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PESQUISA DE Salmonella enterica E DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE

SUSCETIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS EM EXCRETAS COLETADAS EM FEIRAS


LIVRES DE GOIÂNIA
RESEARCH OF SALMONELLA ENTERICA AND DETERMINATION OF THE
SENSITIVITY PROFILE OF ANTIBIOTICS IN EXCRETERS OF BIRDS IN FAIRS FREE
OF GOIÂNIA

Clara Morato Dias1, Stanislau Parreira Cardoso2, Maisa Araújo Pereira1, Joice Rodrigues de
Paula Lemes1 Maria Auxiliadora Andrade3

RESUMO–O presente estudo foi conduzido para investigar a frequência de sorotipos de


Salmonella em excretas de galinhas “caipiras” comercializadas em feiras livres do município
de Goiânia, bem como determinar o perfil de suscetibilidade dos isolados a diferentes classes
de antimicrobianos, usados na prática veterinária e clínica humana. Foram coletadas 99
amostras de excretas em gaiolas localizadas em feiras livres. As amostras foram submetidas à
pesquisa de Salmonella pelo método bacteriológico convencional. Entre 99 amostras coletadas
cinco foram positivas para Salmonella (4,95%), as quais foram tipificadas em Salmonella
enterica subesp. enterica O: 4,5, Anatum, Agona, Newport e Heidelberg oriundas de cinco
diferentes feiras e a resistência a maior resistência verificou-se para sulfonamida, seguida de
ceftiofur e tetraciclina. Enrofloxacina, aztreonam, fosfomicina e cloranfenicol podem consistir
uma alternativa no tratamento de infecções por Salmonella.
PALAVRAS-CHAVE: excretas, galinha “caipira”, salmonelose, saúde pública.

1. INTRODUÇÃO

As Doenças transmitidas por alimentos (DTAs) constituem um grave problema de saúde


pública(MARTIN, 2004) e Salmonella é o principal agente etiológico de doenças de origem
alimentar em diversos países (CHITTICK et al., 2006) e também no Brasil. Existe ainda a
preocupação no sentido de veiculação de fenótipos bacterianos zoonóticos resistentes aos
antimicrobianos para a cadeia alimentar do homem, como Salmonella (FIGUEIREDO, 2013).

Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e trata-se de uma bactéria cocobacilo,


Gram negativa, anaeróbia facultativa e de ampla ocorrência nos animais (fezes), ambiente
(água, solo), insetos, superfície de equipamentos e utensílios de fábricas de cozinhas (BACK,
2010). Já foram distinguidos mais de 2.600 sorotipos de S. enterica (ISSENHUTH-JEANJEAN
et al., 2014). Os sorotipos de Salmonella entérica subsp. enterica tem por habitat o trato
gastrointestinal dos animais de sangue quente e são responsáveis aproximadamente 99% das

1Acadêmica em Medicina Veterinária, Bolsista em Iniciação Científica, Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade
Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil, clara.mvet@gmail.com
2 Médico Veterinário, Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Escola de Veterinária e Zootecnia,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brasil, drstanislau@gmail.com


3 Professor Titular, Setor de Medicina Preventiva, Departamento de Medicina Veterinária, Escola de Veterinária e Zootecnia,

Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil, Caixa Postal 131, CEP 74. 690. 900, (62) 3521-1527, maa@ufg.br
“Revisado pelo orientador”
salmoneloses humanas, que estão frequentemente associados ao consumo de carne e produtos
avícolas (LIRIO et al. 1998).

O Brasil é o maior exportador de frango de corte no mundo e o terceiro maior produtor


(GUIMARÃES, 2006). Este desenvolvimento da avicultura industrial baseia-se em boas
técnicas de manejo, melhoramento genético, nutrição, ambiência e controle sanitário que têm
possibilitado a produção de carne de qualidade e com segurança ao alimento (BACK, 2010).
No entanto, é comum em Goiás, assim como em todo o país, seja pelos costumes e culturas
locais, aliados ao apelo culinário, bem como a crescente tendência pelo consumo de alimentos
mais naturais sem algum “artificialismo” a comercialização de aves tipo “caipira” em feiras
livres (GUIMARÃES,2006).

As galinhas “caipiras” são obtidas a partir de criações não tecnificadas, as quais são
comercializadas vivas ou abatidas (GUIMARÃES, 2006). As aves vivas podem albergar as
salmonelas no intestino sem apresentar nenhum sinal clínico e pelas excretas podem contaminar
o ambiente, o homem e outros animais o que caracteriza um fator de risco para a proliferação
de microrganismos patogênicos como as bactérias do gênero Salmonella (ALCÂNTARA,
2015). Este fato se agrava na ausência de condições higiênicas sanitárias das gaiolas utilizadas
no transporte e exposição nas feiras. Mesmo em uma atividade econômica de pequena escala
como a produção caipira, ainda há relatos de resistência da Salmonella a diversos
antimicrobianos. Para minimizar tais riscos ações de vigilância e monitoramento do
desenvolvimento da resistência devem ser adotadas (ALCÂNTARA, 2015).

Baseado no exposto o presente projeto foi desenvolvido com o objetivo de investigar a


presença de Salmonella enterica em amostras de excretas de galinhas “caipiras” coletadas em
gaiolas expostas em feiras livres do municípo de Goiânia, bem como a determinação do perfil
de suscetibilidade a diferentes classes de antimicrobianos, usados na prática veterinária e clínica
humana.

2. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de bacteriologia do Setor Preventiva
do Departamento de Medicina Veterinária da Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade
Federal de Goiás.

No trabalho a campo, foram visitadas 117 feiras no município de Goiânia onde realizou-
se a coletas de excretas em 32 feiras que comercializavam galinhas vivas.
As excretas foram colhidas com espátulas esterilizadas e mãos revestidas com luvas que
foram devidamente identificadas, armazenadas em embalagens do tipo stomacher,
acondicionadas em caixa isotérmica com gelo, e imediatamente conduzidas ao laboratório para
início do processamento.

No laboratório, as amostras foram transferidas para caldo de enriquecimento não


seletivo (fase de pré-enriquecimento não seletivo), solução salina peptonada 1% tamponada, na
proporção de 1:10 e incubadas por 18-24h a 37°C +/- 1°C. Em sequência, 0,1mL e 1mL da
solução foram transferidas para tubos contendo caldos de enriquecimento seletivo, Rappaport
Vassiladis e Selenito Cistina, respectivamente.

Após o enriquecimento seletivo e incubação a 37° +/- 1°C por 18-24h, uma alíquota dos
caldos Rappaport Vassiliadis e de Selenito Cistina foi retirada com alça de níquel cromo e
transferida para os ágares placas de Petri por semeadura superficial por esgotamento (fase de
plaqueamento diferencial) nos ágares verde brilhante (VB) e Xilose Lisina Tergitol (XLT4)
respectivamente e incubado nas mesmas condições descritas anteriormente.

Seguida a incubação das placas, foram feitas as leituras das unidades formadoras de
colônias (UFC). As UFCs que apresentaram características fenotípicas sugestivas do gênero
Salmonella, isto é, colônias lactose negativas sem produção de H2S em meio VB e colônias
lactose negativas com produção de H2S em meio XLT4, foram inoculadas (fase de triagem da
identificação bioquímica) em tubos contendo meio ágar tríplice açúcar ferro (TSI)através de
picada profunda e estriamento na superfície no intuito de avaliar o consumo de glicose, sacarose
e lactose .

Os tubos de TSI com características morfológicas compatíveis com o perfil fenotípico


do microrganismo, portanto superfície inalterada (rampa alcalina) e base amarela (fundo ácido)
com ou sem produção de gás (bolhas ou rachaduras no meio de cultura) e H2S (escurecimento
ou não do meio no fundo), foram submetidos aos testes bioquímicos (fase de identificação
bioquímica).

Os testes bioquímicos constituíram em produção de urease, sulfeto, teste de indol,


motilidade, vermelho de metila, citrato de Simmons, malonato, lisina descarboxilase.

As provas bioquímicas que apresentaram perfil sugestivo do gênero Salmonella, ou seja,


negatividade para urease, indol, malonato, lisina controle e positividade para lisina
descarboxilase e sulfeto, sendo citrato Simmons e motilidade positiva ou não, foram repicadas
em ágar nutriente inclinado e remetidos ao laboratório FIOCRUZ (RJ) onde foi realizada a
sorotipificação.

Após o isolamento e identificação bioquímica foi realizado o teste de suscetibilidade a


antimicrobianos segundo orientações do Manual Clinical and Laboratory Standarts Institute
(CLSI, 2017). O método empregado consistiu em disco-difusão, indicado para bactérias da
família Enterobacteriaceae.

Na execução deste teste as UFCs foram suspensas diretamente em caldo Casoy de modo
a obter a concentração equivalente ao padrão de turbidez 0,5 da escala McFarlande. Após quatro
horas de crescimento comparou-se visualmente os dois tubos, suspensões que apresentaram
densidades distintas ao padrão de turbidez esperado foram ajustadas com solução salina ou
permaneceram por mais tempo em crescimento, caso a concentração estivesse maior ou menor,
respectivamente, ao valor de referência.

Em seguida, foi mergulhado um suabe esterilizado dentro de cada suspensão, removido


o excesso, girando o instrumento sobre seu próprio eixo, contra a parte interna do tubo, acima
do nível da suspensão presente nos tubos.

Cada suabe contendo o inóculo foi espalhado uniformemente sobre o meio ágar Müeller
Hinton em placas de Petri (150 mm) de modo a recobrir toda a placa e após 15 minutos os
discos contendo os antimicrobianos foram aplicados sobre o ágar e incubado a18-24h a 37°C
+/- 1°C.

Foram testadas as drogas norfloxacina 10mcg, amoxicilina 10mcg, enrofloxacina 5mcg,


aztreonam 30mcg, sulfonamida 300mcg, ceftiofur 30mcg, tetraciclina 30mcg, ciprofloxacina
5mcg, gentamicina 10mcg, trimetoprim-sulfametoxazol 25mcg, fosfomicina 200mcg e
cloranfenicol 30mcg. Como amostra de referência fez-se uso da Salmonella enterica ATCC
14028.

Na leitura das placas de ágar Mueller-Hinton, foi utilizado uma régua para aferir os
diâmetros dos halos de inibição em milímetros. Para tal, as bordas dos halos foram lidas no ponto
de completa inibição e valores obtidos interpretados segundo os valores de corte do CLSI.

3. RESULTADOS

Em função da baixa frequência de Salmonella detectada e variabilidade dos sorotipos


identificados, os resultados obtidos foram submetidos à análise por meio da estatística
descritiva.
Entre 99 amostras de excretas de galinha “caipira” coletadas em feiras livres do
município de Goiânia 4,95% apresentaram positividade para Salmonella.

Foram identificados diferentes sorotipos circulantes correspondentes a S. entérica


subesp. entérica O: 4,5, Anatum, Agona, Newport e Heidelberg (vide tabela 1).

Tabela 1 Identificação dos sorotipos isolados de excretas de galinhas “caipiras” e feiras de


comercialização
Sorotipificação Feira
Salmonella enterica subsp. enterica O:4,5 Vera Cruz 1
Agona Setor Sudoeste
Anatum Nova Esperança
Newport Vila Pedroso
Heidelberg Parque Oeste

Nos testes de suscetibilidade aos antimicrobianos, os sorotipos Agona, Anatum e


Heidelberg foram resistentes a três ou mais antibióticos, sendo classificados como
multirresistentes. Os sorotipos Newport (duas resistências) e S. entérica subesp. enterica O: 4,5
(uma resistência) mostraram maior suscetibilidade aos antimicrobianos testados.

Nenhum sorotipo apresentou 100% de resistência aos 12 princípios antimicrobianos


utilizados. A maior resistência verificou-se para sulfonamida (quatro de cinco amostras
resistentes), seguida de ceftiofur e tetraciclina (três de cinco amostras resistentes) (vide Tabela
2).

Dentre os antibióticos, todas as amostras obtiveram halos intermediários em relação a


ciprofloxacina. Além disso, o sorotipo Newport também demonstrou ser intermediário às
drogas ceftiofur e sulfametoxazol-trimetoprim, enquanto Agona e Anatum também foram
intermediários à aztreonam e tetraciclina, respectivamente. Gentamicina apresentou duas
amostras resistentes, enquanto que enrofloxacina, aztreonam e fosfomicina demonstraram
maior eficácia com apenas uma resistência para cada antibiótico. Foi observado 100% de
suscetibilidade das amostras frente ao cloranfenicol, amoxicilina e norfloxacina (vide tabela 2).

Tabela 2 Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos dos isolados de Salmonella


provenientes de excretas de galinha “caipira”
Antibióticos Salmonella enterica Agona Anatum Newport Heidelberg
subsp. enterica O,4,5
NOR S S S S S
AMO S S S S S
ENO S R S S S
ATM S S I R S
SUL S R R R R
CTF S R R I R
TET R I R S R
CIP I I I I I
GEN S R S S R
SUT S S S I S
FOS S R S S S
CLO S S S S S

NOR: norfloxacina; AMO: amoxicilina; ENO: enrofloxacina; ATM: aztreonam; SUL: sulfonamida; CTF:
ceftiofur; TET: tetraciclina; CIP: ciprofloxacina; GEN: gentamicina; SUT: trimetoprim-sulfametoxasol; FOS:
fosfomicina; CLO: cloranfenicol. Comportamento do isolado frente ao antimicrobiano: sensível (S),
intermediário (I) ou resistente (R)

4. DISCUSSÃO
Os achados do presente trabalho, corrobora com os resultados de Alcântara (2015) a qual
determinou, 0,30% de positividade para a bactéria em uma amostragem de 3.040 aves
provenientes de 190 criações alternativas nas regiões Central e Sul do Estado de Goiás entre
2011 a 2013. Também com Guimarães (2006) que coletou 300 amostras de suabes cloacais em
criações de aves não tecnificadas no Distrito Federal e nenhuma amostra foi positiva para o
gênero Salmonella. A baixa frequência de positividade de Salmonella se deve provavelmente à
rusticidade das aves e a criação em grupos de várias idades, pois, segundo FURLAN et al.,
2004), o maior contato com diferentes bactérias intestinais durante os primeiros dias de vida,
bicando fezes de aves adultas, desenvolve nos pintinhos recém-eclodidos uma microbiota que
persiste e inibe o crescimento de bactérias patogênicas (princípio de exclusão competitiva),
como as salmonelas.

Embora a avicultura industrial apresente maior rigor nas práticas de biosseguridade, a


prevalência de Salmonella spp. é significativamente maior em relação a avicultura de
subsistência (ROSSI, 2005), uma vez que as aves estão sujeitas a estresse e a bactéria pode ser
facilmente introduzida e disseminada através da alta densidade dos lote (mais de dez aves por
metro quadrado), ração contaminada , presença de vetores (insetos, roedores e pássaros),
fômites e pelos próprios funcionários da granja (BACK, 2010).
Os sorotipos Anatum e Agona, identificados neste estudo, também foram encontrados por
Lirio et al. (1998) ao processar bacteriologicamente diversos alimentos, em São Paulo, sendo
os alimentos de origem avícola os mais contaminados. Pulido-Landinez et al. (2013), assim
como no presente trabalho, identificaram Salmonella Heidelberg em excretas de aves no sul do
país.

O sorotipo Heidelberg, identificado no presente trabalho, se destaca por sua característica


mais invasiva, capaz de causar doenças com maior gravidade em relação a outros sorotipos
paratíficos, bem como por sua frequente resistência à ceftiofur (PUBLIC HEALTH AGENCY
OF CANADA, 2006), observado neste estudo.

Heidelberg tem ocupado quarto lugar como causador de infecções em humanos nos Estados
Unidos e terceiro sorotipo mais frequentemente isolado na avicultura no Canadá (CHITTICK
et al., 2006), enquanto no Brasil os dados sobre a prevalência deste sorotipo são escassos, no
entanto, trabalhos têm mostrado a tendência de maior isolamento (DICKEL, 2004;
REZENDE et al., 2005).

Assim como na presente pesquisa, em estudo descritivo realizado pelo Programa Nacional
de Monitoramento da Prevalência de Resistência Bacteriana em Frango (PREBAF) também foi
identificado alta incidência de resistência a múltiplas drogas para o sorotipo Heidelberg a partir
de análise de carcaças de frangos provenientes de 15 capitais brasileiras nas cinco regiões do
país no período de setembro de 2004 a julho de 2006 (MEDEIROS, 2011). A circulação de
sorotipos multirresistentes de Salmonella spp. é um achado preocupante, pois pode ocorrer
aumento das hospitalizações, mortalidade e custos econômicos quando comparado com cepas
suscetíveis (MARTIN, 2004). Isso mostra a importância do aprimoramento dos programas
sanitários em criações de subsistência.

As leis acerca da Defesa Sanitária Animal devem observar um plano de controle e


monitoramento sanitário para aves de fundo de quintal. O governo, por meio de seus órgãos
fiscalizadores, empresas e instituições de fomento à produção devem orientar o manejo
adequado aos produtores e aos comerciantes de galinha “caipira” quanto a relevância do assunto
a nível da produção animal e seus impactos na saúde pública (MAIA et al., 2011).

Mion et al. (2014) realizaram pesquisa de Salmonella com determinação do perfil de


suscetibilidade em diferentes amostras avícola e identificaram resistência a doxiciclina e
ceftiofur de 7,6% e 38,4%, respectivamente, entre os isolados de 2005 e, posteriormente, de
33,3% para ao primeiro antimicrobiano e 100% ao segundo em 2009. Altos níveis de resistência
à tetraciclina, em concordância a este estudo (três resistências em cinco amostras), foram
observados em Salmonella isoladas de carne de frango amostrada em plantas de beneficiamento
no Brasil, variando de 80% a 100%, segundo os pesquisadores Ribeiro et al. (2007) e Cardoso
et al. (2006), respectivamente. Em Portugal, foi identificado resistência pelo menos a um
antibiótico em 87% dos isolados demostrando maior resistência à tetraciclina (49%) e
ampicilina (37%) (DGV, 2010). A discordância dos achados destes trabalhos com os dados da
presente pesquisa, uma vez que o antimicrobiano sulfonamida foi o mais resistente, se deve
provavelmente ao fato de ser o antimicrobiano mais antigo comercializado em casas
agropecuárias e, portanto, amplamente utilizado em um período de tempo maior em relação à
tetraciclina.

Este trabalho também identificou elevada resistência à tetraciclina e ceftiofur. Este


último é utilizado apenas em medicina veterinária e seu uso na produção animal pode ter
selecionado positivamente cepas de Salmonella carreando β-lactamases responsáveis por
conferir resistência aos β-lactâmicos (MENDONÇA, 2016).

A tetraciclina pertence a uma das primeiras classes de antimicrobianos a serem


utilizados terapeuticamente em animais de produção de forma indiscriminada (MION et al.,
2014). Embora as tetraciclinas tenham sido proibidas como aditivos na alimentação animal no
Brasil em 1998, elas ainda são usadas terapeuticamente e, portanto, exercem pressão seletiva
sobre microrganismos, podendo algumas cepas continuar a manter-se em determinados nichos
ecológicos, o que explica o comportamento intermediário verificado por Cortez et al. (2006),
realçando a necessidade do controle do uso de antibióticos (FIGUEIREDO et al., 2013).

Santos et al. (2000) verificaram 48 de 150 amostras positivas para Salmonella spp. em
carcaças de frango congeladas e observaram, em consonância a este estudo científico, 100% de
suscetibilidade ao cloranfenicol e maior suscetibilidae ao aztreonam (1/48, 2,1%).

Cortez et al. (2006), por sua vez, coletaram 288 amostras, incluindo água de
escaldagem, de evisceração e de resfriamento; carcaça não eviscerada, eviscerada e resfriada;
fezes e penas e identificaram, dentre os antibióticos testados, halos intermediários para
cloranfenicol (7/29, 24,14%) em 29 amostras positivas para Salmonella. A proibição do uso de
cloranfenicol na prática veterinária em animais de produção desde 1998 pode ter contribuído
para o decréscimo da resistência a esse antibiótico, conforme verificado neste estudo e por Mion
et al. (2014) frente aos isolados de S. Heidelberg em 2005 e 2009.
Os resultados intermediários, como observados para ciprofloxacina (100% dos isolados
intermediários), preconizam cautela no uso do antimicrobiano, uma vez que aumenta-se as
chances de possíveis resistências de cepas bacterianas, limitando, futuramente, a
disponibilidade de antibióticos ao tratamento de infecções na clínica humana.

Baseado no reduzido perfil de resistência antimicrobiana e eficácia dos antibióticos


testados frente aos isolados de Salmonella de importância em saúde pública, enrofloxacina,
aztreonam, fosfomicina e cloranfenicol podem consistir uma alternativa no tratamento de
infecções por Salmonella em humanos e animais.

5. CONCLUSÃO

A presença de Salmonella enterica em excretas de galinha “caipira” comercializadas em


feiras livres em Goiânia é baixa, entretanto ocorre a circulação de sorotipos zoonóticos, com
destaque à Heidelberg, resistentes a antimicrobianos de uso humano em veterinário.

Os antibióticos enrofloxacina, aztreonam, fosfomicina e cloranfenicol podem consistir


uma alternativa no tratamento de infecções por Salmonella.

6. REFERÊNCIAS

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