Benemérita Universidad

Autónoma de Puebla

Facultad de Ciencias Biológicas

Licenciatura en Biotecnología
Química Analítica

Cromatografía
Objetivos.

Generales.
● Conocer el funcionamiento de la cromatografía.
● Comprender los fundamentos mediante los que funciona.
● Conocer y comprender los diversos tipos de cromatografía.

Específicos.
● Entender la relación entre la cromatografía y la biotecnología
● Aprender sobre los diversos usos de la cromatografía en la biotecnología.
● Reconocer la importancia de la cromatografía en la biotecnología.

Introducción.
La palabra cromatografía viene del griego chroma: color y graphos: escritura; esta técnica analítica consiste
en la separación física de los componentes de una mezcla; tiene la propiedad de dividir a las moléculas en
función de su polaridad, de sus cargas moleculares, potencial redox o de sus constantes de disociación. (Herrera
2016); una de las características principales de dicha técnica es la separación en dos fases inmiscibles entre
sí; una fase móvil (fluido que se mueve en una dirección determinada a través de la fase estacionaria, puede
ser un líquido, un gas, etc.) que desplaza a los compuestos de la mezcla y la fase estacionaria (contiene la
muestra).
La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende
de su afinidad relativa por ambas fases. En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan
lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor
rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de
la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un
detector, su caracterización química.
Diferentes tipos de cromatografía:
● En papel
● En capa fina
● De gases
● Líquida
● Líquida en fase inversa
● Permeación en gel
● Intercambio iónico
● Exclusión de iones
● Fluidos supercríticos
● De afinidad

Antecedentes.

Generales.
La historia de la cromatografía podría decirse que comienza en el año de 1850 cuando el químico F.F. Runge
que gracias a sus trabajos con tintas logró la separación por migración de cationes orgánicos; tiempo después
en 1906 el botánico Mijaíl Tswett (primero en usar el término cromatografía) mediante la separación de
colorantes vegetales dio pasó a la cromatografía por columna.
En el año de 1938 dos científicos rusos Izmailov y Schraiberen mediante trabajos con tinturas farmacéuticas
dan origen a la cromatografía en capa fina. Pero es hasta el año 1956 que Egon Stalh le da oficialmente ese
nombre.
Avanzando un poco más, en el año de 1943 Archer John Marti descubrió que, gracias a las interacciones del
soluto con el papel, hacen que los compuestos se desplacen a velocidades diferentes; creando así el método
de la cromatografía en papel. En 1952 Anthony Trafford James y Archer John Porter Martin desarrollan la
cromatografía de gases.

Específicos.
● 1848: H. Thompson y T.J. Way, mediante sus trabajos con arcillas, lograron la extracción y obtención
de cianuro y calcio respectivamente logrando así entender el intercambio iónico en sólidos.

● 1850: Friedrich Ferdinand Runge, Christian Friedrich Schönbein, hicieron diferentes experimentos
mediante el análisis por capilaridad en papel de distintas tintas, a Runge se le considera como pionero
en el descubrimiento de la cromatografía en papel.

● 1876: Lemberg estudió la estequiométria del intercambio iónico de los minerales.

● 1892: Reed logró la separación de dicromato de potasio de la eosina, mediante tubos rellenos de
kaolin; tiempo después a esta técnica se le dio el nombre de análisis frontal en cromatografía de
columna.

● 1906: Se le considera como el padre de la cromatografía, describió el proceso de extractos vegetales

mediante la cromatografía por columna
● 1930: Richard Kuhn, Paul Karrer, László Zechmeister paralelamente trabajaban en mejorar la técnica
de cromatografía para los estudios de pigmentos vegetales.
● 1935: B.A. Adams y E.L Holmes lograron obtener resinas sintéticas por intercambio de iones.
● 1938: Reinchstein fue pionero de la cromatografía de líquidos, además de extender las aplicaciones de
la cromatografía a sustancias incoloras; conjuntamente los investigadores Izmailov y Schraiber
lograron la separación de extractos de plantas por cromatografía en capa fina de alúmina.
● 1952: Richard L. M. Synge y Archer John Porter Martin desarrollaron la cromatografía de participación,
que trata de que la fase estacionaria pasa de sólida a líquida.

Desarrollo.
El método utilizado para realizar el experimento es una variante de la cromatografía liquida de ultra precisión
(UPLC, por sus siglas en inglés). Esta se beneficia de los múltiples desarrollos tecnológicos en la química de
partículas, el diseño de detectores y el procesamiento y manejo de datos, manteniendo los mismos principios y
ventajas de la HPLC y mejorándolas en velocidad, sensibilidad y resolución.
Aun cuando la UPLC y la HPLC funcionan bajo los mismos principios, la UPLC trabaja con partículas de tamaño
menor a 2µm que según la ecuación de Van Deemter, al disminuir el tamaño de las partículas por debajo de
2.5µm no solo existe una importante ganancia en la eficiencia del método, si no que esta eficiencia no disminuye
con el incremento de la velocidad del fluido. Debido al uso de partículas mas pequeñas, mayor velocidad y
capacidad de carga, es que se realiza la diferencia con su método antecesor.
Al utilizar partículas de menor tamaño es necesario mayores presiones de funcionamiento y un sistema
diseñado apropiadamente para capitalizar la ganancia en eficiencia, un sistema que pueda tanto entregar de
manera fiable la presión requerida y mantener la eficiencia en la separación de las pequeñas partículas.
Si lo que buscamos es sin embargo una mejora en la velocidad del análisis, al tener las partículas pequeñas y
un alto flujo, podemos simplemente acortar la longitud de la columna, acortar la columna en un tercio nos
permitirá realizar el procedimiento en una novena parte del tiempo y mantener la resolución.
Existen muchos métodos de separación, sin embargo, la utilizada en la realización del experimento fue la de
fase reversa. Esta recibe su nombre debido a que hace uso de una fase estacionaria no polar y una fase móvil
polar, separando analitos hidrofóbicos, de manera inversa a la fase normal.
Este tipo de cromatografía separa los analitos según su afinidad con cualquiera de las fases, introduciendo la
mezcla de analitos en la columna, y a medida que la fase móvil avanza los analitos entraran en contacto con la
fase estacionaria, los compuestos hidrófobos contaran con una mayor afinidad a la fase estacionaria, aquellos
que sean hidrofílicos tenderán a quedarse con la fase móvil y se transportaran de manera acelerada a través
de la columna.
Para este caso se utilizó un método por exclusión de tamaño, en este la fase estacionaria es un material poroso
separando los solutos en función de sus tamaños moleculares. Los rellenos utilizados deben ser inertes,
estables, resistentes y con un tamaño de partícula y poro uniforme. Los analitos que tienen mayor tamaño no
pueden adsorberse por lo que son excluidos y se eluyen con rapidez, los que tienen tamaños menores pueden
penetrar en los poros y ser retenidos por un mayor tiempo.
El método de exclusión por tamaño proporciona ciertas ventajas, como tiempos de separación más cortos y
definidos, buena sensibilidad, menor perdida de solutos al no interactuar con la fase estática, no obstante, este
también cuenta con ciertas desventajas ya que debido a los tiempos cortos la cantidad de bandas que se pueden
acomodar es limitada, a su vez esta no puede separar analitos con dimensiones similares, isómeros, requiriendo
una diferencia del 10% en las masas moleculares.
En el principio de la UPLC era común el uso de columnas de sílice, las cuales tenían ciertas desventajas, como
un bajo rango de pH y presencia de residuos de sustancias básicas, este último ocasionado por la deprotonación
de los grupos silanol que eran incapaces de desactivar y mientras que las columnas de polímeros eran capaces
de sobrepasar el problema del pH, estas tenían una baja eficiencia, capacidades de carga limitada y una pobre
fuerza mecánica. Esto hizo necesaria la creación de columnas hibridas que combinaran las fortalezas de ambos
tipos sin tener sus desventajas, estas fueron producidas mediante una síntesis sol-gel incorporando grupos
metilo.
Esta fue posteriormente actualizada a una tecnología de híbrido etílico entrelazado (BEH) en orden de obtener
una estabilidad mecánica adecuada, mediante el entrelazado de los grupos metilo a la matriz de sílice.
Para completar la cromatografía es necesaria la utilización de un sistema para la detección de estos analitos,
en este caso se utilizó un detector de dispersión de luz multiangular (MALS), este mide la masa absoluta molar
y el tamaño promedio de las moléculas en la solución a través de la forma en la que estas dispersan la luz.
Al tener un mayor rendimiento por muestra con una mayor cantidad de información los tiempos para que un
producto pueda ser comercializado se ven reducidos, algo que resulta de suma importancia para la industria
farmacéutica, al contar con una resolución tan alta nos permite el análisis de metabolitos con menor
concentración, previniendo el uso de compuestos potencialmente tóxicos. Este también resulta útil en la
separación de compuestos biológicos y la detección de sustancias en sangre.

“Acoplamiento de dispersión de luz de múltiples ángulos a la cromatografía de

ultra alta presión de fase inversa (RP-UPLC-MALS) para la caracterización de
anticuerpos monoclonales”
Resumen.

La dispersión de luz de múltiples ángulos junto con la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-MALS) es
un enfoque estándar para la caracterización de proteínas. Recientemente, la detección de MALS se ha
combinado con la cromatografía de intercambio iónico (IEX) que demostró la viabilidad y el alto valor de MALS
en combinación con métodos de fraccionamiento no basados en el tamaño. En este estudio, en el estudio del
cual trata este artículo, se acoplo la cromatografía líquida de ultra alta presión en fase inversa (RP-UPLC) con
un detector MALS de baja dispersión para la caracterización de anticuerpos monoclonales (mAbs) intactos y
sus fragmentos. Con esto se confirmó un valor de incremento del índice de refracción constante para mAbs en
gradientes RP, de acuerdo con los valores en la literatura para otras clases de proteínas.

Se logró demostrar que las impurezas que se eluyen de una columna RP a menudo pueden estar
relacionadas con especies agregadas y se pudo confirmar que en la mayoría de los casos estos oligómeros
también están presentes en SEC-MALS. Sin embargo, en algunos casos, las fracciones de agregados
pequeños en RP-UPLC son un artefacto. De hecho, las proteínas que presentan estabilidad térmica y física no
adecuadas para la condición severa aplicada durante la separación RP de mAbs (es decir, solventes
orgánicos a alta temperatura) pueden agregarse. Aunado a esto, se aplicó RP-UPLC-MALS durante los
estudios de estabilidad a largo plazo. El principio diferente de separación utilizado en RP-UPLC-MALS
proporciona un nivel crítico adicional de caracterización de proteínas en comparación con SEC-MALS e IEX-
MALS.

Introducción.
La dispersión de la luz es una de las técnicas ampliamente utilizadas para la caracterización de
macromoléculas y partículas en solución en ciencias biológicas y biofarmacéuticas (Minton, 2016). Con
mucho, la aplicación más común de la dispersión de la luz en este campo es la determinación de la masa y el
tamaño de las proteínas por medio de la dispersión de la luz de múltiples ángulos junto con la cromatografía
de exclusión por tamaño (SEC-MALS) (Wyatt, 1993) o el fraccionamiento de flujo de campo (FFF-MALS)
(Wittgren & Wahlund, 1997). Otras aplicaciones importantes incluyen la caracterización de la estabilidad
coloidal y conformacional de la proteína y la caracterización de la interacción “proteína-proteína” tanto
específica como no específica. El uso de MALS con muestras fraccionadas produce un cálculo del peso
molecular absoluto (M w) en cada punto del cromatograma.

Como el “M w” estimado por el tiempo de retención es a menudo inexacto SEC-MALS proporciona una
herramienta útil para la determinación de monómeros y fragmentos “M w” precisos, estado oligomérico y radio
hidrodinámico (Rh). Recientemente se han demostrado las ventajas de acoplar MALS con cromatografía de
intercambio iónico (IEX), pues el IEX separa las proteínas de acuerdo con la carga superficial en función de
las diferencias en la interacción iónica con la matriz de soporte. El principio diferente utilizado en la separación
de IEX-MALS proporciona información crítica adicional y puede resolver las deficiencias de SEC-MALS.

En este trabajo, acoplaron MALS con otro tipo de cromatografía líquida, fase inversa (RPLC), ¿qué es RPLC?
pues se refiere a una técnica muy prometedora para estudiar los cambios químicos y cuantificar péptidos y
proteínas, incluidos los anticuerpos monoclonales (mAbs). Históricamente, el uso de RP para monitorear mAb
intacto fue limitado porque la naturaleza hidrofóbica e hidrófila compleja de estas proteínas grandes causó una
recuperación deficiente y una resolución limitada.

Recientemente, el uso de columnas con poros grandes (300 Ȧ) a altas temperaturas (60–75 °C) en
combinación con un sistema de solventes no tradicional que contiene agentes de apareamiento iónico se ha
consolidado como un procedimiento estándar para el análisis de mAbs, superando las dificultades anteriores.
Las pequeñas diferencias químicas no pueden separarse mediante RP-HPLC estándar, ya que a menudo son
insuficientes para producir cambios significativos en la polaridad. Aquí, aprovechamos la instrumentación de
LC de presión ultra alta (UPLC) para refinar aún más la separación de las especies de mAb y sus derivados.
Investigamos RP-UPLP-MALS para la caracterización de mAb, enfocándonos en dos aplicaciones comunes:
 ● Análisis y caracterización de fragmentos de mAb, que generalmente se estudian por espectrometría de
masas,
● Análisis de mAbs después del almacenamiento a largo plazo.

La primera es una prueba de estabilidad en tiempo real que permite establecer las condiciones de
almacenamiento recomendadas y la vida útil de los productos bioterapéuticos. La adición de MALS permite la
asignación de “M w” para cada pico individual en el cromatograma, lo que permite la diferenciación entre
variantes químicas de la forma monomérica y otras impurezas o productos de degradación como agregados y
fragmentos.

Materiales y métodos.

Preparación de la muestra.

Para este estudio se registró que AstraZeneca (Cambridge, Reino Unido) proporcionó cinco anticuerpos IgG1
(PPI02, PPI03, PPI04, PPI10, PPI13), un anticuerpo biespecífico (PPI08), un IgG2 (PPI17) y una proteína de
fusión HSA (PPI18). El interferón alfa-2a (PPI30) fue proporcionado por Roche Diagnostics GmbH. Las
proteínas se dializaron durante la noche usando casetes Slide-A-Lyzer™ (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, EE. UU.) Con un corte de membrana adecuado contra un exceso de 10 mM de tampón de histidina
HCl con pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5. Las soluciones madre de excipiente (por ejemplo, NaCl) se prepararon
en los tampones respectivos. La concentración de proteínas se midió en un Nanodrop 2000 (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, EE. UU.) Utilizando el coeficiente de extinción de proteínas calculado a partir de la
secuencia primaria. Todas las condiciones se prepararon en tubos Eppendorf de PP sin recubrimiento de 1,5
ml. Finalmente, las formulaciones se filtraron estérilmente con filtros de acetato de celulosa de 0,22 μm de
VWR International (Darmstadt, Alemania). La pureza de las proteínas fue estudiada por SEC y cEIF.

Ahora, ¿por qué es importante nombrar a las empresas responsables de los reactivos, materiales y equipo?,
Porque el registro de los resultados se puede ver influenciado por las características de estos, exactitud de
mediciones, tal vez la fuerza con la que hacen su trabajo o las revoluciones del motor (en el caso de algunos
equipos), la pureza de las sustancias, etcétera; además de esto, ciertas empresas, ciertas instituciones, tienen
mayor prestigio que otras debido a que sus productos fueron ocupados anteriormente y dieron gratos
resultados.

Cromatografía de fase inversa de presión ultra alta combinada con dispersión de luz de
múltiples ángulos (RP-UPLC-MALS).

RP-UPLC-MALS se realizó en un sistema ACQUITY UPLC H-Class (Waters, Reino Unido) equipado con una
bomba cuaternaria, un inyector automático, un detector UV y un detector μDAWN (Wyatt Technology, EE.
UU.). La separación se realizó con un Acquity BEH-300 C4 (Waters, Reino Unido) y una columna Zorbax
300SB-C8 (Agilent Technologies, EE. UU.). Las muestras se diluyeron a 1 mg/ml antes de la inyección. Para
los anticuerpos monoclonales, se usó un gradiente piloto del 20 al 40% del eluyente B en A durante 20
minutos. El eluyente A consistía en acetonitrilo al 10% p/v y ácido trifluoroacético al 0,1% p/v en agua ultra
pura. El eluyente B consistió en 0.1% p/v de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. El caudal fue de 0,2 ml/min.
La temperatura del horno de columna se ajustó a 75 °C. Se incluyó un precalentado antes de la columna.
Posteriormente, dependiendo de la proteína y la columna utilizada, el gradiente se ajustó. Todos los métodos
se basaron en un gradiente del 20-25 al 40%. La adsorción en columna de los mAbs se evaluó
sistemáticamente y se alcanzó una recuperación de masa casi completa para todas las proteínas.

Todos los cálculos se realizaron con el software ASTRA V7.1 (Wyatt Technology, EE. UU.). La recuperación
de masa se calcula a partir de la masa inyectada frente a la masa calculada del detector de concentración (es
decir, UV). Por lo tanto, para lograr una determinación precisa de la recuperación de masa, la concentración
de la muestra debe medirse con precisión. Por lo tanto, la concentración se midió nuevamente antes de la
inyección en triplicados reales por un Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.). Los
coeficientes de extinción teóricos se verificaron nuevamente y volvieron a calcular los valores de los picos
monoméricos de RI durante los experimentos SEC-MALS. Se usó PPI30 (int-2alpha) como estándar.
Finalmente, para lograr una línea base plana, recolectamos y restamos los espacios en blanco mediante el
algoritmo incluido en el software ASTRA V7.1.

Cromatografía de exclusión por tamaño combinada con dispersión de luz multiángulo (SEC –
MALS).

SEC-MALS se realizó en el sistema Agilent 1260 Bio-Inert con un detector UV de longitud de onda variable
operado a 280 nm (Thermo Fischer Scientific, EE. UU.), Seguido de un detector TREOS II (Wyatt
Technology, EE. UU.) Y un Optilab T-rEX (Wyatt Tecnología, Estados Unidos). El inyector automático de
temperatura controlada se mantuvo a 4 °C. La separación se realizó con una columna Superdex 200
aumentada 10/30 GL. Los datos se recopilaron y procesaron utilizando el software ASTRA® V7.2 (Wyatt
Technology, EE. UU.). La fase móvil acuosa consistió en NaH2PO4 38 mM, Na2HPO4 12 mM, NaCl 150 mM
y NaN3 200 ppm a pH 7.4 disuelto en agua de grado HPLC, filtrado a través de filtros de membrana Durapore
VVPP 0.1 m (Millipore Corporation, EE. UU.). Las muestras fueron centrifugadas e inyectadas en duplicados
de 25 µl.

Ensayo de estrés.

Se dividieron en alícuotas de 0,2 ml de cada solución de proteína a una concentración de 1 mg/ml y se

filtraron en tubos Eppendorf de PP no recubiertos estériles de 0,5 ml. Las muestras se incubaron a 4 °C y 25
°C, durante 6 meses. Después del almacenamiento, las muestras se enfriaron en un baño de hielo, se dejaron
a 4 °C y se midieron en dos semanas. La concentración de la muestra se midió después del estrés en
triplicados reales mediante un Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.). De manera
similar, el pH se midió después del estrés sin mostrar cambios dentro del error experimental (es decir, ± 0.1).

Preparación y purificación de fragmentos Fab y Fc.

Se utilizó papaína inmovilizada (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) Para digerir PPI01 en sus
fragmentos Fab y Fc. Se pipeteó PPI01 a 20 mg/ml en un vial de vidrio de 15 ml, el vial se cubrió con el
separador de resina provisto con el kit para eliminar toda la interfaz aire-líquido. El vial se hizo girar
suavemente con un rotador Sunlab SU1100 durante 5 a 37 °C. Se usó un purificador ÄKTA 10 (GE
Healthcare, Uppsala, Suecia) equipado con un cartucho de cromatografía de proteína A Pierce (Thermo
Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) (Volumen de columna, CV = 5 ml) para separar Fc (y mAb no digerido)
de los Fragmentos fab. El tampón de unión estaba compuesto de fosfato de sodio 100 mM con NaCl 150 mM
a pH 7,2. La columna se equilibró con 2 CV de tampón de unión con un flujo de 2 ml/min.

Las fracciones se recogieron en tubos de PP de 15 ml utilizando un colector de fracciones Frac 920 (GE
Healthcare, Uppsala, Suecia) capturando cualquier especie no unida, por ejemplo, Fab. El tampón de elución
(fosfato de sodio 100 mM a pH 3) se mantuvo al 100% durante 7 CV. La proteína eluyente se recogió en tubos
de PP de 15 ml utilizando el colector de fracciones, y se neutralizó inmediatamente con un tampón de fosfato
de sodio 1 M a pH 8,5. La ultrafiltración se realizó utilizando tubos Vivaspin® con una membrana MWCO PES
de 10 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Gotinga, Alemania). El éxito de la purificación fue monitoreado por HP-
SEC. La ultrafiltración se realizó utilizando tubos Vivaspin® con una membrana MWCO PES de 10 kDa
(Sartorius Stedim Biotech, Gotinga, Alemania).

Resultados y discusión
Técnica RP-HPLC-MALS.

El principio de RP-HPLC-MALS es la combinación de cromatografía RP con un detector MALS en línea (fig.1).

Múltiples áreas hidrofóbicas de moléculas de proteínas interactúan con la superficie derivada de alquil silano
de la fase estacionaria. La separación se logra disminuyendo la concentración de agua en la fase móvil
aumentando la fracción de solvente orgánico (por ejemplo, acetonitrilo). Esto a su vez debilita la atracción
hidrofóbica de la proteína a la columna. Durante la elución de la columna, las moléculas se introducen en un
detector de concentración (es decir, UV) y posteriormente en un detector MALS. Usando estos detectores
para medir el “M w” la elución de moléculas es especialmente importante ya que no se puede aplicar ningún
procedimiento de calibración de columna, análogo al de SEC analítico, para relacionar el tamaño de una
molécula con su interacción hidrófoba con una matriz de columna.

Ilustración esquemática del método RP-UPLC-MALS. Se inyecta una muestra de proteína en la columna de
cromatografía RP en línea con un detector MALS. La proteína interactúa con la matriz hidrofóbica.

Desarrollo de RP-UPLC-MALS.

Las buenas condiciones de RP-HPLC para el análisis de proteínas intactas se logran típicamente con una
UPLC, una fase estacionaria con una longitud de cadena de alquilo corta y un gran tamaño de poro, un fuerte
agente de apareamiento de iones y un gradiente adecuado que disminuye el contenido de agua de la fase
móvil a alta temperatura. Acoplamos un detector MALS de bajo volumen y baja dispersión a nuestro sistema
UPLC que permite un ancho de pico pequeño y alta resolución. Se utilizaron seis IgG1 diferentes (PPI01,
PPI02, PPI03, PPI04, PPI10, PPI13), una IgG2 (PPI17), una biespecífica (PPI08) y un conjugado proteína-
fármaco (PPI18) para desarrollar y evaluar el método RP-UPLC-MALS, IFNα2a sirvió como referencia, ya que
RPLC es una técnica bien establecida para detectar sus especies químicamente modificadas. Durante el
desarrollo del método RP-UPLC-MALS, se evaluaron el tipo de columna, la temperatura, el caudal, el volumen
de inyección, la fase móvil y el gradiente.

Algunas proteínas presentaron una mejor resolución con la columna BEH-300 C4 en comparación con la
columna Zorbax 300SB-C8. Sin embargo, se notó una rápida disminución de la eficiencia con el BEH-300 C4
después de solo 400 inyecciones, mientras que el Zorbax 300SB-C8 mostró una buena robustez. Esto
posiblemente se deba al hecho de que la química de la fase C4 es menos resistente a la hidrólisis en medios
ácidos que la química de la fase C8. Como el cribado de proteínas en múltiples formulaciones y en muchos
puntos de tiempo implican miles de inyecciones, seleccionaron el Zorbax 300SB-C8 como caballo de batalla.

Para determinar “M w” correctamente, es necesario conocer el incremento del índice de refracción del soluto
en el valor de la solución dn/dc y la concentración para cada segmento de un pico. Se ha demostrado que
MALS es compatible con gradientes de elución RPm, investigaron diferentes clases de proteínas en la
literatura con diversas composiciones de fase móvil que contienen tampón acuoso y acetonitrilo que producen
valores de dn/dc cercanos a 0.175 ml/g.

Se demostró que asumir una constante dn/dc en el intervalo estrecho de un pico de elución solo induce un
error como máximo 3-4%. Esto se debe al hecho de que el índice de refracción del solvente cambia solo muy
ligeramente dentro del marco de tiempo de elución máxima.
Primero calcularon la proteína “M w” usando el dn/dc de proteínas en agua a 660 nm de 0.185 ml/g, el “M w”
obtenido fue de aprox. 25% por debajo del “M w” calculado en base a la secuencia primaria. En consecuencia,
fijaron el “M w” del monómero calculado a partir de la secuencia primaria y confirmado por SEC-MALS para obtener un
dn/dc en el eluyente RP-MALS. Esto produjo un valor dn/dc de 0.1742 +/− 0.0017 ml/g para las proteínas, que se usó
para calcular el “M w” de las proteínas investigadas.

Análisis de anticuerpos monoclonales intactos utilizando RP-UPLC-MALS.

Las proteínas con un tamaño similar no se pueden separar por SEC, pero si tienen una hidrofobicidad
diferente, se pueden separar por RP-UPLC. En el estudio se encontraron tres casos:

● El “M w” de todos los picos refleja variantes monoméricas (p. Ej. PPI01 y PPI10)
● El pico principal representa una forma monomérica mientras que otros picos de impurezas se
identifican como agregados (p. Ej. PPI04)
● El pico principal representa una forma monomérica, mientras que otros picos de impurezas se
identifican como agregados, fragmentos o cercanos, pero no iguales dentro del error experimental, al
monómero “M w” (por ejemplo, PPI02) (Fig. 2).

Los dímeros detectados en SEC-MALS (Fig. 3) no se encontraron en RP-UPLC-MALS (Fig. 2), como la
recuperación de RP-UPLC fue a menudo cercana o exactamente del 100%, planteamos la hipótesis de que:

● El equilibrio monómero-dímero se desplaza completamente hacia la forma monomérica en el eluyente

RPLC
● Los dímeros se incitan a una agregación adicional
● Los dímeros se pierden sobre la columna. Tanto RP-UPLC-MALS como SEC-MALS confirmaron la
ausencia de oligómeros más allá de los dímeros visibles en SEC para PPI01 y PPI10 (Fig. 2).

Se llegaron a conclusiones similares para PPI13, PPI08 y PPI17. De manera diferente, PPI04 (Fig. 2) y PPI18
mostraron una fracción muy pequeña de oligómeros por RP-UPLC-MALS, que no se detectaron en SEC-
MALS (Fig. 3), estos oligómeros pueden haber sido inducidos por la alta temperatura de 75 °C aplicada
durante la separación de RP. La primera temperatura de despliegue (Tm1), la temperatura de agregación
(Tagg) y el parámetro de interacción de difusión (kD) para PPI01, PPI02, PPI03, PP10 y PP17 son 66, 61 °C y
5.6 mg/L (datos promediados de 24 condiciones de formulación, Gentiluomo L, et al.), en comparación con 54
°C, 47 °C y 4.7 mg/L resp. para PPI18 y 64 °C, 55 °C y −1.9 mg/L para PPI04. Esta menor estabilidad térmica
y/o coloidal de PPI18 y PP4 podría explicar su susceptibilidad a la agregación en condiciones de RP.

Finalmente, PPI02 mostró agregados y fragmentos (resaltados en rojo en la Fig. 2) que también se detectaron
en SEC-MALS (Fig. 3). El “M w” promedio de los agregados PPI02 de SEC-MALS y RP-UPLC-MALS son
respectivamente de 250 kDa y 235 kDa, esta diferencia probablemente se deba al alto error en los cálculos de
“M w”, que a su vez se debe a la pequeña concentración de tales agregados. Además, el agregado de 235
kDa en RP-UPLC-MALS no está separado de la línea base; PPI02 presentó además una serie de picos y
hombros con 5 a 15 kDa de diferencia con el monómero “M w”, que no eran visibles por SEC-MALS.

En “M w” la diferencia puede deberse posiblemente a modificaciones postraduccionales de la IgG. Estos

típicamente incluyen oxidación de metionina, desamidación de asparagina y glutamina, acetilación o ciclación
N-terminal, glicación de lisina y glicosilación variable. Físicamente, el incremento del índice de refracción es
insensible a la estructura de largo alcance de las macromoléculas y es casi independiente de su composición
de aminoácidos, sin embargo, los restos de carbohidratos sí afectan el valor del índice de refracción, esto
sugeriría que PPI02 viene con un alto grado de variación en la glicosilación.
 RP-UPLC-MALS de mAbs. Cromatogramas típicos que muestran las señales UV y MALS de PPI02, PPI01, PPI04 y
PPI10 analizadas por RP-UPLC-MALS. El MW del monómero, agregados / fragmentos y dímeros se resaltan en azul y
respectivamente. (*) denota agregados.

SEC-MALS de mAbs. Cromatogramas típicos de las proteínas investigadas por SEC-MALS que muestran señales UV y
LS superpuestas con la masa molar calculada. La MW del monómero, los agregados / fragmentos y los dímeros se resaltan
en azul, rojo y verde, respectivamente. HMW significa especies de alto peso molecular, que generalmente no están
separadas, y en todos nuestros casos investigados no presentaron señal UV detectable. (*) denota agregados; (**) denota
dímeros.
Caracterización de fragmentos Fab y Fc.

La digestión proteolítica completa de mAb (mapeo de péptidos) seguido de RP-UPLC junto con
espectrometría de masas (MS) es un método bien establecido para la identificación y cuantificación de la
modificación química de mAbs. Alternativamente, el análisis por MALS de fragmentos grandes, como Fab y
Fc, requiere poca preparación de la muestra y puede proporcionar una alternativa de alto rendimiento, la
preparación y purificación de los fragmentos se realizó como se describe en el material y los métodos.

Posteriormente, se investigaron los fragmentos Fab y Fc de PPI01 por RP-UPLC-MALS. El fragmento Fc

eluyó antes del mAb intacto, que a su vez eluyó antes del fragmento Fab (Fig. 4). Este último exhibió dos
hombros a la izquierda y derecha del monómero de 47 kDa con un “M w” cercano al de un dímero Fab (~90
kDa). El fragmento Fc eluye con una serie de picos después del pico principal de ~110, ~700, ~170 kDa con
un tiempo de elución más largo. Las mediciones SEC-MALS en los fragmentos purificados confirmaron la
presencia de dímero Fab y de dímero y trímero Fc (los fragmentos se mostraron en SI 3, el mAb intacto se
mostró en la Fig. 3).

Sin embargo, el agregado de 700 kDa Fc no se detectó en SEC-MALS. Como se mencionó anteriormente, la
formación de una pequeña fracción de oligómeros de alto peso molecular debido a las condiciones de RP
puede afectar a las proteínas con una estabilidad térmica y / o coloidal insuficiente. PP01 muestra T m1
promediada, que refleja típicamente el despliegue del dominio CH2 y T m2, que refleja típicamente el
despliegue del fragmento CH3 y Fab, de 64 y 77 °C.

Esto explicaría la mayor susceptibilidad del fragmento Fc al despliegue y la agregación. Por lo tanto, podría
ser útil acoplar MALS con RP-UPLC-MS para diferenciar entre monómero y pico de agregados antes de
analizar los espectros de MS.

UPLC-MALS de PPI01 y sus fragmentos. Los fragmentos PPI01 Fc, PPI01 (mAb completo) y el fragmento Fab PPI01 se
trazan en líneas azul, negra y roja, respectivamente.
Estudios de estabilidad a largo plazo.

Finalmente, realizaron un estudio de estabilidad a largo plazo y se analizaron muestras con el método RP-
UPLC-MALS desarrollado en este documento para saber la posibilidad de obtener información adicional de la
información MALS sobre la estabilidad química de las proteínas. PP02, PP03, PP04, PP08, PP10, PP13 se
probaron en 8 formulaciones diferentes durante seis meses a 4 °C y 25 °C.

Con lo que se observó una alta estabilidad química general, los cambios significativos en el estrés de
almacenamiento ocurrieron solo en algunas condiciones. PP10, formulado en His 10 mM a pH 6,5
almacenado a 25 °C, exhibió una mayor hidrofobicidad del hombro, presentando el mismo “M w” del
monómero (Fig. 5) Los cambios químicos pueden perturbar la estructura local de conformación de las
proteínas, como en el caso de la desamidación, la reacción hidrolítica más común para la proteína y la
isomerización de Asp. Las variantes conformacionales de las proteínas a menudo presentan una mayor
hidrofobicidad y son más propensas a agregarse.

Otras reacciones químicas, como la oxidación de Met, podrían disminuir la hidrofobicidad de las proteínas. Sin
embargo, RP-UPLC-MALS no puede proporcionar una visión mecanicista detrás de una mayor hidrofobia
después del estrés isotérmico. Para tal fin, la espectroscopía de masas, que podría combinarse con RP-
UPLC-MALS, podría proporcionar la cuantificación de los productos de degradación, como en el caso de los
productos de desamidación. PPI08 almacenado a 25 °C en histidina 10 mM a pH 5 mostró un nuevo pico con
un “M w” de 225 kDa, que parece ser no se observó en ninguna otra formulación y no se notó en SEC-MALS
(Fig. 5).

Este agregado probablemente está formado por una mezcla de fragmentos formados durante la tensión, por
ejemplo, Fab, Fc, cadena pesada o por un complejo formado por monómero y cadena ligera. La comparación
con SEC-MALS confirmó la presencia de fragmentos (Fig. 5). Como no se obtuvo la separación inicial entre el
monómero y el dímero, no pudimos determinar si el pequeño complejo está presente en la formulación o si se
formó durante la separación RP. Independientemente, MALS proporcionó la “M w” exacta de los picos
eluyendo sobre RP-UPLC, que permitió la diferenciación entre variantes químicas del monómero (es decir, en
casos de PPI10) y agregados (es decir, en caso de PPI08) formados durante el almacenamiento a largo plazo.
 RP-UPLC-MALS y SEC-MALS de mAbs para estudios de estabilidad a largo plazo. Cromatogramas típicos del estudio
de almacenamiento a largo plazo, que muestran las regiones de la muestra de elución.
Arriba: cromatogramas RP-UPLC-MALS; abajo: cromatogramas SEC-MALS. Izquierda: PPI10; derecha: PPI08. El “M
w” del monómero, los agregados / fragmentos y los dímeros se resaltan en azul, rojo y verde, respectivamente. HMW
significa especies de alto peso molecular, que generalmente no están separadas, y en todos nuestros casos investigados no
presentaron señal UV detectable. Una sección ampliada muestra las impurezas para PP08. El desplazamiento de los
cromatogramas en diferentes puntos temporales se debe al envejecimiento de la columna. PPI10 se muestra en una sola
formulación (His 10 mM a pH 6.5), donde los cromatogramas antes y después de 6 meses a 25 °C se representan en negro
y rojo, respectivamente. PPI08 se muestra formulado a pH 6.5 (His 10 mM) antes del estrés, en negro y después de 6
meses a 25 °C, en magenta, y formulado a pH 5 (His 10 mM) antes, en negro y después de 6 meses a 4 °C, en verde, y 6
meses a 25 °C, en rojo. Los fragmentos PPI08 se amplían.

Conclusiones (respecto al artículo).

De acuerdo con el artículo, se acoplaron con éxito RP-UPLC con MALS para calcular el “M w” de cada pico de
elución de mAbs intactos y de fragmentos Fc y Fab. El principio diferente de separación utilizado en RP-
UPLC-MALS proporciona un nivel crítico adicional de caracterización de proteínas en comparación con SEC-
MALS e IEX-MALS. RP es una de las técnicas analíticas más prometedoras para analizar proteínas. Sin
embargo, los picos que se eluyen de la columna a menudo pueden estar relacionados con especies
agregadas. Gracias a MALS, es posible saber si una impureza es realmente una variante química del
monómero, un agregado o un fragmento.

Se dice también que el solvente orgánico y la temperatura aplicada durante la separación RP de mAbs
podrían inducir artificialmente agregados que pueden conducir a una falsa interpretación de la pureza de la
proteína. Sin embargo, MALS no podría ser suficiente para describir mecanismos detallados y un mayor
acoplamiento con MS (es decir, RP-UPLC-MALS-MS) podría probar en el futuro desarrollo natural para
caracterizar cromatogramas RP.

Conclusiones generales.
Lo mostrado en este trabajo nos demuestra las aportaciones que otorgan la invención, desarrollo y constante
innovación dentro de la cromatografía y todas sus ramas, la gran utilidad que dan a la ciencia, dentro de la
química, dentro de otras ciencias y más aún, dentro de la biotecnología, gracias a su gran abanico de
opciones.
El equipo se atreve a declarar, que al menos entre los miembros de este, los objetivos se han cumplido
satisfactoriamente y se espera que con el resto del grupo suceda lo mismo.
Finalmente, este trabajo (al ser de apertura a futuros proyectos por nombrar algunas de las principales ramas
de la cromatografía y sus principales características) en conjunto con el articulo empleado, puede ayudar a
reflexionar a quien lo leyese, sobre el potencial de este método, de sus aplicaciones y puede motivar al
estudiante a innovar, a crear, a inventar, a seguir investigando y haciendo ciencia y que mejor que sea un
estudiante de la multifacética y adaptable licenciatura de biotecnologías.
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