ESTUDIO QUÍMICO Y EVALUACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ANTIOXIDANTE Y

ANTIFÚNGICA DEL EXTRACTO METANÓLICO DE LA ASCIDIA Polyclinum

constellatum (POLYCLINIDAE)

Propuesta de trabajo de grado como requisito para obtener el título de Químico

Presentado por:

MANUEL CAMILO SALGADO GIRALDO

Directores:

MARY MONTAÑO CASTAÑEDA. Ph. D.

GILMAR SANTAFÉ PATIÑO Ph. D.

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

MONTERÍA – CÓRDOBA

2019
CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 5
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 7
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 9
3.1. Objetivo general. ................................................................................................. 9
3.2. Objetivos específicos. .......................................................................................... 9
4. MARCO T EÓRICO............................................................................................... 10
4.1. Organismos marinos.......................................................................................... 10
4.1.1. Clase Ascidiacea ........................................................................................... 11

4.1.2. Polyclinum constellatum ................................................................................. 12

4.1.3. Distribución geográfica de la especie Polyclinum constellatum ...................... 14

4.1.4. Clasificación de la especie Polyclinum constellatum ...................................... 15

4.2. Efectos del proceso de oxidación en biomoléculas y enfermedades infecciosas

causadas por hongos....................................................................................................... 15
4.2.1.Estrés oxidativo .............................................................................................. 15

5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 23

5.1. Recolección del material biológico ..................................................................... 23
5.2. Materiales y equipos .......................................................................................... 23
5.3. Preparación del material biológico ..................................................................... 24
5.4. Fraccionamiento por reparto .............................................................................. 24
5.5. Derivatización de la fracción de ácidos grasos .................................................. 24
5.6. Identificación de los compuestos aislados. ........................................................ 25
5.7. Evaluación de la actividad antioxidante ............................................................. 25
5.7.1. Método del radical DPPH•............................................................................. 25

5.7.2. Método del acido cationico ABTS+• ................................................................ 27

5.7.3. Evaluación del potencial de reducción férrica ................................................ 28

5.8. Evaluación de la actividad antifúngica ................................................................... 29

5.9. Análisis estadístico ............................................................................................... 30
6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 31
7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ............................................................................ 35
8. PRESUPUESTO .......................................................................................................... 36
LISTA DE FIGURAS

Fig.1: Especies de invertebrados ............................................................................. 11

Fig.2: Ascidia colonial ............................................................................................... 12

Fig.3: Ascidia solitaria ............................................................................................... 12

Fig.4: Larva renacuajo .............................................................................................. 12

Fig.5: Polyclinum constellatum ................................................................................. 14

Fig.6: Hembra de Haplostomides hawaiinensis ....................................................... 14

Fig.7: Mapa de distribución de la especie Polyclinum Constellatum ...................... 15

Fig.8: Respues celular frente a EROs ...................................................................... 18

Fig.9: Esquema de degradación celular .................................................................. 19

LISTA DE TABLAS

Tabla 1: Clasificación taxonomica de la especie Polyclinum constellatum ............ 16

Tabla 2: Clasificación de reacciones donde intervienen los RL .............................. 17

Tabla 3: Principales factores externos que incrementan la producción de EROs

....................................................................................Error! Bookmark not defined.

Tabla 4: Clasificación de los ensayo in vitro de actividad antioxidante ............ Error!

Bookmark not defined.

Tabla 5: Cronograma de actividades a realizar ....................................................... 37

Tabla 6: Presupuesto global de la propuesta ........................................................... 38

1. INTRODUCCIÓN

El afán del ser humano durante el pasar del tiempo ha sido el entender y descubrir
cada uno de los aspectos del entorno que le rodea, la composición y el uso en el
cual pueda ser aplicado estos descubrimientos. Con el pasar del tiempo dicho
interés se ha enfocado principalmente en la búsqueda, estudio y aplicación de
sustancias, especialmente de origen natural, con alta actividad biológica que
permita combatir todo tipo de enfermedades que aquejan a la humanidad, estando
en el foco de atención todas las enfermedades derivadas del estrés oxidativo
causadas por radicales libres y por la intervención de agentes externos dañinos para
el organismo.

La aparición de enfermedades resistentes a medicamentos junto con el creciente

temor y recelo al uso de todo tipo de sustancia de orígen sintético, los estudios se
han orientado a todo tipo de metabolitos naturales, llevando a cabo diversas
investigaciones, las cuales tiene como principal objetivo el descubrimiento de
sustancias o compuestos que garanticen el cumplimiento de estas necesidades.

Desde las últimas décadas las cifras sobre medicamentos de origen natural que se
encuentran en investigación, desarrollo y en ensayos clínicos han superado el 60%,
según la organización mundial de la salud,[1,2] siendo el entorno marino una gran
área de estudio debido a que el número de especies marinas reconocidas y
clasificadas, es de aproximadamente 230.000 aunque se estima que hay hasta
972.000 especies diferentes de organismos eucariotas en los mares,[3] y solo en la
actualidad se conocen alrededor de 20.000 productos naturales de origen marino
con actividad biológica.[4]

Una amplia gama de compuestos procedentes de organismos marinos han sido

estudiados a fondo, evidenciando una amplia gama de actividades biológicas, con
aplicaciones tales como, antibacteriana, antioxidante, antifúngica, antiviral,
neurotóxica, entre otras.[5-9]

5
Con respecto a la evaluación de la actividad frente a diversas células cancerígenas,
mediante estudios in vitro e in vivo, estos compuestos de origen marino han
mostrado muy buenos resultados y aunque aún haga falta implementar ensayos con
estos compuestos en estudios in vivo en humanos, todos los resultados obtenidos
previamente resultan ser muy esperanzadores para la lucha contra los diversos
tipos de cáncer que actualmente se presentan a nivel mundial. [10]

En este trabajo se busca contribuir al estudio químico y de la bioprospección del

invertebrado marino Polyclinum constellatum, recolectado en el Caribe Cordobés.

6
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Conforme pasa el tiempo, más grandes son los avances de la humanidad en cada
uno de los aspectos relacionados a nuestro entorno, buscando siempre incontables
mejoras, innovaciones, descubrimientos, nuevos enfoques, manteniendo
constantemente la relación del ser humano con la naturaleza. Desde los orígenes,
el ser humano ha encontrado en la diversidad biológica un potente aliado para la
prevención de enfermedades, aprovechando la amplia gama de compuestos
orgánicos sintetizados por los organismos vivos, los cuales representan una
inmensa utilidad a la hora de calmar diversas necesidades que aquejan a la
sociedad.

Esta necesidad constante de bienestar hace que la búsqueda, análisis, clasificación

y evaluación de estos metabolitos secundarios haya despertado tanto interés,
apoyándose en estudios de bioprospección, la cual es la rama del conocimiento que
se encarga de estudiar la naturaleza con un enfoque a la búsqueda y hallazgo de
toda aquella sustancia u organismo con posibles implicaciones favorables para el
ser humano.[11] Con el creciente declive y desaparición de una cantidad significativa
de especies de fauna y flora y con los crecientes niveles en la contaminación del
medio ambiente, la bioprospección surge y cobra fuerza al reafirmar la riqueza que
la naturaleza.

Colombia es un gran representante en lo que a poderío en bioprospección se refiere, Commented [HJ1]: Revisa lo del formato: mismo espacio
entre párrafos
con una biodiversidad muy vasta, debido a su ubicación geográfica, al estar
atravesada de norte a sur por la gran cordillera de los Andes, limitar con dos mares,
casi con el 50% de la superficie nacional cubierta por selvas vírgenes, cuenta con
una de las reservas acuíferas más grandes del planeta, con innumerables especies
animales y vegetales, cuenta con diversidad de climas, lo que permite ver en un
solo país desde selvas tropicales, pasando por desiertos, hasta páramos. [12]

Lastimosamente el enorme potencial que la biodiversidad en Colombia representa

para la bioprospección no ha sido explotado lo que realmente se merece en la región

7
especialmente hablando en el caso de la bioprospección de organismos marinos,
esto se debe a la existencia de normas y legislaciones vigentes que regulan gran
cantidad de estudios. Para la región Cordobesa es un tema relativamente
desconocido, pese a tener dentro de sus dominios la bahía de Cispatá, siendo esta
una región ampliamente conocida por su alta biodiversidad en fauna marina debida
a la influencia del río Sinú, la dinámica de las corrientes superficiales locales, la
heterogeneidad del fondo marino y la variación estacional a lo largo del ciclo anual
en el que se reconocen temporadas secas y lluviosas con cambios notables en la
productividad primaria y secundaria.[13]

En este trabajo se plantea la oportunidad de realizar un estudio en bioprospección

de organismos marinos, con el aporte al estudio de la Ascidia Polyclinum
constellatum, recolectada en el departamento Córdoba, evaluando su potencial
actividad antifúngica y antioxidante realizando además una contribución al estudio
químico de esta especie.

8
3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general.

Realizar el estudio químico y evaluación de las actividades antioxidante y
antifúngica del extracto metanólico de la Ascidia Polyclinum
constellatum (Polyclinidae).

3.2. Objetivos específicos.

 Obtener el extracto metanólico del organismo marino Polyclinum constellatum,
utilizando el método de maceración en frio.
 Realizar un proceso de partición con con diferentes solvente al extracto
metanólico, para obtener los respectivos subextractos.
 Aislar y purificar los metabolitos secundarios mayoritarios de los subextractos
mediante el uso de técnicas cromatográficas como Cromatografía en Columna
(CC), Cromatografía en Capa Delgada (CCD) y Cromatografía en Capa Delgada
Preparativa (CCDP).
 Determinar la estructura de los metabolitos secundarios mayoritarios aislados,
mediante espectrometría de masas (EM).
 Evaluar la actividad antioxidante del extracto y subextractos por medio de los
métodos de radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH●), el radical catiónico 2,2-
azino-bis-3-etil-benztiazolin-6-sulfonato (ABTS+●) y potencial de reducción
férrica (FRAP).
 Evaluar la actividad antifúngica del extracto metanólico frente a las cepas de
hongo Candida albicans (ATCC 10231), Candida albicans (sangre) y Candida
krusei (Catéter) empleando los métodos de microdilución y difusión en agar
empleando pozos.

9
4. MARCO T EÓRICO

4.1. Organismos marinos

Dentro del reino animal se estima que hay 7,77 millones de especies de animales, [14]
dentro de los cuales se encuentran incluidos los invertebrados como una pequeña
porción de esta abismal cifra, de este subgrupo de especies animales los
invertebrados están constituidos por aproximadamente 14 Phylum, siendo de los
principales los Phylums Porífera, Cnidaria, echinodermata, Platyhelminthes,
Nematoda y Chordata.[14]

Fig. 1. Especies de invertebrados pertenecientes a los Phylum más característicos.

(Imagen disponible en https://image.slidesharecdn.com/calcarea1-160126231428/95/phylum-
porfera-1-638.jpg?cb=1453850088).

10
4.1.1. Clase Ascidiacea

Las ascidias, también conocidas como chorros o jeringas de mar, son organismos
que pertenecen a la clase Ascidiacea del Phylum Chordata y están representadas
por aproximadamente 2.800 – 3.000 especies. Son un grupo dominante en las
comunidades bénticas marinas, donde se encuentran formando colonias (Fig. 2) o
de manera solitaria (Fig. 3). En estado juvenil presentan una larva conocida como
larva renacuajo (Fig. 4), la cual es de vida libre natatoria durante 36 horas o
menos.[15] Posterior a la fase libre nadadora, la larva se fija en algún sustrato
mediante papilas adhesivas anteriores, enseguida ocurre una metamorfosis donde
la notocorda y el tubo neural se reabsorben, el cuerpo entero gira 180° y los sifones
se desplazan hacia atrás para quedar en el extremo opuesto al punto de fijación. En
estado adulto son sésiles, lo que las hace eficientes filtradoras de pequeñas
partículas de materia suspendida en la columna de agua. [15]

Fig. 2. Ascidia colonial. Fuente: foto tomada por José B. Ruiz.

(https://www.mindenpictures.com/cache/pcache2/90165084.jpg)

Fig. 3. Ascidia solitaria. Fuente: foto tomada por Jacinta Richardson y Paul Fenwick.
(https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e5/Sea-tulip.jpg/250px-Sea-tulip.jpg)

11
 Fig. 4. Larva renacuajo.
(Imagen disponible en: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/19/Larva_ascidia-
ES.svg/350px-Larva_ascidia-ES.svg.png).

Su elevada capacidad de colonización en la mayoría de los sustratos artificiales

convierte a las Ascidias en uno de los principales integrantes de las comunidades
de organismos esclerobiontes o incrustantes. Además, el intenso tránsito marítimo
ha permitido que las especies pertenecientes a la clase Ascidea estas especies se
introduzcan y dominen en zonas marinas y puertos, ya sea a través de las
descargas de las aguas de lastre o del transporte de fauna incrustante en todo tipo
de embarcaciones. [16]

4.1.2. Polyclinum constellatum

La especie Polyclinum constellatum, conocida comúnmente como “ascidia papa”

(Fig.5) es considerada como especie exótica invasora. Teniendo en cuenta una
especie exótica puede considerarse como toda aquella especie que se establece
fuera de su área natural (pasada o actual) y de dispersión potencial (fuera del área
que ocupa de manera natural o que no podría ocupar sin la directa o indirecta
introducción o cuidado humano) e incluye cualquier parte, gameto o propágulo de
dicha especie que puede sobrevivir y reproducirse. Así mismo, una especie exótica
invasora es aquella especie o población que no es nativa, y que amenaza la
diversidad biológica nativa, la economía y la salud pública. Siendo esta especie
(Polyclinum constellatum) una especie originaria de Hong Kong y China.[17]

12
 Fig. 5. Polyclinum constellatum. Fuente: foto tomada por Rendón-Rodriguez, S.
(http://images.dev.morphbank.net/?id=496648&imgType=jpg)

Como especie exótica invasora esta ascidia ha generado impactos negativos,

principalmente laborales y económicos en el cultivo de ostión, ya que los
acuicultores deben invertir mayor esfuerzo y tiempo en la limpieza (retiro de la
ascidia) de los ostiones para comercialización, así como en las charolas y redes de
siembra.[18,19] Por su parte, las industrias portuaria y naviera también invierten dinero
en la compra de pinturas anti-fouling para su aplicación en boyas de señalización,
pilotes, muelles y cascos de embarcaciones, estructuras que se dañan por la
corrosión ocasionada por la placa de organismos incrustantes.[18]

Polyclinum constellatum es un tunicado incrustante colonial, puede ser de color gris,

marrón violáceo o verde, con sistemas de zooides blancos o beige visibles en la
superficie. El área de unión de la colonia puede ser pequeña, de modo que solo una
pequeña parte de la base está unida directamente al sustrato. Las colonias son
firmes y cartilaginosas, a menudo sin restos adheridos, pero a veces colonizadas
por hidroides u otra epifauna.[19]

13
Las colonias varían en tamaño desde 25-65 mm de largo y 5-20 mm de espesor.
Los zooides de Polyclinum constellatum tienen aproximadamente 5-7 mm de largo
cuando están enderezados. Los zooides están dispuestos en sistemas circulares,
de aproximadamente 20 zooides cada uno, que bordean una cloaca común circular
(o sifón auricular). Los sifones orales son tubulares y están bordeados por seis
lóbulos largos y triangulares. Los órganos reproductivos se encuentran en el post-
abdomen, con los testículos hacia los ovarios.[20]

4.1.3. Distribución geográfica de la especie Polyclinum constellatum

Estas especies están distribuidas en gran parte de los océanos del mundo. Está
distribuida a lo largo de las costas de África, América central, Asia, etc. [19] Como se
puede observar en la figura 7. En Colombia se ha encontrado esta especie a lo largo
de la costa caribe.

Fig. 7. Mapa de distribución de la especie Polyclinum constellatum. Nativa (verde), introducida

(rojo) y criptogenizada (amarillo).
(https://invasions.si.edu/nemesis/images/159019.png?time=1564949926169).

14
4.1.4. Clasificación de la especie Polyclinum constellatum

La clasificación taxonómica de la especie se puede observar en la Tabla 1.

Tabla 1. Clasificación taxonómica de la especie Polyclinum constellatum[19]
REINO Animalia
PHYLUM Chordata
SUBPHYLUM Tunicata
CLASE Ascidiacea
ORDEN Aplousobranchia
FAMILIA Polyclinidae
GENERO Polyclinum
ESPECIE Constellatum

4.2. Efectos del proceso de oxidación en biomoléculas y enfermedades

infecciosas causadas por hongos

4.2.1. Estrés oxidativo

Los radicales libres son peligrosos, son moléculas capaces de existir con uno o más
electrones desapareados, Los cuales le dan a la molécula un carácter
paramagnético,[21] volviéndolas especies inestables y altamente reactivas con
capacidad para combinarse inespecíficamente con las diferentes moléculas que
integran la estructura celular y los derivados de estas, y con la capacidad de atacar
cualquier tipo de biomolécula.[22,23]

Estas especies radicalarias son especies químicas que en el organismo pueden

causar severos daños; conociéndose una gran cantidad de las enfermedades que
afectan al ser humano son causadas por estos radicales libres.[24] En numerosas
patologías; gástricas, cardiacas, respiratorias, óseas, multiorgánicas, Se han
encontrado intermediarios de radicales libres en las vías metabólicas de una amplia
variedad de compuestos orgánicos los cuales parecen estar implicados en efectos
tóxicos y en el desarrollo de enfermedades terminales.[25,26]

El principal riesgo que representan los radicales libres reside en el hecho de poder
formarse como producto de todo tipo de ruta metabólica llevada a cabo en cada una
de las células, aunque en nuestro organismos pueden ser controlados por medio de

15
múltiples mecanismos, ya sean de tipo enzimático o simplemente por inactivación
de dichos radicales, cuando dos especies de estas se encuentran y reaccionan
entre ellas, de igual manera genera gran preocupación que estas especies puedan
formarse a partir de diversos mecanismos, siendo la agregación de electrones a
moléculas estables el más común de estos mecanismos.[28-30]

Una vez formado estas moléculas inestables, buscan la manera de recobrar la

estabilidad tratando de alcanzar una configuración electrónica idónea, es por este
motivo que los radicales libres interactúan con otras moléculas a través de
reacciones de óxido reducción.[29] Podemos clasificar los diversos mecanismos de
formación de radicales libres en tres grupos: (Tabla 2).

Tabla 2. Clasificación de reacciones en donde intervienen los radicales libre. [31]

REACCIONES DE REACCIONES DE REACCIONES DE

INICIACIÓN PROPAGACIÓN TERMINACIÓN
Son aquellas en donde se Son aquellas en las cuales Son todas aquellas
producen radicales libres a la producción de un radical reacciones en las cuales
partir de especies no libre se produce cuando un dos radicales libres entran
radicalarias. radical libre interactúa con en contacto poniendo fin a
una molécula estable. la nueva formación de
radicales.

Los radicales libres pueden ser clasificados dependiendo de los átomos presentes
en el grupo funcional que hay en estas especies, tales como: bromo, cloro, fósforo,
nitrógeno, tioles, oxígeno, siendo este último el que genera los radicales libres más
comunes y más relevantes. [32,33]

16
Figura 8. Respuesta celular frente a la formación de EROS a través de estímulos fisiológicos (28).
Fuente: Review Reactive Oxygen an nitrogen species in normal physiological processes, República
Checa, Pourova J. 2010:22.

Por otra parte, los radicales libres son formados a través de diferentes procesos
metabólicos aeróbicos esenciales del organismo,[34] razón por la cual, son
considerados especies químicas naturales, ya que de modo continuo son
generadas por los seres vivos,[35] y participan en varios procesos fisiológicos como
la producción de energía, regulación del crecimiento celular, síntesis de sustancias
biológicas (colágeno y prostaglandinas), defensa de tipo inmune (fagocitosis),
señalización intracelular y favorecimiento en la quimiotaxis. [36,37] Los radicales libres
no solo son formados a causa de agentes internos, otros factores que favorecen la
producción de radicales libres, como los son las fuentes exógenas (tabla 3). Un
ejemplo lo constituye el oxígeno ya que estudios han logrado demostrar lo
perjudicial que puede llegar a ser este especialmente cuando los seres vivos se
exponen a concentraciones por encima de las normales, lo que puede causar a
daños de todo tipo, siendo el más grave la muerte celular.[38] Este efecto tóxico está
ligado al proceso en el cual las moléculas del oxígeno se reducen de forma parcial
y de estas se obtienen especies reactivas conocidas como EROS (especies
reactivas del oxígeno), estas especies representan un peligro cuando la cantidad de
estas presentes en el cuerpo superan a los agentes encargados en contrarrestar
estas especies.[39]

17
 (Tabla 3). Tabla 3. Principales factores externes que incrementan la producción
de EROs

* Fibras de asbestos * Polvo de minerales

* Ozono * Monóxido de carbono
Contaminantes * Óxido nítrico y dióxido de nitrógeno * Sílice
* Solventes * Toxinas
* Hipocloritos * Dióxido de sulfuro
* Bifenilos policlorados * Paraquat y diquat
* Acetaminoceno * Coprofloxacino
Drogas * Antidepresivos tricíclicos * Nitrofurantoinas
* Antidiabéticos * Bleomicina
* Doxorubicina
Iones metálicos * Hierro * Cobre * Cadmio
* Níquel * Cromo * Mercurio
Radiaciones * Ultravioleta * Rayos X * Gamma
Dieta * Ácidos grasos poliinsaturados * Glucosa
Otros * Tabaco * Ejercicio intenso * Licor

Fuente: Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes naturales. Citotoxicidad y

capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en modelos celulares. Ugartondo V. 2009

La constante exposicion a fuentes de radicales libres, causa que el cuerpo no pueda

inhibir la enorme cantidad de especies radicales causando un desbalance en el
organismo conocido como estrés oxidativo. Este ocurre cuando hay un desequilibrio
en nuestras células debido a un aumento en los radicales libres y/o una disminución
en los antioxidantes; con el tiempo este desajuste en el equilibrio entre los radicales
libres y los antioxidantes puede causar severos daños en el cuerpo (Figura 9).[39]

18
 Figura 9. esquema de como las celulas sanas se ven degradas por accion de radicales libres.
(https://st4.depositphotos.com/7017042/21831/v/1600/depositphotos_218317166-stock-illustration-
oxidative-stress-diagram.jpg)

Los Antioxidantes son compuestos que pueden evitar o retardar la oxidación de

otras moléculas inhibiendo la iniciación y/o propagación de las reacciones en
cadena de los radicales libres. Los antioxidantes se pueden dividir en dos categorías
principales que son: enzimaticos y no enzimaticos.[40]

Los antioxidantes de tipo enzimático son considerados como la primera línea

defensiva que posee el cuerpo para evitar la acumulación de especies reactivas del
oxígeno, entre este grupo los antioxidantes más representativos son:

 Superóxido Dismutasa (SOD). Esta enzima permite la transformación del

radical O2•- a H2O2, siendo este mucho menos reactivo que el primero y se
degrada mucho más fácilmente.[40]

 Glutatión peroxidasa (GPx). Es una selenoproteína, en presencia de GSH,

como agente reductor, cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno y otros
hidroperóxidos orgánicos en agua y alcohol, respectivamente. [40]

Por otra parte están los antioxidantes de tipo no enzimáticos, siendo estos un grupo
de moléculas que pueden tener carácter hidrofílico o hidrofóbico y que tienen como
función localizar, capturar, y transformar a los radicales libres en moléculas menos
nocivas para la célula,[41] [42] entre este grupo de antioxidantes los más
representativos son:

19
 Vitamina C. Se encuentra en forma de ascorbato, actúa directamente sobre los
radicales Superóxido, hidroxilo y algunos hidroperóxidos lipídicos, además de
actuar sobre el tocoferoxilo, transformándolo a vitamina E, sin embargo, el
ascorbato puede llegar a ser un potente oxidante cuando se encuentran
presentes excesivas concentraciones de iones hierro y cobre. [43]

 Glutatión. Es un tripéptido actúa sobre el peróxido de hidrógeno, superóxido y

el radical hidroxilo.[44]

 Flavonoides polifenólicos. Se encuentran un amplio grupo de compuestos

fenólicos (catecinas, cianidinas, quercetinas) que actúan como quelantes de
metales y que además, capturan de forma in vitro EROS. Pueden ser de tipo lipo
e hidrosolubles y se ubican tanto intra como extracelularmente.[43]

La tasa de efectividad de un agente antioxidante no puede determinarse de forma

concreta pero se puede generar una estimación por medios de pruebas de oxidación
controladas en el laboratorio, en estas mediciones de sustancias antioxidantes
suele usarse productos finales o intermediarios para así poder medir y valorar el
potencial antioxidante de una sustancia pero la actividad antioxidante de una
muestra no puede ser determinada basándose solo en un ensayo de prueba. [45]

Experimentalmente existen muchos modelos de pruebas in vitro que permiten la

evaluación de la actividad antioxidante, no obstante es imprescindible el considerar
que estos modelos son distintos entre sí, dificultando la comparación de resultados
entre uno y otro ensayo. Estos ensayos pueden ser clasificados usando como
criterio las reacciones químicas llevadas a cabo durante estos procesos, estas dos
categorías se observan en la tabla 4.[46]

20
 Tabla 4. Clasificación de los modelos de ensayo in vitro según su modo de
reacción ET o HAT[46]

De todos estos ensayos los más comúnmente utilizados son los ensayos de DPPH ●
y ABTS+•. El método DPPH● (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo) es el más rápido, es simple
(no incluye muchos pasos) y de menor costo en comparación con otros modelos.
Por otro lado, el ensayo de decoloración ABTS+• (2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-
6-sulfonico)) se puede emplear con sustancias antioxidantes hidrofílicas y lipofílicas.
Los métodos de ABTS+• y de DPPH●, consisten en medir la decoloración en el
máximo de absorbancia del radical a 734 nm y 517 nm, respectivamente.
Posteriormente con los respectivos datos de absorbancia se cuantifica la cantidad
de especies radicalarias barridas como consecuencia de la decoloración, por efecto
de la muestra antioxidante.[46]

Otro método para determinar de forma indirecta la actividad antioxidantes es por el

Potencial de Reducción Férrica (FRAP). Es una de las pruebas más rápidas y muy
útil para el análisis de rutina. La actividad antioxidante se estima midiendo el
aumento de la absorbancia causada por la formación de iones ferrosos a partir del
reactivo FRAP que contiene TPTZ (2,4, 6-tripiridil-s-triazina) y FeCl2*6H2O. La
absorbancia se mide espectrofotométricamente a una longitud de onda 593 nm. [47]
El método FRAP puede ser útil en combinación con otros métodos para la

21
determinación de la capacidad antioxidante de muestras que contengan
antioxidantes de distinta naturaleza química.[47]

4.2.2. Enfermedades infecciosas causadas por hongos

Los hongos son organismos vivos muy comunes en la naturaleza, representan uno
de los reinos de la naturaleza siendo organismos primitivos, entre este reino se
encuentran las setas y el moho, siendo estos relativamente inofensivos para el ser
humano. Estos microorganismos pueden desarrollarse en cualquier medio, en el
aire, suelo, plantas, agua e incluso en los seres humanos.

Algunos hongos se reproducen mediante pequeñas esporas en el aire, las cuales

pueden inhalarse o pueden caer sobre las personas y como consecuencia las
infecciones por hongos (micóticas) normalmente comienzan en los pulmones o en
la piel.

En países en donde los niveles de pobreza son elevados, las enfermedades

producidas por hongos constituyen una principal causa de muertes, siendo la
desnutrición y la exposición a agentes que debilitan los sistemas inmunes, los
factores que ayudan a que las personas de estos países sean más vulnerables a
estos microorganismos; siendo enfermedades de origen fúngico, como la
candidiasis, las más comunes. Se estima que entre el 2% y el 15% de los sujetos
colonizados pueden terminar en candidiasis diseminada, con mortalidad de hasta
79%.[48]

Debido al aumento en el riesgo de sufrir afecciones causadas por hongos y con la

aparición de especies de estos microorganismos que desarrollan resistencia a los
fármacos se han enfocado las investigaciones en la búsqueda de metabolitos que
tengan actividad antimicótica de manera natural.

22
5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Recolección del material biológico

Los organismos de Ascidia Polyclinum constellatum serán recolectados en la Bahía

de Cispatá, ubicada en el municipio de San Antero en el departamento de Córdoba,
con el apoyo de personal experimentado perteneciente a los programas de Biología
y de Química de la Universidad de Córdoba.

Los especímenes recolectados serán ubicados taxonómicamente en el

departamento de Biología de la Universidad de Córdoba.

5.2. Materiales y equipos

 Cromatografía en columna (CC): Fase estacionaria silica gel (0.063-0.2 mm,

Merck®) y como fase móvil se utilizarán mezcla de solventes con gradiente de
polaridad de Hexano, Diclorometano (DCM), Acetato de etilo (AcOEt) y Metanol
(MeOH).

 Cromatografía en capa delgada (CCD): Cromatoplacas de aluminio de silica

gel 60F254 y un espesor de 0.2 mm marca Merk.

 Lámpara Ultravioleta: Marca CAMAG (con longitudes de onda de 254 y 366

nm).

 Rotavaporador: Heidolph G3 y Büchi R-114.

 Espectrofotómetro UV/VIS: Genesis 20 thermo spectronic modelo 4001/4.

23
 5.3. Preparación del material biológico

El material recolectado se cortará en pedazos y someterá a maceración en frío con

metanol (MeOH) durante 8 días, luego se filtrará y concentrará a presión reducida
a 45 °C, obteniendo los extractos primarios.

5.4. Fraccionamiento por reparto

El extracto orgánico de la especie estudiada serán sometidos a cromatografía en

columna (CC) usando sistemas de elución desde Bencina: Acetato de Etilo (4:1)
aumentando polaridad hasta Metanol (MeOH), las subfracciones obtenidas serán
monitoreadas por cromatografía de capa delgada (CCD), usando patrones de ácido
oleico y colesterol. Como reveladores serán utilizados luz ultravioleta, vapores de
yodo y Vainillina. Las subfracciones serán reunidas con base a los Rf obtenidos por
cromatografía en capa delgada (CCD) y concentradas a presión reducida para
continuar su estudio.

5.5. Derivatización de la fracción de ácidos grasos

Los ésteres metílicos de ácidos grasos serán obtenidos colocando 150 mg de la

fracción de ácidos grasos a reflujo con 4 mL de solución 2N de hidróxido de potasio
(KOH) en metanol a 80 °C por 3 horas con agitación magnética, luego la mezcla se
enfriará y se monitoreará la saponificación por cromatografía en capa delgada
(CCD) usando bencina/acetato de etilo (7:1 v/v) y como revelador vainillina.
Posteriormente se adicionarán 5 mL de solución al 12 % de trifluoruro de boro
metanólico (BF3/MeOH) y se pondrá a reflujo por 3 h a 80 °C, Luego se verificará la
esterificación por CCD usando el mismo sistema anterior.

La mezcla de reacción se extraerá con diclorometano (DCM), se lavara con solución

saturada de cloruro de sodio, luego se adicionará sulfato de sodio anhidro, se filtrará
y se concentrará a 37°C por destilación a presión reducida. Los ésteres metílicos

24
obtenidos se purificaran por Cromatografía en Columna (CC) y posteriormente se
analizarán por Cromatografía de Gases de Alta Resolución Acoplado a
Espectrometría de Masas (CGAR-EM) [50]

5.6. Identificación de los compuestos aislados.

Los compuestos aislados serán identificados a partir de los análisis de los espectros
de masas, obtenidos por impacto electrónico (IE), los cuales serán estudiados,
elucidados y comparados con algunos reportados en la bibliografía especializada.

5.7. Evaluación de la actividad antioxidante

La evaluación de la actividad antioxidante se llevara a cabo frente a los radicales

DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) y radical catiónico ABTS+• (ácido 2,2'-azino-bis
(3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico)) y la evaluación del potencial de reducción férrica
(FRAP) [51]

5.7.1. Método 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•)

5.7.1.1. Preparación de la solución madre DPPH •

Para preparar la solución madre de DPPH • se disolverán 75 mg DPPH• en 3.5 mL

MeOH y esta solución será guardada en la oscuridad durante 24 horas. Pasado
este tiempo se tomaran pequeñas alícuotas de 1ml que serán diluidas en MeOH
analítico hasta que se obtenga una longitud de onda de 517 nm una absorbancia
ajustada de 0.300±0.05 en un espectrofotómetro. El blanco del equipo para hacer
las lecturas de absorbancia se ajustara con metanol.

25
 5.7.1.2. Evaluación de las muestras

Se evaluara la capacidad antioxidante de los extractos y subfracciones obtenidas a

partir de los organismos marinos se realizara primero un ensayo preliminar a una
concentración de 100 ppm, para lo cual se preparan los siguientes tratamientos:

- Muestra: se mezclan 40 µL de la muestra a 10.000 ppm (5 mg de muestra en 500

μL de dimetilsulfóxido (DMSO)) con 1960 μL de la solución del radical DPPH •
previamente preparado. La mezcla se deja a temperatura ambiente durante 30 min
en la oscuridad y posteriormente se lee la absorbancia en el espectrofotómetro a
517 nm.

- Blanco de muestra: Para el blanco de muestra se mezcla 40 µL de la muestra

con 1960 µL de MeOH.

- Referencia: Para la referencia se mezcla 40 µL de DMSO con 1960 µL Radical

DPPH•.

Todas las mediciones serán realizadas por triplicado y el porcentaje de inhibición a

esa concentración será calculado utilizando la ecuación 1. Luego se buscará un
intervalo de concentraciones que permita conocer la concentración a la cual la
muestra evaluada inhibe el 50% del radical presente (IC 50) por interpolación lineal.
m/z:74
m/z:83 m/z:129 m/z:101 O
m/z:41 m/z:31
m/z:242 m/z:69

H3C O
m/z:55
m/z:97 m/z:115 m/z:87 ML
CH3

Ecuación 1. % de Inhibición de muestra

Donde:

A. muestra: Absorbancia de muestra

A. blanco: Absorbancia de blanco

A. referencia: Absorbancia de referencia

26
5.7.2. Método del ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico)
(ABTS+•)

5.7.2.1. Preparación de la solución madre ABTS+•

Para preparar la solución madre del catión radical ABTS +• se toman 8.75 mg de
ABTS• y se disuelven en 4.95 mL de agua estéril, simultáneamente se disuelven en
otro recipiente 34 mg de persulfato de potasio (S 2O8K2) en 1mL de H2O. De estas
soluciones preparadas se toman 4.95 ml de solución de ABTS +• (3.5 mM) y 0.1 mL
de solución de persulfato de potasio (125 mM) y se mezclan, finalmente se guarda
en la oscuridad por 12 horas. Pasado este tiempo se tomaran pequeñas alícuotas y
serán diluidas con un buffer fosfato de pH 7.4 y con el espectrofotómetro ajustado
con un blanco de buffer fosfato y a una longitud de onda de 732 nm se estabilizara
el radical hasta obtener una absorbancia ajustada de 0.700±0.05A.

5.7.2.2. Evaluación de las muestras

Se evaluara la capacidad antioxidante del extracto y subfracciones obtenidas a partir

del organismo marino, se procederá primero que todo llevando a cabo un ensayo
preliminar a una concentración de 100 ppm, para lo cual se preparan los siguientes
tratamientos:

- Muestra: se mezcla 40 µL de la muestra a 10.000 Ppm (5 mg de muestra en 500

μL de dimetilsulfóxido (DMSO)) con 1960 μL de la solución del radical ABTS +•
previamente preparado. La mezcla se deja a temperatura ambiente durante 30 min
en la oscuridad y posteriormente se lee la absorbancia en el espectrofotómetro a
732 nm.

- Blanco de muestra: Para el blanco de muestra se mezcla 40 µL de la muestra

con 1960 µL de buffer de fosfato.

- Referencia: Para la referencia se mezcla 40 µL de DMSO con 1960 µL Radical

ABTS+•.

27
Todas las mediciones serán realizadas por triplicado y el porcentaje de inhibición a
esa concentración se calcula utilizando la ecuación 1, para que se busque un
intervalo de concentraciones que permitiera conocer la concentración a la cual la
muestra evaluada inhibe el 50% del radical presente (IC50) por interpolación lineal.

5.7.3. Evaluación del potencial de reducción férrica

5.7.3.1. Preparación de la solución madre de 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-

triazina (TPTZ)

La preparación de la solución madre de TPTZ se realizará mezclando 25 mL de

solución buffer de acetato 300 mM; pH 3.6, con 2.5 mL de solución de TPTZ 10 mM
(0.083 g de TPTZ aforados a 10 mL) en HCl 40 mM (1.7 mL de HCl aforados en 500
mL de H2O) y 2.5 mL de FeCl3·6H2O 20 mM (0.540 g de FeCl3·6H2O aforados a 100
mL de H2O).

5.7.3.2. Evaluación de las muestras

Para la evaluación del potencial de reducción se mezclarán 900 μL de solución

madre de TPTZ previamente preparada, con 50 μL de muestra en agua destilada (a
concentraciones finales de 10, 20, 50 y 100 μg/mL) y 50 μL de agua destilada. Luego
se guardara la mezcla a temperatura ambiente durante 60 min y se medirá la
absorbancia a una longitud de onda de 593 nm en un espectrofotómetro, usando
agua estéril para ajustar el blanco del equipo. Para cada muestra se tendrá en
cuenta la lectura de la absorbancia del blanco que no contenía TPTZ y se utilizará
ácido ascórbico como patrón de referencia. Todas las lecturas se realizarán por
triplicado y se graficará la absorbancia en función de las concentraciones de
muestra, para observar la cantidad de Fe 2+ formado en la reacción a diferentes
concentraciones de muestra.

28
 5.8. Evaluación de la actividad antifúngica

La actividad antifúngica de los extractos se evaluará frente a la cepa de referencia

del hongo Candida albicans (ATCC 10231) y a los aislados clínicos Candida
albicans (sangre) y Candida krusei (catéter). La capacidad inhibitoria de los
extractos frente a las especies de Candida sp. se evaluarán en un rango de
concentraciones a determinar en ppm en DMSO al 10% mediante los métodos de
difusión en agar empleando pozos y microdilución, según el estándar establecido
por el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

5.8.1. Método de microdilución

Se emplearán microplacas ELISA de 96 pozos, sobre las cuales se adicionan 50 μL

de los extractos a las concentraciones anteriormente mencionadas y 50 μL de la
suspensión fúngica previamente estandarizada. Como control positivo se utilizarán
pozos que contienen el antifúngico comercial Fluconazol (5000 ppm), y como control
negativo, pozos con DMSO al 10%, y su respectivo control de crecimiento. Las
microplacas serán selladas con adhesivos e incubadas a 36 ± 1 °C por 24 horas.
Tras la incubación, el crecimiento fúngico se detectará por medición de la densidad
óptica a 630 nm en un lector de ELISA (ChroMate® 4300).

5.8.2. Método de difusión en agar: empleando pozos

Se tomará 1 mL del inóculo previamente estandarizado y se mezclará con 25 mL de

Agar Saboraud Glucosado fundido a 48°C, se servirá en cajas de Petri previamente
estériles, una vez solidificadas se realizarán pozos en el agar aproximadamente de
6 mm de diámetro con ayuda de un sacabocados estéril, luego se agregarán en
cada pozo 50 μL de los extractos a evaluar, a las concentraciones previamente
descritas. Como control positivo de adicionará en uno de los pozos 50 µL del
antifúngico comercial Fluconazol a una concentración 1000 ppm, como control
negativo, se utilizarán pozos con DMSO al 10%. Posteriormente, las cajas serán
selladas con adhesivos e incubadas a 36 ± 1 °C por un periodo de 72 horas, el cual

29
se monitoreará a las 24 h. Los ensayos se realizarán por triplicado, tras la
incubación, la evaluación se realizará por medición del diámetro de las zonas de
inhibición de crecimiento alrededor de los pozos para ser comparado con los
controles.

5.9. Análisis estadístico

En los ensayos de actividad antifúngica se utilizará un diseño completamente al

azar. Todos los ensayos se realizarán por duplicado con tres repeticiones en cada
uno y los datos obtenidos serán analizados por ANOVA y la prueba de Tukey
(α=0,01; p<0,01).

En la evaluación de la actividad antioxidante para encontrar los valores de IC 50

correspondientes, el experimento se hara bajo un diseño completamente al azar.
Todos los ensayos se realizarán por triplicado y los datos obtenidos serán
analizados por ANOVA y la prueba de Tukey (α=0,01; p<0,01). Para la
determinación de la concentración inhibitoria media (IC 50) se utilizará regresión
lineal.

30
6. BIBLIOGRAFÍA

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7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Tabla 5. Cronograma de actividades a realizar

TIEMPO (MESES)
ACTIVIDAD
1 2 3 4 5 6

Toma de muestras
X X

Obtención de Extractos X X

Evaluación de actividades
biológicas
X X

Separación, Purificación y
Elucidación de Metabolitos
X X X
secundarios

Revisión Bibliográfica X X X X X X

Redacción del informe final X

35
8. PRESUPUESTO

Esta investigación será financiada por la Universidad de Córdoba y desarrollada en

el Grupo de Investigación “Química de los Productos Naturales”
Tabla 6. Presupuesto global de la propuesta (en miles pesos)

RUBROS TOTAL

Personal $0

Equipos $0

Salidas de campo $1.100

Bibliografía/software $700

Materiales e insumos $1.580

Servicios técnicos $1.500

Construcciones $0

Mantenimiento $0

Asistencia a congresos/viajes $1.300

Otros (informe final y publicación) $1.500

TOTAL $7.680

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