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1. MARCO TEORICO.
Los microorganismos, los microbios, son organismos vivos diminutos sólo visibles por microscopio.
Entre ellos están las bacterias, algas, hongos, protozoos y los virus, estos últimos sólo visibles con
el microscopio electrónico. Están capacitados -según el tipo- para vivir en multitud de ambientes.
Los mohos y levaduras forman parte de los hongos. Las levaduras son unicelulares en condiciones
normales mientras que los mohos crecen como un sistema ramificado de filamentos (micelio). Se
trata de organismos eucarióticos cuyas células, al igual que las vegetales y animales, tienen un
núcleo cerrado por una doble membrana porosa y llevan como mínimo dos cromosomas, a más de
veinte en algunas especies . Las eubacterias y los actinomicetos son procarióticos. Sus células
carecen de membrana nuclear y mitocondrias, además poseen un solo cromosoma que se
encuentra libre en el citoplasma y una pared celular rígida.
Las células de los procariotas son, en general, mucho menores que las de los eucariotas;
unas 10 veces menor en medidas lineales y por lo tanto unas 1000 veces menor en volumen. Los
protozoos del suelo se alimentan de bacterias y presentan movimientos ligados a la fagocitosis
que es la ingestión de partículas mediante invaginación de la membrana citoplasmática y
formación de vesículas intracelulares
Cofia Portaobjetos
Guantes Cubreobjetos
Tapabocas Goteros
Zapato Cerrado Papel arroz
Viscera / Lentes Especímenes utilizados para los preparados
Bata anti-fluidos manga larga Medio de cultivo con microorganismos obtenido por
precipitación.
Material Proporcionado
Microscopio Óptico.
Aceite de Inmersión.
Asas bacteriológicas curvas
Mechero de Bunsen
Set de colorantes de Gram
Set de colorante de azul de metileno
3. PROCEDIMIENTO
Antes de iniciar con el análisis de los microorganismos se hace indispensable que cuente con
el equipo de protección individual (cofia, tapabocas, lentes, bata adecuada, guantes
adecuados, etc.)
El inicio del análisis comienza con la apertura correcta de la caja de Petri que contiene el
espécimen.
Las indicaciones serán dadas por Docente.
Haga un relato sobre los pasos descritos por el docente: norma de bioseguridad que empieza
por mí , que va hacia la comunidad y por ultimo por el ambiente , expuesto esto procedemos
abrir la caja de Petri siempre y cuando se en el radio de protección del mechero de alcohol ,
procedemos abrir la caja en cualquiera de los métodos ya mostrados anterior mente (al lado
del mechero abriendo poco a poco o usando la flama de escudo para mi protección ) esto lo
hacemos para eliminar los aerosoles que emana la caja de Petri y eliminar algún patógeno
que salga con estos aerosoles , manteniendo la caja de Petri en el radio de seguridad
pasamos a esterilizar el aza bacteriológica ( echa de ferro níquel ) hasta que se encuentre al
rojo vivo , enfriamos con el gel de cultivo posamos retirar la colonia en estudio haciendo un
frotis y una emulsión en 2 diferentes cubre objetos con 2 pequeñas gotas de agua y
esperamos qué se sequen y en otro porta objeto hacemos una emulsión y pasamos a cubrir
con un cubre objetos . Cuando las otras 2 muestras estén secas pasamos a flamear cada
muestra la pasamos 3 veces por el mechero de alcohol y pasamos a colorear con los
colorantes adecuados 1 con azul de metileno ( 2 min ) y la otra con coloración Gram ( cristal
violeta 1 min diluir con agua , lugol de gram 1 min diluir con agua ,alcohol de acetona 0,5
diluir con agua min y safranina1 min diluir con agua ) realizado este proceso la muestra
que posee el cubre objetos la pasamos a observar hasta en 40 x , las 2 consiguientes hasta
en 100 x y realizamos las observaciones e identificaciones necesarias
Sobre la superficie del medio de cultivo solido se observan a simple vista una biomasa
(masa celular) delimitada producto de agrupaciones celulares (Bacterias); se denominan
colonias bacterianas.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color
característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio de cultivo en que se desarrolle,
es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones
dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven como herramienta para
identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, además de éstas características se
requiere estudiar otros aspectos y propiedades del microorganismo para poder realizar una
identificación completa.
Las características macroscópicas de las colonias bacterianas que se tendrán en cuenta son:
Tamaño de las agrupaciones
Tamaño
Forma de las agrupaciones
Margen o borde de las agrupaciones
Altura de las agrupaciones
Cromogénesis (color de la colonia)
Commented [P1]:
Forma de las agrupaciones
En esta se mostraba unas formas circulares
dfzbfgc
Características Ópticas.
Determine si la colonia bacteriana es
brillante, opaca, translucida, transparente,
etc
RTA
.
Presenta un color rojo Candy brillante
En las preparaciones húmedas, las bacterias muestran pocos detalles morfológicos, sin embargo
se puede utilizar para la determinación de la movilidad.
Tomar una lamina sobre ella agregar una pequeña gota de agua. Hacer una pequeña
emulsión con una agrupación de microorganismos tomada del medio de cultivo. Cubrir con
una laminilla (Ver. Figura)
Los frotis fijados de los gérmenes para su posterior tinción, son de uso universal y se obtienen a
partir o muestras originales colocadas directamente sobre el portaobjeto y su posterior extensión.
Cubrir la muestra con colorante de Azul de Metileno y dejar actuar por 2 minutos.
Observar al Microscopio con objetivos de 10x, 40X y 100X (Agregar aceite de inmersión).
Describa sus observaciones basados en las características de tamaño y forma
Cubrir la muestra con solución de Cristal violeta por 1 minuto. Lavar con abundante agua
Cubrir la muestra con solución de Lugol de Gram por 1 minuto. Lavar con abundante
agua
Decolorar la muestra con solución de Alcohol Acetona por 30 segundos. Lavar con
abundante agua
Cubrir la muestra con solución de Fucsina de Gram durante 1 minuto. Lavar con
abundante agua, dejar secar al aire.
Observar al Microscopio con objetivos de 10x, 40X y 100X (Agregar aceite de inmersión).
Describa sus observaciones teniendo como parámetros la forma, las características
tintoriales y las agrupaciones si se presentan.
4. CONCLUSIONES.
5. PREGUNTAS ADICIONALES
2. ¿Qué condiciones física son importantes para el desarrollo de las bacterias en el laboratorio?
3. ¿Cómo se llama y en que consiste el tipo de reproducción utilizado por las bacterias? ‘
4. Describa las etapas de la curva normal de crecimiento (in vitro) de las bacterias
6. ¿Qué ventaja representa las observaciones de las muestras o preparados teñidos o con una
tinción especifica al microscopio?
9. ¿Qué importancia desde el punto de vista médico tiene la clasificación de las bacterias en
Grampositivas y Gramnegativas?
10. ¿Qué es la coloración de Ziehl Neelsen? ¿Cuál es la importancia desde el punto de vista
médico?
contener como mínimo carbono, nitrógeno, azufre, fósforos y sales inorgánicas. Actualmente, la forma
más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa
una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón. A menudo se añaden al medio de cultivo ciertos
colorantes.
Consistencia del medio. Partiendo de un medio liquido podemos modificar su consistencia añadiendo
Luz ambiental. La mayoría de los microorganismos de un cultivo de bacterias crecen mucho mejor en la
Temperatura. En líneas generales los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho
Humedad y pH. Un mínimo de humedad en medio y atmosfera es necesario para el desarrollo, así
como un pH neutro
Esterilidad. Fundamental recordar que todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles
para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascara o impedir el crecimiento.
3 ¿Cómo se llama y en que consiste el tipo de reproducción utilizado por las bacterias? ‘
A diferencia de las formas de vida multicelulares, las bacterias se reproducen asexualmente. Esto
significa que no vienen en las formas masculinas y femeninas convencionales, sino que producen crías
a través de la replicación de sí mismas. Esto puede ocurrir en varias formas diferentes, y es por ello
que las bacterias pueden reproducirse tan rápidamente en algunos casos. Veamos los distintos
casos:
Fisión binaria o bipartición
De manera general la reproducción de las bacterias se lleva a cabo por un proceso conocido como
fisión binaria, el cual básicamente consiste en una primera duplicación del ADN para una posterior
Según el tipo de bacteria, la reproducción pueden llevarla a cabo cada 10 minutos, cada 20 o cada 30.
Esto hace que en tan sólo 16 horas puedan generarse 5000 millones de bacterias.
Reproducción sexual
gametos, ni estos se fusionan en un zigoto. Sin embargo, sí que tienen mecanismos de intercambio
de genes que conllevan la aparición de bacterias “hijas”, con características diferentes a las
4 Describa las etapas de la curva normal de crecimiento (in vitro) de las bacterias?
1- Fase de adaptación
La fase de adaptación, también conocida como fase de retraso, es un período relativamente plano en el
gráfico, en el que la población parece no crecer o está creciendo a un ritmo muy lento.
El crecimiento se retrasa principalmente porque las células bacterianas inoculadas requieren un periodo
de tiempo para adaptarse al nuevo ambiente.
En este periodo las células se preparan para multiplicarse; esto significa que deben sintetizar las
moléculas necesarias para llevar a cabo este proceso.
Durante este periodo de retraso se sintetizan enzimas, ribosomas y ácidos nucleicos necesarios para el
crecimiento; también se genera energía en forma de ATP. La duración del período de retraso varía un
poco de una población a otra.
2- Fase exponencial
Al inicio de la fase del crecimiento exponencial, todas las actividades de las células bacterianas se
dirigen a aumentar la masa celular.
En este periodo las células producen compuestos tales como aminoácidos y nucleótidos, los respectivos
bloques de construcción de las proteínas y los ácidos nucleicos.
Durante la fase exponencial o logarítmica, las células se dividen a una velocidad constante y sus
números aumentan en el mismo porcentaje durante cada intervalo.
La duración de este periodo es variable, continuará mientras las células tengan nutrientes y el ambiente
sea favorable.
Debido a que las bacterias son más susceptibles a los antibióticos y otras sustancias químicas durante
este tiempo de multiplicación activa, la fase exponencial es muy importante desde el punto de vista
médico.
3- Fase estacionaria
En la fase estacionaria la población entra en un modo de supervivencia en el que las células dejan de
crecer o crecen lentamente.
La curva se nivela porque la tasa de muerte celular equilibra la tasa de multiplicación celular.
Dr. Cristóbal Zambrano Parada. Bact. U.J REV 2018A 15
Practica No.6 Mis Apuntes sobre CIPB…
El tiempo que permanecen las células en la fase estacionaria varía según la especie y las condiciones
ambientales.
Algunas poblaciones de organismos permanecen en la fase estacionaria durante unas pocas horas,
mientras que otras permanecen durante días.
4- Fase de muerte
A medida que los factores limitantes se intensifican, las células comienzan a morir a una velocidad
constante, literalmente pereciendo en sus propios desechos. La curva ahora se inclina hacia abajo para
entrar en la fase de muerte.
La velocidad con la que ocurre la muerte depende de la relativa resistencia de la especie y cuán tóxicas
son las condiciones, pero generalmente es más lenta que la fase de crecimiento exponencial.
En el laboratorio la refrigeración se utiliza para retrasar la progresión de la fase de muerte, de modo que
los cultivos sigan siendo viables el mayor tiempo posible.
6. ¿Qué ventaja representa las observaciones de las muestras o preparados teñidos o con
una tinción especifica al microscopio?
forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra (antes o
después de la fijación y el montaje) en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para
eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de
un mordiente, esto es, un compuesto químico que reacciona con el colorante para formar
un precipitado coloreado insoluble. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el
aclarado, la tinción mordentada permanece.
La mayoría de los colorantes utilizados en microscopía se encuentran disponibles como colorantes
certificados. Esto significa que los colorantes ofrecidos por el fabricante han sido evaluados por un
organismo independiente, la Biological Stain Commission, y que este organismo ha determinado que el
producto ofrecido cumple o excede ciertos estándares de pureza, concentración de sustancia colorante
y desempeño en las técnicas de tinción empleadas.
7 ¿Qué es la coloración de Gram ?
La coloración de gran consiste en la combinación de 4 colorantes que se agregan al preparado para
darle distinción a las muestras a estudiar y consiste en: cristal violeta lugol de Gram alcohol acetona y
safranina
¿Cuál es la importancia desde el punto de vista médico?
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado
en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al
bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 18841. Se utiliza tanto para
poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a
la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias grampositivas a las que se visualizan de color
morado, y bacterias gramnegativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.