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EFECTO DE UN YOGUR CON BETAGLUCANOS, OBTENIDOS BIOTECNOLOGICAMENTE A PARTIR DE GANODERMA LUCIDUM, SOBRE EL SISTEMA INMUNOLÓGICO Y EN LA INCIDENCIA DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA E INFECCIÓN RESPIRATORIA AGUDA EN NIÑOS PREESCOLARES. MEDELLÍN, 2015

Ensayo Clínico Controlado

PROGAL BT S.A.S.

MEDELLÍN

2015

TABLA DE CONTENIDO

1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

8

1.1 Planteamiento del problema

8

1.2 Justificación

9

1.3 Preguntas de investigación

11

2. MARCO TEÓRICO

12

2.1

GENERALIDADES

12

2.1.1

Ganoderma lucidum

12

2.2

BETAGLUCANOS DEL GANODERMA LUCIDUM

14

2.2.1. Estructura

14

2.2.2

Aislamiento de los betaglucanos

15

2.3

EFECTOS DE LOS BETAGLUCANOS

16

2.3.1 Betaglucanos y el Sistema Inmunológico

16

2.3.2 Efectos antivirales y antibacteriales

22

2.3.3 Estudios clínicos previos sobre el efecto de los Betaglucanos en humanos

23

2.4

DOSIS ESTIMADA DIARIA DEL GANODERMA LUCIDUM Y BETAGLUCANOS

24

2.4.1 Dosis de Ganoderma lucidum

24

2.4.2 Dosis de Betaglucanos

25

2.5 CARACTERÍSTICAS DE LA MATRIZ (Betaglucanos de Ganoderma lucidum)

26

2.6 METABOLISMO DE LOS BETAGLUCANOS

27

2.7 EFECTO DE LOS BETAGLUCANOS EN PELO Y PIEL

27

2.8 TOXICIDAD Y EFECTOS SECUNDARIOS DEL G.LUCIDUM Y SUS POLISACARIDOS

28

2.9 EFECTOS SECUNDARIOS DEL GANODERMA LUCIDUM

30

2.10 CONTRAINDICACIONES

31

2.11 INFECCIONES EN LA INFANCIA

32

2.11.1. Enfermedad Diarreica Aguda (EDA)

32

 

2.11.2 Infección Respiratoria Aguda (IRA)

33

3. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN

36

 

4. OBJETIVOS

37

4.2

Objetivos secundarios

37

4.3

Objetivo exploratorio

37

5. METODOLOGÍA

38

5.1 Enfoque metodológico de la investigación

38

5.2 Tipo de estudio

38

5.3 Grupos de estudio

38

5.4 Intervención

39

5.5 Población de estudio

40

 

5.6 Muestra

40

5.7 Criterios de Inclusión

42

5.8 Criterios de Exclusión

42

5.9 Operacionalización de las variables

42

5.10

Técnicas de recolección de información

48

5.10.1 Fuentes de información

48

5.10.2 Instrumento de recolección de información

48

5.11 Proceso de obtención de la información

48

5.12 Control de errores y sesgos

49

5.13 Técnicas de procesamiento y análisis de datos

49

5.14 Consideraciones éticas

51

6. CRONOGRAMA

54

7. PRESUPUESTO

¡Error! Marcador no definido.

BIBLIOGRAFÍA

55

Anexo 1. Instrumento de recolección de la Información

75

Anexo 2. Registro de extracción de muestra sanguínea

76

Anexo 3. Formato de reporte reacciones adversas, adherencia e infecciones semanal

77

Anexo 4. Protocolo de investigación

78

Anexo 5. Consentimiento y Asentimiento Informado

85

Anexo 6. Póliza de seguro de Progal-BT S.A.S. para atención de reacciones adversas

89

Anexo 7. Certificado INVIMA

90

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.

Efectos de los polisacáridos de G.lucidum en las células inmunes

19

Tabla 2.

Toma de betaglucanos (mg/persona/día y mg/kg de peso corporal /día) basado en datos

de USDA

25

Tabla 3.

Número de menores matriculados en los centros de la Fundación de Atención a la niñez -

FAN- entre 3 y 5 años. Septiembre, 2014

42

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama explicativo de la formulación del problema

11

Figura 2. Estructura química del Beta-Glucano del Ganoderma

14

Figura 3. Aislamiento y purificación de los B-Glucanos del Ganoderma

16

Figura 5.Efectos inmunomodulatorios del Ganoderma

18

Figura 6. Efectos inmunomodulatorios de los lipopolisacaridos del Ganoderma lucidum

21

Figura 7. Diagrama de flujo del ensayo clínico: Betaglucanos como compuesto fortificante de una

yogur para preescolares. Medellín, 2015

40

Resumen

Introducción: El sistema inmune es fundamental para la supervivencia humana, debido a que requiere de un tiempo para que madure, los menores de cinco años son más susceptibles de presentar infecciones, siendo la enfermedad diarreica aguda y la infección respiratoria aguda dos de las más prevalentes e incidentes en la infancia. Entre las estrategias que se plantean para mejorar la respuesta inmunológica y la consecuente disminución estas infecciones, está el enriquecimiento de los alimentos con betaglucanos, polisacáridos derivados de hongos como el Ganoderma Lucidum.

Objetivo: Evaluar el efecto de los betaglucanos derivados del Ganoderma Lucidum como compuesto fortificante de un alimento funcional en la modulación inmunológica y en la incidencia de enfermedades comunes en niños de 3 a 5 años durante doce semanas de seguimiento.

Método: Se diseñó un ensayo clínico, con asignación aleatoria de grupos, triple ciego en niños preescolares, donde se suministrará yogur enriquecido con betaglucanos en matriz Maltodextrina y Polidextrosa. Los niños que no recibirán los betaglucanos, consumirán el mismo yogur pero sin betaglucanos. Se harán pruebas inmunológicas de marcadores CD3 en linfocitos y CD16 en células Natural Killer (NK), así como recuento de hemoglobina, hematocrito y de células blancas al inicio y al final de la intervención. Se evaluará también la incidencia de enfermedad diarreica aguda e infecciones respiratorias agudas como parámetros epidemiológicos del estado de salud de los niños.

Resultados esperados: Se espera que los resultados de esta investigación puedan ser útiles al proporcionar evidencia científica sobre el posible beneficio que la ingesta de alimentos funcionales enriquecidos con betaglucanos en la salud de los niños preescolares al incidir en el mejoramiento de las condiciones de salud de los menores en situación de vulnerabilidad.

Abstract

Introduction: The immune system is essential for human survival, because this system requires time to mature, children under five years of age are more susceptible to infections; acute diarrheal disease and acute respiratory infection are two of the most prevalent and incident during childhood. Among the strategies highlighted to enhance the immune response and the consequent decrease of these infections, there is the enrichment of foods with beta-glucans, polysaccharides derived from fungi such as Ganoderma lucidum.

Objective: To evaluate the effect of beta-glucan derived from Ganoderma lucidum as fortifier of a functional food in immune modulation and the incidence of common diseases in children of 3-5 years.

Method: A clinical trial with random assignment to the group, triple blind was designed, in which a milk supplement enriched in beta-glucan in matrix Maltodextrin and Polydextrose will be provided to one of the groups, and the product added with the matrix (Maltodextrin and Polydextrose) but not beta-glucans to the other group. Immunological tests will be performed; lymphocytes CD3 and CD16 on natural killer cells (NK) markers, hemoglobin, hematocrit and white cells will be measured before and at the end of the intervention. The incidence of acute respiratory infections and acute diarrheal disease will also be evaluated.

Expected results: It is expected that the results of this research will be useful to provide evidence of the possible benefits of beta-glucan-enriched foods intake could have on the health of preschool children, focusing on improving health conditions of the children at vulnerability.

1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

1.1 Planteamiento del problema

El sistema inmune es fundamental para la supervivencia humana, en ausencia de un sistema activo, incluso infecciones menores pueden avanzar hasta ocasionar la muerte (1); debido a que se necesita un tiempo para que dicho sistema madure, los niños menores de cinco años se consideran más susceptibles de presentar diferentes enfermedades infecciosas (2).

La enfermedad diarreica aguda -EDA- y la infección respiratoria aguda -IRA- constituyen dos de las enfermedades más prevalentes en la población infantil; situación por la cual el sector salud debe destinar una considerable magnitud de recursos para atender esta problemática, tanto para el manejo ambulatorio de la enfermedad, como para el cuidado hospitalario derivado de sus complicaciones (3).

Para conocer la respuesta inmune en fases tempranas de infección, se utilizan los linfocitos T, debido a que se constituyen en los marcadores indicados para conocer la calidad y el tipo (Th1 o Th2) de la respuesta (4). Asimismo, las citoquinas juegan importantes papeles en la patogénesis y en la protección contra infecciones virales agudas, que pueden influir la clínica resultado de la enfermedad (5).

Conjuntamente, existen células linfocitarias muy importantes denominadas células asesinas naturales (NK), linfocitos granulares que se han establecido como efectores implicados en las respuestas inmunes innatas (6,7). El fenotipo de las células NK puede especificar el tipo de respuesta como citotóxica o citolítica y esto se define por la expresión de marcadores de superficie celular CD16 y CD56. El CD16 es un receptor de baja afinidad expresado en las células NK y otros tipos de células, que son importantes en la activación de las NK y la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (6,7).

Se ha visto como en niños con infección de tracto respiratorio superior de tipo viral se produce linfocitosis significativa, aumento del tamaño relativo y el número absoluto de células T CD3 +, CD8 +, CD16 + y CD56 +, las células NK y el número absoluto de linfocitos T activados que causan estimulación antigénica en estos pacientes (8).

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y UNICEF, para el año 2008 se estimó que en el mundo murieron 8.795 millones de menores de cinco años, 68% de los cuales fallecieron por enfermedades infecciosas: 18% por neumonía y 15% por diarrea (9). Específicamente en la ciudad de Medellín, si bien se ha observado una considerable disminución en la tasa de mortalidad por IRA y EDA, todavía en 2012 murieron por estas causas 15,7 y 1,4 niños por cada cien mil menores de cinco años, respectivamente (10).

Debido a sus implicaciones, las medidas que contribuyen a prevenir este tipo de enfermedades constituyen la principal estrategia para combatir este grave problema de salud pública (11), impactando positivamente no solo al sistema de salud, sino también y de manera significativa, en la calidad de vida del menor y la de su familia.

Entre las estrategias para prevenir estas enfermedades, se encuentran los controles prenatales, la ingesta de una alimentación saludable y balanceada, el cumplimiento del esquema de vacunación, la prevención de contacto con personas enfermas, medidas de saneamiento, adecuada manipulación y conservación de alimentos, la adquisición y práctica de hábitos adecuados de higiene y de manera muy especial, la fortificación de alimentos (11).

Entre los compuestos fortificantes que pueden utilizarse, se encuentran los betaglucanos, polisacáridos derivados de distintos hongos como el Ganoderma lucidum (12), que según estudios tienen un efecto benéfico en las funciones inmunes del cuerpo y en los factores biológicos implicados en procesos infecciosos, así como estados de tensión y de la tolerancia reducida a las condiciones ambientales desfavorables (12).

En la literatura revisada no se encontró información que evidenciara si en el caso de preescolares de Medellín, la ingesta de un alimento funcional fortificado con betaglucanos favorece la modulación inmunológica, evaluada a partir del comportamiento de los marcadores CD3 y CD16 de linfocitos, del perfil hematológico, y de la incidencia de dos de las infecciones más prevalentes en la infancia: la enfermedad diarreica aguda y la infección respiratoria aguda, además del cambio subjetivo en la apariencia del pelo y la piel de quienes consumen el alimento. Tampoco se conoce evidencia sobre posibles efectos adversos derivados de la ingesta de estos polisacáridos en estos niños.

De otro lado, se encontraron recomendaciones derivadas de revisiones sistemáticas en las que se promueve el diseño y ejecución de ensayos clínicos en subgrupos poblacionales específicos, en quienes se evaluara el efecto que produce la inclusión de betaglucanos y otros polisacáridos en la dieta regular (13).

Se espera que los resultados de esta investigación puedan ser útiles al proporcionar evidencia científica sobre el posible beneficio que la ingesta de alimentos funcionales enriquecidos con betaglucanos pueda traer a la salud de los niños preescolares y de ser así, incentivar la inclusión de este compuesto en los programas y proyectos enfocados a mejorar las condiciones de salud de los menores en situación de vulnerabilidad.

1.2 Justificación

Cada año mueren en el mundo millones de niños menores de cinco años como consecuencia de enfermedades que pudieron ser evitadas o tratadas mediante la aplicación de medidas eficaces de control (14). Entre las principales causas de esta problemática, las Infecciones Respiratorias

Agudas (IRA) y la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) constituyen un importante problema, tanto por las cifras de morbilidad, como por el elevado índice de mortalidad que provocan, principalmente en países en desarrollo (3,14).

Habitualmente los niños menores de cinco años presentan entre 7 y 10 episodios de IRA al año; estas enfermedades constituyen la principal causa de consulta en los servicios de salud (40% - 60%) y representan una importante proporción de las causas de hospitalización (30% - 50%) (15). Adicionalmente estas enfermedades inciden directamente en otros aspectos, como el ausentismo escolar, las necesidades de atención médica, el consumo de medicamentos y principalmente, en las afectaciones sociales derivadas de la situación que provoca la enfermedad y la pérdida de una vida que recién comienza (16).

Reducir la mortalidad infantil se ha considerado un imperativo en Colombia y en el mundo entero, al reconocer la importancia de la salud de los niños en el desarrollo social y económico de las poblaciones (17).

Se ha observado como la desnutrición y la baja estatura durante los primeros tres años de vida, está relacionada negativamente con los resultados educativos de los niños, con los niveles de ingresos y salarios obtenidos a futuro y con la posibilidad de contraer enfermedades durante la niñez y la edad adulta. Estos hallazgos sugieren que los canales a través de los cuales la desnutrición trunca las posibilidades de desarrollo futuro son acumulativos y progresivos, en el sentido de que los efectos tienden a agravarse en la edad adulta (18).

Se han estudiado en el mundo diferentes compuestos nutricionales que sean coadyuvantes en el mejoramiento de la salud del ser humano, entre ellos está el Ganoderma lucidum (G. lucidum), un hongo medicinal utilizado comúnmente en medicina tradicional china para prevenir y tratar varias enfermedades (1921). En las últimas décadas la actividad biológica y funcional de las sustancias del G.lucidum han sido ampliamente estudiadas, entre ellas su rol sobre la inmunidad (19,22,23). Entre los componentes del hongo, los betaglucanos son unos de los constituyentes activos más importantes; de este compuesto se ha reportado un amplio efecto regulador de funciones inmunológicas, tanto in vitro, como in vivo en el ser humano (2429). Recientemente los betaglucanos han sido aprobados por la FDA como ingrediente alimentario (30).

Según el Fondo de Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF) cerca de seis millones de los casi once millones de niños y niñas que mueren todos los años se podrían salvar por medio de medidas no muy sofisticadas y eficaces en relación a sus costos, encontrándose entre estas el suministro y fortificación de alimentos con micronutrientes (31). Es así como intervenciones como la ingesta de alimentos fortificados con diferentes compuestos, entre ellos los betaglucanos, podrían ayudar en la tarea de tener en una población infantil menos vulnerable y más resistente a las enfermedades.

De allí la necesidad de encontrar evidencia que pueda utilizarse en la formulación e implementación de programas y proyectos en los que se suministren alimentos fortificados a los menores de cinco años, de manera que se conozca si los compuestos son efectivos, bien tolerados

y suministrados en vehículos adecuados para el consumo de los niños, con el fin de disminuir la alta carga de morbimortalidad infantil. En la Figura 1 se expone el diagrama explicativo de la formulación del problema.

¿Existe modulación

inmunológica?

Marcadores CD3 y CD16

Perfil hematológico

inmunológica? Marcadores CD3 y CD16 Perfil hematológico Niños entre 3 y 5 años que ingieren una
Niños entre 3 y 5 años que ingieren una bebida fortificada con betaglucanos (β-1- 6-D-Glucano)
Niños entre 3 y 5
años que ingieren
una bebida
fortificada con
betaglucanos (β-1-
6-D-Glucano)
durante 3 meses

¿Disminuye la incidencia

de enfermedades

prevalentes en la infancia?

Enfermedad Diarreica Aguda

Infección Respiratoria Aguda

Enfermedad Diarreica Aguda Infección Respiratoria Aguda ¿Qué reacciones adversas se presentan? Vómito Dolor de
Enfermedad Diarreica Aguda Infección Respiratoria Aguda ¿Qué reacciones adversas se presentan? Vómito Dolor de

¿Qué reacciones adversas

se presentan?

Vómito

Dolor de estómago

adversas se presentan? Vómito Dolor de estómago Figura 1. Diagrama explicativo de la formulación del

Figura 1. Diagrama explicativo de la formulación del problema

1.3 Preguntas de investigación

¿Existe modulación inmunológica posterior a la ingesta de un alimento funcional fortificado con betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum en niños sanos de tres a cinco años de Medellín?

¿Existen diferencias en las incidencias de IRA y EDA en menores que reciben betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum durante tres meses y los que no los reciben?

¿Existen diferencias en la proporción de reacciones adversas a la ingesta del yogur entre los niños que reciben betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum y los que no los reciben?

¿Mejora la apariencia subjetiva del pelo y la piel en los niños que toman el alimento funcional con betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum durante tres meses?

2.1 GENERALIDADES

2.1.1 Ganoderma lucidum

2. MARCO TEÓRICO

El Ganoderma lucidum (G. lucidum) es un hongo medicinal comúnmente usado en medicina tradicional china y formulado en varios países de Asia para prevenir y tratar varias enfermedades (20,21). En China, el Ganoderma ha sido usado por los humanos desde hace miles de años (32), siendo uno de los medicamentos tradicionales más prescritos.

El hongo está ampliamente distribuido en el mundo, desde el Amazonas a regiones del sur de Norteamérica y gran parte de Asia. Este hongo se encuentra menos frecuentemente en regiones templadas que en las sub-tropicales (33).

El hongo G. lucidum posee un 31% de humedad y una composición (% peso seco) de 11,1% de glucosa, proteína 7,3% y un 10,2% de metales (K, Mg y Ca son los mayores componentes con Ge como quinto metal más abundante, con una concentración de 489 μg/g) (34). G. lucidum es un hongo bajo en calorías y rico en proteínas vegetales, quitina, vitaminas y minerales (35).

Entre otros componentes naturales bioactivos, además de los polisacáridos y los triterpenoes, se encuentran nucleosidos, ácidos ganodéricos, ergosteroles, proteínas, ácidos grasos insaturados, vitaminas y minerales (34).

Los estudios recientes se han concentrado en las propiedades medicinales de estos hongos dados sus compuestos bioactivos, los cuales incluyen no solo el ácido ganodérico y los polisacáridos, sino que también proteínas y otros metabólitos (36).

COMPONENTES NATURALES BIOACTIVOS DEL GANODERMA LUCIDUM

Varias proteínas activas han sido aisladas del G.lucidum, mientras algunas otras proteínas existen en forma de complejos de péptidos-polisacáridos.

Se ha descrito la secuencia completa de aminoácidos y las propiedades bioquímicas e inmunológicas del Lingzhi-8 (LZ-8), péptido del Ganoderma que ha demostrado ser mitogénica para los esplenocitos de ratón in vitro, e inmunomoduladora in vivo al reducir la formación de anticuerpos inducida por antígenos. Se ha evidenciado, además, que el péptido del G. lucidum es su principal componente antioxidante (37).

Se han encontrado varios aminoácidos de alto valor nutricional y con propiedades medicinales, entre ellos los micelios, el cuerpo fructífero y el polvo de esporas aminoácidos en varias concentraciones siendo los de más alta concentración la serina (15,2mmol%), alanina (14,8mmol%), glicina (12,7mmol%), treonina (12,4mmol%), ácido aspártico (9,9mmol%), ácido glutámico (8,1mmol%) y prolina (6,9mmol%) (38,39).

Los Triterpenos / triterpenoides son uno de los componentes biológicamente activos más importantes del G.lucidum. Los triterpenos predominantes son los ácidos ganodéricos A-Z, ganoderal A y B, ganoderol A y B, epoxyganoderiol A-C, ácido ganoderenico A-D, ácidos ganodermicos, ganoderiol, ganodermanontriol A-I, ganodermatriol, ácidos ganolucidico A-E, lucidone A-C, ácidos lucidenico A-M, lucidadiol y lucidal (40).

Los triterpenoides han mostrado que poseen efecto hepatoprotector, anti-hipertensivo, efectos

hipocolesterolémicos y anti-histamínicos, actividad anti-tumoral y anti-engiogénica, efectos sobre

la agregación plaquetaria y la inhibición del complemento (41).

Más de 200 polisacáridos han sido aislados de los cuerpos fructíferos, las esporas, micelios y caldos de cultivo del G. lucidum (42), que representan una clase de macromoléculas biológicas estructuralmente diversas con amplias propiedades físico químicas con una gran capacidad para transportar información biológica debido a su variabilidad estructural (32).

Los polisacáridos como los beta-D-Glucanos, heteropolisacaridos y glicoproteínas han sido aislados

y caracterizados como los de mayor actividad en el G. lucidum (41). Se ha encontrado que los

Glucanos con alto peso molecular parecen ser más efectivos que los de bajo peso molecular (27).

Entre los polisacáridos aislados del G.lucidum se encuentran: Polisacáridos neutrales (β-1-3, β-1- 6 homo D-Glucan), glicanosacidos y poliglicanos, proteínas unidas a heteroglucanos, arabinoxyo glucanos, heteroglicanos con β-1-4 core, y peptidoglicanos (ganoderan A, B, y C) (40).

Los principales polisacáridos bioactivos aislados de las especies del Ganoderma son glucanos, beta-(1,3) y beta-(1,6)-D-Glucanos. Uno de los productos más investigados últimamente llamado Ganopoly, consta principalmente de polisacáridos neutrales compuestos por unidades de glucosa; aproximadamente la tercera parte de los polisacáridos consisten de beta-(1-3)-D-Glucanos, que contienen ramificaciones beta-(1-6)-D-glucosiladas (32).

Varias actividades antitumorales e inmunomoduladoras se han reportado desde los años 60 y recientemente se han conducido amplios estudios sobre el efecto antitumoral, especialmente los polisacáridos solos y ligados a proteínas. Los polisacáridos, especialmente los beta-D-Glucanos han mostrado que poseen efectos anti-tumorales a través de la inmunomodulación y anti- angiogénesis. Adicionalmente, los polisacáridos tienen un efecto protector frente a los radicales libres reduciendo el daño celular causado por mutágenos (41).

2.2 BETAGLUCANOS DEL GANODERMA LUCIDUM

2.2.1. Estructura

Los β-Glucanos (beta-Glucanos) se componen de polímeros de D-glucosa unidos por enlaces glucosídicos tipo beta. Estos anillos de seis caras pueden ser conectados unos a otros, en una variedad de posiciones en la estructura del anillo de D-glucosa variando su solubilidad, viscosidad, peso molecular y configuración tridimensional (Figura 2) (43). El rango de peso molecular de los beta-Glucanos está entre los 9,6 kDA a 298 kDA, y característicamente se presenta como un fino polvo de color beige soluble en agua (39).

como un fino polvo de color beige soluble en agua (39). Figura 2. Estructura química del

Figura 2. Estructura química del Beta-Glucano del Ganoderma

Extraído de Gao Y, Zhou S. Cancer Prevention and Treatment by Ganoderma , a Mushroom with Medicinal Properties. Food Rev. Int. 8 de enero de 2003;19(3):275-325.

La estructura química más común de los betaglucanos de hongos es beta-1,3-Glucanos en el tallo y diferentes grados de beta-1,6 y/o beta-1,4 en las ramificaciones. Investigaciones han demostrado que betaglucanos insolubles (1,3 / 1,6), tienen mayor actividad biológica que sus homólogos betaglucanos solubles (1,3 / 1,4) (44).

La forma más activa de los betaglucanos son los que integran unidades de D-glucosa unidas unas a otras en la posición (1,3) con cadenas laterales de D-glucosa unidas a la posición (1,6). Estas son referidas como 1,3/1,6-betaGlucano. Algunos investigadores han sugerido que es la frecuencia, la ubicación y la longitud de la cadena lateral, en lugar de la columna vertebral de betaglucano, la que determina su actividad sobre el sistema inmune (43).

Otra variable es el hecho de que algunos de estos compuestos contienen una única cadena de filamentos, mientras que las columnas vertebrales de otros beta-1,3-Glucanos existen en forma de cadenas hélice doble y triple. Hay opiniones diferentes sobre qué peso molecular, forma, estructura y fuente de beta- (1,3)-Glucanos proporcionan el mayor beneficio terapéutico (43).

La estructura en triple hélice, el peso molecular y la carga de los polímeros Glucanos son determinantes importantes en la unión al receptor de membrana (CR3, aMb2 integrín, o CD11b/CD18 ) a través del cual se inicia la respuesta inmune innata o adaptativa de los linfocitos y macrófagos (45), siendo este el paso inicial de la notable capacidad de los betaglucanos derivados del G.lucidum para modular el sistema inmunitario.

2.2.2 Aislamiento de los betaglucanos

La FDA ha aceptado la notificación de la afirmación de GRAS (Generalmente Reconocido como Seguros, por sus siglas en inglés Generally Recognized as Safe) a los betaglucanos aislados del hongo G.lucidum (39). Las condiciones específicas de fabricación, los datos de seguridad y las especificaciones del producto solo se aplica a la versión Beta-1,3-D-Glucano producido con un proceso tal como se define en el expediente de GRAS y en la notificación de FDA (39).

PROCESO DE AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

El micelio de la cepa de G. lucidum se subcultiva y se mantiene en medio de agar estéril bajo condiciones controladas. El proceso de fabricación se inicia con la preparación de una medio de cultivo que contiene glucosa, galactosa, sacarosa, manosa y extracto de levadura. Después de un procedimiento de esterilización a una temperatura seleccionada y la presión durante un tiempo específico, el micelio de G. lucidum se introduce en el medio estéril y se cultiva utilizando una incubadora a una gama de temperaturas por 3-5 semanas para permitir el crecimiento completo del hongo. Posteriormente, se extraen los betaglucanos del micelio, utilizando una centrifugadora de alta velocidad y un homogeneizador ultrasónico. La solución resultante se filtra y se separa usando una membrana cerámica para despojar a la mayoría de las pequeñas moléculas de carbohidratos residuales. Las partículas del concentrado de betaglucanos son reunidas, secadas y molidas en la forma de polvo. Al finalizar, los betaglucanos se empaquetan como polvo (39).(¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.3)

Este proceso de fabricación y el producto final son altamente reproducibles de forma que el producto final cumpla con las especificaciones. El producto final está compuesto por betaglucanos (50%) con un contenido total de carbohidratos de más de 95%. Los betaglucanos también contienen aproximadamente 1% de grasa, 1% de proteínas, 3% de ceniza y 2% humedad (39).

Medio de cultivo que consiste en Glucosa, Galactosa,

Manosa + Sacarosa + extracto de levadura

Esterilización Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana

Esterilización

Esterilización Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana

Medio de cultivo esterilizado

Esterilización Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana

Incubadora

Esterilización Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana

Extracción

Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana cerámica
Filtración
Filtración

Filtrar y separar el uso de membrana cerámica

Medio de cultivo esterilizado Incubadora Extracción Filtración Filtrar y separar el uso de membrana cerámica

Zeta de Beta Glucano (forma líquida)

de membrana cerámica Zeta de Beta Glucano (forma líquida) Secado Moler Polvo de color canela fina

Secado

cerámica Zeta de Beta Glucano (forma líquida) Secado Moler Polvo de color canela fina Polvo de

Moler

cerámica Zeta de Beta Glucano (forma líquida) Secado Moler Polvo de color canela fina Polvo de

Polvo de color canela fina

(forma líquida) Secado Moler Polvo de color canela fina Polvo de seta de β -Glucano Inoculación

Polvo de seta de β-Glucano

Polvo de color canela fina Polvo de seta de β -Glucano Inoculación del G. lucidum Para
Inoculación del G. lucidum
Inoculación del
G. lucidum

Para aislar moléculas de hidratos de carbono residuales

Figura 3. Aislamiento y purificación de los B-Glucanos del Ganoderma

Extraído de Steele, EA. Notification of GRAS Determination for [3-Glucans derived from mushroom. 2011.

2.3 EFECTOS DE LOS BETAGLUCANOS

2.3.1 Betaglucanos y el Sistema Inmunológico

Existen en la literatura diferentes reportes y evidencia de las propiedades antiinflamatorias y de supresión de respuestas alérgicas del Ganoderma lucidum y de sus polisacáridos, entre ellos los betaglucanos (4648). Dichas propiedades antiinflamatorias tienen sus usos en la prevención de diferentes enfermedades vasculares e inflamatorias crónicas (47), siendo ayudadas por los potentes efectos antioxidantes e inmunomoduladores que también poseen los betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum que los hacen excelentes suplementos nutricionales para pacientes en tratamiento con inmunosupresores y quimioterapia antitumoral (49,50).

Los betaglucanos son reconocidos por su capacidad de activar el sistema inmunológico (51). Se sabe que un receptor en la superficie de las células inmunes llamado Receptor del Complemento 3 (CR3 o CD11b /CD18) es responsable de la unión a betaglucanos, permitiendo que las células inmunes los reconozcan (52). Sin embargo, la actividad de los betaglucanos, diferente de algunos fármacos que sobre estimulan el sistema inmunológico, hacen que este sistema funcione mejor (53). Al mejorar la actividad del sistema inmunológico, los betaglucanos ayudan en el tratamiento

y prevención de infecciones, así como potencial adyuvantes en el tratamiento del cáncer.

Los polisacáridos son unos de sus principales compuestos que modulan la función inmune in vivo

e in vitro, su efecto es múltiple: promueve la presentación del antígeno a las células, acción sobre células mononucleares, inmunidad celular y humoral (27).

Estudios en ratones inmunosuprimidos han mostrado como los polisacáridos del G. lucidum mejoran la respuesta inmunológica, ayudan a recobrar las células de la medula ósea, glóbulos rojos, glóbulos blancos así como los linfocitos T natural killer (NK) esplénicos. Mejora la proliferación de linfocitos T y B (al octavo día de suministrado), los linfocitos T citotóxicos (al quinto día) y las células NK (entre el séptimo y noveno día), se promueve la fagocitosis y la citotoxicidad de macrófagos al día doce sin encontrar ningún tipo de efectos adverso (54).

Aún no están completamente claros los detalles sobre la forma como las células reconocen a los polisacáridos, sin embargo, hay reportes y experimentos que han propuesto algunos receptores de betaglucanos (55).

Entre los receptores de betaglucanos que intervienen en estas actividades inmunomoduladoras se encuentran el receptor de Complemento 3 (CR3, αM β2-integrina, CD11b/CD18), la lactosilceramida, el glicoesfingolipido, receptores estabilizadores de radicales libres, la dectina-1, y los receptores TLR-2 y TLR-4 (32). El reconocimiento de los microbios y sus moléculas mediadoras por parte de los macrófagos, es mediado por receptores TLRs que son específicos para diferentes componentes microbianos (32). Se ha encontrado que el G. lucidum suprime marcadamente la secreción de citoquinas inflamatorias: factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la interleuquina-6 (IL- 6), óxido nítrico (NO) y la prostaglandina E 2 (PGE 2)(56).

Los polisacáridos del G. lucidum como inmunomodulador biológico actúan a través de los siguientes mecanismos (32) (Figura 4):

1. Mediante la activación de los macrófagos, facilita la transformación de linfocitos T, en células T citotóxicas y, aumenta el número y la actividad de los linfocitos B y las células natural killer (NK).

2. Puede activar el sistema retículo endotelial y el sistema de complemento; Induce varios factores inmunes tales como: INF, TNF., etc.

3. Puede influenciar “el Sistema Inmune neuro endocrino”

4. Puede facilitar la síntesis de RNA y ADN y la síntesis celular de proteínas, así como aumentar los contenidos celulares de GMPc y AMPc.

Figura 4.Efectos inmunomodulatorios del Ganoderma Extraido de: Gao Y, Zhou S. Cancer Prevention and Treatment

Figura 4.Efectos inmunomodulatorios del Ganoderma

Extraido de: Gao Y, Zhou S. Cancer Prevention and Treatment by Ganoderma , a Mushroom with Medicinal Properties. Food Rev. Int. 8 de enero de 2003;19(3):275-325.

Efecto sobre los Linfocitos T

Estudios demuestran que la función de la inmunidad mediada por células es incrementada por el G. lucidum. Los polisacáridos incrementan la proliferación de linfocitos (por intermedio de la Con A linfocitaria) aumentando la síntesis de DNA en las células esplénicas (27), además de aumentar el conteo de células blancas en el hemoleucograma. En la inmunidad mediada por células aumentan los linfocitos CD3+, CD5+, CD4+, CD8+ en sangre periférica (57).

Con el tratamiento de los polisacáridos, se aumentan las citoquinas: IL-1, IL-2, IFN- γ (58). El G. lucidum además al incrementar la producción de IL-12 promueve la activación de los macrófagos. La IL-4 (citoquina que se altera en las alergias) no se afecta con el tratamiento a largo plazo con el G. lucidum. Esto sugiere que la administración oral produce inmunopotenciación de las Th1 (59).

En estudios recientes se ha visto como los polisacáridos derivados del Ganoderma lucidum son fuertes inductores de respuesta inflamatoria innata, aumentando la respuesta Th1, con altos niveles de IFN-y y IL-2, y demostrando que no tienen impacto sobre la producción de IL-4, con un patrón similar sobre la citoquina IL-10 (60).

Efecto sobre los Linfocitos B

La fracción bioactiva de los glicopolisacaridos del G. lucidum puede estimular la activación, proliferación y diferenciación de los linfocitos B. Este efecto es independiente del producido sobre los linfocitos T (27).

Los polisacáridos (en particular los beta-D-Glucanos) se unen a las superficies de los linfocitos B a través de receptores específicos o proteínas especificas en el suero llevado a modulación en la actividad de macrófagos, células T auxiliares, células NK, y otras células efectoras (61) (Tabla 1).

Tabla 1. Efectos de los polisacáridos de G.lucidum en las células inmunes.

Células de Inmunidad

Efectos

Mejora la fagocitosis.

Promoción IL-1, la producción del TNFαy la expresión del TNFαmRNA.

Macrófagos

 

Previene la lesión oxidativa inducida por tBOOH oxidante

Protege la membrana mitocondrial y alivia la lesión de la membrana por radicales libres.

Incrementa el [Ca² + ]

Induce la formación del IP 3 y el DAG

Incrementa la actividad del PKC

Activa los macrófagos a través de TLR4 y TLR4-modulada por proteína quinasa y vías de señalización.

Aumento de la PKC, MAPK, HCK y actividad de la tirosina quinasa Lyn.

Neutrófilos

Inhibir la apoptosis espontanea e inducida por la activación de AKT-regulados vías de señalización.

Promover la maduración y la iniciación de la respuesta inmune inducida por CD.

Células Dendríticas

Promover la citotoxicidad de CTL específica inducida por CD.

mejorar las células NK

Células Natural killer

Aumentar la citotoxicidad mediada por células NK

Aumentar la proliferación inducida por Con A linfocitario y MLC.

Linfocitos T

Promover la IL-2 y la producción de IFN- γ

Incrementar la síntesis del DNA y mejorar la actividad del DNA polimerasa α.

Células de Inmunidad

Efectos

Incrementar el porcentaje de CD3 + , CD4 + , CD5 + y CD8 + .

Linfocitos B

Incrementar la producción del IP 3 y el DAG.

Incrementar el PKA y el PKC.

Incrementar la proliferación linfocitaria inducida por LPS.

Aumentar la secreción de inmonoglobulina.

Estimular la expresión del PKC.

Reducir la respuesta de mucosa de IgA específica en ratones adultos jóvenes inmunizados con la toxina del cólera por vía oral.

Extraído de : Lin Z-B. Cellular and molecular mechanisms of immuno-modulation by Ganoderma lucidum. J. Pharmacol. Sci. octubre de 2005;99(2):144-53.

Efectos sobre los Macrófagos

Los macrófagos hacen parte de la primera línea de defensa del organismo. Se ha visto como los extractos de polisacáridos acuosos del G. lucidum aumentan la fagocitosis in vivo e in vitro, además de la actividad de los macrófagos en un 340%, y un incremento significativo de la fagocitosis (62,63). Por lo tanto, la producción de IL-1 y el TNF-α, incrementan significativamente en los macrófagos expuestos a los polisacáridos del G. lucidum. Los beta-D-Glucanos principales compuestos de los polisacáridos inducen la expresión y síntesis de TNF-α (29).

Efecto en los Natural Killer (NK)

Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos granulares que se han establecido como efectores implicados en las respuestas inmunes. La citotoxicidad de las células NK permite el direccionamiento de las células tumorales e infectadas con un virus sin sensibilización previa (8).

Los NK hacen parte de la inmunidad innata en contraste con las células T citotóxicas que se activa previa sensibilización. Estos aumentan su actividad luego de la estimulación con interferón (IFN- gama). El fenotipo de las células NK puede especificar el tipo de respuesta ya sea citotóxica o citolítica y esto se define por la expresión de marcadores de superficie celular CD16 y CD56. El CD16 es un receptor de baja afinidad expresado en las células NK y otros tipos de células, que son importantes en la activación de las NK y la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (6,7). Los polisacáridos (fracción de glucoproteina F3) del G.lucidum aumentan la actividad de los NK en un 31,7% (64).

En un estudio reciente realizado por Chang et. Al (2014), se demostró el poder de los polisacáridos derivados del Ganoderma lucidum en el aumento de las citotoxicidad de las células NK al estimular

la secreción de perforinas y granulosinas; esta citotoxicidad aumentada es útil contra células tumorales, a través de activación de receptores de pared de las mismas células NK. Estos hallazgos dan evidencia de los efectos antitumorales del Ganoderma lucidum reportados en la literatura (65).

Los polisacáridos del G.lucidum regulan la excesiva función inmune por efecto de modulación de las citoquinas en modelos animales (inhiben la vasculitis, los efectos del shock sistémico y la anafilaxis cutánea) (27).

En la Figura 5, se aprecia un esquema de los efectos inmunomodulatorios de los polisacáridos del Ganoderma lucidum sobre las células inmunes: Estimula la proliferación y activación de las células B, promueve la relación de las células T y el TNF, aumenta la activación y maduración de las CD inmaduras, promueve la maduración y diferenciación de los macrófagos, y sensibiliza a las células NK mediada por citotoxicidad. Estos efectos son mediados por diferentes vías de señalización (24).

son mediados por diferentes vías de señalización (24). Figura 5. Efectos inmunomodulatorios de los

Figura 5. Efectos inmunomodulatorios de los lipopolisacaridos del Ganoderma lucidum (GLPS).

Extraido de: Xu Z, Chen X, Zhong Z, Chen L, Wang Y. Ganoderma lucidum polysaccharides:

immunomodulation and potential anti-tumor activities. Am. J. Chin. Med. 2011;39(1):15-27.

2.3.2 Efectos antivirales y antibacteriales

Un buen número de compuestos naturales extraídos de medicinas herbales se les ha reportado tener efectos antimicrobianos. Estas sustancias químicas antimicrobianas pertenecen a diferentes clases tales como: terpenos, esteroides, saponinas, flavones, xantonas, cumarinas y alcaloides

(32).

El G. lucidum ofrece un tratamiento potencialmente eficaz en la prevención y tratamiento de varias infecciones, existe también la evidencia de que la terapia de combinación en caso de infección establecida puede ser más segura y rentable, de forma que cantidades más bajas de fármacos antivirales y antibacterianos podrían ser utilizados con una disminución concomitante en el riesgo de efectos secundarios. Sin embargo, esto requiere de mayor investigación en términos de estudios in vitro y ensayos clínicos bien diseñados (66).

Los polisacáridos del G.lucidum ha mostrado efectos inhibitorios sobre el virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2), y virus de la estomatitis vesicular (VSV) en cultivo de tejidos. Además, hubo un marcado efecto sinérgico cuando los polisacáridos fueron utilizados en el cultivo de tejidos en combinación con agentes anti herpéticos, aciclovir o vidarabina (67).

Estudios in vitro e in vivo indican que G. lucidum exhibe un amplio espectro de actividades antibacterianas y antivirales. Varios polisacáridos, incluyendo a los betaglucanos, y tripertenoides del Ganoderma representan los principales constituyentes con actividad antimicrobial (68).

Los polisacáridos (betaglucanos) son los que juegan un rol más importante por su actividad antibacteriana, con un amplio espectro inhibiendo el crecimiento de E. coli, B. dysenteriae, Pseudomonasspp., neumococo, estreptococo (tipo A), estafilococo, y otros (33).

En un estudio de inhibición de 15 tipos de bacterias gram positivas y gram negativas en diferentes extendidos solos y en combinación con antibióticos, se encontró que los polisacáridos de G. lucidum eran más eficaz que los antibióticos contra E. coli, Micrococcusluteus, S. aureus, B. cereus, Proteusvulgaris , y Salmonella typhi (69).

En otro estudio in vivo en animales utilizando extracto de G. lucidum inyectado en ratones un día antes de la inyección con Escherichiacoli mostró mejoría notable en las tasas de supervivencia (mayores al 80% frente al 33% en los controles) (70); en un estudio in vitro que utilizó un extracto de polisacáridos de G. lucidum se investigó su efecto antibacteriano sobre bacterias gram positivas (Bacillussubtilis, Staphylococcusaureus, Enterococcusfaecalis ) y bacterias gram-negativas (E.coli, Pseudomonasaeruginosa). Los resultados mostraron que el extracto tenía efectos inhibidores del crecimiento en dos de las bacterias gram-positivas con una concentración inhibitoria mínima (MIC) de 8 mg / ml para S. aureus y B. subtilis (71).

Recientemente se ha demostrado también que estractos del Ganoderma lucidum poseen efectos inhibidores sobre bacterias gram-positivas y levaduras, con concentraciones inhibitorias muy bajas (6,25 mg/ml) sin embargo, no son efectivas contra bacterias gram-negativas. Se ha

asumido que el efecto antimicrobiano de los estractos de Ganoderma lucidum son derivados de la mezcla de esteroides y triterpenoides (72).

2.3.3 Estudios clínicos previos sobre el efecto de los Betaglucanos en humanos

Se han realizado algunos estudios independientes Fase I y Fase II, y otros tantos que combinan ambas fases en diferentes tipos de voluntarios humanos; tanto sanos como con condiciones de inmunocompromiso severos (7377). En el año 2006, Lehne y cols. evaluaron la seguridad y tolerancia de los beta 1-3 D-Glucanos en voluntarios sanos, demostrando un efecto positivo sobre la secreción de inmunoglobulina A en las glándulas salivales de estos sujetos, sin encontrarse alguna reacción adversa, aún a dosis incrementales del compuesto, concluyendo así que este es bien tolerado y benéfico en pacientes sin morbilidad (76).

Por otro lado, los betaglucanos han sido evaluados en pacientes con alto riesgo quirúrgico, como inmunomodulador para mejorar su recuperación postquirúrgica, tanto en estudios combinados de Fase I/Fase II (75), como en un estudio multicéntrico Fase II (77), donde los resultados demostraron bajas tasas de infección postoperatoria y menos tiempo en estancia de cuidados intensivos, que reduce a su vez el riesgo de morbilidad y mejora la relación costo- beneficio.

También se ha demostrado un efecto positivo en pacientes inmunocomprometidos. Gordon y cols. en 1998, demostraron un efecto positivo de los betaglucanos en pacientes VIH positivos en un ensayo Fase I/II controlado con placebo, donde se evidenció una tendencia hacia el aumento de las células CD4 y una buena tolerancia al suministro del compuesto (74). Por su parte, Weitberg (2008) mostró en un ensayo Fase I/II, como pacientes en estadio avanzado de leucemia linfocítica crónica y linfoma, recibiendo quimioterapia, presentaban beneficios sobre la hematopoyesis que se traducía en una mejor tolerancia a la quimioterapia en pacientes que recibían betaglucanos (73).

La mayoría de estudios reportados se han llevado a cabo en pacientes adultos con diferentes afecciones como son pacientes con tumores malignos en tratamiento con quimioterapia (73); pacientes VIH positivos entre los 18-60 años de edad (74), pacientes sometidos a cirugía torácica y abdominal con alto riesgo para infección (75,77), mujeres sanas entre los 26 y 50 años con moderado estado de estrés psicológico (78), entre otros.

También se han realizado algunos estudios de seguridad y tolerabilidad en voluntarios sanos (79); y otros estudios donde los betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum se han usado como coadyuvantes de otros tratamientos o en combinación con otros compuestos o ingredientes nutricionales para mejorar los resultados terapéuticos en pacientes con hiperlipidemia (80); con desordenes hematológicos (81); y pacientes con cáncer colorectal avanzado (82).

La mayoría de estudios realizados y mencionados han usado población adulta enferma, en diferentes diseños experimentales que comprenden estudios desde fase I hasta ensayos clínicos

controlados; pocos estudios se han realizado en población sana voluntaria. Sin embargo, como regla general, las conclusiones de todos los estudios mencionados es que los betaglucanos tienen efectos benéficos sobre los diferentes resultados que se buscaban en los diferentes estudios, ya fuera como disminución de riesgos de enfermar o complicar (74,75,77,80), o como adyuvante en quimioterapias u otro tipo de terapias para diferentes patologías (73,81). Su seguridad y tolerabilidad ha sido también confirmada en todos estos estudios, donde los pacientes o participantes son especialmente vulnerables debido a sus patologías de base.

En niños, se conocen estudios relevantes en los que los betaglucanos hacen parte de compuestos terapéuticos usados para tratar afecciones respiratorias en niños (83,84). En este primer estudio (Jesenak et al, 2013), se desarrollaron un ensayo clínico en un grupo de 175 niños con edad promedio de 5,65 años, con infecciones respiratorias recurrentes. Los niños fueron aleatorizados a dos grupos; un grupo al que se le suministró jarabe de Imunoglukan P4H® (con pleuran - Beta-D-glucanos de Pleurotus ostreatus y vitamina C), o un grupo de placebo con solo vitamina C. En estos niños se determinó la incidencia de infecciones respiratorias y se midieron parámetros inmunológicos para evaluar la efectividad del compuesto con betagluacanos. En este estudio se concluyó que el fármaco compuesto entre otros por betaglucanos, es efectivo en la prevención de infecciones respiratorias agudas en niños susceptibles, y a la vez posee una actividad inmunomoduladora en los mismos (83).

En el otro estudio, se evaluó la seguridad de un dispositivo a base de plata coloidal y bataglucanos para el tratamiento de rinitis viral en niños en comparación con solución salina. La muestra fue de 100 niños entre los 0-12 años aleatorizados a los dos grupos de estudio. El tratamiento demostró ser seguro y bien tolerado, y aunque tanto el dispositivo médico como la solución salina mejoraron los síntomas en los niños, el primero presento un mejor rendimiento y mejores resultados de manera estadísticamente significativa (84).

Diferente a los estudios reportados en adultos y especialmente en niños, el presente estudio clínico en fase II propone una población voluntaria de niños preescolares sanos; sin ninguna afección objeto de estudio. Como tal, de acuerdo a lo encontrado en la literatura, este sería el primer estudio realizado en una población voluntaria de niños sanos, donde se evaluará el efecto no terapéutico de un complemento nutricional con betaglucanos derivados del Ganoderma lucidum.

2.4 DOSIS ESTIMADA DIARIA DEL GANODERMA LUCIDUM Y BETAGLUCANOS

2.4.1 Dosis de Ganoderma lucidum

Según estudios realizados por Chang (1994), la máxima dosis efectiva del G. lucidum crudo macerado es de 35 gramos diarios, mientras investigadores como Liu y Bau recomiendan un rango de dosis entre 3 y 15 gramos. The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, ha recomendado en su monografía sobre el G. lucidum una dosis de 6 a 12 gramos día vía oral (52).

2.4.2 Dosis de Betaglucanos

En estudios usando receptores de betaglucanos en células blancas de humanos, se ha determinado que la dosis de 0,05 mg/kg de betaglucanos puede provocar actividad antimicrobiana in vitro. Basados en la concentración de betaglucanos mínima de 0,19% (que usa fracción soluble en agua de b-1,3-Glucano), equivale a una dosis efectiva de 300 mg vía oral (52). La dosis sugerida fluctúa entre 338,7 y 678,4 mg / persona / día (7,3 y 16,4 mg / kg de peso corporal / día), respectivamente, con un promedio de 150 mg de betaglucanos por porción en adultos. En niños mayores de 2 años 16,6 mg /kg de peso corporal / día vía oral. (Tabla 2).

Tabla 2. Toma de betaglucanos (mg/persona/día y mg/kg de peso corporal /día) basado en datos de USDA

 

Todos los

 

Todos los

 
 

consumos

Grupo de

Grupo de

%

Actual #

consumos de

 

de usuarios

población

edad

(años)

Usuarios

Usuarios

persona (mg)

(mg)

 

Percentil

 

Percentil

 

Media

90

ta

Media

90

ta

Infantes

0-2

71.6

2,526

224,1

c

521.6

287.3

568.4

 

(17.8)

d

(41.0)

(22.9)

(44.2)

Niños

3-11

98.4

6,205

389.8

712.6

397.7

713.9

 

(16.1)

(31.1)

(16.5)

(31.2)

Mujeres

361.8

726.6

adolescentes

12-19

91.5

642

330.9

702.6

(6.7)

(14.5)

 

(6.1)

(14.3)

 
 

476.4

972.9

Hombres

12-19

91.7

638

436.2

930.3

7.8

(16.3)

adolescentes

(72.)

(15.1)

 
 

278.2

551.9

Mujeres

20

y más

85

3,887

238.7

526.9

(4.3)

(8.9)

adultas

(3.7)

(8.4)

 
 

355.1

743.7

Hombres

20

y más

81,6

3,876

290.6

678.8

(4.4)

(9.5)

adultos

(2.6)

(8.6)

 
 

338.7

678.4

Total de la población

Todas las

86.4

17,812

292.7

644.7

(7.3)

(16.9)

edades

 

(6.3)

(15.4)

 

Extraído de: análisis del United States Department of Agriculture (USDA) 1994-1996, Continuing Survey of Food Intakes by Individuals (USDA CSFII 1994-1996).While infants are included in these estimates, mushroom p-Glucans is not intended for inclusion in infant formula or baby foods. cValues in mg/person/day. dValues in parenthesis represent intake as mg/kg bw/day.

Para este estudio se definió una dosis de 500 mg/día, lo que equivaldría a 350 mg netos de Betaglucanos (dada la caracterización del producto, pues se ha encontrado un 70% de betaglucanos en el producto final). Dado lo anterior y dentro de lo que se espera en la población estudiada (tanto por rango de edad, como por el peso), la dosis que se usará es coherente y segura, encontrándose dentro del consumo diario entre los percentiles 50 a 90, según referencia del GRAS (39).

La determinación de la seguridad de los betaglucanos del G.lucidum se basa en la totalidad de la evidencia disponible, incluyendo específicamente estudios de toxicidad animal, así como estudios en humanos e in vitro, que han corroborado su seguridad (39).

En la actualidad, la FDA recomienda el consumo de los betaglucanos, derivados del G.lucidum como ingrediente alimentario en productos de panadería, bebidas y bases de bebidas, cereales y productos de cereales, leche y productos lácteos, productos de proteínas vegetales, frutas y jugos de frutas, caramelos blandos y sopas (39).

2.5 CARACTERÍSTICAS DE LA MATRIZ (Betaglucanos de Ganoderma lucidum)

Los Betaglucanos de Ganoderma lucidum constituyen un ingrediente funcional orientado al desarrollo de alimentos, suplementos dietarios y premezclas que contribuyen a fortalecer el sistema inmunológico de los seres humanos.

Este ingrediente es obtenido biotecnológicamente, a partir de un cultivo sumergido del hongo Ganoderma lucidum; su aspecto final en polvo es de color beige claro y puede ser utilizado en diferentes áreas de la industria alimenticia, empresas de concentrados y empresas farmacológicas

o consumo directo.

Los ingredientes del producto utilizado en esta investigación son: β-D-Glucanos (70%), Maltodextrina (27%) y Polidextrosa (3%), como excipientes. Dado lo anterior, y considerando que el grupo intervenido recibirá un yogur con 350 mg de β-D-Glucanos por porción de producto (150

g de yogur), el aporte de Maltodextrina será de 135 mg y de Polidextrosa 15 mg por porción.

La Maltodextrina es un aditivo alimentario utilizado como agente de volumen y espesante, entre otras funciones tecnológicas; es un polímero de glucosa obtenido a partir del almidón por procesos enzimáticos y no le han sido atribuidos efectos prebióticos, ya que es metabolizada rápidamente, de hecho en diferentes estudios ha sido utilizada como placebo (8588).

La polidextrosa es un aditivo alimentario sintetizado a partir de dextrosa, sorbitol y ácido cítrico, es usada en productos bajos en calorías para reemplazar azúcar y grasas. Además, es considerada una fibra dietaria soluble prebiótica (aporte calórico de 1kcal/g), para lo cual debería ser adicionada a un producto alimenticio en una cantidad mínima de 2,5g por porción para poderla declarar, contribuyendo así al cubrimiento de requerimiento diario de fibra que son 25g (89,90).

Las cantidades de Maltodextrina y Polidextrosa que se adicionarán al yogur son mínimas, no alcanzan a representar un gramo del producto por porción, con lo cual sus efectos fisiológicos no estarían relacionados con algún efecto prebiótico ni con la inmunomodulación que se pretende estudiar en los β-D-Glucanos del Ganoderma lucidum.

2.6 METABOLISMO DE LOS BETAGLUCANOS

Los betaglucanos, al igual que los prebióticos, permanecen en gran medida sin digerir en el tracto gastrointestinal superior. Por lo tanto, la absorción por el epitelio intestinal y la exposición sistémica significativa a estas partículas de betaglucanos es poco probable. Al igual que otros polisacáridos no digeribles, los betaglucanos del G.lucidum son resistentes a la digestión en la parte superior del tracto gastrointestinal. Sin embargo, en el colon, son fragmentados por la microbiota residente resultando en la formación de H2, CO2 y ácidos grasos de cadena corta (AGCC) (91). Por lo tanto, el metabolismo de los betaglucanos no plantea problemas de seguridad y no hay toxicidad sistémica esperada después de su ingestión (39).

En un estudio en seres humanos Lehne et al, investigó la tolerabilidad y la absorción de una preparación de b-1,3 / b-1,6-D-Glucanos de levadura (92). En este estudio, ocho voluntarios sanos fueron aleatorizados para recibir 100, 200, o 400 mg de b-1,3 / b-1,6-D-Glucanos / persona por un período de 4 días consecutivos. Las concentraciones en plasma de betaglucanos se midieron en el día primero a la hora de tratamiento y en los días 2, 5 y 8. El límite de detección fue de 5 pg / ml. Las concentraciones plasmáticas de los betaglucanos no fueron diferentes entre los valores antes de comenzar el estudio y los valores registrados el día 5 y 8, lo que demuestra que no había absorción sistémica. No hubo cambios estadísticamente significativos en los grupos de tratamiento como en comparación con el valor basal. Los resultados de este estudio indican que no hay absorción sistémica de b-1,3-Glucano luego de seguimiento a corto plazo de la administración oral (92).

2.7 EFECTO DE LOS BETAGLUCANOS EN PELO Y PIEL

En las últimas décadas los betaglucanos se introdujeron en algunas aplicaciones cosméticas no clínicas, como una de las posibles soluciones para el mantenimiento de la salud de la piel, al ser un suplemento con compuestos biológicamente activos (93), además se ha observado un efecto benéfico sobre el envejecimiento y la prevención de la retención de humedad de los agentes cosméticos (94), por su capacidad de proporcionar aplicabilidad adecuada (93).

La cicatrización es un proceso complejo y bien organizado en el que están implicados factores fisiológicos y mecanismos inmunológicos, se han encontrado diferentes moduladores inmunes para mejorar el sistema de defensa no específica, donde resaltan los betaglucanos como uno de los más potentes y ampliamente investigados (95).

La aplicación tópica de betaglucanos es uno de los usos más comunes, por su capacidad para mejorar y prevenir las enfermedades o irritaciones de la piel debido a su acción de retención de la humedad; además como ya se dijo, se utiliza para prevenir el envejecimiento de la piel, debido a sus propiedades para prevenir y restaurar lesiones cutáneas. También se han descrito efectos de radio-protección, propiedades antioxidantes y capacidades de barrido de radicales libres (9698). Algunos autores describen las propiedades de los betaglucanos en la regeneración del cabello y el crecimiento mediante la activación de los folículos pilosos (99,100).

En un grupo de mujeres voluntarias se observó el efecto de la aplicación tópica de los betaglucanos en la piel con signos de envejecimiento (no herida), se observó que el producto actuó como revitalizante, para reducir el número, la profundidad y la duración de las arrugas, así como la reducción de la rugosidad y sequedad de la piel (101).

Debido a su capacidad de activar los macrófagos epidérmicos (células Langerhans) para realizar el efecto de barrido de radicales libres, los betaglucanos podrían ser aplicados como un agente fotoprotector en los antisolares, pues su aplicación se relacionó con la reducción del eritema inducido por los rayos UV y la conservación de la cantidad de células de Langerhans en la epidermis. Los filtros solares comerciales pueden evitar las quemaduras, pero no pueden garantizar la adecuada prevención de varios tipos de cáncer de piel, incluyendo el melanoma. Los rayos UV causan la pérdida de células de Langerhans incluso cuando la piel ya está bronceada, de ese modo, su función inmunológica se ve disminuida. Se sugiere una combinación de protector solar con betaglucanos porque podría ayudar en la preservación de los macrófagos epidérmicos (95). El efecto de los betaglucanos en protectores solares también fue mencionado por ciertos autores (94).

2.8 TOXICIDAD Y EFECTOS SECUNDARIOS DEL G.LUCIDUM Y SUS POLISACARIDOS

Los estudios toxicológicos de hongo G.lucidum en Human Medical College, Hunan, China informó de que la administración intragástrica de un extracto de Ganoderma en alcohol a 1,2 y 12 g / kg al día durante 30 días no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento y desarrollo de los animales; ni se encontraron anormalidades en la función del hígado, EKG, o los órganos observados. De manera similar, no se observaron reacciones tóxicas en perros con 12 g / kg al día de un extracto frio en alcohol durante 15 días y un extracto en alcohol caliente de 24 g / kg al día durante 13 días (40).

Con el proceso de producción recomendado y según evaluaciones de la FDA en diferentes lotes de betaglucanos buscando posibles contaminantes externos al hongo tales como metales pesados y microorganismos, generalmente asociados con dichos productos alimenticios, reveló que estos contaminantes no se detectaron dentro de los límites de detección del método utilizado, concluyendo que si existen contaminantes no detectables es improbable que causen efectos adversos (39).

Según el reporte de la FDA, un panel de expertos revisó las publicaciones de toxicología y estudios clínicos publicados y otra información relevante en relación con la seguridad del producto y la conclusión es que ni los betaglucanos ni ningún de sus productos de degradación plantea ningún riesgo toxicológico o preocupaciones de seguridad con su uso en los niveles recomendados (39).

La directrices de la OCDE y de la FDA muestran que los betaglucanos del hongo Ganoderma no producen efectos adversos en dosis de hasta 2000 mg / Kg de peso/ día, la dosis más alta probada. Se sugiere un nivel no observado de efectos adversos (NOAEL) de 2000 mg / kg de peso / día. La ingesta estimada es más de 120 veces menor que la NOAEL en estudios en animales. El consumo de beta-glucanos, si se ingiere diariamente durante toda la vida, está determinado como seguro

(39).

En un estudio toxicológico realizado en animales de experimentación con betaglucanos obtenidos biotecnológicamente por fermentación en estado líquido (empresa PROGAL BT) durante 14 días por parte del programa de escorpionismo y ofidismo de la Universidad de Antioquia en el año 2011, encontraron en el análisis de la toxicidad aguda (102):

Los betaglucanos no causan daño a la membrana de las células sin importar las dosis evaluadas; es decir el empleo de cualquiera de las dosis no impide la viabilidad celular, ni la integración de la misma y por esta razón se debe descartar eventual toxicidad a nivel celular.

Sin importar la dosis administrada de acuerdo al peso corporal de los ratones (5, 50, 300 y 2000 mg/kg), no se presentó muerte o signos evidentes de toxicidad en ninguno de los animales en estudio, reflejo de la inocuidad de los betaglucanos.

En el análisis de la toxicidad sub-crónica encontraron que aún con las dosis más altas ensayadas, no se evidencian efectos tóxicos importantes; por el contrario, pareciera existir algunos efectos protectores que deben ser evaluados en estudios encaminados a ese fin

(102).

En el estudio de toxicidad sub-crónica no se presentó alteración severa o muerte en los animales tratados con la sustancia bajo estudio durante 90 días, a dosis repetidas. En ningún momento del experimento se produjeron cambios o alteraciones a nivel de los sistemas nervioso (central o autónomo), respiratorio, gastrointestinal, tegumentario o genitourinario de los animales tratados con la sustancia a 5, 50 y 300 mg/kg (102).

En ningún momento se evidenció una disminución del peso corporal que hiciera pensar en algún cambio en la homeostasis normal de los animales; al contrario, hubo aumento paulatino del mismo, sin aparente efecto de dosis, pero con incrementos que llegan a ser entre 4,9 y 8,2 gramos, con respecto al grupo control (102).

No se observó ningún efecto adverso (NOAEL) con la administración oral de los betaglucanos en los animales de experimentación (102).

2.9 EFECTOS SECUNDARIOS DEL GANODERMA LUCIDUM

Los efectos secundarios o reacciones adversas secundarias al suministro de betaglucanos derivados del Ganoderma Lucidum son muy raros o inexistentes, y se han vinculado a la presencia de morbilidades importantes o al suministro con fármacos o compuestos que son los responsables de los efectos reportados (33, 66, 90).

Aunque en niños son pocos los estudios de betaglucanos publicados, estos no reportan efectos secundarios o reacciones adversas secundarias al suministro de los mismos en este grupo etario (113, 114).

En pacientes con dispepsia se recomienda el consumo postprandial del G.lucidum (33), ya que se han reportado leves molestias digestivas generalmente de corta duración (40).

En pacientes diabéticos puede disminuir la glucosa que suele normalizarse en unas semanas, por

lo cual cuando se formula en diabéticos se debe controlar la glicemia con el fin de ajustar la dosis

de insulina o hipoglicemiantes orales (33).

No se informaron efectos secundarios debidos al consumo de betaglucanos en la literatura

científica disponible, los síntomas reportados han sido por el hongo macerado consumido en polvo

o por fórmulas magistrales que contienen otros compuestos herbales además del G. lucidum descritos en algunos reportes de casos (40).

Aunque al G. lucidum se le atribuyen funciones hepatoprotectoras, en 2004, Yuen y colaboradores reportaron un caso de toxicidad hepática debida al consumo de G. lucidum en polvo en una mujer china de 78 años de edad, la cual se comportó como una colangitis aguda mediada por una reacción inmunoalérgica. La enfermedad se mejoró luego de suspender el consumo. Los autores informaron la posible toxicidad debido al uso de varias plantas en la preparaciones herbales chinas

(103).

En 2006, Wanachiwanawin y colaboradores reportaron en Tailandia un hombre de 49 años que consumía polvo de G. lucidum en medicina herbal y que desarrollo un cuadro de pseudoparasitosis. Los síntomas fueron causadas por las esporas del hongo que se encontraron en materia fecal (32).

En un ensayo controlado en sujetos sanos a los que se administró extracto de G. lucidum a razón de 2 gramos dos veces por día durante 10 días, se observó que los extractos fueron bien tolerados, sin efectos colaterales subjetivos u objetivos (104).

Un Estudio Fase I/II de un extracto de G. lucidum en pacientes con cáncer avanzado en los 85 pacientes estudiados, que consumieron 1800mg cada 8 horas diario por 12 semanas, se registraron en tres pacientes síntomas gastrointestinales (náusea, 2; diarrea, 1) (105).

En otro estudio, 34 pacientes con estadio avanzado de cáncer de varios tejidos consumieron 1800 mg oralmente de Ganoderma tres veces por día antes de las comidas durante 12 semanas. Se

midieron los parámetros inmunológicos (citoquinas IL-1, IL-2,IL-6), interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF- ), subconjuntos de células T (CD3,CD4,CD8,CD56) y la actividad de células natural killer entre la línea basal y luego de 12 semanas de tratamiento no reportando efectos adversos (106).

En 7 ensayos clínicos muchos de estos multi céntricos, doble ciego con G.lucidum en diferentes enfermedades incluyendo cáncer, diabetes tipo II, enfermedad coronaria, hepatitis crónica B, y neurastenia reportaron que el G .lucidum fue bien tolerado (107).

Se necesitan muchos más estudios clínicos bien diseñados (aleatorizados, controlados con placebo, doble ciegos y con un tamaño de muestra adecuado) con el fin de establecer el modo de acción, la eficacia y la seguridad del G. lucidum en humanos, en especial en niños donde son pocos los estudios (32).

2.10 CONTRAINDICACIONES

No hay contraindicaciones citadas en la literatura, sin embargo, inmunomoduladores tales como sustancias del G.lucidum se deben utilizar con mucho cuidado o evitarse completamente en pacientes de trasplante de órganos que utilizan agentes inmunosupresor o en pacientes con enfermedades autoinmunes (40).

Interacciones del Ganoderma

Se ha demostrado que el Ganoderma potencia la acción sedante de la reserpina y la clorpromazina

y antagoniza la actividad estimulante central de las anfetaminas. También se ha informado que potencia el sueño inducido por fenobarbital en ensayos clínicos en humanos (40).

Debido a los reportes como inhibidor en la agregación plaquetaria su administración en pacientes que usan anticoagulantes debe ser supervisada por médico (40).

El G.lucidum debido a su acción inhibitoria sobre la HMG-CoA reductasa, puede potenciar los efectos de lovastatina y de medicamentos reductores del colesterol que actúe de manera similar

(40).

Interacciones de los esteroides y la inmunidad

Se ha observado como los esteroides / corticoides tipo prednisolona, producen efectos celulares de los corticoides, en la medida que incrementan el número de neutrófilos circulantes, pero lo reducen en el foco inflamatorio al disminuir las moléculas de adhesión (ICAM1 y ELAM1), los

factores quimiotácticos y las citoquinas. También interfieren en la activación de los neutrófilos, posiblemente al disminuir la producción de IL-8. Reducen el número de eosinófilos, la quimiotaxis

y la degranulación. Disminuyen el número de monocitos-macrófagos, la quimiotaxis, la expresión

de moléculas HLA de clase II y la producción de IL-1. También disminuyen el número de linfocitos circulantes mediante su redistribución en bazo, ganglios linfáticos y conducto torácico y mediante

la activación de endonucleasas que rompen la cromatina y el DNA y conducen a la muerte celular

programada o apoptósis de timocitos y linfocitos B inmaduros. Reducen la respuesta de linfocitos T a antígenos celulares y solubles y la producción de IL-2. Por su parte, no se ha encontrado evidencia de que se pueda alterar la secreción de inmunoglobulinas por los linfocitos B (108).

2.11 INFECCIONES EN LA INFANCIA

En el mundo, para el año 2008 según la OMS/UNICEF, se estima que ocurrieron 8.795 millones de muertes en niños menores de 5 años, de estas el 68% (5.970 millones) fueron causadas por enfermedades infecciosas, 18% de las cuales fueron por neumonía y 15% por diarrea. En el mismo año para el continente Americano, se estimaron 284 mil muertes , de estas, un 12% tuvo como causa de muerte la neumonía y un 7% la enfermedad diarreica aguda (9).

2.11.1. Enfermedad Diarreica Aguda (EDA)

Cada día la diarrea causa cerca de 1,3 millones de muertes en niños menores de 5 años (9), siendo una de las enfermedades más prevalentes en la infancia, presentándose seis cuadros por año en países subdesarrollados y en países desarrollados entre 0,8 y 1 cuadro por año, en menores de 5 años (109). La pérdida de líquidos y la deshidratación es la mayor causa de muerte en los pacientes con diarrea (109).

En el Departamento de Antioquia, según datos de La Dirección Seccional de Salud, la segunda causa de morbilidad en consulta externa y urgencias en niños menores de 5 años durante el año 2010 fue la diarrea aguda con 50.652 casos. En forma similar, en el Área Metropolitana del Valle de Aburrá para el año 2010, la segunda causa de consulta externa y por urgencias en niños menores de 5 años la ocupó la diarrea aguda (110).

La Enfermedad Diarreica Aguda es una enfermedad de comienzo rápido, caracterizada por el incremento en el número de evacuaciones al día y alteración en la consistencia de las heces fecales que pueden acompañarse de otros síntomas como náuseas, vómitos, dolor abdominal y fiebre.

El número de deposiciones varía según la dieta y la edad, pero en general se define la diarrea como tres o más deposiciones líquidas o blandas por día. Si un niño ha tenido más de diez deposiciones en veinticuatro horas o más de cuatro en cuatro horas, se considera que tiene diarrea de alto gasto (111).

En países de ingreso medio y bajo, la trasmisión de patógenos se da principalmente a través de comidas y aguas contaminadas. Las bacterias y los virus son los mayores responsables de esta enfermedad (112). Las infecciones virales (rotavirus 15-50%) son causantes del 70 80% de los episodios de diarrea. Las bacterias (Shigella 10-15% de diarrea agudas en menores de 5 años, Salmonella no typhi, campilobacterjejuni, E. coli) y los parásitos (E. Histolytica, GiardiaLamblia, Crytosporidium). En el 20-40% de los casos no es posible conocer la causa de la diarrea por exámenes de laboratorio (111).

Las citoquinas juegan papeles importantes en la patogénesis y la protección contra infecciones virales agudas y pudiendo influir en la respuesta clínica de infecciones como la enfermedad diarreica aguda (5). En el caso de la infección por rotavirus se induce la respuesta inmune innata y adaptativa, incluyendo la producción de citoquinas y anticuerpos específicos contra el virus (5).

Los antibióticos solo están indicados en la diarrea disentérica y por cólera, y los anti diarreicos deben ser formulados con precaución y nunca en menores de cinco años. Su empleo, lejos de ayudar, entorpece, en algunos casos, el curso normal de un cuadro diarreico, además de causar innecesarias reacciones adversas e incremento en las tasas de resistencia microbiana a los antibióticos (113).

Hasta hace poco tiempo el único tratamiento recomendado por OMS y UNICEF para la diarrea aguda no disentérica era la terapia de rehidratación oral, además de continuar con la alimentación habitual. Estos enfoques terapéuticos han reducido sustancialmente la mortalidad por diarreas en los últimos 20 años, sin embargo, el uso de las soluciones de rehidratación oral no ha disminuido la incidencia de la diarrea (114).

Nuevas intervenciones para el tratamiento de la diarrea (soluciones de rehidratación oral de baja osmolaridad gasto (111), el uso terapéutico del zinc y vacunas contra el rotavirus para la prevención de la diarrea, han proporcionado una oportunidad para el control de la enfermedad diarreica aguda en todo el mundo (115).

2.11.2 Infección Respiratoria Aguda (IRA)

Las infecciones de las vías respiratorias a través de Tejido Linfoide Relacionado con Mucosas sistema MALT por sus siglas en inglés, desempeña un papel positivo en la maduración y el desarrollo del sistema inmune (3).

Muchos trastornos inmunológicos pueden ocurrir durante las infecciones respiratorias (116); y pueden afectar la inmunidad humoral y celular específica, que son la principal causa de la inflamación en el tracto respiratorio superior (3,4,6,117,118) .

En los niños el resfriado suele ser más sintomático que en adultos y presentar más complicaciones (otitis, amigdalitis, neumonías, exacerbaciones de alergias respiratorias). Las estadísticas indican que más del 80% de los resfriados comunes que exigen atención médica afectan a los niños (119). A pesar de ser un proceso benigno, de curso auto-limitado, y sin tratamiento etiológico disponible, genera un consumo elevado de recursos en salud, tanto en consultas como en métodos diagnósticos y tratamientos farmacológicos, generalmente de escasa utilidad y en ocasiones con importantes efectos adversos (111).

Las enfermedades respiratorias agudas en los niños constituyen un problema de gran relevancia epidemiológica; son una causa muy importante de enfermedad y consulta a los servicios de salud y son una de las primeras causas de muerte de menores de cinco años (111) . En niños preescolares

el número de resfriados por niño puede ser mayor de doce episodios al año (121). La infección aguda del tracto respiratorio superior es el segundo diagnóstico más común en los consultorios médicos (122) y el primer diagnóstico en los departamentos de emergencia (123). Se estima que 22 millones a 189 millones de días de asistencia a la escuela se pierden anualmente debido al resfriado común (2,124).

Para Antioquia, según datos de La Dirección Seccional de Salud, la primera causa de morbilidad en consulta externa y urgencias en niños menores de 5 años en el año 2010 fue el resfriado común (78.889 casos), y en sexto lugar la infección aguda de las vías respiratorias superiores (18.878 casos). En forma similar, en el Área Metropolitana del Valle de Aburra para el año 2010, la primera causa de consulta externa y por urgencias en niños menores de 5 años la ocupó el resfriado común (110).

La transmisión de la infección respiratoria depende del agente causal, las producidas por virus son altamente contagiosas por transmisión aérea, las bacterianas atípicas son también muy contagiosas, su contagio depende mucho de factores del huésped (111). Se han descrito más de 200 tipos diferentes de virus que pueden causar el resfriado común. El rhinovirus es causante de cerca del 35% de los resfriados generalmente con desenlace benigno. Otros virus como los adenovirus, virus de la influenza A y B, varios virus parainfluenza, virus sincitial respiratorio, tienen la potencialidad de ocasionar una infección severa del tracto respiratorio inferior en niños pequeños (116).

Respecto a la neumonía, entre los 4 meses y 5 años de edad es causada principalmente por infecciones virales (virus sincitial respiratorio, parainfluenza, influenza A y B, adenovirus y rhinovirus). La etiología bacteriana, usualmente precedida por una infección viral, aumenta con la edad, 25% en menores de 6 meses y 40% en niños entre 6 meses y 5 años. Entre las bacterias se encuentran el S.pneumoniae, H.influenzae no tipables, H. influenzae tipo b y el M. pneumoniae

(111).

Respecto al tratamiento del resfriado común, más de una tercera parte de los pacientes que consultan al médico reciben prescripción con antibióticos para su manejo, con las implicaciones en la resistencia antibiótica por el sobre uso sin indicación de estos medicamentos (125). No existe evidencia clara de ningún tratamiento ni método preventivo para el resfriado común por lo cual cualquier intervención que sea efectiva en el tratamiento y prevención de las infección respiratoria puede reducir la morbilidad y costos económicos debidos a esta enfermedad (126).

Según la OMS/UNICEF, estrategias como la vacunación (sarampión, tosferina, hemófilus influenzae tipo b), lactancia materna exclusiva y el suministro de complementos con micronutrientes pueden ayudar a disminuir la incidencia y gravedad de las infecciones respiratorias en la niñez al mejorar la respuesta inmunológica ante estas infecciones (127).

Pocos son los estudios que se encuentran sobre los efectos de los betaglucanos como tratamiento u opción preventiva para la infección respiratoria aguda en niños; sin embargo, un primer estudio

reportado por Damiani y cols. (2011), mostró como betaglucanos en combinación con plata coloidal, presentaban mejores resultados para el tratamiento del resfriado común con obstrucción nasal en niños, cuando se comparaba con tratamiento con solución salina, sin que se presentaran diferencias en cuanto a los efectos secundarios (84).

En un estudio más reciente, Jesenak y cols. (2013) demostraron como el tratamiento con betaglucanos, controlado con placebo, modula positivamente la inmunidad humoral y celular en niños, teniendo como consecuencia efectos preventivos sobre la morbilidad causada por infecciones respiratorias recurrentes (83).

3. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN

: Al finalizar la intervención los marcadores CD3 y CD16 (NK) y los niveles del perfil hematológico, serán estadísticamente diferentes en el grupo intervenido con betaglucanos derivados del G. lucidum, comparado con el que consumió yogur sin fortificación.

: Tanto la incidencia de infección respiratoria aguda, como la incidencia de enfermedad diarreica aguda, serán significativamente diferentes (50% o más) al comparar el grupo que ingiere betaglucanos derivados de G. lucidum, con respecto al grupo placebo.

: La tasa de reacciones adversas asociadas a la ingesta del alimento fortificado con betaglucanos derivados del G. lucidum y la proporción de niños que rechazan el alimento al menos en una oportunidad, no diferirán significativamente al comparar los dos grupos.

4.1 Objetivo primario

4.

OBJETIVOS

Evaluar el efecto de los betaglucanos obtenidos biotecnológicamente por fermentación líquida a partir del Ganoderma lucidum como compuesto fortificante de un alimento funcional en la modulación inmunológica y en la incidencia de enfermedades comunes en niños de 3 a 5 años, comparado con placebo. Medellín, 2015.

4.2 Objetivos secundarios

Caracterizar social y demográficamente los niños preescolares entre 3 y 5 años matriculados en los centros de la Fundación de Atención a la Niñez seleccionados para el estudio, según el grupo de intervención.

Describir el estado nutricional de los niños preescolares entre 3 y 5 años antes y después de la intervención.

Evaluar los marcadores inmunológicos y el perfil hematológico, antes y después de la intervención por doce semanas, comparando las diferencias intra e inter grupos de evaluación (intervención y placebo).

Determinar la incidencia de enfermedad diarreica aguda y la incidencia de enfermedad respiratoria aguda, durante doce semanas de seguimiento, comparando las diferencias entre el grupo de intervención y el grupo placebo.

Determinar la incidencia de reacciones adversas a la ingesta del alimento y la aceptación del mismo, en el grupo de intervención comparadas con el grupo placebo durante las doce semanas de seguimiento.

4.3 Objetivo exploratorio

Describir el estado general de la piel y pelo, antes y después de doce semanas de intervención, en los dos grupos de estudio.

5.

METODOLOGÍA

5.1 Enfoque metodológico de la investigación

La investigación está enmarcada en el enfoque metodológico cuantitativo, debido a que se quiere evaluar la eficacia del betaglucanos obtenidos biotecnológicamente por fermentación líquida a partir del G. lucidum, estableciendo diferencias numéricas entre los valores de los marcadores inmunológicos CD3 en linfocitos y CD16 en células Natural Killer (NK), y entre las incidencias de enfermedades comunes en preescolares. En este caso resulta necesaria la utilización de técnicas estadísticas propias del enfoque empírico - analítico.

5.2 Tipo de estudio

Se llevará a cabo un estudio experimental, tipo ensayo clínico con asignación aleatoria a grupos, triple ciego, con intervención durante tres meses a niños preescolares, inscritos en cuatro de los centros infantiles de la Fundación de Atención a la Niñez (FAN) de Medellín.

La asignación del yogur con betaglucanos y del yogur placebo se realizará de manera aleatoria a los diferentes centros infantiles, utilizando bloques aleatorizados de longitud variable. Por su parte, estarán cegados los sujetos de estudio (niños preescolares y sus padres o representantes legales), los investigadores y profesoras recolectoras de la información diaria, y los investigadores encargados de realizar el análisis de los resultados. También se realizará enmascaramiento del producto, de manera que tanto el yogur con betaglucanos, como el yogur placebo, tendrán la misma apariencia en su empaque, consistencia, color y sabor, con el fin de preservar el cegamiento hasta finalizar el análisis estadístico de los datos. Los códigos de aleatorización serán mantenidos por parte de un monitor-auditor independiente contratado por la empresa patrocinadora para este fin y para el monitoreo del proyecto.

Se justifica la intervención durante tres meses debido a que es un tiempo adecuado para observar el comportamiento de las variables epidemiológicas consideradas, las incidencias de enfermedad diarreica aguda y de enfermedad respiratoria aguda, además se podrán observar los cambios, si existen, de las variables inmunológicas incluidas en el estudio que se han reportado tan temprano como en ocho (8) días (49).

5.3 Grupos de estudio

Se realizará seguimiento a dos grupos de intervención, uno de intervención y otro placebo:

Intervención: niños preescolares inscritos en dos centros infantiles de la Fundación de Atención a la Niñez (FAN) de Medellín quienes recibirán yogur enriquecido con betaglucanos.

Placebo: niños preescolares inscritos en dos centros infantiles de la Fundación de Atención a la Niñez (FAN) de Medellín quienes recibirán yogur pero sin betaglucanos.

5.4 Intervención

La intervención (Betaglucanos o Placebo) se asignará de forma aleatoria a los cuatro (4) centros infantiles seleccionados para el estudio y donde se encuentran matriculados los niños sujetos de investigación, de manera que dos centros reciban la yogur fortificada y dos centros el yougur sin fortificación.

En la semana de la matrícula de los menores en cada centro, se recogerán los consentimientos informados por parte de los padres o representantes legales y se harán las actividades de asentimiento para los menores en cada uno de los centros. Durante esta etapa inicial, también se recolectará la información social, demográfica y nutricional de base de cada uno de los menores incluidos en el estudio, a través de un instrumento diseñado por los investigadores para este fin (Anexo 1).

Posteriormente, una vez se cuente con ambas autorizaciones, se procederá a la toma de muestras sanguíneas por parte de auxiliares del laboratorio clínico del Hospital Pablo Tobón Uribe, que serán transportadas conservando las condiciones óptimas para la realización de las pruebas en la sede del laboratorio. Cada extracción de muestra sanguínea será reportada en un formato preestablecido (Anexo 2). Se estima que esta etapa del estudio tomará una semana por cada centro.

Al inicio de la semana posterior a la toma de las muestras sanguíneas, se comenzará el suministro de 350 mg/día de betaglucanos en el yogur de cada niño del grupo intervenido y del yogur sin betaglucanos en el grupo placebo. El alimento funcional se dará a los preescolares de lunes a viernes en los centros infantiles por parte del personal de la institución, quienes estarán pendientes de la ingesta de la totalidad del alimento; consignando esta información diariamente para documentar la adherencia al alimento durante doce semanas. Se contara con la asistencia de un médico general quien diariamente reportará las reacciones adversas, además de las incidencias de EDA e IRA que presenten los preescolares en el formato previamente diseñado para este fin (Anexo 3). En el anexo 1 se consignaran también los resultados de laboratorio a medida que se vayan reportando, al igual que los retiros o pérdidas.

Para garantizar el suministro adecuado de nutrientes diarios a los niños contemplados en la minuta de la fundación, se realizara la modificación mínima de la misma para acomodar el complemento a estos requerimientos. Esto se hará con la autorización, asesoría y acompañamiento de las directivas y nutricionistas de la fundación. No se reemplazara la administración de ningún alimento requerido ni se interrumpirá el acceso a programas de alimentación brindado por otras entidades.

5.5

Población de estudio

Para la evaluación de la eficacia de los betaglucanos como ingrediente en alimentos, la población de estudio estará conformada por todos los niños entre 3 y 5 años, inscritos en los cuatro de los centros infantiles de FAN en Medellín seleccionados, durante 2015. El diagrama de flujo del ensayo clínico se presenta en la Figura 6.

de flujo del ensayo clínico se presenta en la Figura 6. Figura 6. Diagrama de flujo

Figura 6. Diagrama de flujo del ensayo clínico: Betaglucanos como compuesto fortificante de una yogur para preescolares. Medellín, 2015

5.6 Muestra

Se utilizará una muestra por conveniencia, tanto por su tamaño como por su selección, incluyendo todos los niños que cumplan con los criterios de inclusión y de quien se tenga consentimiento

informado firmado por escrito por su acudiente o representante legal, en los cuatro centros seleccionados.

Para garantizar el poder del estudio, se calcula una muestra utilizando la fórmula mediante la cual se obtiene el tamaño requerido para la realización de la mayoría de los estudios experimentales, en los que se pretende probar la hipótesis de la existencia de una diferencia entre dos proporciones; a partir del estudio de Sánchez y cols. (2013) se tomó una proporción anticipada para el grupo placebo del 21% (incidencia acumulada de Infección Respiratoria Aguda en niños de la Fundación de Atención a la Niñez entre 3 y 5 años que tomaron placebo) (128); se considera que el estudio se justifica si la ingesta de yogur con betaglucanos disminuye la incidencia de IRA en un 50% o más, es decir, si la incidencia de IRA en el grupo que recibe el compuesto es de 10,5% o menos, además se acepta el riesgo de equivocar las conclusiones según un error tipo I del 5% y de tipo II del 20%. De esta manera se obtiene la siguiente expresión:

 

[

√[

]]

[

√[

]]

Donde:

n es el tamaño de cada grupo

son los valores de la variable normal estándar correspondiente a las probabilidades de errores tipo I y II, aceptadas en la investigación, 5% y 20% respectivamente.

es la proporción anticipada en el grupo control.

es la proporción anticipada en el grupo tratado

De acuerdo al cálculo muestral, se requeriría un total de 238 menores para el estudio. Teniendo en cuenta un 10% de posibles pérdidas en el seguimiento, la muestra total necesaria seria de 261 niños (130 niños en cada brazo o grupo de estudio). A octubre de 2014 se encontraban matriculados en total 286 niños y niñas elegibles por edad en los cuatro centros infantiles seleccionados (Tabla 3), indicando que probablemente con la muestra seleccionada por conveniencia a partir de estos cuatro centros se alcance un poder del 80%, o más, para el estudio.

Tabla 3. Número de menores matriculados en los centros de la Fundación de Atención a la niñez -FAN- entre 3 y 5 años. Octubre, 2014.

Número de menores matriculados

Sede

Dirección

Barrio

 

Cra 50 64 - 09

Prado

92

Cra 44 42 21

Niquitao

60

Cra 39 50 68

Boston

73

Cra 28 107 - 366

Santo Domingo

61

Albergue Infantil Antioqueño Centro de Atención a la Niñez y la Familia Centro Educativo Padre Bernardo Vélez IE Antonio Derka Corp. Mi Alegre Porvenir

5.7 Criterios de Inclusión

Se incluirán en el estudio quienes:

Pertenezcan a alguno de los cuatro centros infantiles de la Fundación de Atención a la Niñez (FAN) de Medellín: Albergue Infantil Antioqueño, Corporación Mi Alegre Porvenir, Centro de Atención a la Niñez y la Familia y Centro Educativo Padre Bernardo Hoyos.

Asistan al centro infantil de tiempo completo (ocho horas diarias).

Tengan tres años cumplidos o más, al momento de la intervención.

5.8

Criterios de Exclusión

Se excluirán los niños que:

Sus padres o representantes legales se nieguen a firmar el consentimiento informado por escrito.

No estén afiliados al Sistema General de Seguridad Social en Salud (SGSSS), en cualquiera de sus regímenes.

Estén tomando esteroides / corticoides como tratamiento médico al momento de comenzar la intervención.

5.9

Operacionalización de las variables

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

Edad

Edad en años cumplidos

Cuantitativa de razón continua

Edad en años cumplidos

1

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

Grupo de estudio

Grupo de estudio al que pertenece el preescolar

Cualitativa nominal

1. Betaglucano

1

dicotómica

2. Placebo

 

1. Albergue Infantil Antioqueño

 

Nombre del centro infantil donde se encuentra matriculado el niño

 

2. Corporación mi alegre porvenir

Cualitativa nominal

3. Centro de Atención a la Niñez y la Familia

 

Institución

politómica

1

4. Centro Educativo Padre Bernardo Hoyos

 

Cualitativa nominal

1. Hombre

Sexo

Sexo biológico

dicotómica

2. Mujer

1

Lactancia exclusiva

Duración en meses de la lactancia materna exclusiva

Cuantitativa de razón continua

Meses de lactancia materna

1

 

1. Bajo bajo

Estrato

Estrato socioeconómico de la vivienda según clasificación de EPM

 

2. Bajo

socioeconómico de

Cualitativa ordinal

3. Medio bajo

1

la vivienda

politómica

4. Medio

 

5. Medio Alto

6. Alto

 

1. Nuclear

2. Extensa o conjunta

 

Clasificación de la familia según miembros

Cualitativa nominal

3. Monoparental

Tipo de familia

4. Ampliada

1

politómica

5. Simultánea

 

6. Grupo de hermanos

7. Otro, ¿cuál?

Número de miembros de la familia

Número de personas que conforman la familia

Cuantitativa de razón discreta

Número de personas

1

Número de hijos en el hogar

Número de hermanos más el niño entre 2 y 5 años

Cuantitativa de razón discreta

Número de personas

1

 

1. Casa

Tipo de vivienda

Tipo de vivienda donde reside la familia

Cualitativa nominal

2. Apartamento

1

politómica

3. Cuarto

 

4. Otro

Tenencia de la vivienda

Tipo de tenencia de la vivienda

Cualitativa nominal

1. Propia

2. Arrendada

1

politómica

3. Prestada

Madre cabeza de familia

 

Cualitativa nominal

1. Si

Madre cabeza de familia

dicotómica

2. No

1

 

1. Menos de 1 SMMLV

Ingresos familiares en el último mes

Ingresos totales a nivel familiar en el último mes

Cualitativa ordinal

2. Entre 1 y 2 SMMLV

3. Más de 2 y hasta de 5 SMMLV

1

politómica

4. Más de 5 y hasta 10 SMMLV

 

5. Más de 10 SMMLV

Edad de la madre

Edad en años cumplidos de la madre

Cuantitativa de razón continua

Edad en años cumplidos

1

Edad del padre

Edad en años cumplidos

Cuantitativa de razón

Edad en años cumplidos

1

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

 

del padre

continua

 

1.

Ninguno

2.

Primaria

Escolaridad de la madre

 

Cualitativa ordinal

3.

Secundaria

Escolaridad de la madre

politómica

4.

Técnica

1

 

5.

Profesional

9.

Sin dato

 

1.

Ninguno

2.

Primaria

Escolaridad del

Cualitativa ordinal

3.

Secundaria

padre

Escolaridad del padre

politómica

4.

Técnica

1

 

5.

Profesional

9.

Sin dato

 

1.

Soltera

2.

Casada

Estado civil de la madre

 

Cualitativa ordinal

3.

Unión libre

Estado civil de la madre

politómica

4.

Separada

1

 

5.

Viuda

9.

Sin dato

 

1.

Soltero

2.

Casado

Estado civil del padre

 

Cualitativa ordinal

3.

Unión libre

Estado civil del padre

politómica

4.

Separado

1

 

5.

Viudo

9.

Sin dato

 

El menor se encuentra afiliado al Sistema General de Seguridad Social en Salud

Cualitativa nominal

1.

Si

Afiliación al SGSSS

dicotómica

2.

No

1

Régimen de afiliación al SGSSS

Régimen de afiliación al Sistema General de Seguridad Social en Salud

Cualitativa nominal

1.

Contributivo

dicotómica

2.

Subsidiado

1

 

La familia sufrió procesos de desplazamiento forzoso

Cualitativa nominal

1.

Si

Desplazado

dicotómica

2.

No

1

Alergias

Antecedentes de diagnóstico de asma y rinitis

Cualitativa nominal

1.

Si

1

ambientales

dicotómica

2.

No

Suplementos

Utilización de suplementos dietarios

Cualitativa nominal

1.

Si

1

dietarios

dicotómica

2.

No

Peso antes

Peso en kilogramos antes (semana 0) de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Peso en kilogramos

2

Peso después

Peso en kilogramos después (semana 12) de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Peso en kilogramos

2

Talla antes

Cuantitativa de razón continua

Talla en centímetros

2

Talla en centímetros antes (semana 0) de la intervención

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

Talla después

Talla en centímetros después (semana 12) de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Talla en centímetros

2

Peso para la talla antes

Indicador de crecimiento que relaciona el peso con la talla

Cuantitativa de razón continua

Relación peso / talla

2

Peso para la talla después

Indicador de crecimiento que relaciona el peso con la talla

Cuantitativa de razón continua

Relación peso / talla

2

 

1. Peso muy bajo para la talla

2. Peso bajo para la talla

Clasificación

Clasificación peso para la talla

Cualitativa ordinal

3. Riesgo de bajo peso para la talla

peso/talla antes

politómica

4. Peso adecuado para la talla

2

5. Sobrepeso

 

6. Obesidad

 

1. Peso muy bajo para la talla

2. Peso bajo para la talla

Clasificación

Clasificación peso para la talla

Cualitativa ordinal

3. Riesgo de bajo peso para la talla

peso/talla después

politómica

4. Peso adecuado para la talla

2

5. Sobrepeso

 

6. Obesidad

IMC/E antes

Indicador de crecimiento que relaciona el IMC con la edad

Cuantitativa de razón continua

IMC para la edad

2

IMC/E después

Indicador de crecimiento que relaciona el IMC con la edad

Cuantitativa de razón continua

IMC para la edad

2

Clasificación IMC/E

Clasificación nutricional según el IMC

Cualitativa ordinal

1. Sobrepeso

antes

dicotómica

2. Obesidad

2

Clasificación IMC/E

Clasificación nutricional según el IMC

Cualitativa ordinal

1. Sobrepeso

después

dicotómica

2. Obesidad

2

Estado nutricional

Estado nutricional según la edad

Cualitativa nominal

1. Adecuado

antes

dicotómica

2. Inadecuado

2

Estado nutricional

Estado nutricional según la edad

Cualitativa nominal

1. Adecuado

después

dicotómica

2. Inadecuado

2

CD3 1

Resultado CD3 antes de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Resultado CD3

3

CD3 2

Resultado CD3 después de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Resultado CD3

3

CD16 1

Resultado CD16 antes de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Resultado CD16

3

CD16 2

Resultado CD16 después de la intervención

Cuantitativa de razón continua

Resultado CD16

3

Basófilos 1

Valor basófilos antes de

Cuantitativa de razón

Porcentaje

3

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

 

la intervención, en porcentaje

continua

Basófilos 2

Valor basófilos después de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Eosinófilos 1

Valor eosinófilos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Eosinófilos 2

Valor eosinófilos después de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Linfocitos 1

Valor linfocitos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Linfocitos 2

Valor linfocitos después de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Neutrófilos 1

Valor neutrófilos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Neutrófilos 2

Valor neutrófilos después de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Leucocitos 1

Valor de leucocitos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón discreta

Número de células blancas por µl

3

Leucocitos 2

Valor de leucocitos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón discreta

Número de células blancas por µl

3

Eritrocitos 1

Valor de leucocitos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón discreta

Numero de hematíes por ml

3

Eritrocitos 2

Valor de leucocitos antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón discreta

Numero de hematíes por ml

3

Hemoglobina 1

Valor de la hemoglobina antes de la intervención, en g/dl

Cuantitativa de razón continua

Valor en g/dl

3

Hemoglobina 2

Valor de la hemoglobina después de la

Cuantitativa de razón continua

Valor en g/dl

3

intervención, en g/dl

 

Hematocrito 1

Valor del hematocrito antes de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Hematocrito 2

Valor del hematocrito después de la intervención, en porcentaje

Cuantitativa de razón continua

Porcentaje

3

Enfermedad

3 o más deposiciones

Cualitativa Nominal

1. si

4

NOMBRE

DEFINICIÓN

TIPO DE VARIABLE

ESCALA DE MEDICIÓN O CATEGORÍA

OBJETIVO

diarreica aguda 1

liquidas en 24 horas de 2

 

2.

no

o

más días, al menos una

vez durante el tiempo de seguimiento

 

Enfermedad diarreica aguda 2

Número episodios de EDA durante el seguimiento

Cuantitativa de razón continua

Resultado número de episodios

4

 

El

episodio de EDA al momento de recolectar la primera muestra

sanguínea

menor presenta un

 

Enfermedad diarreica aguda 3

 

1.

si

Cualitativa Nominal

2.

no

4

   
 

El

episodio de EDA al momento de recolectar la segunda muestra sanguínea

menor presenta un

 

Enfermedad diarreica aguda 4

 

1.

si

Cualitativa Nominal

2.

no

4

 

2 o más de los siguientes:

 

Infección

Tos ¥ , rinorrea £ , dificultad respiratoria¤, dolor faríngeo de 2 o más días,

Cualitativa nominal

1.

Si

respiratoria aguda

dicotómica

2.

No

4

1

al

menos una vez

durante el tiempo de

 

seguimiento

Infección

respiratoria aguda

Número episodios de IRA durante el seguimiento

Cuantitativa de razón continua

Resultado número de episodios

4

2

 
 

El

menor presenta un

Infección

episodio de IRA al momento de recolectar la

 
 

1.

si

respiratoria aguda

Cualitativa Nominal

2.

no

4

3

primera muestra sanguínea

 
 

El

menor presenta un

Infección

episodio de IRA al momento de recolectar la

 

respiratoria aguda

Cualitativa Nominal

1.

2.

si

no

4

4

segunda muestra

 

sanguínea

 

Presencia de alguna reacción adversa

Cualitativa nominal

1.

Si

Reacción adversa

dicotómica

2.

No

5

 

Presencia de dolor abdominal

Cualitativa nominal

1.

Si

Dolor abdominal

dicotómica

2.

No

5

 

Presencia de vómito hasta una hora después de consumir el alimento

Cualitativa nominal

1.

Si

Vómito

dicotómica

2.

No

5

Disgusto por el alimento

El

niño expresa disgusto

Cualitativa nominal

1.

Si

por el alimento

dicotómica

2.

No

5

Días recibe el yogur

Número de días que el niño recibe el yogur

Cuantitativa de razón discreta

Número de días

5

5.10 Técnicas de recolección de información

5.10.1 Fuentes de información

Esta investigación utilizará la fuente primaria como medio para obtener la información; para ello se encuestarán los padres o representantes legales de los niños, además se realizará un seguimiento diario del reporte de infecciones, adherencia y de reacciones adversas, consignado por las cuidadoras institucionales; adicionalmente se tomarán muestras de sangre para los análisis de laboratorio requeridos para el estudio. Se realizara seguimiento médico de los eventos que se presenten de IRA y EDA.

5.10.2 Instrumento de recolección de información

Se diseñaron dos instrumentos de recolección de información, el primero constituido por una encuesta que se aplicará con acompañamiento a los padres o representantes legales de los niños (Anexo 1), en la que además de indagar por las características sociodemográficas del menor y de su familia, se consignará información sobre los resultados de los exámenes de laboratorio y su estado nutricional. Por otro lado, se diseñó también un formato para el reporte diario de las incidencias de las enfermedades de interés, reacciones adversas, y aceptación y adherencia al yogur (Anexo 3). Este instrumento ya ha sido validado a través de dos ensayos clínicos controlados realizados por este equipo de trabajo, ya publicados (129,130).

5.11 Proceso de obtención de la información

La encuesta inicial realizada con el acudiente o representante legal de niño se realizará por la investigadora principal y coinvestigadores en el momento de la matrícula de los niños en cada uno de los cuatro centros seleccionados para el estudio. Semanalmente se recogerán los formatos de reporte diario de incidencias y reacciones adversas, suministradas por el médico general y las cuidadoras del centro infantil.

La evaluación nutricional de los niños será realizada por el personal de la fundación (nutricionistas) que se encuentra entrenada y estandarizada y con los debidos instrumentos calibrados para el examen. Estas evaluaciones se realizarán antes, durante y al final de la intervención. Se medirán parámetros como talla y peso y se calcularan el IMC, el peso para la talla, y se realizará una clasificación del estado nutricional de los niños.

Auxiliares del laboratorio clínico del Hospital Pablo Tobón Uribe tomarán las muestras, procesando todos los exámenes en el mismo centro con un formato de registro para cada extracción sanguínea (Anexo 2). Al mismo tiempo se realizará la toma de fotografías de rostro completo a

cada uno de los niños. La recolección de las muestras sanguíneas se realizará en las dos últimas semanas de febrero de 2015.

En el protocolo se expone con mayor detalle parte del proceso de obtención de la información (Anexo 4).

5.12 Control de errores y sesgos

Los niños y sus padres o representantes legales, las profesoras, coordinadoras de centros infantiles y los investigadores no conocerán si el yogur suministrado a los centros fue fortificado con betaglucanos o no, el cegamiento se mantendrá hasta después del análisis de los resultados.

El yogur fortificado se asignará a los centros infantiles de manera aleatoria, de manera que cada centro (y sus niños) tenga la misma oportunidad de recibir betaglucanos.

Los evaluadores y encuestadores (investigadores) serán entrenados y estandarizados, para generar poca variabilidad inter-observador.

Las mediciones nutricionales se hacen con equipos, instrumentos y personal estandarizado por la FAN.

Los exámenes de laboratorio serán procesados en el mismo centro diagnóstico (laboratorio clínico del Hospital Pablo Tobón Uribe) y con pruebas estandarizadas y equipos calibrados, con el fin de disminuir la variabilidad entre los equipos y métodos utilizados.

Se realizará control de calidad a todas las encuestas, tanto en medio físico como en digital.

5.13 Técnicas de procesamiento y análisis de datos

La información se digitalizará en una hoja de cálculo de MS Office Excel 2010, luego se exportará, almacenará y procesará en base de datos en el programa estadístico SPSS v21®. Para el cálculo de intervalos de confianza y algunas pruebas de asociación se utilizará la calculadora epidemiológica EPIDAT v3.0, entre tanto que la presentación tabular, pictórica y textual se realizará mediante el procesador de texto de MS Office Word 2010. Se usara además el software especializado para análisis bioestadística de ensayos clínicos Phoenix WinNonlin 6.3® (perform NCA and PK/PD modeling and simulation).

El análisis de los datos se realizará por intención de tratar; esto es, que se tomarán las pérdidas como el peor resultado posible en cuanto a los eventos de enfermedad diarreica aguda e infección respiratoria aguda, es decir que se contaran como incidencias de cada una de las enfermedades de interés. Se considerará pérdida a todo niño que por voluntad de sus padres o representantes legales, decida retirarse del estudio en cualquier momento; que se retire del centro infantil definitivamente, o que deje de consumir el yogur por más del 25% de los días de suministro del alimento por voluntad o por inasistencia al centro infantil.

Objetivo 1: Caracterizar social y demográficamente los niños preescolares entre 3 y 5 años matriculados en los centros de la Fundación de Atención a la Niñez seleccionados para el estudio.

Para cumplir con este objetivo se realizará una descripción de las variables correspondientes a las características demográficas, económicas y sociales de los adultos mayores incluidos en el estudio.

Se presentarán, mediante gráficos y tablas, la distribución univariada y bivariada de algunas características de las unidades de análisis de la muestra. Se utilizarán, para describir las variables cuantitativas, la media, la mediana, la moda y el rango intercuartílico, la desviación estándar, el mínimo, el máximo y el coeficiente de variación, según la distribución de las mismas; mientras que para las variables cualitativas, se utilizarán los porcentajes.

Objetivo 2: Se indicará la distribución del estado nutricional en la población, antes, durante y después, a través de porcentajes y gráficas; se utilizará la prueba de McNeamar para la comparación tipo antes - después. Para la clasificación del estado nutricional, se utilizarán los aplicativos gratuitos de la OMS, Anthro V 3.2.2 y Anthro plus 1.0.4, para los menores de cinco años y para los niños con cinco años y más, respectivamente.

En el caso de encontrar niños que consumen suplementos dietarios, se estratificarán los resultados por esta variable.

Se presentarán, mediante gráficos y tablas, la distribución univariada y bivariada de algunas características de las unidades de análisis de la muestra. Se utilizarán, para describir las variables cuantitativas, la media, la mediana, la moda y el rango intercuartílico, la desviación estándar, el mínimo, el máximo y el coeficiente de variación, según la distribución de las mismas; mientras que para las variables cualitativas, se utilizarán los porcentajes.

Objetivo 3: Evaluar los marcadores inmunológicos y el perfil hematológico, antes y después de la intervención por doce semanas, comparando las diferencias intra e inter grupos de evaluación.

Los valores iniciales de las pruebas hematológicas y de marcadores inmunológicos serán tomados como los niveles basales, que servirán de comparación con los valores obtenidos después de las doce semanas de seguimiento. Para cumplir con este objetivo secundario, se utilizará la diferencia de medias o medianas según estas variables sigan o no una distribución normal. En el caso de la evaluación entre grupos se utilizará la diferencia para muestras independientes, bien sea la t de

Student o la U de Mann Withney; mientras que en la evaluación antes-después se utilizará la t de Student pareada o Wilcoxon, según sea el caso.

Se calculará el Riesgo Relativo, su respectivo Intervalo de Confianza del 95%, la Reducción Absoluta del Riesgo y el Número Necesario a Tratar.

Objetivo 4: Determinar la incidencia de enfermedad diarreica aguda y la incidencia de enfermedad respiratoria aguda, durante doce semanas de seguimiento, comparando las diferencias entre el grupo de intervención y el grupo placebo.

Se indicará la tasa de incidencia en general y según grupo de intervención, lo cual se mostrará a través de gráficos y tablas; para conocer si existen diferencias, se utilizará la prueba Chi cuadrado de independencia. Se calculará el Riesgo Relativo, su respectivo Intervalo de Confianza del 95%, la Reducción Absoluta del Riesgo y el Número Necesario a Tratar.

Objetivo 5: Determinar la incidencia de reacciones adversas a la ingesta del alimento y la aceptación del mismo, en el grupo de intervención comparadas con el grupo placebo.

Se indicará la proporción de niños que presentaron al menos una reacción adversa en general y según grupo de intervención, además se mostrará la distribución de las principales reacciones adversas encontradas, se mostrará a través de gráficos y tablas; para conocer si existen diferencias entre los grupos se utilizará la prueba Chi cuadrado de independencia.

Se evaluará la aceptación, en este sentido se determinará y se comparará la proporción niños que se niegan a tomar el yogur al menos una vez durante el tiempo de seguimiento, se mostrarán gráficos y tablas; para conocer si existen diferencias entre los grupos, se utilizará la prueba Chi cuadrado de independencia.

Objetivo 5: Describir el estado general de la piel y pelo, antes y después de doce semanas de intervención, en los dos grupos de estudio.

Se realizara una evaluación cualitativa a través de fotografías al rostro de los niños seleccionados para el estudio, de manera que permita la descripción y comparación subjetiva del estado del pelo y de la piel de los menores. Se mostrarán las fotografías, cuidando siempre de no exponer la identidad del menor.

5.14 Consideraciones éticas

En todo momento, durante el desarrollo de esta investigación, se tendrán como principios los establecidos para la investigación en seres humanos, además se garantizará el no daño de los participantes, prevaleciendo el respeto por su dignidad, la protección de sus derechos y su bienestar; en este orden de ideas se propenderá siempre por:

a) Respetar la autonomía: A los padres, tutores o representantes legales de los participantes se les explicarán detalladamente los objetivos de la investigación, de modo que estén suficientemente informados y se les permita ejercer su libertad de tomar la decisión que consideraran correcta o adecuada. La inclusión de los niños se realizará después de obtener el consentimiento informado por escrito de los padres, tutores o representantes legales de acuerdo con la Declaración de Helsinki II y la Resolución 008430 del Ministerio de Salud de 1993 (Anexo 5), de igual manera y en concordancia con el Ministerio, se tendrá en cuenta el asentimiento de los niños a partir de su capacidad de entendimiento, razonamiento y lógica, explicando lúdicamente lo que se pretende hacer con un equipo liderado por psicólogos expertos en el tema (Anexo 5). Por otra parte, se dejará claro a los padres o representantes legales que podrán retirar a los menores del estudio en cualquier momento, sin que esto tenga algún tipo de repercusión.

b) Beneficencia: Se procurará maximizar los beneficios para la población, de manera que se aumente la respuesta inmunológica en los niños y se pueda evaluar el estado general de salud en todos los niños participantes a través de los exámenes de laboratorio.

c) No maleficencia: En ningún caso la ingesta del yogur (con betaglucanos o no) constituirá un riesgo para la salud de los niños. De llegar a presentarse algún efecto adverso directamente relacionado con la ingesta del yogur con betaglucanos, la empresa Progal-BT S.A.S. se compromete a cubrir los gastos derivados de la atención en salud no cubiertos por el Sistema General de Seguridad Social en Salud (SGSSS) a través de una póliza de seguro (Anexo 6). De otro lado, se tiene establecido que en el caso de detectar algún evento adverso serio, la intervención será suspendida inmediatamente.

d) Justicia: Los centros infantiles tendrán la misma probabilidad de pertenecer a cualquiera de los dos grupos de estudio, en este sentido se aleatorizarán los grupos con el propósito de obtener una mayor transparencia en la intervención, además de controlará el sesgo que puede presentarse al aleatorizar individuos.

Según la resolución 008430 de 1993, dadas sus características esta investigación se clasificará como con riesgo mayor que el mínimo. Adicionalmente las implicaciones concernientes a la toma de dos muestras de sangre, antes y después de la intervención, para el análisis de las pruebas de laboratorio son tenidas en cuenta.

Personal del laboratorio del laboratorio clínico del Hospital Pablo Tobón Uribe realizará la extracción y análisis de muestras de sangre, garantizando el cumplimento de las normas y principios concernientes al manejo y bioseguridad de las muestras.

Por su parte, el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (INVIMA), concedió el registro sanitario por término de diez años, a la mezcla en polvo con betaglucanos con base en

Maltodextrina que será utilizada en este estudio y que tiene vigencia hasta el 20 de marzo de 2019 (Anexo 7). Los resultados que se obtengan a partir del desarrollo de esta investigación, será presentada de manera global, garantizando siempre la confidencialidad de los menores.

6. CRONOGRAMA CRONOGRAMA DEL PROYECTO 6 MESES (INICIO FEBRERO 17-JULIO 31 de 2015) NOMBRE DEL
6.
CRONOGRAMA
CRONOGRAMA DEL PROYECTO
6 MESES (INICIO FEBRERO 17-JULIO 31 de 2015)
NOMBRE DEL PROYECTO
SEMANAS
May-
Agos-
Oct-
Feb 16-
Mar 2-
Mar
Mar 9-
Jun 1-
ACTIVIDADES
Jun -Jul
Jul/14
Sep/14
Nov/14
27
20
10-24
May 15
19
1
Diseño y escritura de proyecto
2
Evaluación por comité de ética
3
Consecución de consentimientos
informados, actividades de
asentimiento, primera encuesta
en los 4 hogares FAN
4
Toma de muestras iniciales
5
Inicio suministro del alimento
6
Seguimiento y recolección de
encuestas semanales
7
Toma de muestras finales
8
Tabulación, análisis y
presentación de informe final

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