8,00
Média= --------------
Desvio padrão= --------------
Segunda Parte

Validação da curva analítica

18. Para validar a curva analítica temos de calcular os limites baseados nas medidas das replicatas das
concentrações da tabela 2.
19. Devemos também preparar uma solução do ponto 2 e uma solução do ponto 6 e o branco e fazer a leitura
no espectrômetro de UV/Vis.

Tabela 3 – Validação da curva analítica – Vol para balão de 100 mL.


Equação da Reg Lin. curva analítica obtida da tabela 1 =
Número Sol 2 (mL) Sol 3 Sol 4 Sol 5 Conc Absorção
Balão 20,0µg/mL) (mL) (mL) (mL) (µg/mL)
1 (branco) 0,00 4,00 4,00 8,00 -----------
2 1,00 4,00 4,00 8,00
Limite superior da variabilidade permitida Média + 3 x S =
Limite inferior da variabilidade permitida Média + 3 x S =
6 5,00 4,00 4,00 8,00
Limite superior da variabilidade permitida Média + 3 x S =
Limite inferior da variabilidade permitida Média + 3 x S =

20. Se a concentração obtida estiver dentro dos limites podemos usar a curva analítica caso contrário
devemos construir outra curva. Substitua na carta de controle.

Determinação da Concentração de Ferro em Medicamentos:

21. Os medicamentos anti-anemia apresentam três concentrações de sulfato ferroso:


• Se medicamento com 25 mg/mL de Fe(II);
• Se medicamento com 50 mg/mL de Fe(II));
• Se medicamento com 125 mg/mL de Fe(II));
• Se comprimido de 250 mg de de Fe(II), triture e dilua para 1 L em água e siga do item 16.
22. Olhe o rotulo do medicamento e execute a diluição apropriada que deve ser feito para que o medicamento
apresente a leitura dentro da faixa da curva analítica.
I. Se 25 mg mL-1 de FeSO4 dilua 100x. (1,0 ml 100 mL).
II. Se 50 mg mL-1de FeSO4 dilua 200x. (1,0 ml p/200 mL).
III. Se 125 mg mL-1de FeSO4 dilua 500x. (1,0 mL p/500 mL).
IV. Se comprimido use a solução preparada no item 14.
Com esta diluição os três concentrações diferentes vão para a mesma concentração em torno de 0,250
mg/mL de Fe(II).
23. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes:
• 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%;
• 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
• 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
24. Completar o volume com água destilada.
25. Deixar em repouso por 10 minutos.

Branco Testemunha

Em alguns medicamentos podemos ter cores devido a adição de corantes e outras substâncias componentes
da formulação ou mesmo substãncias que mudam o índice de refração e outros que poderam interferir no
resultado do ensaio. O chamado Branco Testemunha tem por objetivo corrigir estas interferências que são
características individuais de cada amostra.

26. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes:
• 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%;
• 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
• 0 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
27. Completar o volume com água destilada.
28. Deixar em repouso por 10 minutos.
29. Para fazer os cálculos corrija a absorbância da amostra descontando o valor da absdorbância do Branco
testemunha.

Amostra dopada

Para demonstrar que os ensaios estão sendo feitos de forma correta uma das formas é fazer a recuperação
de uma amostra dopada (Spike) de uma amostra. Neste caso se adiciona uma quantidade do padrão a uma
das amostra e calculamos o valor da recuperação do material adicionado.

30. Adicione 0,2 mL da amostra diluída (item 15) em um balão de 100 mL e adicionar os reagentes e 3 mL da
solução item 2 (20,0g/mL) e :
• 4 mL de solução aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%;
• 4 mL de solução aquosa de acetato de sódio 2 mol L-1;
• 8 mL de solução de 1,10-fenantrolina.
31. Completar o volume com água destilada.
32. Deixar em repouso por 10 minutos.
33. Para fazer os cálculos corrija a absorbância da amostra descontando o valor da absdorbância do Branco
testemunha.

Resultados

Anote os resultados na tabela abaixo

Tabela 4 – Análise das amostras – Vol para balão de 100 mL.


Número Sol 2 Sol 3 Sol 4 (mL) Sol 5 (mL) Conc Absorção
Balão (mL) (mL) (µg/mL)
Branco 0,2 amostra 4,00 4,00 0,00
testemunha + 0 mL sol
2
amostra 0,2 amostra 4,00 4,00 8,00
+ 0 mL sol
2
Abs AMOSTRA – Abs Branco Testemunha
Amostra 0,2 amostra 4,00 4,00 8,00
dopada +3mL sol
item 2
Abs AMOSTRA DOPADA – Abs Branco Testemunha
Absorção Recuperação (Experado ao ponto 4) =

34. Trate a curva analítica de padronização externa como feito na prática de padronização externa.
35. Antes de calcular as concentrações da amostra e da recuperação desconte o valor do Branco testemunha
dos valores de absorção da amostra e da recuperação.
36. Calcule a concentração da amostra diluída e o erro da medida considerando a incerteza da curva
analítica.
37. Calcule a concentração da amostra e dopada com Fe(II) diluída e o erro da medida considerando a
incerteza da curva analítica.
38. Calcule a concentração da recuperação diluída e o erro da medida considerando a
incerteza da curva analítica.
• Desconte o valor de concentração encontrado para amostra do valor encontrado da amostra dopada
Conc (recuperação) = Conc Am Dopada – Conc Amostra
• Clacule a recuperação em %:
% recuperação = Conc (recuperação) x 100 / Valor dopado*
*Valor dopado é a conc do ponto 3 da curva.

39. Calcular o resultado em mg de ferro por mL de medicamento.


40. Calcule o error relativo considerando o valor obtido como verdadeiro.
41. Discuta a recuperação e que garantias de qualidade ela representa.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5a Ed. Bookman
Companhia, 2002.
SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a Edição,
São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
Tutorial de tratamento de Dados
Aula experimental

Determinação da concentração de Fe(II) por espectrometria de absorção


no visível

Dados experimentais:
Figura 1-Tabela de dados do experimento
Número Balão Sol 2 (mL) Sol 3 (mL) Sol 4 (mL) Sol 5 Volume do Conc Absorção
20,0 g/mL) (mL) balão (mL) (g/mL)
1 (Branco) 0 4,00 4,00 8,00 100,00 0,000 0,012
2 1 4,00 4,00 8,00 100,00 0,200 0,073
2 1 4,00 4,00 8,00 100,00 0,200 0,064
3 2 4,00 4,00 8,00 100,00 0,400 0,123
3 2 4,00 4,00 8,00 100,00 0,400 0,134
4 3 4,00 4,00 8,00 100,00 0,600 0,201
4 3 4,00 4,00 8,00 100,00 0,600 0,189
5 4 4,00 4,00 8,00 100,00 0,800 0,256
5 4 4,00 4,00 8,00 100,00 0,800 0,267
6 5 4,00 4,00 8,00 100,00 1,000 0,332
6 5 4,00 4,00 8,00 100,00 1,000 0,335

Com os dados experimentais da tabela 1 foi possível construir a curva analítica (Figura2):

Figura 2-Gráfico dos dados do experimento e a regressão linear.

Onde obtemos da regressão linear a curva y = 0,325x + 0,003.

A partir da equação podemos fazer a curva de resíduos Figura 3.

Figura 3 -Tabela com dados de Abs teórica obtida da equação da regressão linear obtida da figura 2.
Conc Absorção Abs Resíduos
Fe(µg/mL) teórica
0,00 0,012 0,002 0,010
0,20 0,073 0,068 0,005
0,20 0,064 0,068 -0,004
0,40 0,123 0,134 -0,011
0,40 0,134 0,134 0,000
0,60 0,201 0,199 0,002
0,60 0,189 0,199 -0,010
0,80 0,256 0,265 -0,009
0,80 0,267 0,265 0,002
1,00 0,332 0,331 0,001
1,00 0,335 0,331 0,004

Na figura 4 temos o gráfico de concentração de Fe x resíduo onde podemos observar os pontos máximos de
0; 0,012 e mínimo de 0,40; -0,011.

Figura 4 – Grafico de resíduos de Abs x Concentração de Fe.

Teste Q
Os dois pontos extremos foram testados usando o teste Q para demonstrar que estão consistentes com a
variabilidade do conjunto de dados e que não são pontos anômalos.
A faixa é dada de f= 0,010-(-0,011) = 0,021
• O ponto P 0,00; 0,010 apresenta como ponto mais próximo o ponto 0,20; 0,05 e e portanto a equação:

Q calculado = Pduvidoso - Ppróximo = 0,010 -0,05 = 0,2380 com N = 11


Faixa 0,021

O Q Tabelado = 0,708 para N=11 em um nível de confiança de 95%.


Assim podemos afirmar que estatisticamente o valor deve permanecer no conjunto sem ser excluído.
• O ponto P 0,40; -0,011 apresenta como ponto mais próximo o ponto 0,20; 0,05 e e portanto a
equação:

Q calculado = Pduvidoso - Ppróximo = -0,011 –(-0,010) = 0,04762 com N = 11


Faixa 0,021

O Q Tabelado = 0,708 para N=11 em um nível de confiança de 95%.


Assim podemos afirmar que estatisticamente o valor deve permanecer no conjunto sem ser excluído.

Análise de Variância (ANOVA)


Para realizar a ANOVA usaremos o programa ProjLin da Excel. O resultado esta na Figura 5.
Figura 5 – Tabela contendo os dados retornados do programa Excel função Proj.Lin
a= 0,3250 B= 0,0033
S a= 0,0066 S b= 0,0042
R= 0,996 S r= 0,00701
F calc= 2423 GL= 9
SMQ SMQ
reg= 0,119 res= 0,00044
GL= (11-6=)5 GL= (6-1=)5

Na análise da variância apresentou resultados que demonstram que o modelo é adequado.


O Valor de F calculado foi de 2423 e tem GL do numerador de 5 (N-I e 11 – 6 = 5) e do denominador de 5 (I-
1e 6-1=5). Na tabela de teste F5,5 com 95% de confiança tem valor de 5,05 que multiplicado por 10x fica 50,5
que é um valor muito menor que o F calculado.
O desvio da inclinação é 2,0% do valor da inclinação demonstrando a boa correlação do modelo.
O desvio do intercepto e de 126% o valor do intercepto o que mostra que a intercepto pode ser considerado
como zero.
O Coeficiente de correlação é 0,996 que é próximo de 1. O desvio de de R mostra um valor de 0,7%
indicando uma baixa contribuição da incerteza da curva analítica para a incerteza da concentração da
amostra. Isto ocorre devido ao Sr ser usado no calculo da incerteza como mostrado na Figura 6.
Figura 6 – Formula do desvio padrão da concentração da amostra levando em conta a contribuição da
incerteza da curva.

Carta de Controle
O uso de cartas de controle é útil quando temos de fazer análises de rotina onde seria necessário a
construção de curvas de calibração a cada dia.
Aqui repetimos o ensaio de dois pontos da curva analítica, ponto 2 e ponto 6 que são o menor ponto da curva
e o maior desta forma controlamos a estabilidade da curva analítica ao longo do tempo. No experimento o
tempo foi de uma semana entre a produção da curva e a análise.
Os dados para produção da curva estão na Figura 7.
Ponto inferior da carta de controle
Figura 7 – Dados utilizados para construção da curva de calibração
0,20 conc conc
Abs µg de Fe/mL µg de Fe/mL
Ponto 2 Média s
1 0,066 0,193 0,187 0,187
2 0,074 0,218
3 0,058 0,168
4 0,071 0,208
5 0,062 0,181
6 0,057 0,165
7 0,061 0,178

Assim os limites são:


s 2s 3s -s -2s -3s
0,207 0,227 0,247 0,167 0,147 0,128
Destes dados podemos construir a carta de controle que é um gráfico dos pontos experimentais onde a média
é o linha central e as linhas verde, amarela e vermelha são os limites de s, 2s (limite de alerta) e 3s (limite de
controle) Figura 8.

Figura 8 – Carta de controle da curva analítica – Ponto inferior.

O mesmo é feito para o ponto superior, Figura 8.


Ponto superior da carta de controle
Figura 9 – Dados utilizados para construção da curva de calibração
1,00 µg de Fe/mL conc
Abs conc µg de Fe/mL
Ponto 6 Média s
1 0,324 0,987 1,016 0,018
2 0,335 1,021
3 0,328 0,999
4 0,341 1,039
5 0,332 1,012
6 0,337 1,027
7 0,337 1,027

Assim os limites são:


s 2s 3s -s -2s -3s
1,034 1,052 1,070 0,998 0,980 0,962

Destes dados podemos construir a carta de controle que é um gráfico dos pontos experimentais onde a média
é o linha central e as linhas verde, amarela e vermelha são os limites de s, 2s (limite de alerta) e 3s (limite de
controle) Figura 10.
Figura 10 – Carta de controle da curva analítica – Ponto superior

.
Uso das Cartas de Controle
Assim podemos ter duas situações onde as medidas podem estar sob controle ou não.
Figura 11 – Dados de controle da curva após uma semana.
Conc de Fe Situação de controle Situação fora de controle
Conc Teórica Abs Conc calculada Abs Conc calculada
Pontos ug/mL ug/mL ug/mL
1 0,000 0,001 -0,0070 0,001 -0,0070
2 0,200 0,066 0,1930 0,025 0,0668
6 1,000 0,342 1,0423 0,367 1,1192

Para exemplificar vamos fazer o processo com o ponto inferior.


Suponhamos que a leitura do ponto 2 nos dias subseqüentes sejam as apresentadas na tabela 11 e que os
dados do ponto 2 na situação de controle e fora de controle sejam inserindo na carta de controle temos a
Figura 12.

Figura 11 – Carta de controle da curva analítica – Ponto inferior – com os dados de amostras nos dias
subseqüentes a construção da curva.

• Na situação onde o processo se encontra sobre controle este é demonstrado pelo ponto testado esta
dentro dos limites de ±3s.
• Na situação onde o processo se encontra fora de controle este é demonstrado pelo ponto testado esta
dentro dos limites de ±3s. Neste caso a análise não pode continuar e problema deve ser resolvido. A
primeira ação é refazer a solução do ponto dois e repetir o ensaio. Caso o resultado se confirme,
podemos ir mudando partes do processo até encontrar a origem da alteração. Refazer solução por
solução, trocar vidrarias e equipamentos usados.

A mesma situação pode ser exemplificada para o ponto 6 na Figura 12.


Figura 12 – Carta de controle da curva analítica – Ponto superior– com os dados de amostras nos dias
subseqüentes a construção da curva.

A carta de controle demonstra que a curva construída ainda responde nos mesmos termos da época em que
foi preparada e portanto pode ser utilizada.
Análise das amostras
Os dados das amostras estão na Figura 13.
Figura 13 – Dados das amostras
Conc de Fe
Amostra Abs Abs corrigida calculada
µg/mL
Branco
testemunha 0,025
amostra 0,125 0,100 0,2976
Amostra dopada 0,275 0,250 0,7592

Observem na Figura 13 que antes do calculo da concentração de de Fe nas amostras devemos descontar o
valor da absorção do branco testemunha para eliminar as absorções referentes as interferências presentes na
amostra. Assim temos o como resultado uma concentração de 0,2976 µg/mL e da amostra dopada de 0,7592
µg/mL. A amostra dopada foi produzida pela adição de 3,00 mL da solução do item 2 o que deveria levar a
uma adição de 0,600 µg/mL de Fe na solução. Se descontarmos este valor do valor de concentração da
amostra teremos o valor recuperado sendo 0,462 µg/mL. O que corresponde a uma recuperação de 76,9%.
Existem situações onde a amostra tem um nível de interferentes que varia e não pode ser feito pelo ajuste de
matriz onde esta prática de branco testemunha é necessária.
Alem disto, existem casos onde uma amostra de referencia (que pode ser adquirida de órgãos certificadores
ou produzida pelo próprio laboratório) são analisadas junto com a amostra para controlar o processo de
preparo das amostras que é diferente do preparo dos padrões para produção da curva. Nestes casos uma
terceira carta com os resultados da amostra de referencia deve ser construída.
Existe casos em que a amostra não estável, e portanto não existe amostra certificada, nestes casos,
podemos fazer a recuperação como o apresentado e produzir uma carata de controle da recuperação.
Para achar a concentração da amostra devemos compensaras diluições da amostra. Como a concentração
foi de 0,2976 µg/mL e a solução veio de um balão de 50 mL temos uma massa de 14,88 µg que vieram de 0,1
mL de uma solução preparada em um balão de 50 mL. Assim a massa de Fe no balão é 14,88 x 50/0,1 =
7440 µg ou 7,44 mg. Este balão foi preparado pela diluição de 12,5 mL da solução preparada do comprimido
em um balão de 50 mL. Assim a massa de Fe no balão é 7,44 x 100 / 12,5 = 59,52 mg de Fe no comprimido.
Observe que a recuperação do método foi de 76,9 podemos corrigir a massa: 59,52 x 100 /76,9 = 77,4 mg
sendo que o esperado era de 92 mg,
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Roteiro da Aula Experimental

Dosagem de Ácido Acetilsalicílico (AAS) em medicamentos por potenciometria indireta

Dosagem de Ácido Acetilsalicílico (AAS) em medicamentos por potenciometria indireta

INTRODUÇÃO:

Varias substâncias usadas comercialmente tem funções ácido ou base e podem ser dosadas indiretamente
pela titulação ácido-base. Muitas substâncias são ácidos e bases fracas, o que dificulta a titulação com o uso
de indicadores. Uma forma de dosá-las é a titulação potenciométrica indireta (neutralização). Como exemplo,
tem-se a titulação do ácido acetilsalicílico (AAS), massa molecular 180,157 g/mol, por medidas
potenciométricas. Para tal, é usado um eletrodo sensível ao pH, eletrodo de vidro, e os dados são
convenientemente tratados para obtenção do ponto final da titulação. Esta metodologia de determinação do
ponto final de uma titulação é mais exata que o uso de indicadores que promovem a mudança de cor da
solução, quando o ponto final da reação é atingido.

A estrutura do AAS possui um grupo ácido de modo que a sua titulação com
o NaOH irá resultar na seguinte reação:

NaOH + H-AAS → Na- AAS + H2O

Sendo a reação 1:1.

Estrutura do AAS

OBJETIVOS:

Determinar o teor de ácido acetilsalicílico em medicamentos, por dosagem indireta da concentração


hidrogeniônica da solução, usando a técnica de titulação potenciométrica.

MATERIAIS E MÉTODOS:

- Materiais e reagentes:

Béqueres de 250 mL
Barra magnética
Grau e pistilo
Bureta de 50 mL
Suporte universal
Solução de NaOH 0,100 mol L-1 padronizada ( para comprimido com AAS adulto)
Solução de NaOH 0,020 mol L-1 padronizada ( para comprimido com AAS infantíl)

Etanol P.A

- Instrumentos:

pHmetro Agitador magnético

- Procedimento:

Preparo da amostra

1. Com base no comprimido usado estime o volume de NaOH 0,100 mol/L que será gasto na
titulação.
2. Pesar um comprimido de AAS (infantil), transferir para um gral e triturá-lo com o auxílio de um
pistilo.
3. Transferir a amostra quantitativamente para um béquer, adicionar 50 mL de etanol e agitar para
dissolver.
4. Adicionar 150 mL de água destilada e uma barra de agitação magnética.

Calibração do pHmetro

5. Ligar o pHmetro apertando e segurando a tecla L.


6. Em seguida selecionar a função pH apertando a tecla B.
7. Selecionar a função de calibração apertando a tecla B.
8. Retirar o eletrodo de pH da solução de descanso (KCl), lavar o eletrodo com água destilada
quando for solicitado, enxugá-lo e inserir o eletrodo no tampão pH=7 e confirmar apertando a tecla
B.
9. Lavar o eletrodo com água destilada quando for solicitado, enxugá-lo e inserir o eletrodo no
tampão pH=4. Confirmar apertando a tecla B.
10. Apertar a tecla B da opção de não calibrar com o tampão pH=10.
11. Transferir o eletrodo para solução de espera (KCl). Apertar a tecla B e em seguida apertar a tecla
A da opção de espera (SBY).

Montagem da titulação

12. Lavar o eletrodo e colocá-lo imerso na solução a ser


titulada.
13. Monte o pHmetro dentro do béquer com solução a ser
titulada em cima do agitador magnético e coloque a bureta
com NaOH ao lado de modo que possa se adicionar
volumes de NaON no béquer da amostra.
14. Ligar o agitador com cuidado para que a barra magnética
não o toque.
15. Esquema da montagem abaixo.
Titulação da amostra

16. Anotar o pH da solução indicado pelo pHmetro antes da adição de NaOH.


17. Colocar a solução padrão de NaOH 0,1 moll/L (ou 0,02 mol/L) em uma bureta de 50 mL, sem
esquecer de anotar a concentração.
18. Adicionar 1 mL de solução de NaOH ao béquer, anotar o volume adicionado e o pH.
19. Repita o item 18 até 1 mL antes do volume calculado no item 1.
20. Passe a adicionar o NaOH em volumes de 0,1 em 0,1 mL até que o pH atinja valores de pH
superiores a 10.
21. Construir os gráficos de pH x V (mL); ∆pH x V (mL) e ∆2pH x V (mL).
22. Calcular a massa de AAS no comprimido, utilizando as médias dos pontos de equivalência
encontrados.

Volume pH Volume pH Volume pH Volume pH


mL mL mL mL

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1. SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5a Ed.Bookman
Companhia, 2002. 836 p.
2. TICIANELLI, E.; GONZALEZ, E.R. Eletroquímica. São Paulo: Edusp. 1998. 224 p.
3. SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química Analítica. 8a
Edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
Tratamento dos dados do experimento:

Dosagem de Ácido Acetilsalicílico (AAS) em medicamentos por potenciometria indireta

Tutorial de tratamento de dados do experimento de de


determinação potenciométrica da concentração de AAS

O primeiro passo é construir a curva de volume de NaOH x pH e definir a região do ponto de equivalência.
Delta Delta pH 32,5 10,98
volume pH pH ^2 32,7 10,99
0 3,14
5 3,59
7 3,73
9 3,85
11 3,97
13 4,08
15 4,19
17 4,31
19 4,43
21 4,58
23 4,73
25 5,01
27 5,5
29 7,37
29,1 7,4
29,2 7,49 0,09
29,3 7,57 0,08 -0,01
29,4 7,65 0,08 0,00
29,5 7,74 0,09 0,01
29,7 7,85
29,8 7,97 0,12 0,12
29,9 8,13 0,16 0,04
30,0 8,2 0,07 -0,09
30,1 8,48 0,28 0,21
30,2 8,55 0,07 -0,21
30,3 8,9 0,35 0,28
30,4 9,44 0,54 0,19
30,5 9,91 0,47 -0,07
30,6 10,01 0,10 -0,37
30,7 10,2 0,19 0,09
30,9 10,34
31,0 10,44 0,10 0,10
31,1 10,47 0,03 -0,07
31,2 10,55 0,08 0,05
31,3 10,61
31,4 10,67
31,5 10,73
31,7 10,76
31,8 10,8
31,9 10,84
32 10,88
32,1 10,92
32,3 10,95
32,4 10,97
Podemos observar que a região entre 30 e 31 mL contem o ponto de inflexão.
Ampliando temos:

Podemos então tratar estes dados.

Tabela

volume pH Delta pH Delta pH ^2


30,2 8,55 0,07 -0,21
30,3 8,9 0,35 0,28
30,4 9,44 0,54 0,19
30,5 9,91 0,47 -0,07
30,6 10,01 0,10 -0,37

ntando o gráfico de Volume de NaOH x delta pH temos


E temos um refinamento da região e já podemos inferir que a viragem esta em tornode 30,4
mL.

Então podemos montar o gráfico de Volume de NaOH x delta^2 pH temos

Observe que o primeiro ponto esta discrepante do conjunto. Assim podemos eliminá-lo e
construir o gráfico p apenas com o 4 últimos pontos.
Obtendo um reta temos o valor do volume no ponto de equivalência fazendo y = 0. Assim
o V pe = 67,30/2,21 = 30,45 mL de NaOH

A partir deste ponto temos o Volume e o calculo é o mesmo de uma titulação.


Volume naOH= 30,45 mL

Conc NaOH = 0,0983 mol/L (rotulo do frasco de NaOH obtido pela


padronização com biftalato de potássio
(prática de Química analítica Experimental)

nº Mol= Volume x Conc


nº Mol= 0,002993 mol

MM AAS= 180,14 g/mol

mAAS = MM AAS x nº Mol


m AAS= 0,539245 g
ou 539,2454 mg de AAS
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Roteiro de aula prática

AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA NA SEPARAÇÃO DE


ALCOÓIS VOLÁTEIS

INTRODUÇÃO

Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada são separados em


conseqüência de sua partição entre a fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida ou
sólida contida dentro da coluna. Na separação por cromatografia gasosa, a amostra é
vaporizada e injetada na cabeça da coluna cromatográfica e a eluição é feita por um fluxo
defase móvel gasosa inerte que não interage com as moléculas do analito, sua função é
transportar os componentes da mistura através da coluna. Por isto é comum em
cromatografia gasosa a fase móvel ser chamada de gás de arraste.
A cromatografia gasosa é separada em cromatografia gás-líquido e gás-sólido. Atualmente,
a mais utilizada é a gás-líquido com colunas capilares. Estas colunas são revestidas com
polímeros que são ligados quimicamente à superfície interna do tubo de sílica fundida e as
mais resistentes ainda possuem ligações cruzadas entres cadeias poliméricas.
A injeção de amostras com água não é comum devido a vários inconvenientes, entre eles:
as colunas cromatográficas não são muito resistentes quimicamente à água; a água ao
vaporizar ocupa um volume bem maior que solventes orgânicos, o que pode levar a perda
de sensibilidade e problemas na eficiência da cromatografia e pode causar problemas aos
detectores mais simples como alteração na linha de base ou mais sérios como desgaste
acelerado de partes destes como no detector de fósforo e nitrogênio e no de massas. No
detector por ionização de chama (DIC ou FID), se o volume de vapor de água for levado à
chama, esta pode apagar.
A eficiência das colunas pode ser calculada em função de um composto. Para tal, calculo
valores de medidas experimentais retirados de um pico cromatográfico é necessário.

Determinação experimental do Numero de pratos teóricos

O numero de pratos teóricos (N) pode ser calculado pela formula:

Onde tR é o tempo de retenção do composto e W é a largura da base do pico. A unidade de


tR e W tem de ter o mesma unidade de tempo. Estes parâmetros podem ser obtidos do
cromatograma de forma experimental como mostrado na figura abaixo:

Observe que o pico não é simétrico na maioria das vezes sendo necessário fazer um
triangulo para retirar os valores.

Resolução entre picos

A resolução (R) é um parâmetro de eficiência que pode ser obtido experimentamente entre
dois picos de compostos. A resolução reflete a eficiência de separação de dois compostos.
Ela pode ser calculada pela formula:
Onde tRA e tRB são os tempos de retenção dos dois compostos e W A e WB a largura obtida
experimentalmente.
Estes parâmetros podem ser obtidos do cromatograma de forma experimental como
mostrado na figura abaixo:

Calculo do Fator de Assimetria

O fator de assimetria (As) é um parâmetro que mostra se o formato do pico é adequado e


reflete se a eficiência cromatográfica esta maximizada.
Os picos cromatográficos podem apresentar distorções como mostrado na figura abaixo:

Diferentes formas de picos cromatográficos. (A) Pico gaussiano ideal, (B) Pico com cauda,
(C) Pico com cauda severa, (D) Pico alargado, (E) Pico com fronte, e (F) Conjunto de picos
com ombro.
Para se calcular o fator de assimetria dividisse o pico ao meio a partir do máximo do sinal.
Na base ou a uma altura fixa (normalmente 10% da altura) é obtido os valores do meio a
linha lateral (figura abaixo). Os segmentos A e B podem então ser divididos B/A. Assim os
valores maiores que 1 indicam aparecimento de calda e menores que um deformação
frontal. Na prática é difícil obter um pico perfeito assim valores entre 0,8 e 1,2 são
considerados satisfatório sem a presença de caldas.

Representação de um pico cromatográfico genérico, ilustrando os parâmetros empregados


para cálculo do fator de assimetria

OBJETIVOS

Observar os efeitos que a temperatura da coluna cromatográfica e variações na vazão do


gás de arraste exercem sobre a eficiência de separação na cromatografia gasosa.

MATERIAIS E MÉTODOS

- Materiais e reagentes
- Metanol
- Isopropanol
- Etanol
- Mistura metanol, isopropanol e etanol 1:1:1
- Seringa cromatográfica de 10 µL
- Balão volumétrico de 25 mL

PROCEDIMENTO

Condições cromatográficas:
• Injetor a 210°C em modo split de 1:60
• Coluna cromatográfica fase de polietilenoglicol de 30 m x 0,25 mm id x 0,25 µm de
filme
• Gás de arraste Hélio
• Detector por ionização em chama a 230°C
• Temperatura da coluna – ver condições abaixo
• Vazão da coluna – ver condições abaixo

Com o cromatógrafo ajustado nas condições cromatográficas descritas acima, injetar 2 µL


do vapor do headspace de uma mistura de metanol, isopropanol e etanol obtidos por
agitação de 5 mL da mistura em um frasco com barra magnética agitado por 10 min. Na
cormátografia é variando somente os parâmetros de vazão do gás de arraste da coluna
(fase móvel) e a temperatura do forno, conforme especificação dos cromatogramas 1 a 5.

Cromatograma 1 - Vazão da coluna de 0,5 mL min-1 de He e forno do cromatógrafo em


isoterma a 40°C.

Cromatograma 2 - Vazão da coluna de 1,0 mL min-1 de He e forno do cromatógrafo em


isoterma a 40°C.

Cromatograma 3 - Vazão da coluna de 1,5 mL min-1 de He e forno do cromatógrafo em


isoterma a 40°C.

Cromatograma 4 - Vazão da coluna de 1,0 mL min-1 de He e forno do cromatógrafo em


isoterma a 60°C.

Cromatograma 5 - Vazão da coluna de 1,0 mL min-1 de He e forno do cromatógrafo em


isoterma a 80°C.

Fazer a injeção de 2 µL do vapor de metanol na melhor condição de separação


cromatográfica obtida nos cromatogramas 1 a 5. Repetir o procedimento para o etanol e o
isopropanol.

Resultados a apresentar:
1. Través das três injeções individuais de metanol, etanol e isopropanol defina a ordem
de eluição dos três alcoóis.
2. Calcular a resolução entre os sinais de metanol e isopropanol e entre o isopropanol e
etanol para todos as 5 condições cromatográficas.
3. Calcular o número de pratos teóricos da coluna sobre cada uma das 5 condições,
usando os três compostos.
4. Calcular a simetria de pico para os três compostos nas três condições
cromatográficas.

Monte gráficos de comparação de cada parâmetro para as 5 condições e através dos


mesmos decida qual das condições é a mais adequada.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia. 1 ª ed.


Campinas: UNICAMP, 2006. 456 p.

SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5a Ed.
Bookman Companhia, 2002.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

Roteiro de aula prática

Determinação de BTEX por GC

INTRODUÇÃO

Compostos orgânicos voláteis são uma série de compostos que possuem, em geral,ponto
de ebulição abaixo de 200°C e alta pressão de vapor . O benzeno, o tolueno e os xilenos (o,
m e p) são conhecidos pela sigla BTX e são exemplos destes compostos. Esses compostos
têm grande importância, pois são importantes indicadores de contaminação ambiental por
derivados de petróleo.

Para a determinação da concentração destes compostos em amostras de água, eles devem


ser removidos para uma matriz adequada, pois a água é um líquido que causa problemas na
cromatografia gasosa, seja pela sua natureza incompatível com a maioria das colunas, seja
pelo volume de vapor formado, o que pode acarretar perda de sensibilidade e dependendo
do volume apagar a chama do detector por ionização em chama (DIC ou FID m inglês).
Várias são as técnicas de preparo de amostras que podem ser usadas para estes
compostos, mas duas delas se destacam: a extração tipo headspace (HS) e a microextração
em fase sólida (MEFS ou SPME em inglês).

A extração tipo headspace consiste em se lacrar um volume fixo da amostra em um frasco


deixando um volume de ar na superfície e alterar as condições de equilíbrio, para que os
compostos voláteis de interesse predominem na fase vapor. Com o auxilio de uma seringa
para gás, uma alíquota do vapor é retirada e transferida para o injetor do cromatógrafo a
gás.
Já a SPME consiste em expor uma fibra com um material adsorvente (polímero), que é
fixada no êmbolo de uma seringa que fica dentro da agulha, à amostra. Assim a fibra é
recolhida após os compostos de interesse sorverem na fibra na fase vapor e exposta no
injetor do cromatógrafo, onde os compostos são dessorvidos termicamente.

OBJETIVOS:

Determinar a concentração de BTX em amostras de água usando a microextração em fase


sólida e comparar o perfil de extração desta técnica com o obtido na extração através do
headspace.

MATERIAIS E MÉTODOS:

- Materiais e reagentes:

Seringa cromatográfica de 10 µL
Seringa de microextração em fase sólida (holder)
Seringa para injeção de gás (gastight)
Fibra de polidimetilsiloxano de 100 µm
Frascos de headspace
Septos de silicone faceados com teflon
Barra magnética compatível com o frasco de headspace
Suporte universal com garra
Metanol grau cromatográfico
Benzeno P.A.
Tolueno P.A.
o-Xileno P.A.
Cloreto de sódio seco em estufa a 200ºC por 4 h
Água Ultra Pura
Água contaminada com gasolina

- Instrumentos:

Agitador magnético com aquecimento


Balança analítica
Cronômetro
Cromatógrafo a gás com detectores por ionização em chama e condutividade térmica Perkin
Elmer Clarus 600 GC, com coluna de 30 m x 0,25 mm id x 0,25 µm de filme de
polidimetilsiloxano.

- Procedimento:

Preparo das soluções:

A. Solução estoque 10,00 g/L de BTX: Em um balão volumétrico de 25,0 mL, com
auxilio de uma micropipeta, pesar por volta de 250 mg (anotar a massa) de benzeno,
250 mg (anotar a massa) de tolueno, 250 mg (anotar a massa) de o-xileno e
completar o volume com metanol.
B. Solução estoque 100,0 mg/L de BTX: Pipetar 0,250 mL das soluções A para um
balão volumétrico de 25,0 mL e completar o volume com metanol.
C. Solução intermediária 4,000 mg/L: Pipetar 1,00 mL da solução estoque, transferir
para um balão volumétrico de 25,0 mL e completar o volume com metanol.
D. Solução saturada de NaCl: Pesar 36,5 g de NaCl, dissolver em água e transferir para
um balão volumétrico de 100 mL.

Extrações por microextração em fase sólida

Obs: Antes do uso da fibra de SPME, a mesma deve ser condicionada a uma temperatura e
tempo dependentes do seu recobrimento, conforme recomendação do fabricante.

As soluções são preparadas diretamente no frasco de headspace.

1. Programar o cromatógrafo a gás com as seguintes condições: Injetor a 250 °C em


modo splitless por 30 segundos, seguido de split 1:40 com He como gás de arraste e
vazão de 1 mL min-1. O forno deve iniciar a 70ºC e subir a uma taxa de aquecimento
de 10 ºC min-1 até 180 ºC. O detector por ionização em chama deve operar a 270
ºC.
2. Antes de iniciar as extrações das amostras, injetar 1,0 µL da solução intermediária
(solução E). Após o término da corrida cromatográfica, anotar os tempos de retenção
de cada um dos componentes.

Benzeno Tolueno 0-Xileno


Tr (min)

Branco

3. Adicionar a um frasco de headspace (com uma pipeta volumétrica ou automática


calibrada) 5,0 mL de amostra e 5,0 mL de solução saturada de NaCl.
4. Adicionar a barra magnética.
5. Adicionar 15 µL de metanol.
6. Colocar o frasco de headspace sobre o agitador magnético e introduzir a seringa de
microextração pelo septo do frasco. Expor a fibra e proceder à extração por 10
minutos (marcar o tempo com cronômetro).
7. Recolher a fibra e retirá-la do frasco de extração exatamente aos 10 minutos e
introduzi-la no injetor até o fim, acionar o cromatógrafo e empurrar o êmbolo da
seringa expondo a fibra. Após 5 minutos de corrida cromatográfica, recolher a fibra e
retirá-la do injetor. Esperar esfriar antes de proceder a uma nova extração.
8. Anotar as áreas dos sinais de cada componente no seu TR.

Benzeno Tolueno 0-Xileno


Tr (min)
Área do sinal

9. Adicionar a um frasco de headspace (com uma pipeta volumétrica ou automática


calibrada) 5,0 mL de amostra; 5,0 mL de solução saturada de NaCl; 5 µL da solução
estoque (solução E) mais 10 µL de metanol, antes da introdução da fibra de SPME.
10. Repetir os procedimentos dos itens 4 a 8.

Benzeno Tolueno 0-Xileno


Tr (min)
Área do sinal

11. Adicionar a um frasco de headspace (com uma pipeta volumétrica ou automática


calibrada) 5,0 mL de amostra; 5,0 mL de solução saturada de NaCl; 10 µL da
solução estoque (solução E) mais 5 µL de metanol, antes da introdução da fibra de
SPME.
12. Repetir os procedimentos dos itens 4 a 8.
Benzeno Tolueno 0-Xileno
Tr (min)
Área do sinal

13. Adicionar a um frasco de headspace (com uma pipeta volumétrica ou automática


calibrada) 5,0 mL de amostra; 5,0 mL de solução saturada de NaCl; 15 µL da
solução estoque (solução E) mais 0 µL de metanol, antes da introdução da fibra de
SPME.
14. Repetir os procedimentos dos itens 4 a 8.

Benzeno Tolueno 0-Xileno


Tr (min)
Área do sinal

Extração através do headspace

15. Adicionar a um frasco de headspace (com uma pipeta volumétrica ou automática


calibrada) 5,0 mL de amostra e 5,0 mL de solução saturada de NaCl.
16. Adicionar a barra magnética.
17. Adicionar 15 µL de metanol.
18. Colocar o frasco de headspace sobre o agitador magnético e proceder e agitar por
10 minutos (marcar o tempo com cronômetro).
19. Decorrido este tempo, coletar 500 µL de vapor do headspace do frasco com uma
seringa gastight e injetar no cromatógrafo a gás.
20. Anotar as áreas dos sinais de cada componente no seu TR.
Benzeno Tolueno 0-Xileno
Tr (min)
Área do sinal
21. Comparar o perfil cromatográfico obtido com aquele proveniente da microextração
em fase sólida obtido no item 3.
22. Construir as curvas analíticas de adição de padrão para cada composto e fazer o
tratamento matemático e quantificar a amostra.

Concentração Benzeno Concentração Tolueno Concentração Tolueno


mg/L Área do sinal mg/L Área do sinal mg/L Área do sinal

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. SKOOG, D.A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 6a


Ed. Porto Alegre: Bookman. 2009. 1055 p.
2. COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia. 1 ª ed.
Campinas: UNICAMP, 2006. 456 p.
3. SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química
Analítica. 8a Edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.
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CAMPUS ALTO PARAOPEBA – CAP

ANÁLISE INSTRUMENTAL EXPERIMENTAL APLICADA À ENGENHARIA DE


BIOPROCESSOS

Roteiro de aula prática

Determinação de cafeína em refrigerante


Usando método espectrofotométrico por absorção molecular na região do ultravioleta
e por cromatografia a gás

Professor: Vagner Fernandes Knupp

OURO BRANCO - MG
Versão 2016
Introdução

A espectroscopia e fotoespectrometria de absorção molecular podem ser aplica


também na região do ultra-violeta. Mas devemos tomar cuidados redobrados, pois
alem nesta região diversos grupos cromóforos apresentam absorção sendo uma
região muito suscetível a interferências espectrais.

A determinação da concentração de substâncias componentes de alimentos é de


fundamental importância na industria de alimentos, pois muitos aditivos alimentares
se consumidos em excesso podem causar problemas de saúde.

A cafeína – figura 1 - é um alcalóide muito consumido e OMS inclusive recomenda


seu consumo diário, mas ela também recomenda limites de consumo porque pode
gerar malefícios se consumida em excesso. O seu consumo esta relacionado a
produtos como o café e alguns chás, mas a presença em concentrações altas em
alguns refrigerantes pode implicar em desequilíbrio da dieta levando a problemas de
saúde.

Figura 1 – Formula estrutural da cafeína


Parte I
Objetivo

Determinar em refrigerante a concentração de cafeína presente usando absorção


fotoespectrométrica na região do ultra violeta. Este método é aplicável a
refrigerantes e refrescos que contenham cafeína (trimetilxantina), natural ou
adicionada, e baseia-se na extração com clorofórmio em meio alcalino e
determinação por espectrofotometria na região do ultravioleta.

Material

• balança analítica,
• funil de filtração,
• algodão hidrófilo,
• funil de separação de 250 mL,
• béquer de 100 mL,
• pipeta graduada de 1,0 mL ; 5,00 mL e 10,00 mL,
• proveta de 50 mL e 10 mL,
• 1 balão volumétrico de 100,00 mL,
• Espátula,

Reagentes

A. Clorofórmio, grau espectrofotométrico


B. Solução redutora – Pese 5 g de sulfito de sódio e 5 g de tiocianato de
potássio, dissolva em água e dilua a 10 mL em balão volumétrico.
C. Solução de hidróxido de sódio a 25% m/v
D. Solução de permanganato de potássio a 1,5% m/v
E. Solução de ácido fosfórico -- Dilua 15 mL de ácido fosfórico (d=1,69g/cm3) em
85 mL de água
F. Sulfato de sódio anidro
Procedimento

Eliminação do gás do refrigerante.


1. Adicione aproximadamente 100,00 mL da amostra em um béquer de 250 mL.
2. Aqueça até que a amostra entre em ebulição e perca todo gás carbônico
dissolvido nela (5 a 10 min de fervura).
3. Pipete de 50,00 mL da amostra desgaseificada para um funil de separação.
4. Junte 10 mL da solução de permanganato de potássio a 1,5 % e agite.
5. Após 5 minutos, junte 20 mL da solução redutora com agitação contínua.
6. Adicione 2 mL da solução de ácido fosfórico e agite.
7. Adicione 2 mL da solução de hidróxido de sódio a 25 % e agite.
Repita extração três vezes.
8. Extraia a cafeína com de 20 mL de clorofórmio e agite vigorosamente por 10
segundos, inverta o funil e abra a torneira para aliviar a pressão. Repita até
que não haja mais pressão. Agite por um minuto vigorosamente. E deixe em
repouso no suporte até a separação das fases.
9. Após a separação a fração orgânica estará na parte inferior. Transfira a fração
orgânica para um funil com sulfato de sódio anidro recobrindo um chumaço de
algodão e recolha os filtrados em um mesmo balão volumétrico de 100 mL.
10. Repita a extração (item 8 e 9) e recolha o extrato no mesmo balão.
11. Lave a haste do funil de separação e o filtro com porções de 2 mL de
clorofórmio, após cada extração.
12. Complete o volume com clorofórmio.
13. Transfira para um frasco âmbar e reserve até a análise no instrumento.
Parte II

Objetivos

• Determinar em refrigerante a concentração de cafeína (e o desvio absoluto da


medida) presente usando absorção fotoespectrométrica na região do ultra
violeta. Este método é aplicável a refrigerantes e refrescos que contenham
cafeína (trimetilxantina), natural ou adicionada, e baseia-se na extração com
clorofórmio em meio alcalino e determinação por espectrofotometria na região
do ultravioleta.

• Determinar em refrigerante a concentração de cafeína (e o desvio absoluto da


medida) presente usando cromatografia gasosa. Este método é aplicável a
refrigerantes e refrescos que contenham cafeína (trimetilxantina), natural ou
adicionada, e baseia-se na extração com clorofórmio em meio alcalino e
determinação por GC/FID.

• Comparação entre os desvios a fim de determinar qual dos métodos


instrumentais apresenta menor desvio da medida.

Material

• Espectrofotômetro UV/VIS,
• Cubeta de quartzo de 5 cm,
• Cromatografo á gás

• béquer de 100 mL,


• 11 balões volumétricos de 25,00 mL e
• micro pipeta de 100 a 1000 µL.
• micro pipeta de 10 a 100 µL.
• proveta de 50 mL e

Reagentes
A. Cafeína com pureza mínima de 99%.
B. Clorofórmio, grau espectrofotométrico
C. Solução-padrão de cafeína – Pese 100 mg de cafeína, dissolva e dilua em
clorofórmio num balão volumétrico de 100 mL – Solução 1 mg/mL ou 100
mg/100mL ou 1000 mg/L.
D. Pipete 10 mL da solução-estoque de cafeína e dilua a 100 mL com clorofórmio
– solução 0,1 mg/mL ou 10 mg/100 mL ou 100 mg/L.

Procedimento

• Pipete 0,10(3x); 0,20; 0,25; 0,50; 0,75 e 1;00(3x) mL da solução-padrão de


cafeína (D) para balões volumétricos de 25,00 mL e complete o volume com
clorofórmio. As concentrações estão registradas na tabela 1.

Análise no espectrofotometro

• Usando a solução feita com 6 mL de cafeína faça a varredura de 200 a 350


nm e verifique se o máximo de absorção ocorre em 276 nm.
• Determine a absorbância a 276 nm, usando clorofórmio como branco e faça
os registros na tabela 1.
• Trace a curva padrão, registrando os valores de absorbância nas ordenadas e
as concentrações de cafeína em mg/100 mL de clorofórmio nas abcissas.

Análise cromatográfica

• Injete 3,0 µL da das amostras no cromatografo nas seguintes condições:


Cromatografo com injetor a 290ºC em splitless/ 0,5 min seguido split 1:15
voltando a fechar o split em 2 min. A coluna usada tem fase
100%polidimetilsiloxano de 30 m x 0,25mm id x 0,25 µm de filme e fluxo de
He de 3,0 mL/min com o forno iniciando a temperatura em 200ºC (1 min) e
subindo a 25ºC/min até 250ºC e o deterctor por ionização de chama a 300ºC
(40 ml/min H2 e 400 mL/min de ar sintético).
• Registre as áreas integradas sobre o pico da cafeína na tabela 1.
Tabela 1 – Curva analítica
Número Volume solução Concentração Absorbância em Sinal Cromatografia a
padrão (mL) em µg/100mL 276nm / Abs gás / µV.s-1
0,00 (branco)
1 0,100 40
2 0,100 40
3 0,100 40
4 0,200 80
5 0,250 100
6 0,500 200
7 0,750 300
8 1,000 400
9 1,000 400
10 1,000 400
Amostra
(extrato)
Amostra
(diluída)

• Trace a curva analítica de padronização externa registrando os valores de


absorbância nas ordenadas e as concentrações de cafeína em µg/100 mL de
clorofórmio nas abcissas. Procure não eliminar pontos pelo teste q para que
os modelos tenham o mesmo grau de liberdade e possam ser comparados

Tratamento do extrato das amostras

• Faça a leitura da absorção diretamente.


• Caso o sinal seja maior que o sinal do maior ponto da curva e calcule a taxa
de diluição dividindo o resultado do sinal da amostra pelo sinal do ponto
médio da curva (ponto 5)
• O volume da amostra é calculado pela divisão do volume do balão (no caso
25mL) pela taxa de diluição calculada no item anterior. Arredonde a volume
para um valor que possa ser pipetado.
• Faça a diluição e leia no espectrofotômetro e no cromatografo novamente.
• Calcule a concentração de cafeína no extrato diluído e com os dados da
ANOVA calcule o desvio da medida devido a curva analítica para o método
cromatográfico e para o método espectrofotométrico e diga qual tem menor
impacto na medida.
• Calcule a concentração de cafeína na amostra levando em conta as diluições.

Referência Bibliográfica

• Método 470 - Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas. Métodos Físico-


Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital

• ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of


analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 962.13)
Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 29. p. 3.

• SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Química
Analítica. 8a Edição, São Paulo: Thomson, 2007. 999 p.

• HARRIS, D.C. Análise Química Quantitativa. 6ª edição, Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p.