UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas, catalizadores de los sistemas biológicos, son moléculas de gran interés que determinan la
pauta de las transformaciones químicas. También intervienen en la transformación de diferentes tipos
de energía. Las características más sobresalientes de las enzimas son su poder catalítico y
especificidad. Además, la actividad de muchas enzimas está regulada.

Casi todas las enzimas conocidas son proteínas. Sin embargo, el descubrimiento de que existen
moléculas de RNA catalíticamente activas indica que las proteínas no tienen un monopolio absoluto
como catalizadores. Las proteínas son una clase de macromoléculas que participan en forma muy
eficaz en las diversas reacciones químicas, debido a su capacidad para unirse específicamente a un
gran número de moléculas (Lehninger, et al, 2006). Utilizando el completo repertorio de fuerzas
intermoleculares, las enzimas acercan los substratos con una orientación óptima, siendo esto el
preludio para establecer o romper enlaces químicos.

Las enzimas tienen entonces un enorme poder catalítico, aceleran las reacciones multiplicando su
velocidad por un millón de veces e incluso más. De hecho, la mayoría de las reacciones en los
sistemas biológicos no tendrían lugar a velocidades perceptibles en ausencia de enzimas. Una reacción
tan sencilla como la hidratación del dióxido de carbono es permitida por una enzima denominada
anhidrasa carbónica. En su ausencia, la transferencia del CO 2 desde los tejidos a la sangre y desde ésta
al aire alveolar sería incompleta. La anhidrasa carbónica es una de las enzimas más rápidas que se
conocen. Cada molécula enzimática puede hidratar 10 5 moléculas de CO2 en un segundo. Esta reacción
catalizada es 107 veces más rápida que la misma reacción no catalizada.

Figura 1. Efecto de una enzima sobre una reacción.

MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS

La sustancia sobre la que actúa la enzima (como en el caso anterior, el ácido carbónico), se denomina
sustrato de la enzima. El sustrato se une a la enzima en una región concreta, llamada centro activo de
la molécula enzimática. A veces una enzima requiere para su función la presencia de otras sustancias
no proteicas, que colaboran en la catálisis: son los cofactores. Los cofactores pueden ser iones
inorgánicos (Ca++, Mg++, CI-, etc.) o moléculas orgánicas (coenzimas) (Lehninger, et al, 2006). Las
enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre
requiere un sustrato muy determinado. Así, una reacción de hidrólisis y otra de oxidación requerirán
enzimas diferentes, llamados respectivamente hidrolasas y oxidasas. Dentro de las reacciones de
hidrólisis, por ejemplo: el almidón y una proteína requerirán diferentes hidrolasas como una amilasa y
una proteasa respectivamente, puesto que se trata de sustratos diferentes.

En las reacciones espontáneas los productos finales tienen menos energía libre que los reactantes. Sin
embargo, el comienzo de la reacción requiere un aporte inicial de energía. Por ejemplo, la reacción
espontánea de combustión de un papel, requiere el aporte inicial de energía de una cerilla. Esta energía
inicial, que hay que suministrar a los reactantes para que la reacción transcurra, se llama energía de
activación.

Como es natural, cuanto menor es la energía de activación, menor es el obstáculo que tienen que
superar los reactantes para convertirse en productos finales, y más fácilmente transcurre la reacción.
La acción de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir esta energía de activación. Los
enzimas son catalizadores especialmente eficaces, por cuanto disminuyen la energía de activación
mucho más que los catalizadores inorgánicos. Por ejemplo, el agua oxigenada (H 202) se puede
descomponer, según la reacción:

H202 H20 + ½ 02

El proceso de descomposición anterior se puede llevar a cabo de tres maneras; (1) sin catalizador, (2)
con un catalizador inorgánico (platino) o (3) con un enzima específico (catalasa). Las respectivas
energías de activación son 18.000, 12.000 y 6.000 cal/mol. A partir de estos datos se puede calcular
que el platino acelera la reacción unas 20.000 veces, mientras que la catalasa lo hace unas 370.000.000
veces (Ver figura No.2).

Figura 2. Descomposición de la Catalasa.

Por lo dicho anteriormente se comprende el modo de actuación de los enzimas desde un punto de vista
energético. Consideremos ahora la explicación rnolecular de la catálisis enzimática. En primer lugar,
recordaremos que una reacción química requiere que las moléculas de los reactantes choquen con una
orientación y una energía adecuadas. La enzima actúa:

 Uniendo los reactantes (sustratos) a su centro activo de modo que quedan en la orientación
óptima para que la reacción tenga lugar.

 Modificando las propiedades químicas del sustrato, mediante la interacción de éste con el
centro activo, con lo que se debilitan los enlaces existentes y se facilita la formación de
enlaces nuevos.

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS

Las propiedades de los enzimas se derivan del hecho de ser proteínas y actuar como catalizadores.
Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las otras conformaciones posibles;
en general, los, cambios de conformación implican cambios en su actividad catalítica (Recuerde usted
lo catastrófico que pueda llegar a ser las mutaciones puntuales, que alteran la estructura proteica y por
consiguiente una vía metabólica).

 Sensibilidad al pH. Todas las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilo -COOH,
amino -NH2, hidroxilo -OH, tiol -SH) en las cadenas laterales de los aminoácidos que los
componen. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o
neutra, debido a que la conformación de las proteínas depende en parte de sus cargas eléctricas,
habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica (pH
óptimo). Así, por ejemplo, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo muy ácido (2,0), mientras que la
tripsina pancreática actúa mejor a pH moderadamente alcalino (7,8). Cambios importantes en el
pH pueden ocasionar la desnaturalización de la proteína.

Ahora bien, no todas las enzimas son igualmente sensibles a los cambios de pH. En el caso, de la
papaína (una peptidasa), la actividad enzimática apenas se modifica entre amplios márgenes de pH.
Sin embargo, la mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. En el ser humano
existe un complicado conjunto de mecanismos, para mantener el pH del medio extracelular en un valor
óptimo de 7,42. Desviaciones de unas pocas décimas, por encima o por debajo de este valor crítico,
pueden afectar de tal modo las actividades enzimáticas, que resulten incompatibles con la vida.

 Sensibilidad a la temperatura: En general, los aumentos de temperatura producen una

aceleración de las reacciones químicas: por cada 10º C de incremento, la velocidad de reacción se
duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, por tratarse
de proteínas, las enzimas sufren desnaturalización térmica a partir de una cierta temperatura. Así
pues, por encima de la llamada temperatura óptima, la desnaturalización compensa y sobrepasa el
aumento de la velocidad debido al incremento de temperatura y la actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse.
 Especificidad: Como se ha indicado antes, las enzimas catalizan reacciones específicas, ésta es
una de las diferencias importantes entre los catalizadores inorgánicos (más polivalentes, pero
menos eficaces) y los biológicos, o enzimas. Dentro de éstos, se dan distintos grados de
especificidad. Entre los pocos específicos están las proteasas digestivas; así, por ejemplo, la
quimiotripsina rompe muchos enlaces amida de proteínas o péptidos, e incluso enlaces éster. Otras
enzimas son más estrictas: La lactasa intestinal rompe el enlace -glicosídico de la lactosa y
compuestos muy similares.
En general, las enzimas no son absolutamente específicas, pueden actuar sobre una serie más o menos
grande de substratos semejantes. El agente enzimático actúa con la máxima eficacia sobre el substrato
natural, y con menor eficacia sobre los substratos análogos. Por ejemplo, para la sacarosa del intestino:
la sacarosa es su substrato natural, y la maltosa e isomaltosa son substratos análogos.

 Cofactores: Algunas enzimas requieren para su función la presencia de sustancias no proteicas

que colaboran en la catálisis. Estas sustancias reciben el nombre en forma general de cofactores,
aquellos que son de naturaleza orgánica se denominan co-enzimas y en el microambiente celular,
muchos de estos compuestos son sintetizados.

Con alguna frecuencia las co-enzimas, actúan como aceptores temporales de un fragmento de sustrato,
que incluso pueden transportar de una enzima a otra. Por ejemplo, el agente co-enzimático FAD
(Flavina Adenina Dinucleotido), puede recibir dos átomos de hidrógeno del succinato,
transformándose en FADH2 y transferirlos a otro substrato. A este último aspecto cabe señalar que las
vitaminas en su mayoría constituyen las coenzimas o precursores de cofactores enzimáticos, en los
microambientes celulares.

MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Una determinada molécula de enzima no tiene por qué actuar siempre a la misma velocidad; ésta es
otra propiedad que distingue a las enzimas de los catalizadores inorgánicos. Esta observación obedece
a una serie de circunstancias tales como:

 En primer lugar, la actividad enzimática puede ser modulada por cambios de pH y temperatura,
como ya ha quedado expuesto.

 Además, la velocidad enzimática depende de las concentraciones de sustratos y de cofactores.

 Por otra parte, la presencia de los productos finales de una reacción enzimática puede hacer que
ésta sea más lenta, o incluso invertir su sentido.

 También existen moléculas que actúan sobre los enzimas inhibiendo su acción catalítica, bien por
ocupar temporalmente el centro activo (inhibidores competitivos) o por alterar la conformación

espacial del enzima (inhibidores no competitivos). Ver figura No.3.

Figura 3. Regulación de actividad enzimática. Diferenciación entre inhibidor competitivo y no

competitivo.
 Existen agentes enzimáticos, llamados enzimas alostéricas, que pueden adoptar dos
conformaciones interconvertibles, llamadas R (relajada) y T (tensa). Se denomina forma R a la
más activa debido a que se une al sustrato con más facilidad. Se puede considerar un equilibrio:

R  T

 En este equilibrio, hay sustancias que tienden a estabilizar o favorecer la forma R. son los
llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo; otras
moléculas que favorecen la forma R son los activadores alostéricos.

 Por el contrario, hay sustancias que favorecen la forma T, disminuyendo la actividad enzimática;
son los moduladores negativos. A este grupo pertenecen los inhibidores alostéricos. (alostérico
significa que actúa en otro lugar, diferente del centro activo). Ver figura No.4

Figura 4. Esquema de enzimas alostéricas.

 Otro aspecto, interesante, es el hecho, que algunas enzimas pueden pasar de una forma menos
activa a otra más activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño (P,
AMP etc.). También puede darse el caso inverso, es decir que agentes enzimáticos muy activos
pasen a formas menos activas al liberar ese grupo químico. Así, el glucógeno fosforilasa (Vía de
la glucogenólisis), puede adoptar dos formas principales por modificación covalente. (Ver figura
No.5 ).

Figura 5. Modificación covalente del glucógeno fosforilasa.

 Finalmente, un agente enzimático que cataliza la primera etapa de una vía biosintética resulta
normalmente inhibido por el producto final. La biosíntesis de isoleucina en bacterias sirve para
ilustrar este tipo de control, que se denomina retroinhibición (inhibición por retroalimentación o
'feed-back"). La treonina se convierte en isoleucina en cinco etapas, la primera de las cuales está
catalizada por la treonina desaminasa. Este enzima se inhibe cuando se alcanza una concentración
de isoleucina suficientemente elevada. La isoleucina lo inhibe uniéndose al enzima en un centro
regulador, que es diferente del centro catalítico. Esta inhibición está mediatizada por una
interacción alostérica reversible. Cuando disminuye el nivel de isoleucina suficientemente, la
treonina desaminasa se activa de nuevo y vuelve a sintetizarse isoleucina. Ver figura No.6.
 (-)

Figura 6. Modelo de Retroinhibición de la Actividad enzimática

PROENZIMAS O ZIMOGENOS

Algunos elementos enzimáticos no se sintetizan como tales, sino en forma de proteínas sin actividad
catalítica. Estos elementos reciben el nombre de proenzimas o zimógenos.

Para activarse las proenzimas, sufren un ataque hidrolítico que origina la liberación de uno o varios
péptidos. El resto de la molécula se reorganiza espacialmente y adopta la conformación y las
propiedades de la enzima activa. (Ejemplo: las enzimas pancreáticas o los factores enzimáticos de la
coagulación).

CINÉTICA ENZIMÁTICA

El enfoque más antiguo para entender los mecanismos enzimáticos, y el que sigue siendo el más
importante, es el determinar la velocidad de la una reacción y como cambia en respuesta a diferentes
parámetros experimentales (pH, temperatura, concentración sustrato y concentración enzima, entre
otros) (Lehninger, et al, 2006). Un factor inicial que afecta la velocidad de la reacción es la
concentración del sustrato [S] que cambia durante el curso de la reacción, debido a que es convertido a
un producto. Un enfoque en los experimentos cinéticos es medir la velocidad inicial designada como
Vo. El efecto de Vo al variar el [S] cuando la concentración de la enzima permanece constante se logra
ver en la figura 7A. A bajas concentraciones del sustrato, Vo incrementa casi linealmente con un
incremento en [S] (Lehninger, et al, 2006). A una mayor concentración, Vo incrementa por cantidades
cada vez menores al aumentar [S]. Finalmente, se alcanza un punto más allá en el cual los aumentos en
Vo son sumamente pequeños a medida que [S] aumenta. Esta región Vo está próxima a la velocidad
máxima, Vmax que ocurre cuando la enzima se ha saturado de sustrato.

El complejo ES, es un punto importante para conocer el comportamiento cinético. Leonor Michaelis y
Maud Menten, postularon que la enzima, primero se combina irreversiblemente con su sustrato para
formar un complejo sustrato-enzima: E+S  ES en donde el complejo ES se rompe y libera la enzima
y el producto de la reacción: ES E+P (Lehninger, et al, 2006). A pesar de que es difícil medir
exactamente la concentración de sustrato que da el Vmax, las enzimas pueden caracterizarse mediante la
concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Esta
concentración se conoce como la constante de Michaelis-Menten (K m). Este modelo se encuentra
basado en la formación del complejo enzima-sustrato [ES] y la reacción puede verse afectada por las
enzimas, el sustrato, agentes competitivos y la temperatura (Lehninger, et al, 2006).
 (1)

Las velocidades de reacción vienen dadas por:

A. B.

Figura 7. A. Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad inicial de la reacción catalizada

por una enzima. B. Gráfica de Lineweaver-burk.

Consideraciones del modelo Michaelis-Menten:

 La reacción es irreversible y no hay interacción entre el producto y la enzima.

 La velocidad inicial es medida antes de que se tengan cantidades significativas del producto
acumulado, esto es al momento inmediato en que se pone la enzima en contacto con el
sustrato y antes de que se haya consumido menos del 10% de la concentración inicial del
mismo[P] 0.
 La reacción ocurre cuando se ha alcanzado el equilibrio.
 La concentración del sustrato es mucho mayor a la de la enzima asegurando disponibilidad del
sustrato para la reacción [E]<<[S].
 La tasa de formación y disociación de ES es igual, su concentración es constante. Supuesto de

estado estacionario (Briggs-Haldane).

La ecuación de Michaelis-Menten:

(2)

Puede ser algebraicamente transformada en ecuaciones que son más útiles para graficar los datos
experimentales. Una transformación común es cambiar los recíprocos en ambos lados de la ecuación
de Michaelis-Menten:

(3)

Separando los componentes del numerador en el lado derecho y simplificando:

 (4)

Esta forma de la ecuación de Michaelis-Menten es llamado la ecuación de Lineweaver-Burk. Para las

enzimas que obedecen la relación Michaelis-Menten, una gráfica de 1/Vo Versus 1/[S] (el doble
reciproco de Vo versus [S]) produce una recta fig 6B. Esta línea tiene una pendiente de K m/Vmax, un
intercepto de 1/Vmax en el eje de 1/Vo, un intercepto de -1/K m en el eje de 1/[S] (Lehninger, et al,
2006). La gráfica de Lineweaver-Burk tiene una gran ventaja en permitir una determinación más
precisa de Vmax.

AMILASA SALIVAL

La saliva que es producida y secretada por las glándulas salivares, tiene diversos componentes: entre
mucopolisacáridos, compuestos bacterianos, electrolitos y diferentes enzimas, en donde la amilasa es
una de las mayoritarias (Simic,A 2011). Esta enzima es perteneciente a la familia glucósido hidrolasas
que tiene como función catalizar la reacción de hidrólisis de carbohidratos complejos para formar
azúcares más simples, como: glucosa o maltosa, mediante la escisión de enlaces alfa-1,4-glicosídicos
(Tiwari M,2011). Los humanos producen dos clases de alfa amilasa (salivar y pancreática), las cuales
presentan el 97% de homología.

El almidón: también llamado amilosa (fig. 8) es un polímero compuesto de moléculas de glucosa

conectadas entre sí mediante enlaces covalentes. Es usada y producida por muchos organismos como
una manera de almacenamiento para su posterior uso. Para que los organismos sean capaces de usar
esta energía, el polímero debe ser hidrolizado a unidades más sencillas.

Figura 8. Estructura de la molécula de amilosa

La hidrólisis de almidón es el proceso que hace parte de la digestión. La -Amilasa se encuentra en la

saliva, por ello la digestión de hidratos de carbono comienza en la boca, posteriormente continúa en el
estómago hasta que el pH baja demasiado y finalmente termina en el intestino por acción de otra
amilasa. Las amilasas catalizan solo la hidrólisis de enlaces -1,4 glicosidícos de los componentes del
almidón: la amilosa y la amilopectina (Tiwari M,2011). Durante la reacción es posible obtener
productos de una hidrólisis parcial, de tamaño intermedio. Los productos son la maltosa (dos unidades
de glucosa) y la dextrina (dos unidades de glucosa unidos por un enlace -1,6 además de los enlaces
-1,4 (fig. 9) (Laboratory Experiments for GOB Chemistry).

Figura 9. Reacción de la -Amilasa.

 FUNDAMENTO DE LA PRÁCTICA
En este laboratorio demostraremos la hidrólisis del almidón a glucosa utilizando la enzima amilasa.
Para analizar la acción de esta enzima se realizará el test del almidón. El lugol va a teñir el almidón,
pero no la glucosa o maltosa. Por lo tanto, cuando el almidón sea hidrolizado totalmente la solución
permanecerá amarillo-marrón. Sin embargo, como la hidrólisis está teniendo lugar y parte del almidón
ha sido hidrolizado y otras no, la solución mostrará un color marrón negro en caso de que el almidón
todavía se encuentre presente. Para monitorear la reacción de la enzima, es necesario comprobar la
aparición o desaparición del almidón durante un tiempo determinado.

Se evaluará la actividad enzimática dependiendo del cambio de varios factores, incluyendo la

concentración del sustrato, pH y temperatura. Finalmente se realizarán análisis cinéticos que mostrarán
los efectos de cada uno de estos parámetros en el comportamiento de la amilasa salival.

REACTIVOS

 Buffer Fosfato de Sodio pH 10

 Buffer Fosfato de Sodio pH 7.8
 Buffer Fosfato de Sodio pH 6.8
 Buffer Fosfato de Sodio pH 5.8
 Lugol (dilución 1:100)
 Almidón 5 mg/mL

PROCESO EXPERIMENTAL

El ensayo enzimático se deberá montar en placas para luz visible.

AMILASA SALIVAL

1. Un estudiante de cada grupo de laboratorio deberá donar saliva para la práctica. Hacer un
enjuague bucal con agua destilada. Posteriormente, se debe recolectar alrededor de 3 mL de
saliva.
2. Realicé una dilución 1:30 de la saliva en agua destilada. Prepare 1mL de la dilución.

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO

3. Realizar una curva de diluciones seriadas de almidón como aparece en la siguiente tabla.

Concentración
TUBO Buffer (mL) Volumen (mL)
mg/mL
A 5
B 4 0.29 A 1.16
C 3 0.35 B 1.05
D 2 0.47 C 0.93
E 1 0.73 D 0.73
F 0.75 0.35 E 1.05
G 0.5 0.47 F 0.93
H 0.25 0.7 G 0.7
I 0.125 0.7 H 0,7
J 0.0625 0.7 I 0.7
 K 0

4. Realizar una curva estándar usando diferentes concentraciones de almidón y adicionando

Lugol.

Almidón Volumen Buffer Fosfato de Lugol

g/mL de Sodio 50 mM pH (L)
(concentración) Almidón 7.8
(L) (L)
B 4000 100 10 12 Mezclar
C 3000 100 10 12 la
D 2000 100 10 12 muestra
E 1000 100 10 12 por 1
F 750 100 10 12 minuto y
G 500 100 10 12 leer a
H 250 100 10 12 595 nm
I 125 100 10 12
J 62.5 100 10 12
K 0 - 110 12
blanco 122 (agua) -

5. La hidrólisis del almidón a diferentes concentraciones del sustrato (almidón) debe ser
preparado como aparece en la siguiente tabla.

Almidón Volumen Amilas Buffer Lugol

g/mL de a salival Fosfato de (L)
(concentración) Almidón (L) Sodio 50 mM
(L) pH 7.8 Mezclar
(L) la Mezclar
B 4000 100 10 - muestra 12 la
C 3000 100 10 - por 1 12 muestra
D 2000 100 10 - minuto 12 por 1
E 1000 100 10 - e 12 minuto
F 750 100 10 - Incubar 12 y leer a
G 500 100 10 - por 6 12 595 nm
H 250 100 10 - min a 12
I 125 100 10 - 37 oC 12
J 62.5 100 10 - 12
K 0 - 10 100 12
blanco - - 122 (agua) -
EFECTO DE LA TEMPERATURA

6. La hidrólisis del almidón a diferentes temperaturas debe ser preparado como aparece en la
siguiente tabla.

Almidón Volumen Amilas Buffer Lugol

g/mL de a salival Fosfato de (L)
(concentración) Almidón (L) Sodio 50 mM
(L) pH 7.8 Mezclar
(L) la Mezclar
B 4000 100 10 - muestra 12 la
C 3000 100 10 - por 1 12 muestra
D 2000 100 10 - minuto 12 por 1
E 1000 100 10 - e 12 minuto
F 750 100 10 - Incubar 12 y leer a
G 500 100 10 - por 6 12 595 nm
H 250 100 10 - min a 12
I 125 100 10 - 4oC 12
J 62.5 100 10 - 12
K 0 - 10 100 12
blanco - - 122 (agua) -

EFECTO DEL PH

7. La hidrólisis del almidón a diferentes a diferentes pHs debe ser preparado como aparece en la
siguiente tabla.

pH Almidón a Amilasa Agua (L) Lugol

0.5 mg/mL salival (L) (L)

3 100 10 - Mezclar la 12 Mezclar

5.8 100 10 - muestra por 1 12 la
6.8 100 10 - minuto e 12 muestra
7.8 100 10 - Incubar por 6 12 por 1
9 100 10 - min a 37 oC 12 minuto y
Control 100 - 10 12 leer a
Blanco - - 122 - 595 nm

BIBLIOGRAFIA

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Laboratory Experiments for GOB Chemistry. Hydrolysis of starch by salivary amylase.
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