FACULTAD DE INGENIERIA-UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA 22 de mayo de 2019

“INFORME DE LABORATORIO DE PREPARACION DE

MEDIOS, SIEMBRA Y TINCION DE
MICROORGANISMOS”
“REPORT OF LABORATORY FOR PREPARATION OF
MEDIA, SEEDING AND STAINING OF
MICROORGANISMS”
Juan Sebastian Medina Melani1, Sebastián Padilla², Leyton Adrian Gutierrez
Serna³

RESUMEN
Se desea incurrir en la ciencia de la microbiología, también en la parte práctica o de laboratorio con el
fin de asociar con los métodos y procesos que se llevan a cabo al momento de realizar una investigación
sobre el comportamiento de los microorganismos, Se ha comenzado primero que todo reconociendo
algunas normas técnicas, implementos y su modo de uso. También prepararon 2 medios de cultivo en
sólido” agar de XLD y agar de salmonella shigella” con el fin de instruirse de la manera correcta de
cómo se realiza dicho procedimiento esencial para la investigación. Se realiza la práctica de siembra de
microorganismos utilizando cuatro técnicas conocidas (superficie, doble estría, masa y profundidad)
utilizando una muestra de la superficie de la mesa del baño de la facultad de ingeniería y se le hizo
seguimientos durante 7 días. Por último se realiza el reconocimiento visual utilizando el microscopio
bajo el método de tinción. Se presentan las discusiones.

SUMMARY
It is desired to incur in the science of microbiology, also in the practical or laboratory part in order to
associate with the methods and processes that are carried out when conducting research on the behavior
of microorganisms, It has begun first of all recognizing some technical standards, implements and how
they use them. They also prepared 2 solid culture media" XLD Agar and Shigella Salmonella Agar" in
order to instruct themselves in the correct way of how this essential procedure is performed for research.
The practice of planting microorganisms is performed using four known techniques (surface, double
stria, mass and depth) using a sample of the bathroom surface of the engineering faculty and was tracked
for 7 days. Finally, visual recognition is performed using the microscope under the tintion method.
Discussions are presented.

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1. INTRODUCCIÓN ambientes y diversos materiales cumpliendo

funciones beneficiosas como perjudiciales
La microbiología es una disciplina
(Hernández, 2014).
extraordinariamente amplia, que abarca
especialidades tan diversas como la bioquímica, Los microorganismos que se disponen para ser
la biología celular, la genética, la taxonomía, la sembrados en laboratorio se manejan en
bacteriología de patógenos, la microbiología condiciones especiales pero para referirnos a la
industrial y de los alimentos, y la ecología. siembra de microorganismos primero se tiene
Invalid source specified. que hablar sobre el material alimenticio en el
que crecen los microorganismos es el Medio de
Los microorganismos utilizan nuestros
Cultivo y el crecimiento de los
alimentos como fuentes de nutrientes para su
microorganismos es el Cultivo. Se han
propio crecimiento, hecho que, naturalmente,
preparado más de 10.000 medios de cultivo
puede ocasionar su alteración. Los
diferentes, (microinmundo, 2016). En el cultivo
microorganismos pueden “echar a perder” un
de bacterias, la mayoría de las patógenas
alimento por que se multiplican en él, por que
requieren nutrientes complejos similares en
utilizan nutrientes, por que producen
composición a los líquidos orgánicos del cuerpo
modificaciones enzimáticas, y por qué le
humano (grupo AGQ labs , 2017) es por eso por
comunican sabores desagradables mediante el
lo que la base de muchos medios de cultivo es
desdoblamiento de determinadas sustancias o
una infusión de extractos de carne y Peptona a
mediante la síntesis de nuevos
la que se añadirán otros ingredientes, existen 3
compuestosInvalid source specified.
tipos de cultivos que son los medios sólidos,
Generalmente los laboratorios de cualquier líquidos y semisólidos (agar, agua de peptona y
índole o enfoque tienen una serie de protocolos, mezcla de ambos respectivamente).
normas y reglamentaciones basados en las
En la naturaleza, la mayoría de los
normas técnicas estipuladas para cada país o
microorganismos no se encuentran aislados,
región, como también reglas autónomas que se
sino integrados en poblaciones mixtas. Para
proponen metodologías de tipo general y
llevar a cabo el estudio de estos
específicas, un conjunto de objetivos de
microorganismos y de sus propiedades, es
acciones y metodologías establecidas para
necesario separar unos de otros y trabajar con
prevenir y controlar los accidentes de trabajo y
especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos
enfermedades profesionales (Denton, 1994.
o puros (Facultad De Ciencias Bioquímicas Y
citado por Feo mora, 2011). La indumentaria
Farmacéuticas U. N. R. S.H., 2016), La siembra
básica necesaria para estar en el recinto, el
de microorganismos en medios de cultivo de
conocimiento de las zonas de trabajo, el
laboratorio es un procedimiento que se ha
comportamiento dentro del laboratorio son
estandarizado bajo métodos conocidos como
algunas metodologías practicas generales y
técnicas de cultivo, las cuales se realizan de
específicas según el procedimiento que se vaya
acuerdo a las necesidades ambientales de
a realizar. Siguiendo esta serie de actividades
nuestro microorganismo si es que conocemos de
planeadas permite garantizar la seguridad del
su procedencia, en el caso en que se desconozca
personal y la fiabilidad de lo investigado.
el tipo de microrganismo y quiera determinarse
En los laboratorios enfocados en el estudio y la presencia o la prevalencia de los
análisis de los comportamientos microbianos microorganismos existentes entonces se
exige de estrictas medidas de higiene y manejo realizan diferentes técnicas para siembra, los
de los implementos de laboratorio debido a que fines de las técnicas aplicadas son los
los microrganismos se encuentran en diversos siguientes: siembra por superficie para
microorganismos aerobios estrictos, siembra
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doble capa este método se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y
microaereofílicos, siembra profundidad se
utiliza para microorganismos aerobios, siembra
triple estría el objetivo es tener colonias
aisladas (nacional, universidad tecnologica,
2006).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se prepara dos medios de cultivo, uno liquido el
otro sólido, para el medio liquido agua de
peptona y para el medio solido se prepara dos
medios, Agar SALMONELLA Y SHIGELLA
(DIBICO) y Agar XLD (DIBICO); Para los
dos medios solidos se realiza el método de
preparación indicado por el producto, Agar
XLD estoma una muestra más pequeña que lo
indicado por motivos de costos, con ayuda de
una balanza se pesa 3,3g de Agar para 60ml de
agua destilada (Recomendado 55g para 1 litro
de agua destilada) , se deja reposar por 15
minutos y después se dispone a ingresar al
microondas hasta punto de ebullición, se dejó
enfriar y después en la cámara esterilizada se
depositó en 2 cajas de Petri rotuladas con
nombre de Agar, nombre de grupo y fecha de
producción, se flamea la boca del matraz con el
mechero encendido, cada vez que se retira el
algodón que tapaba el medio contenido para
mitigar que los microorganismos presentes en el
aire se alojen en el Agar recién preparado. Para
el siguiente medio sólido, Agar
SALMONELLA Y SHIGELLA se prepara una
muestra más pequeña de lo indicado por
propósitos económicos, se prepara 3,3 g para
60ml de agua destilada (recomendado por
fabricante 60g para 1 litro de agua destilada) se
deja reposar por 10 a 15 minutos.
Posteriormente es calentado hasta punto de
ebullición en microondas durante 1 minuto
garantizando una completa disolución del
medio, el fabricante recalca (NO
ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE) posterior
al calentamiento se vierte en 2 cajas de Petri
rotuladas con nombre de Agar, nombre de grupo
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y fecha de producción, se flamea la boca del
matraz que contiene el medio con el mechero
encendido, cada vez que se retira el algodón
para reducir los microorganismos que pueden
entrar y alojen en el Agar recién preparado. Para
el medio líquido, Agua de peptona se pesa
eventualmente 1,53g del medio para 60 ml de
agua destilada (recomendado por fabricante
25,5g para 1 litro de agua destilada) con ayuda
de un agitador magnético se mezclan para su
homogenización, posteriormente se depositan
en 6 tubos de ensayo con ayuda de una pipeta
cada uno con un volumen de 9ml los tubos de
ensayo deberán esta rotulados con nombre del
medio, nombre del grupo y fecha de fabricación
para su eventual identificación también deberán
estar tapados, este medio liquido se llevó a la
autoclave a una temperatura de 121ºC, durante
15 ó 20 minutos.
Para las técnicas de siembra que se manejaron
se toma una muestra del baño de mujeres,
ubicado en el bloque de ingeniería tercer piso
de la universidad surcolombiana y una segunda
muestra que se toma del jardín interno ubicado
en el bloque de ingeniería de la universidad
surcolombiana; las muestras tomadas son
tomadas con ayuda de unas pinzas recubiertas
con algodón que a su vez va introducido por
completo en un tubo de ensayo con agua de
peptona anteriormente elaborada, con el fin de
garantizar la supervivencia de los
microorganismos que se han captado y evitando
la contaminación por microorganismos de otras
superficies y del aire, a su ves se dispuso el tubo
de ensayo en incubación a 37°C en la
incubadora por 24 horas.
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Se realiza tres distintos disolución en la superficie del medio con trazos

tipos de siembras tanto horizontales como verticales. Para la
llamados; triple estría, tercera siembra, siembra en profundidad con
superficial o en masa y ayuda de un vòrtex se homogeniza la dilución
siembra en profundidad. (dilución de muestra de suelo de jardín interno
del bloque de ingeniería de la universidad
surcolombiana previamente tomada),
posteriormente con ayuda de una pipeta
graduada se agrega 1ml de esta disolución en
Para la primera siembra, una caja de Petri y por medio de un asa de
triple estría con ayuda de inoculación previamente flameado para su
vòrtex se homogeniza la esterilización se extiende la disolución sobre la
disolución y con una superficie de la caja de Petri, dando
pipeta graduada se agrega continuación se agrega 5ml de Agar XLD y se
en un borde de la caja de homogeniza dando un movimiento circular
Petri 1ml de la dilución tenue en contra las manecillas del reloj durante
(dilución de muestra de 30 segundos. Es
suelo de jardín interno del importante recalcar
bloque de ingeniería de la universidad que cada vez que se
surcolombiana previamente tomada) con ayuda sacaban muestran
de un asa de inoculación previamente flameado de los medios
para su esterilización se realizan tres líquidos se
movimiento en forma de z tocando solo homogenicen en un
únicamente y en un vórtex la muestra,
principio la muestra se flameaban los
logrando así un efecto de tubos para evitar la
degrade de la muestra contaminación de
facilitando en el caso de las muestras por
que la disolución se microrganismos presentes en el medio, se
encuentre muy flamee el asa de inoculación para darlo
concentrada poder aislar e esterilización adecuada antes de cada uso y las
identificar colonias. Para la segunda siembra, muestras extraídas con pipetas sean con pipetas
superficie o masa con ayuda de un vòrtex se esterilizadas y de un solo uso quiere decir; una
homogeniza la dilución (dilución de muestra de vez que entran en contacto con algún medio
suelo de jardín interno del bloque de ingeniería sólido o líquido solo se podrá utilizar esa pipeta
de la universidad surcolombiana previamente únicamente para ese medio.
tomada) y se vierte 1ml en la superficie del
medio con ayuda de un asa de inoculación
previamente flameado para su esterilización se
Para la identificación más profunda de los
realiza un movimiento horizontal continuo de
microorganismos estudiado y sus
un lado de la caja de Petri al otro, este proceso
características de estos, se utilizó la tinción
se realiza durante la primera mitad donde se
Gram, que se basa en identificar las colonias
hace un giro de 180º y se realiza este mismo
más representativas o resaltadas en de las placas
procedimiento en su segunda mitad arrastrando
con siembra, una vez seleccionada la colonia y
la disolución, al terminar se realiza un giro de
el tipo de microorganismos se procede a extraer
90º y se repite los dos procesos anteriores dando
una muestra de la colonia con ayuda de un asa
como resultado una completa distribución de la
de inoculación, por aparte se prepara un porta
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objeto con una gota de agua destilada en su

superficie, con la muestra ya extraída se procede
a esparcir la muestra de la colonia con ayuda del
asa de inoculación, se procede a secar el agua
destilada y seguido a fijar la muestra por medio
de 10 pasadas lentas del porta objetos cerca a la
llama del mechero, una vez este paso este
completo se procede a realizar la tinción, como
primer paso se agrega violeta de genciana
durante 30 segundos esto con el fin de teñir las
células de la colonia, se agrega posteriormente
abundante lugol y se deja fijar durante 1 minuto
por consiguiente se juaga con alcohol dando
como resultado solo el tiñe permanente de las
Gram+ y se deja
aplicado el alcohol
durante 30segundo
posterior a esto se
juaga con agua
destilada durante 4
minuto ya terminado
estos pasos el porta
objetos está listo para
llevar al microscopio y
su eventual evaluación e identificación
3.1.2. análisis y resultados de los métodos de
preparación de medios.
Seguidos al pie de la letra el procedimiento para
realizar los tipos de cultivo que se encontraban
en las instrucciones del empaque de cada medio
se pudo comprender y conocer de manera
práctica dicho procedimiento además de tomar
alguna experiencia al entrar en contacto con los
medios, estos son granulados o en polvo y tiene
olor fuerte característico, también se aclaró el
cuidado a la hora de activar el medio
incrementando su temperatura.
3.2.1. cuestionario de técnicas de siembra
Cuestionario:
1) ¿Cuáles son las ventajas de la siembra
en profundidad?
Poder identificar microorganismos que
crecen en medios anaerobios debido a
que el ambiente aerobio solo influye en
la superficie de del agar
2) ¿Cuáles son los propósitos de la
siembra en doble capa?

Poder certificar la homogenización

completa y más adecuada de la siembra
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN garantizando un medio anaerobio en la
3.1. respuestas de preparación de primera siembra
medios. 3.2.2. análisis y discusión de técnicas de
identificar condiciones de trabajo riesgosas siembra.
que considere en el laboratorio según Para asegurar la viabilidad de los
Buesa, 2008 microrganismos cultivados placa se debe contar
 Todos los tejidos son con el subministro adecuado y en condiciones
procesados manualmente óptimas de uso. de Según los resultados de
(Sánchez M María C, 2017) obtuvieron un
 Algunos tejidos son procesados
crecimiento de UFC “mayores a 300 UFC”
manualmente
incontables de Bacillus subtilis y Sacharomyces
 No hay neutralizantes para
cerevisiae en siembra por profundidad y
derrames de formol
superficie debido a una contaminación con el
 Se usan y afilan lan las
ambiente que generó una competencia de
cuchillas de acero permanente
nutrientes y espacio dentro del medio agar PDA.
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(: Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca, 2013)
asegura que usando cepas de E. coli, salmonella
S. en los medios solidos de Agar soya tripticasa
Salmonella y Agar verde brillante Salmonella,
pudo detallar las UFC de una manera clara.
Para nuestra investigación no se obtuvo el
resultado esperado, las muestras de cada método
de siembra nunca mostraron indicios de
crecimiento de salmonella S. ni de ninguna
bacteria en los medios de Agar XLD, a pesar
que se realizo seguimiento diario durante siete
días, no se encontró viabilidad ninguna de las
diferentes
técnicas de
siembra, solo en
la placa en la que
se realizo
profundidad se
detectó la
presencia de un
punto blanco pero
se reconoció
como hongo lo
que se traduce
que existió contaminación con el ambiente en
algún momento en que se realizó la práctica.
3.3.1. cuestionario de tinción
2. Las porinas son proteínas de membrana
externa presentes en bacterias gram negativas
que tienen como función regular la entra y salida
de diferentes sustancias, formando un canal
acuoso permitiendo la difusión pasiva de
moléculas y de materiales de desecho tanto al
interior como al exterior de la célula así como la
expulsión de determinadas sustancias dañinas
para las bacterias como los antibióticosInvalid
source specified.
La membrana externa contiene diversas
proteínas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas
sustanciasInvalid source specified.
3, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente
lipídico y disuelve la membrana exterior de la
pared de la célula (y también puede dañar la
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membrana citoplásmica a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de
complejo cristal violeta-yodo y la célula se
decolora. Invalid source specified. 3.3.2.
análisis y resultados de tinción
Mediante la Tinción de Gram identificamos y
observamos las características morfométricas
de los microorganismos presente en el medio de
cultivo donde se procedió a extraer las colonias
más representativas
presentes en la placa.
Según como observamos
en la imagen mostrada por
el microscopio
identificamos si la bacteria
Salmonella Shigella es
Gram – o Gram+. Se observó que el
microorganismo se torna color fucsia por ende
pertenece a las Gram-, su morfología se destaca
por ser bacilos algo rectos y curvados. Cabe
resaltar que la muestra obtenida para hacer la
tinción fue suministrada por el cultivo de otro
grupo porque en nuestra investigación la
bacteria no fue viable en ningún método de
siembra.
4. CONCLUSIONES
Los microorganismos siendo ya sea de una
misma especie tienen medios de crecimiento
distintos dependiendo del medio de cultivo y las
condiciones externas e internas dentro de este
mismo, como se pudo analizar con las muestras
de colonia de los demás compañeros.
Las normas de higiene y seguridad de la
utilización del laboratorio en especial para una
practica investigativa deben cumplirse con
recelo para no obtener resultados no esperados
como el hongo que se obtuvo en siembra por
profundidad.
Los medios deben estar en condiciones obtimas
puesto que el que se utilizo estaba vencido y esa
pudo ser una de las causas por las cuales no se
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obtuvo viabilidad de microorganismos en la

investigación. TINCION DE GRAM

Esterelizacion del asa

con calor

Una gota de agua destilada

en el Portaobjetos

Extraer una cepa del

medio de cultivo

Depositarla en el
portaobjetos

Dar unos pases de ladoa lado

al portaobjetos sometido a
calor sujeto con pinzas

fijacion con violeta de

genciana

lavar con recativo lugol

lavar con alcohol

Fijacion con fucsina

basica por 3 minutos

Lavar con agua

destilada

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5. Bibliografía
: Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca, A. O. (2013). Tecnicas de Siembra de Microorganismos.
Queretaró : Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos .
Facultad De Ciencias Bioquímicas Y Farmacéuticas U. N. R. S.H. (10 de agosto de 2016). siembra y
aislamiento de microorganismos . Obtenido de FBIOyF:
https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/169626/mod_resource/content/1/2019%2
0TP2%20BIOQ%20Y%20LCTA.pdf
grupo AGQ labs . (22 de noviembre de 2017). como cultivar bacterias en el laboratorio . Obtenido de
alkemi : https://alkemi.es/blog/como-cultivar-bacterias-en-el-laboratorio/
Lopez-Marin. (2017). utilizacion de platicos en el cultivo del melón. Murcia , España: grupo THM.
microinmundo. (10 de marzo de 2016). los medios de cultivo en microbiologia. Obtenido de
microinmunto: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
nacional, universidad tecnologica. (11 de marzo de 2006). siembra y recuento de microorganismos.
Obtenido de FRRO:
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf
Sánchez M María C, V. U. (2017). Primer acercamiento del estudiante de Microbiología a las
técnicas de recuento en superficie, profundidad y cámara De Neubauer. barranquilla: revista
mente joven .

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