Microorganismos tolerantes a metales pesados del pasivo minero Santa Rosa, Jangas

¿Qué se hizo?

Se estudio el grado de tolerancia a metales pesados de hongos y bacterias aisladas de suelos con y
sin rizosfera, con propósito de reconocer su potencial para aplicaciones en biorremediacion. Se
consiguió el análisis mediante taxonomía (biología molecular) por la región ITS (hongos) y 16S
(bacteria) ADNr. Se aislaron 23 hongos y 18 bacterias. Estos microorganismos fueron
suplementados con sales. (pb, cu, ni, zn, ag, cr, cd).

El suelo del pasivo ambiental minero de santa rosa posee una microflora interesante.

El medio ambiente ha ido cambiando con el tiempo por causas naturales y por causas
antropogénicas. Este trabajo resalta la contaminación causada por minería, que es una actividad
antigua que a su paso ha ido dejando vertederos, relaves, pozas, alterando los ecosistemas
naturales. La minería en Perú es una actividad importante que ha traido desarrollo al país, no
obstante, no todo gira en torno a la economia, puesto que este desarrollo deja de lado el impacto
ambiental que pueda causar. La minería no cuenta con planes de remediación eficaces o planes de
cierre que puedan amainar o reducir la polución. La minería también es un riesgo para la salud.

Los microorganismos para su supervivencia se adecuan al medio en el que viven y son capaces de
cambiar sus rutas bioquímicas metabólicas para poder asimilar contaminantes. Estos
microorganismos generalmente se encuentran en el grupo de extremofilos, ya sea porque viven
en condiciones de ph alto o bajo, temperaturas altas, entorno rico en metales pesados, etc. Estos
toleran y acumulan los metales pesados. Asi mismo estos se presentan como una alternativa
amigable para el medioambiente. Además, gran parte de los microorganismos no han sido
estudiados.

MATERIALES Y METODOS

a. Colecta y caracterización fisicoquímica del suelo

Se tomaron 4 muestras de suelo, 1kg a 25cm de profundidad. El área de muestreo fue de 250m2.
Se tomaron muestras del pasivo minero de la planta concentradora Santa rosa de jangas

Las muestras fueron transportadas al laboratorio en recipientes esteriles a 8°C aprox. Y fueron
identificadas en la universidad nacional Santiago antunes de mayolo.

Analisis fisicoquímicos (metales pesados según APHA) ms08 (cd) Ms11 (cu) Ms22 (ni) ms24 (pb)
ms32 (zn) ms33 (crVI)

Fertilidad de suelos (tipo de suelo, ph, conductividad eléctrica, composición de materia organica),
nitrógeno total, fósforo, potasio.

b. Aislamiento de hongos y bacterias

Antes de aislar, se enriquecio el cultivo inoculando 10g de suelo en 90ml del medio salino LPS,
además se agregó 5g/L de glucosa, también fue suplementado con plomo y se incubo a 24°C a
60rpm en baño maria durante 7 días y se subcultivo tres veces transfiriendo 1mL del cultivo a un
medio fresco.

EL aislamiento se hizo por diluciones seriadas de hasta 10-6, 100uL de las diluciones fueron
inoculadas en placas con LPSA (LPS + agar agar) con 1Mm DE Pb (II). Para hongos se uso
tetraciclina y estreptomicina. Para bacterias cicoheximida. Se hicieron las siembras por duplicado a
28°C y almacenados a 4°C.

Las colonias de hongos fueron sembradas en agar sabouraud mientras que las de bacterias en
Agar tripticasa de soya (TSA).

c. Caracterización molecular de hongos y bacterias.

Los hongos cultivados fueron cultivados en agar sabouraud a 28°C con agitación. Se colecto el
micelio mediante centrifugación orbital y se extrajo el ADN con kit. Se amplifico la región ITS del
ADNr.

En el caso de bacterias se extrajo el ADN y mediante una reacción de PCR se amplifico el gen 16S.

Una vez amplificadas las regiones antes mencionadas, las secuencias fueron buscadas en GenBank
mediante el BlastN del NCBI. A través de esto se realizaron arboles filogenéticos. (Bacterias)

En el caso de hongos se ingresaron a la plataforma BOLDSYSTEMS para la elaboración de los

códigos de barras de ADN.

d. Tolerancia a metales pesados

Se realizo sobre placas PETRI con LPSA suplementado con metales pesados: Pb (PB(NO3)2, Cu
(NO3)2 . 5h2O, Ni (Ni(NO3)2.6H2O, Zn (ZnSO4).

Todos estos metales fueron esterilizados por filtración y agregados al medio de cultivo por
inoculación. %𝑇𝑜𝑙𝑒𝑟𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑙𝑒𝑟𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 ∗ 100
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑜𝑛𝑔𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙
Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑙𝑒𝑟𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 =
𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑜𝑛𝑔𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 sin 𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙

Para bacterias se utilizo 5ml de LPS suplementadocon metales pesados a las mismas
concentraciones que se indica para el caso de los hongos. Como inoculo se uso 20ul de cultivo
joven (16 horas).
𝐷𝑂 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙 − 𝐷𝑂 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙 sin 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜
%𝑇𝑜𝑙𝑒𝑟𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = ∗ 100
𝐷𝑂 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑣𝑜 sin 𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙

e. Análisis estadísticos

Se hicieron 4 repeticiones en un diseño al azar. Se calcularon promedio, desviaciones estandadres

y se compararon las medias mediante el ANOVA.