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Universidad de la Amazonia

Facultad de Ciencias Básicas


BIOQUIMICA
Programa de Química
INGENIERIA DE ALIMENTOS

PRÁCTICA N°5
ACTIVIDAD ENZIMATICA

1. OBJETIVOS

1.1 Conocer la actividad de la catalasa en tejidos vegetales.


1.2 Evidenciar la hidrólisis del almidón por acción de la amilasa presente en la saliva.
1.3 Evidenciar la hidrólisis de la sacarosa por acción de la glucosidasa de las levaduras.
1.4 Demostrar la presencia y definir el modo de acción de otros sistemas enzimáticos
tales como polifenoloxidasas.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO

Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran las reacciones metabólicas de los
seres vivos. Existe al menos una enzima diferente por reacción catalizada, lo que
representa miles de enzimas en un mismo organismo. Las hay extracelulares e
intracelulares.

En cuanto a la catálisis enzimática, esta se da por la formación de un sitio activo. Este


sitio es una región privilegiada que interactúa con substratos que a su vez se transforman
en productos. El sitio activo está constituido por aminoácidos de 4 tipos: de
contacto, auxiliares, colaboradores y no colaboradores. Son los grupos funcionales
radicales de los aminoácidos los que intervienen directamente en la catálisis. Su
participación se debe a su capacidad para transferir electrones (carácter nucleofílico) y
protones (carácter ácido- básico).

La estructura terciaria es primordial para la catálisis. Permite la formación del sitio activo
ya que aproxima los aminoácidos que lo constituyen. Esta conformación juega a la vez un
rol importante en la protección del sitio activo, y se adapta con exactitud al substrato.

La mayoría de las enzimas son de naturaleza proteica y están sujetas a el fenómeno de la


desnaturalización, si la forma de la enzima es alterada por algún factor externo (por
ejemplo, aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular.

La reacción enzimática in vivo o in Vitro puede inhibirse utilizando inhibidores que pueden
ser o no ser análogos estructurales de los verdaderos substratos de la enzima.
De acuerdo a la complejidad de los complejos que forman en presencia de la enzima y/o
del substrato, y de la modificación cinética que generen, los inhibidores son calificados
como competitivos, incompetitivos, no competitivos o mixtos. En presencia de una enzima
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(E) y su sustrato (S), un inhibidor (I) puede formar complejos binarios complejos EI o
ternarios (ESI). Solo el complejo (ES) es productivo.

Cuando el inhibidor se fija a la enzima libre formando el complejo (EI) se habla de


inhibición competitiva. Cuando se fija sobre el complejo (ES) es incompetitivo. Cuando se
fija con afinidades diferentes a (E) y a (ES) es mixto y cuando lo hace con la misma
afinidad por ambos es no competitivo.

3. TRABAJO PREVIO

3.1 Investigar los factores que afectan la actividad de las enzimas


3.2 Investigue las enzimas encontradas normalmente en los vegetales y en los tejidos
animales.
3.3 Investigue que es el pardeamiento enzimático

4. ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA PRÁCTICA

4.1 Materiales y equipos

Tubos de ensayo de 15 mls


Vaso de precipitado de 250 mls
Pinzas para tubo de ensayo.
Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 mls
Caja de Petri
Espátula
Gradilla
Balanza
Plancha de calentamiento

4.2 Reactivos

Cada grupo debe llevar a la práctica los siguientes tipos de muestras: zanahoria, papa,
manzana, levadura y rábano.
Cantidad Reactivo Descripción
5 mL Agua oxigenada Puro
5 mL Fehling A -----
5 mL Fehling B ------
5 mL Metabisulfito de sodio 1%
5 mL Lugol ----
8 mL Solución de almidón Solución al 5 %
4 mL HCl Concentrado
3 grs Sacarosa Sólido
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5. DESARROLLO EXPERIMENTAL

5.1 Presencia de catalasa en tejidos vegetales

Corte dos trozos de zanahoria y dos trozos de papa, introduzca cada muestra en un tubo
de ensayo, ponga 3 ml de agua destilada y ponga a hervir un tubo con zanahoria y otro
tubo con papa en un baño maría durante 15 minutos, pasado este tiempo deje enfriar el
tubo, retire el agua y adicione 10 gotas de peróxido de hidrógeno (H2O) a cada tubo,
observe y registre lo observado en la siguiente tabla:

Tabla 1. Acción de la Catalasa


Sustrato Reacción con el H2O2
Papa hervida
Papa sin hervir
Zanahoria hervida
Zanahoria sin hervir

5.2 Hidrólisis del almidón por acción de la amilasa

Marque 6 tubos de ensayo y realice las siguientes preparaciones:

- Tubos 1 y 2: 2 ml de solución de almidón


- Tubos 3 y 4: 2 ml se solución de almidón y 1 ml de saliva
- Tubos 5 y 6: 2 ml de solución de almidón y 1,5 ml de HCl

Deje los tubos en reposo durante 30 minutos y adicione a los tubos 1,3 y 5; 0,5 mls
reactivo de Fehling A y 0,5 mls de Fehling B y a los tubos 2,4 y 6 lugol. Reporte las
observaciones en la siguiente tabla:

Tabla 2. Hidrolisis del Almidón

Tubo N° Lugol Fehling


1
2
3
4
5
6

5.3 Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de las levaduras

Disuelva 2 gr de levadura en 20 ml de agua destilada, deje reposar esta mezcla durante


15 minutos, filtre la mezcla y el líquido resultante es el extracto de levadura.
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Prepare los siguientes tubos:


Tubo A: 1 gr de sacarosa más 5 ml de agua y agitar
Tubo B: 1 gr de sacarosa más 5 ml de agua más 3 ml de extracto de levadura y agitar

Adicione a cada tubo una reacción de Fehlling y anote los resultados.

5.4 Acción de las polifenol-oxidasas

Corte 12 tiras delgadas de manzana y rábano de aproximadamente 5 cm, raspando los


bordes para destruir células del tejido. A continuación, hierva en un baño maría la mitad
de los trozos de manzana y rábano.

Sobre una caja de Petri ponga 2 trozos de manzana y rábano sin hervir, y sobre otra
ponga 2 trozos de cada uno pero hervidos. Enseguida, sumerja 2 trozos de manzana y
rábano sin hervir en un tubo de ensayo con solución de metabisulfito sódico. Haga lo
mismo con 2 trozos de manzana y rábano hervidos.

Registre las observaciones.

6. RESULTADOS

Completar las tablas y analizar los resultados

7. PREGUNTAS

7.1 ¿Qué tiene que ver la desnaturalización de las proteínas con esta práctica?
7.2 ¿En qué pruebas se puede evidenciar la desnaturalización de las enzimas?
7.3 Mediante un diagrama explique cómo actúa la glucosidasa de las levaduras sobre la
sacarosa.
7.4 ¿Químicamente qué es el metabisulfito de sodio y que efecto tiene sobre las polifenol
oxidasas?
7.5 ¿Qué aplicaciones industriales tiene este compuesto?

8. REFERENCIAS

 Fersht, A. 1998. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme


Catalysis and
Protein Folding. W. H. Freeman. ISBN 0-7167-3268-8.
 Athel C. 2004.Fundamentals of Enzyme Kinetics. (3rd edition), Portland Press,
ISBN 1-85578158-1.
 BOHINSKI. 1991 Bioquímica. 5ed., Pearson. México.
 MATHEWS VAN HOLDE. 2004 Bioquímica. 3 Ed Pearson. España
 WILSON, K., AND WALKER, J. 2000. Principles and Techniques of practical
Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
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