UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 1 COLORIMETRIA Y

ESPECTROFOTOMETRÍA, DILUCIONES EN SERIE E INDEPENDIENTES

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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OBJETIVOS
1. Obtener la curva espectral y la longitud de onda máxima de absorción de un estándar en el espectro
visible.
2. Establecer los factores de dilución que se deben aplicar a un estándar para realizar una curva de
calibración con tres diluciones independientes y proporcionales que inicien en un valor de
absorbancia preestablecido.
3. Elaborar curvas de calibración en micro y macro a partir de diluciones independientes o en serie y
corregirlas por mínimos cuadrados.
4. Establecer los factores de dilución que se deben aplicar a un estándar para realizar una curva de
calibración en micro con tres diluciones en independientes y proporcionales que inicien en un valor
de absorbancia y volumen preestablecido.
5. Calcular la absortividad molar y específica de una sustancia en solución en el espectro visible
aplicando la ley de Lambert Beer y regresión lineal.
6. Determinar la concentración óptima de una solución mediante la curva Ringbom.
7. Establecer la absorbancia donde está el porcentaje mínimo de error donde se puede trabajar la
solución.
8. Racionalizar el uso de reactivos por parte de los estudiantes.
9. Desarrollar habilidades para calcular proporciones y factores de dilución.
10. Desarrollar habilidades y destrezas en el manejo del espectrofotómetro, colorímetro y micropipetas.

PREPARACION PREVIA
1. Repase unidades de conversión para masa y volumen.
2. Lea los principios de espectrofotometría y colorimetría aprendidos en análisis instrumental.
3. Repase los principios del manejo del espectrofotómetro y colorímetro.
4. Elabore un cuadro que relacione el color de la sustancia contra longitud de onda que absorbe a fin de
delimitar los barridos.
5. Revise como se grafica y obtiene la concentración óptima de la curva de Ringbom.
6. Elabore un flujograma de la metodología que realizará en la práctica.

1
 MATERIALES EQUIPOS
1 Gradilla 2 Espectrofotómetros
8 Tubos de ensayo 2 Fotocolorimetros
4 Pipetas de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. 1 Espectrofotómetro UV- Visible.
2 Beakers 50 ml y 250 ml. 4 Celdas para spectronic 21.
2 Celdas de cuarzo para espectrofotómetro
I Frasco lavador con agua destilada. UV- Visible.
2 Hojas de papel milimetrado (alumnos). 4 Celdas de plástico para Fotocolorímetro.
1 Hoja de papel semilogarítmico (alumnos). 1 Estufa de calentamiento
1 Pkte de toallas secantes (grupo) 1 Balanza analítica.
5 Micropipetas 10 μL, 50 μL, 100 μL. 250
1 Rollo papel aluminio (grupo) μLy 1000 μL.
3 Cajas puntas blancas, amarillas y azules. REACTIVOS
100 ml Permanganato de potasio 2,5 – 3 x 10
4 M.
4 Tubos eppendorrf de 1.5 ml.

INTRODUCCIÓN
Las espectroscopias de absorción están desarrolladas para cualquier intervalo de longitudes de onda del
espectro electromagnético, están divididas en regiones, la región visible del espectro electromagnético se
denomina a las longitudes de onda comprendida entre 380 -800 nm, la región infrarroja se encuentra entre
aproximadamente 1.000 -25.000 nm y la región del ultravioleta cercano está comprendida desde 200- 380 nm.
Los rayos X tienen longitudes de ondas menores a 10 nm, mientras que los rayos γ tienen longitudes de onda
más cortas que 0.1 nm (Figura 1). Los instrumentos utilizados en el laboratorio hacen uso de radiaciones
electromagnéticas para determinar la composición y concentración de diversas muestras problema. Para un
laboratorio con aplicaciones en bioquímica clínica las regiones más usadas son las del espectro visible y
ultravioleta [1].

Todas las sustancias absorben energía radiante de una u otra frecuencia y lo hacen de una manera única y
específica. Entonces es posible usar la absorción de radiación como un método para la identificación y
detección de las sustancias y su determinación cuantitativa en una solución o mezcla. Cuando un rayo de luz
incide sobre una sustancia pueden suceder los siguientes fenómenos: que sea reflejado, dispersado, absorbido
por el compuesto ó atravesar el compuesto sin modificación.

Para la espectrofotometría visible es importante la absorción la cual dependerá de las características de las
moléculas del compuesto que absorbe el rayo de luz y de las características del rayo de luz incidente. Una
solución se puede considerar como un material absorbente en el cual existen partículas de soluto capaces de
absorber la radiación electromagnética y un solvente no absorbente. La solución estará contenida en una
cubeta fabricada con material transparente y que no absorba en la región que se va trabajar.

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Figura 1. Espectro electromagnético, regiones de transiciones electrónicas, vibracionales y
rotacionales.

Vibracionales Electrónicas

Rotacionales

La absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético están asociadas con
transiciones electrónicas, las absorciones en el infrarrojo cercano con vibraciones de los núcleos atómicos y
los del infrarrojo lejano con rotaciones moleculares. Todos los compuestos absorben energía de una longitud
de onda (λ) específica aunque algunas lo hacen en regiones no visibles del espectro como el ultravioleta (UV)
e infrarrojo (IR).
La determinación de la absorción a diferentes longitudes de onda (λ) nos da la curva espectral o espectro del
compuesto o sustancia. Los espectros electrónicos moleculares en el estado líquido o en solución aparecen
como bandas anchas debido a las interacciones entre las moléculas.

PRINCIPIO
La ley de Lambert y Beer relacionan la intensidad de la luz transmitida a través de un compuesto con la
distancia recorrida por la luz en el compuesto y la concentración del mismo. La ley de Lambert-Beer dice que
la relación de disminución de la intensidad transmitida con respecto al camino recorrido (x) es proporcional
a la intensidad y a la concentración c del compuesto que absorbe. Matemáticamente tenemos:
Ecuación 1

Si I0 es la intensidad inicial cuando el camino es x = 0, entonces,

Ecuación 2

1
Imagen del espectro electromagnético (modificada). Imagen original tomada de <http://eltamiz.com/wp-
content/uploads/2008/11/espectro-electromagnetico.png>
3
La constante de proporcionalidad K depende de la longitud de onda de la radiación, de la naturaleza de la
sustancia y de las unidades de concentración (c) y de la longitud de la celda (l).
Expresada en logaritmos decimales, tenemos:
Ecuación 3

Aquí se llama A a la densidad óptica o absorbancia y ε es el coeficiente de extinción molar (la absorbancia
molar) si la concentración (c) se expresa en M/L ó de absortividad específica si se da en g/L. La ley de
Lambert y Beer solamente se cumple estrictamente cuando la luz incidente tiene una longitud de onda (λ) fija,
es decir, es monocromática.
El choque entre los fotones y las moléculas absorbentes es un fenómeno estadístico. Un aumento en la
cantidad de las moléculas que absorben tendrá entonces un efecto exponencial, no lineal sobre la frecuencia
de los choques y por consiguiente sobre la absorción que depende de estos. Por ello la ley tiene una forma
exponencial; en ella c y l nos expresan la cantidad de moléculas encontradas en el camino.
Igualmente podemos definir la transmitancia (T) como:
Ecuación 4

De donde:
Ecuación 5

Y
Ecuación 6

La determinación de las intensidades luminosas se basa generalmente en el efecto fotoeléctrico. La incidencia

de un rayo de luz provoca la liberación de un número de electrones en una celda fotoeléctrica que pueden ser
medidos como una diferencia de potencial. Este efecto también depende de la longitud de onda del rayo
incidente.

Los instrumentos más utilizados en el laboratorio para la determinación de sustancias con base a su capacidad
de absorber luz son los espectrofotómetros y fotocolorímetros.
Espectrofotómetro: es un instrumento que permite la obtención de un espectro continuo del cual pueden
seleccionarse diferentes partes que pueden ser usadas como fuentes de luz en determinaciones colorimétricas.
El espectro puede obtenerse mediante la descomposición de la luz (solar producida por un filamento
incandescente) por un prisma o una rejilla de difracción. Un colimador de amplitud variable selecciona las

4
zonas del espectro que se desean utilizar, los cuales después de atravesar el compuesto que se examina,
inciden sobre la superficie de una célula fotoeléctrica que produce corrientes proporcionales a la intensidad de
la luz incidente y que son medidas por un galvanómetro.
Puede establecerse una relación entre la concentración de la solución a examinar y la cantidad de luz que es
absorbida por la misma. En esta forma las lecturas del galvanómetro son una indicación de la concentración
de una sustancia dada en solución.
Existen espectrofotómetros diseñados para ser usados en la región del espectro visible, ultravioleta, infrarrojo
y otros que trabajan en las tres regiones al activar el encendido de la lámpara adecuada para cada espectro.
La espectrofotometría con luz visible implica necesariamente el empleo de soluciones coloreadas, condición
que no es requerida para la región UV del espectro. En la
Figura 2 vemos un diagrama correspondiente al espectrofotómetro.
La posibilidad de usar partes de un espectro continúo con una amplitud de banda inferior a la obtenida en un
colorímetro óptico o fotocolorímetro, hacen del espectrofotómetro un instrumento más versátil y conveniente.

Figura 2. Espectrofotómetro

L = Fuente de luz (lámpara); D = Diafragma; P = Prisma; C = Colimador; M = Muestra; Fc = Fotocelda; G =

Galvanómetro

EL fotocolorímetro: permite medir diferencias en la intensidad de la luz que incide en la superficie de una
célula fotoeléctrica después de haber atravesado una muestra que se desea analizar. Lo mismo que el
espectrofotómetro, las lecturas del galvanómetro están relacionadas con la cantidad de luz que ha sido
transmitida después de atravesar la solución de la muestra problema. En la Figura 3 vemos un esquema de un
fotocolorímetro. Cada filtro permite seleccionar una zona del espectro, de amplitud variable y resulta
necesario usar un filtro diferente cada vez que hagan mediciones con soluciones de diferente color.

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Figura 3: Partes de un Fotocolorímetro

. L = Fuente de luz (lámpara); D = Diafragma; F = Filtro; M = Muestra; Fc = Fotocelda; G = Galvanómetro

Al graficar absorbancia contra la concentración se obtiene una línea recta que pasa por el origen, mientras que
al graficar %T (transmitancia) en función de la concentración, se obtiene una curva exponencial negativa
(Figura 4).
La ley de Lambert y Beer tiene algunas limitaciones, las siguientes condiciones se deben cumplir para que
haya linealidad en la grafica de Absorbancia contra concentración:

a. La luz utilizada debe ser monocromática.

b. La longitud de onda de la luz utilizada debe coincidir con un máximo de absorción de la solución, ya
que esto permite alcanzar una sensibilidad óptima.
c. No debe haber ionización, asociación, partículas insolubles o solvatación de la sustancia con
respecto a la concentración o el tiempo
d. Puede haber desviaciones aparentes de la ley en caso de equilibrio químico. Esas desviaciones son
aparentes por que al cambiar la concentración de las soluciones hay desplazamiento de equilibrio con
cambios de concentración de iones o sustancias que en la solución presentan zonas diferentes del
espectro en que absorbe radiaciones.
e. La ley solo se cumple hasta cierto límite máximo de concentración el cual es característico de cada
compuesto y no puede cumplirse a concentraciones por encima de 0.01 M.
f. No se cumple cuando hay sustancias fluorescentes en la solución debido a que emiten la energía
absorbida en forma de radiación electromagnética y pueden alcanzar el detector.
g. Energía radiante parásita que puede ser radiación de cualquier longitud de onda no absorbible que
alcanza al detector.

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Figura 4: Relación de absorbancia contra la concentración y porcentaje de transmitancia contra la
concentración.

PROCEDIMIENTO
Espectrofotómetro “Spectronic 21”, manejo y cuidados:
Este espectrofotómetro puede ser utilizado en un rango de longitudes de onda entre 380 y 625 nm
(nanómetros) sin modificación alguna. Si se desea trabajar a longitudes de onda mayores a 625 nm se le
adiciona un filtro rojo y un fototubo sensible al rojo, quedando útil en la región de 625 a 950 nm.
Para procesar los blancos y las muestras en un espectrofotómetro o colorímetro, se deben tener en cuenta las
siguientes precauciones para las celdas:

a. Limpie previamente las celdas o cubetas, a fin de que queden libres de grasa, para esto lave con
ácido nítrico al 50% (v/v) o con extran neutro al 3 %, para las celdas de cuarzo utilice dextran al 3%
y luego enjuáguelas con abundante agua destilada.
b. Llene las celdas con agua destilada y compárelas para corregir diferencias en sus propiedades
ópticas. Seque la parte externa con una toalla secante que no deje residuos de celulosa, tome siempre
por la parte superior y no toque con las manos la superficie a través de la cual pasa el haz de luz.
c. Utilice celdas de cuarzo para trabajar en longitudes de onda por debajo de 380 nm, debido a que las
de vidrio absorben en la región UV.

Calibración Espectrofotómetro.
1. Gire el control H para encender el instrumento y deje que los componentes se calienten por lo menos de
10 minutos y verifique que no haya cambios de voltaje.
2. Vire el control de longitud de onda (G) hasta la longitud de onda deseada en nanómetros.
3. Ajuste el control de amplificación (H) para llevar la aguja a cero en la escala de %T, sin tubo-celda en el
portacelda y con la tapa cerrada.
4. Gire el control de luz (l) en sentido contrario a las manecillas del reloj, tanto como sea sin forzarlo.
5. Inserte el tubo-celda con el blanco, con su marca en ángulo recto con la marca del portacelda. Gire la
celda 90°, alinee las marcas y cierre la tapa.
6. Cambie el control (l) suavemente en sentido de las manecillas del reloj hasta ajustar al 100 %T.
7. Gire la celda y remuévala portacelda. Coloque la celda con la muestra, lea %T y/o A. La escala tiene un
espejo para evitar errores de paralelaje.
8. Si va a cambiar de longitud de onda recuerde girar el control I en sentido inverso a las manecillas del
reloj para proteger el fototubo y vuelva a realizar las fases de calibración 3 al 6.

7
9. Si se va a realizar la medición de %T o Abs a una serie de muestras a la misma longitud de onda, la
lectura de estas se puede realizarse después del blanco, purgando la celda con la solución nueva.

Figura 5. Espectrofotómetro.

PROCEDIMIENTO
A. Curva espectral
1. Rotule un tubo de ensayo seco y limpio como estándar y adicione 12 ml de la solución, recuerde
que esta solución le debe alcanzar para realizar toda la práctica y que el volumen mínimo que puede
utilizar para realizar las lecturas en el spectronic 21 es de 3 ml y en los equipos restantes es de 1.5
ml.
2. Prepare un blanco de reactivos, que es una solución que contiene todos los reactivos a excepción del
compuesto que va a medir para determinar su concentración.
3. Calibre el equipo.
4. Efectúe el barrido de la solución estándar de KMnO4 delimitándolo de acuerdo a su color, la
concentración será asignada por su profesor.
5. Grafique % de T contra  en nm y A contra  en nm.
6. Determine en la solución estándar el rango óptimo de absorción, su lambda máxima y su
Absorbancia y registre sus datos en la Tabla 1 del Anexo 1.

Tabla 1. Datos curva espectral permanganato de potasio.

8
 Grup Longitud de
%T A
o onda
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

B. Curva calibración y diluciones en serie.

1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar para elaborar una curva de calibración
con 3 diluciones en serie y proporcionales que partan de un máximo de absorbancia de 06, 065,
0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95 (el profesor le asignará el valor), tenga en cuenta el valor de
absorbancia obtenido en el numeral 5.
2. Rotule tres tubos de ensayo y elabore las 3 diluciones en serie y proporcionales.
3. Lea cada dilución en la  óptima hallada en el numeral 5, registre los valores de factor de dilución, A
y % T en las Tablas de control de clase 2 y 4 Anexo 1.
4. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L , g/L y registre los valores en la Tablas
de control de clase 2 y 4 Anexo 1.
5. Grafique la A de las tres diluciones (ordenada) contra su concentración en M/L y g/L (abscisa) sin
hacer correcciones a los datos, luego corrija los datos de las curvas de calibración por mínimos
cuadrados y grafique los valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y
coeficiente de correlación para las dos gráficas y procese los datos en la Tabla 2 del Anexo 1.
6. Calcule la absortividad molar y específica para la solución de KMnO 4 despejando de la formula de
Lambert-Beer y de los valores obtenidos de la ecuación de la recta (Y = a + bX) al corregir por
mínimos cuadrados la curva de calibración.
7. Calcule la concentración de la solución problema en M/L y g/L despejando de los valores obtenidos
al corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración e interpole en las gráficas elaboradas en
el numeral 5.

Tabla 2. Datos curva calibración permanganato de potasio por diluciones en serie.

9
 Grupo M/L KMnO4 Lambda Abs
g/L M/L Abs
Estándar y Máximo Fd Observada
Esperada
Abs Diluciones en serie donde leyó X X Y
1
2
3
MP 1
a
b
r

C. Curva calibración y diluciones independientes.

1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar para elaborar una curva de calibración
con 3 diluciones independientes y proporcionales donde la concentración máxima tenga una
absorbancia de 1.0, 0.93, 0.89, 0.82, 0.77, 0.73, 0.68, 0,66 (el profesor le asignará uno de estos
valores a cada grupo), prepare un volumen de 1.5 ml para cada una en tubos eppendorf.
2. Lea cada dilución en el espectrofotómetro Perkin Elmer en la  óptima hallada en el numeral 5 de la
curva espectral, registre los valores de factor de dilución y A en la Tabla 3 de control de clase
Anexo 1.
3. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L , g/L y registre los valores en la Tabla
3 de control de clase Anexo 1.
4. Grafique la A de las tres diluciones contra su concentración en M/L y g/L sin hacer correcciones a
los datos, luego corrija los datos de las curvas de calibración por mínimos cuadrados y grafique los
valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y coeficiente de correlación para la
gráfica y procese los datos en la tabla 3 del Anexo 1.
5. Calcule la absortividad molar para la solución mediante su despeje de los valores obtenidos al
corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración.

Tabla 3. Datos curva calibración permanganato de potasio por diluciones independientes.

M/L KMnO4 Lambda Abs
Estándar y Diluciones Máximo g/L M/L Abs Observada
Grupo Abs independientes donde leyó Fd X X Esperada Y
1
2
3
MP 1
a
b
r

D. Curva de Ringbom.
1. Elabore 3 diluciones al azar a partir del estándar, determine su concentración M/L y lea su % T en el
espectrofotómetro, procese los datos en la Tabla 4 del Anexo 1 e incluya los valores de % T de las
tres diluciones en serie que realizó en el numeral B.
2. Calcule el rango óptimo de concentración para las 6 diluciones del numeral 2, por medio de la curva
de Ringbom al graficar los valores % de T contra el logaritmo de la C en M/L (al azar y en serie).
3. Establezca el porcentaje de error relativo.

10
Tabla 4. Datos curva de Ringbom.

Grupo Fd que Y X
Diluciones M/L
aplicó %T Log C
1
2
3
4
5
6

RESULTADOS.

1. Anexe la curva espectral con los datos de la Tabla 1, indicando la longitud de onda máxima de su
estándar y el equipo donde la leyó. No olvide colocar las unidades de las variables
correspondientes.
2. Grafique las curvas de calibración de las diluciones en serie y adjunte: los datos procesados en Tabla
2 del Anexo 1, factores de dilución aplicados, los valores de coeficiente de correlación, pendiente e
intercepto obtenidos por mínimos cuadrados, los valores de absortividad en las unidades solicitadas,
la concentración de la MP en Mol/L y g/L interpolando sobre la curva de calibración, despeje los
Mol/L y g/L de la MP de los datos obtenidos al corregir por mínimos cuadrados o de la formula de
Lambert y Beer).
3. Grafique la curva de calibración para las diluciones independientes y adjunte: los datos procesados
en Tabla 3 del Anexo 1, factores de dilución realizados, los valores de coeficiente de correlación,
pendiente e intercepto obtenidos por mínimos cuadrados y los valores de absortividad en las
unidades solicitadas.
4. Adjunte la grafica de Ringbom con los datos procesados en Tabla 4 del Anexo 1 y el cálculo que
realizó para obtener la concentración óptima.
5. Adjunte el grafico de de porcentaje mínimo de error con los datos procesados en Tabla 4 del Anexo
1 y el cálculo de absorbancia donde está el porcentaje mínimo de error.

BIBLIOGRAFÍA

1. BENDER, G. T. (1987). Métodos Instrumentales de Análisis en Química Clínica. Zaragoza:

Acribia.p. 17, 23, 69-73.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTAR

1. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrometria_de_absorcion.pdf consultado en abril

2009.
2. McKay D. K. et al. A Photometric System for Automatically Reading Concentration. Clinical
Chemistry, 1964: 10, p 907-917

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