CLASIFICACIÓN Y CRIOPRESERVACIÓN

DE LOS EMBRIONES BOVINOS

PRODUCIDOS IN VIVO

M.V. Silvia León Trinidad Correo: sleont@gmail.com

 CLASIFICACIÓN: DESARROLLO
EMBRIONARIO

 La fecundación desencadena el comienzo del desarrollo

del embrión, hasta el día 8 dentro de la zona pelúcida
(ZP), a éstas células producto de la división se
denominan blastómeros.

 Día 7 de la cosecha embrionaria: MÓRULAS Y

BLASTOCISTOS.
PARTES DE UN EMBRIÓN
 BLASTÓMERO
TROFOBLASTO
Casa una de las células que se
Provee nutrientes al embrión y
originan en la primera división
dará origen a la placenta.
del óvulo fecundado

BLASTOCELE
Es una cavidad llena de líquido y
MASA CELULAR INTERNA
que junto al trofoectodermo y la
Da origen a los tejidos
masa celular interna forman el
BLASTOCISTO.

ZONA PELUCIDA
Barrera de protección sanitaria.
Permite la fecundación.
MORULA COMPACTA (Mc)
 Día5-6
 Asemeja a una mora, 32 a 64 blastómeros
aproximadamente.
 Blastómeros unidos y constituyen una masa compacta que
ocupa sólo el 60%-70% del espacio perivitelino.
BLASTOCISTO TEMPRANO (Bt)
 Día 7,100-200 células,
 Formación de una cavidad (blastocele) en el interior del embrión.
 El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino.
BLATOCISTO (B)
 Día 7-8, 100-200 células,
 Marcada diferenciación entre las células del trofoblasto, que
constituyen una pared, que se adosa a la ZP.
BLASTOCISTO EXPANDIDO (Be)
 Día 7-8, más de 200 células,
 El tamaño aumenta considerablemente y hay un adelgazamiento de la ZP.
 La presión creciente del blastocisto en crecimiento provoca la ruptura de
la ZP, a través de la cual comienza su protrusión.
BLASTOCISTO PROTRUIDO (BP)
 Día 8-9, 200-800 células,
 Los embriones han abandonado la zona pelúcida.
 La identificación en este estadío puede ser dificultosa.
 Los Bp pueden ser igualmente transferidos, sin embargo, los embriones
desprovistos de zona pelúcida son extremadamente frágiles y pegajosos.
 EVALUACIÓN MORFOLÓGICA

 Forma esferoide.
 Simetría de los blastómeros.
 Apariencia clara de los blastómeros.
 Tonalidad uniforme.
 Uniformidad de la membrana celular.
 Proporcionalidad entre el embrión y el
espacio perivitelino.
 Integridad de la zona pelúcida.
 Ausencia de detritus celulares adheridos
a la zona pelúcida.
 Compactación de los blastómeros entre
sí.
 GRADOS DE CALIDAD

 La posibilidad de desarrollo y posterior nacimiento de un ternero a

partir del embrión obtenido.
 La morfología y los diferentes grados de calidad son determinados con
un estereoscopio.
 La diferenciación entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran
parte, de la experiencia del operador.
CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA: GRADOS DE CALIDAD
SEGÚN MANUAL DE LA SOCIEDAD INTERNACIONAL DE
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (IETS)

 El código para la calidad del embrión es numérico y se basa en

la integridad morfológica del embrión.

 Los códigos para el grado de calidad del embrión van de 1

hasta 4.
Código 1: Excelente o Bueno

 La masa embrionaria es simétrica y esférica, con blastómeros

individuales uniformes en tamaño, color y densidad.

 El estado de desarrollo del embrión es coherente con la fase de

desarrollo esperada.

 Presenta irregularidades relativamente menores y por lo menos el

85% del material celular debe permaneces intacto dentro de la masa
embrionaria.

 La zona pelúcida debe ser lisa y no debe tener ninguna superficie

cóncava o delgada que podría causar que el embrión se adhiera a la
placa de cultivo o a la pajuela.
Embrión de calidad 1
Código 2: Regular

 Presenta irregularidades moderadas en la forma global de la

masa embrionaria o en el tamaño, color y densidad de las
células individuales.

 Por lo menos el 50% del material celular debe permanecer

intacto dentro de la masa embrionaria.
Embrión de calidad 2
Código 3: Malo

 Presenta irregularidades mayores en la forma de la masa

embrionaria o en el tamaño, color y densidad de las células
individuales.

 Por lo menos el 25% del material celular debe permanecer

intacto dentro de la masa embrionaria.
Embrión de calidad 3
Código 4: Muerto o degenerado

 Embriones degenerados, ovocitos muertos o embriones de una

célula: NO VIABLES
Estructuras de código 4
CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA: ESTADO
DE DESARROLLO
1 : No fecundado
2 : 2 a 12 células
3 : Mórula temprana
4 : Mórula
5 : Blastocisto temprano
6 : Blastocisto
7 : Blastocisto expandido
8 : Blastocisto eclosionado
9 : Blastocisto eclosionado expandido
Codificación numérica de
los embriones
1-9
 IDENTIFICACIÓN DE LA PAJILLA

La IETS recomienda un sistema estandarizado para el marcado de las

pajuelas. La información puede escribirse a mano o a máquina en la pajuela
que contiene el embrión.
Se recomienda que se usen dos líneas para etiquetar las pajillas.
EMBRIONES CONGELADOS PARA TRANSFERENCIA DIRECTA: deben guardarse
en pajillas amarillas translúcidas. Este color se limita exclusivamente a
embriones congelados para T.D.
NÚMERO DE INDENTIFICACIÓN DE CADA PAJILLA: la pajilla será numerada de
forma única con la fecha respectiva de colecta o congelación. Este número
debe ser incluido en el certificado de congelación.
CALIDAD Y ESTADIO EMBRIONARIO: de acuerdo a lo establecido por la IETS.
CRIOPRESERVACIÓN DE LOS
EMBRIONES BOVINOS
PRODUCIDOS IN VIVO
EL OBJETIVO DE ESTA CLASE ES DAR A CONOCER CIERTOS
PARÁMETROS INHERENTES AL PROCESO DE
CRIOPRESERVACIÓN Y LA IMPORTANCIA DE CONOCER
CIERTAS CARACTERÍSTICAS DE LA CÉLULA QUE PUEDEN
INCIDIR CON LA VIABILIDAD DEL PRODUCTO CONGELADO
PARA LOGRAR LA TÉCNICA ADECUADA.
CONSIDERACIONES GENERALES
1. La estructura y composición de las membranas plasmáticas determinan los
principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de
criopreservación, su comportamiento durante la congelación y descongelación
definirá los índices de supervivencia de las célula congelada.

2. Los periodos críticos para la sobrevivencia celular durante la criopreservación son

la fase inicial del congelamiento y el periodo de retorno a condiciones
fisiológicas.
3. La membrana plasmática de las células, independientemente se su composición,
tiene una estructura organizada según el modelo de mosaico fluido. Estas membranas
se componen básicamente de lípidos, proteínas y un pequeño porcentaje de
carbohidratos que es variable de acuerdo al tipo y especie celular.

4. Se debe tener en cuenta que el tamaño

de la partícula, la polaridad y la carga
iónica determinan el paso a través de
las membranas y de esa forma,
pequeñas moléculas como las del agua
(peso molecular PM:18), etanol (PM:46),
glicerol (PM:92) y oxígeno pasan a
través de la membrana mientras que la
glucosa (PM:180) no lo hace.
5. Los lípidos (colesterol y ácidos grasos) como componentes más abundantes
de la membrana plasmática, determinan la fluidez y la resistencia de la
membrana durante los procesos de criopreservación.

6. El empaquetamiento y la posición de estas moléculas en las bicapas

determinarán la rigidez de las membranas y por tanto el transporte de
moléculas. ESTE TRANSPORTE A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS ES EL PUNTO
CRÍTICO PARA LA SOBREVIVENCIA CELULAR POST DESCONGELACIÓN.

7. Las membranas celulares son las estructuras que sufren mayor daño en los
procesos de congelación en general debido a la pérdida de fluidez de sus
componentes lipídicos, la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una
temperatura de 10°C a -16°C alterando de esta manera las funciones de la
membrana dándole un alto grado de fragilidad, durante la deshidratación
celular que tiene lugar en el proceso de congelación se puede presentar
una pérdida de lípidos lo cual afectaría la integridad de la membrana
plasmática por pérdida de su capacidad de expansión durante la
rehidratación al volver a condiciones isotónicas.
 TRANSPORTE A TRAVÉS DE LAS
MEMBRANAS DURANTE LA
CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN

Las bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la

membrana) y la rapidez (décimas de segundo) con la que suceden los
cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen
muy difícil el movimiento de moléculas a través de la membrana
(transporte activo).

La lesión celular crioinducida se explica en función de la formación de

hielo intracelular y el estrés osmótico al que se ven sometidas las
membrana celulares durante la congelación.
 AGENTES CRIOPROTECTORES

Son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad, que disminuyen el punto

eutéctico de una solución dada, (punto en el cual una composición dada de A
y B solidifica como un elemento puro). El descenso del punto eutéctico
implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una
temperatura menor, de forma que la célula estará más deshidratada y el
gradiente osmótico al que será sometido será menor.

¿POR QUE ES TAN IMPORTANTE LA DESHIDRATACIÓN PARCIAL

DE LA CÉLULA

Simplemente para evitar que durante el proceso de congelación se

formen cristales de hielo en el interior de la célula, lo cual
indefectiblemente se formarían cuando comience a congelarse el agua
intracelular que contiene, por lo que en gran parte, de este fenómeno
depende la viabilidad de la célula congelada. Por esta razón se añaden
al medio de congelación soluciones con funciones crioprotectoras.
 ¿DE QUÉ MANERA FUNCIONAN LOS CRIOPROTECTORES

Desplazando el agua del citoplasma y así evitar que durante la

congelación se formen cristales de hielo en el interior de la
célula.

CLASIFICACIÓN DE LOS CRIOPROTECTORES

CRIOPROTECTORES CRIOPROTECTORES
PENETRANTES NO PENETRANTES
 CRIOPROTECTORES PENETRANTES

Son de bajo peso molecular y permeables a través de la membrana celular.

Protegen a la célula de las lesiones producidas por la congelación a
velocidades lentas.

Todos estos compuestos deshidratan la célula penetrando a esta para ayudar

a proteger el citoplasma.

Entre los más conocidos tenemos al glicerol, etilenglicol, polietilenglicol,

etanol, propilenglicol, propanodiol (PROH).
 DIMETILSULFÓXIDO
(DMSO)
Hidrosoluble, de bajo peso molecular.
Previene la acumulación excesiva de
electrolitos y otras sustancias
durante el proceso de
congelamiento, y la formación de
cristales de hielo que rompen la
estructura de la membrana.
ETILENGLICOL
(EG)
Es sumamente permeable en corto
tiempo y es eliminado
rápidamente durante la
dilución, resultando en una
disminución de la toxicidad
embrionaria.
Menor peso molecular que el
DMSO, glicerol, propilenglicol.
Permite el uso de la transferencia
directa.
 GLICEROL

PROH
El glicerol se une con el agua
y disminuye
acentuadamente el punto
de congelación de las
soluciones, se forma en su
presencia menos hielo a
cualquier temperatura Utilizado principalmente para
dada. congelación de blastocistos y
embriones en estado de
preimplantación de humanos
y otras especies.
 CRIOPROTECTORES NO PENETRANTES
Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas
de congelación, son importantes por ejercer su acción crioprotectora
promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse
asociados a los agentes penetrantes.

Destacan: polivinilpirrolidona (PVP), glucosa, fructosa, ficol, dextrano

sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa, rafinosa y otros azucares.

Estos compuestos forman puentes de hidrógeno con el

agua, reduciendo la actividad del agua a una magnitud
mucho mayor.
 Las células inicialmente se
deshidratan para compensar la
fuerza osmótica inducida por la
presencia de los agentes
crioprotectores y después se
hidratan.
 CAUSAS DE DAÑO CELULAR POR
CONGELACIÓN

 Daño mecánico por formación de hielo intra y extra celular.

 Daño mecánico por expansión térmica.
 Hiperosmolaridad extracelular y deshidratación.
 Cambios en el pH.
 Desnaturalización de proteínas.
 FORMACIÓN DE LOS CRISTALES DE
HIELO DURANTE LA CONGELACIÓN

 Estos cristales se forman tanto dentro como fuera de la célula, y son los
cristales intracelulares los que se comportan como cuchillas cortando las
estructuras internas de la célula, especialmente las membranas.
 Debido a estos efectos durante la congelación se debe evitar la formación
de hielo intracelular.
 PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA
CONGELACIÓN
1. Clasificar a los embriones (Grado 0 y grado 1).
2. Identificar a las pajillas (padres, raza, calidad, estadio y fecha)
3. Colocarlos en una placa petri con etilenglycol 1.5M y cargar en la pajuela.
El tiempo de exposición al crioprotector es de 10 minutos como máximo.
4. Colocar las pajillas en el congelador (-6 °C) y dejar pasar 01 minuto.
5. Realizar el seeding “inducir a la cristalización”. Dejar pasar 10 minutos.
6. Luego la temperatura desciende a -35 °C, ha finalizado el proceso de
congelación.
7. Sumergir en Nitrógeno líquido.
 Clasificación Empajillado

Seeding Descenso de
Inducción de la Sumergir en
temperatura Nitrógeno líquido
cristalización
 Pajilla de congelación

M A C A CE A C A M

embrión

M: medio de mantenimiento
A: espacio de aire
C: medio de congelación
CE: medio de congelación con embrión
Esquema del descenso de la temperatura
 VITRIFICACIÓN

• Protocolo de enfriamiento rápido y no requiere de equipos para el

descenso de la temperatura.
• La vitrificación se logra por inmersión directa en nitrógeno líquido.
• No hay cristalización.
• Se llega a un estado vítreo, por la elevada viscosidad durante el
tratamiento.

Elevada velocidad de enfriamiento

Alta densidad
Procedimiento

D-PBS + FCS + Sucrosa VS 1

VS 2 VS 3

Exposición directa en
Cargado del embrión nitrógeno líquido
 DESCONGELAMIENTO PARA
PAJILLAS DE TRANSFERENCIA
DIRECTA

Para la congelación convencional: la descongelación se

realiza sumergiendo las pajillas en baño maría a 25-30 °C
grados durante 20–30 segundos.
Gracias!!!