MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

PRÁCTICA N° 6
AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE
ENZIMAS.

Estudiantes de Ingeniería Agroindustrial

FERNEY VELASQUEZ RINCON, cód. 117003638, DIANA CAROLINA ROMERO
GARZON, cód. 117003633, y YULITXA FERNANDA GALINDO GARZÓN, cód.
117003608
Universidad de los Llanos, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales,
programa de Ingeniería Agroindustrial, Villavicencio, Meta, Colombia.

Presentado el 25 de Mayo de 2017.

Resumen algodonosos que no permitían el paso del

En la práctica de aislamiento y selección de
microorganismos productores de enzimas se
pretendió aislar y cuantificar
microorganismos productores de amilasas,
proteasas y celulasas, realizando siembras en
diferentes medios de cultivo (agar proteína,
agar almidón y agar celulosa) a partir de una
dilución seriada de una muestra de suelo
hasta 10-4 , luego de las siembras se llevaron a
incubación a 370C por 8 días, donde se puede
decir que los resultados que se obtuvieron no
fueron los que se querían, ya que al revelar
los medios de cultivo, estos estaban
totalmente contaminados y por lo tanto no se
pudo observar el aislamiento de las enzimas
deseadas. El medio de agar almidón, fue
revelado con reactivo de lugol que es el que
tiñe los carbohidratos que de haber la
presencia de enzimas que degradaran el
almidón, se hubiera observado el halo de
hidrolisis, el cual no fue así; para los otros
sustratos no fue necesidad de revelarlos ya
que a vista macroscópica se observaron los
medios totalmente contaminados por hongos
reactivo hasta el medio.
Palabras claves: Almidón, enzimas,
hidrólisis, hongos, microorganismos.
Metodología
En primer lugar se desinfectó el mesón que se
utilizó con alcohol al 70% y se encendió el
mechero para realizar los demás pasos con el
mayor de los cuidados, luego se tomó una
muestra de suelo de 10g y se realizaron
diluciones seriadas en tubos de ensayo con
agua peptonada hasta la 10-4 , se tomaron
alícuotas de 0,1ml de la dilución 10-3 y se
sembraron por superficie en cada uno de los
medios disponibles (agar proteína, agar
celulosa y agar almidón) y así mismo se hizo
con la dilución 10-4 para obtener un total de
dos medios iguales sembrados con diluciones
diferentes, luego fueron selladas las cajas de
Petri y se llevaron a incubación a 370C con
una duración de 8 días para luego ser
reveladas.
 Resultados
Figura 1. Vista macroscópica de
microorganismos productores de amilasas
(experimental).
En la figura 1, se observa la vista
macroscópica de microorganismos
productores de amilasas (proveniente de una
muestra de suelo, en medio de cultivo Agar
almidón). Como se observa en la imagen
hubo contaminación en los dos medios de
cultivo 10-3 y 10-4. Está muestra no fue
posible revelarlas con lugol debido a la alta
contaminación en la muestra.
Figura 4. Vista macroscópica de
microorganismos productores de amilasas
(teórico).
En la figura 2, como se puede observar se
logra ver la actividad amilolítica de la
muestra al ser revelada con lugol que tiñe el
almidón de azul y deja un halo claro en el
lugar donde el almidón fue digerido
enzimáticamente.
Figura 3. Vista macroscópica de
microorganismos productores de celulasas
(experimental).
En la figura 3, se observa la vista
macroscópica de microorganismos
productores de celulosas (proveniente de una
muestra de suelo, en medio de cultivo Agar
celulosa). Como se observa en la imagen
hubo contaminación en los dos medios de
cultivo. Está muestra se revelo con rojo
congo pero este no puedo impermeabilizar la
muestra ya que hubo contaminación en el
cultivo por lo tanto no se logró detectar los
halos ni se pudo contar las colonias
productoras de la enzima.
Figura 4. Vista macroscópica de
microorganismos productores de celulasas
(teórico).
En la figura 4. Se puede observar como el
rojo congo logra impermeabilizar el cultivo
haciendo posible la evidencia de la hidrolisis
de polisacáridos celulíticos y no celulíticos.
Esto hace posible la evidencia de la hidrolisis
de celulosa con diferentes halos claros
alrededor de la colonia.
Figura 5. Vista macroscópica de
microorganismos productores de proteasas
(experimental).
En la figura 5, se observa la vista
macroscópica de microorganismos
productores de proteasas (proveniente de una
muestra de suelo, en medio de cultivo Agar
leche). Como se observa en la imagen hubo
contaminación en los dos medios de cultivo y
por lo tanto no se encontraron halos y por lo
tanto no se pudo contar las colonias
productoras de la enzima.
Figura 6. Vista macroscópica de
microorganismos productores de proteasas
(teórica).
En la figura 6, se puede observar que la
caseína siendo la proteína de la leche le
confiere el color blanco a la muestra y como
se observa el medio se puede visualizar halos
transparentes alrededor de la colonia del
microorganismo en donde se logró degradar la
proteína.
Análisis de resultados
Los microorganismos con características
enzimáticas brindan una opción en la
obtención de metabolitos que puedan ser
usados a nivel industrial, aprovechando
procesos de biodegradación de los
polisacáridos como el almidón, la celulosa,
que se encuentran de manera abundante en la
naturaleza, específicamente en el material
vegetal y de las proteínas (Dávila y Vázquez,
2006).
El almidón se encuentra en casi todas las
plantas, está compuesto por amilosa,
constituida por 1.000 a 5.000 moléculas de
glucosa y amilopectina, formada por 6.000 a
20.000 unidades de glucosa. Los
microorganismos amilolíticos utilizan
enzimas reductoras para producir azúcares
simples. Dentro de estos se identifican
bacterias como Bacillus sp., Pseudomonas
sp., y Streptomyces sp. Entre las enzimas
reductoras que utilizan estos
microorganismos las engloba la amilasa cuya
función es hidrolizar los enlaces glucosídicos
del tipo alfa 1,4 de la fracción amilosa de la
molécula de almidón. La cual actúa
desdoblando el almidón hasta alfa dextrinas,
y luego estas hasta maltosa (aunque
predominan las alfa dextrinas). El medio de
agar almidón es utilizado en la selección de
microorganismos productores de amilasas. La
actividad amilolítica es revelada colocando al
medio unos gotas de solución de Lugol (I2-
KI) que tiñe el almidón de azul y deja un halo
claro en el lugar donde el almidón fue
digerido enzimáticamente. Si las colonias
son almidón positivas, aparece un halo
transparente alrededor de las mismas
(Sánchez, et. al, 2005). En el desarrollo de la
práctica en el laboratorio de microbiología
del programa de ingeniería agronómica,
primeramente se realizó la siembra en
superficie a partir de una muestra de suelo
con alto grado de materia orgánica sobre agar
almidón para determinar la actividad
amilolitica efectuada por los
microorganismos amiloliticos presentes en la
muestra de suelo. Pasados los ocho días de
incubación, desafortunadamente se
obtuvieron resultados pésimos, véase la
figura 1, explicable debido a la ausencia de
habilidad y minuciosidad por parte de los
estudiantes para manipular y ejecutar este
tipo de procedimiento, la posible
contaminación de los diferentes implementos
provistos por el laboratorio, en los que se
encuentra las cajas petri con el agar almidón,
éstas pudieron estar mal preparadas, y la mala
refrigeración durante el periodo de
incubación por las idas momentanéas de la
electricidad en la universidad de los Llanos.
Se esperaba obtener diferentes halos
transparentes o más claros alrededor de las
colonias, tal como se observan en la figura 2
y como se afirma en diferentes fuentes
bibliográficas, para posteriormente una
medición del diametro de algunos de los
halos y un recuento e identificación de las
colonias (tanto las que forman como las que
no forman halos de hidrólisis).
La celulosa es un polímero de origen vegetal
constituido por 15.000 moléculas de D-
glucosa. Forma una estructura rígida de
cadenas paralelas unidas por puentes de
hidrógeno. La carboximetilcelulosa o diferentes fuentes bibliográficas, para
carmelosa es un compuesto orgánico,
derivado de la celulosa. Los microorganismos
celulolíticos son mesofílicos, termofílicos,
aerobios y anaerobios, que utilizan enzimas
reductoras capaces de degradar para producir
azúcares simples. Dentro de estos se
identifican bacterias como Bacillus sp.,
Clostridium sp., Streptomyces sp. y hongos
como Sclerotium sp., Aspergillus sp., Achlya
sp., Rhizopus sp. y Penicillum sp.. Entre las
enzimas reductoras que utilizan estos
microorganismos las engloba la celulasa, que
actúa rompiendo los enlaces β-1,4
glucosídicos de la celulosa transformándola
en glucosa libre. El agar celulosa se usa para
aislar microorganismos que digieren la
celulosa. El rojo congo puede ser usado en los
ensayos para evidenciar la hidrólisis de
polisacáridos debido a que el colorante forma
complejos con las moléculas aún no
hidrolizadas, facilitando así la diferenciación
entre microorganismos celulíticos y no
celulíticos por la formación de zonas de
aclaramiento alrededor de las colonias
(Gaitán y Pérez, 2007). En el desarrollo de la
práctica en el laboratorio, se prosiguió con la
realización de la siembra en superficie a partir
de la muestra de suelo con alto grado de
materia orgánica sobre agar celulosa para
determinar la actividad celulolítica efectuada
por los microorganismos celulolíticos
presentes en la muestra de suelo. Pasados los
ocho días de incubación, desafortunadamente
se obtuvieron resultados pésimos, véase la
figura 3, explicable debido a las mismas
razones mencionadas anteriormente para
interpretar los fatales resultados obtenidos
sobre el agar almidón. Se esperaba obtener en
esta prueba de hidrólisis de celulosa
diferentes halos transparentes o más claros
alrededor de las colonias, tal como se
observan en la figura 4 y como se afirma en
posteriormente una medición del diametro de
algunos de los halos y un recuento e
identificación de las colonias (tanto las que
forman como las que no forman halos de
hidrólisis).
La caseína es la proteína predominante de la
leche que le confiere el color blanco. La
hidrólisis de las proteínas es conocida como
proteólisis o peptonización, efectuada por
microorganismos cómo Pseudomonas sp.,
Streptococcus sp., Micrococcus sp.,
Clostridium sp., Bacillus sp., Proteus sp.,
Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp.,
entre otros. Muchos microorganismos
producen la exoenzima caseinasa que degrada
la caseína, produciendo aminoácidos, más
solubles y transparentes. El agar proteína o
agar leche se utiliza para la demostración de
la hidrólisis de la caseína por
microorganismos con esta actividad
proteolítica. El medio es blanquecino opaco.
La proteólisis se evidencia por halos claros
transparentes alrededor de las colonias
(debidos a la degradación de la caseína, que
es aquella que le confiere el color blanco)
(Alarcón, 2001). Se finalizó el desarrollo de
la práctica en el laboratorio con la ejecución
de la siembra en superficie a partir de la
muestra de suelo con alto grado de materia
orgánica sobre agar proteína o agar leche para
determinar la actividad proteolítica efectuada
por los microorganismos proteolíticos
presentes en la muestra de suelo. Pasados los
ocho días de incubación, desafortunadamente
se obtuvieron resultados pésimos, véase la
figura 5, explicable debido a las mismas
razones mencionadas anteriormente para
interpretar los fatales resultados obtenidos
sobre el agar almidón. Se esperaba obtener en
esta prueba de hidrólisis de proteínas
diferentes halos claros transparentes
alrededor de las colonias, tal como se
observan en la figura 6 y como se afirma en
diferentes fuentes bibliográficas, para
posteriormente una medición del diametro de
algunos de los halos y un recuento e
identificación de las colonias (tanto las que
forman como las que no forman halos de
hidrólisis).
Conclusiones
 Se realizaron procedimientos para
aislar y seleccionar microorganismos
mesófilos productores de enzimas a
partir de muestras de suelo con alto
grado de materia orgánica.
 Se llevó a cabo el procedimiento para
aislar microorganismos productores
de amilasas, obteniendosen
resultados fatales debido a varios
factores.
 Se hizo el procedimiento para aislar
microorganismos productores de
proteasas (caseinasas), obteniendosen
resultados pésimos debido a varios
factores.
 Se efectuó el procedimiento para
aislar microorganismos productores
de celulasas, obteniendosen
resultados atroces debido a varios
factores.
Bibliografía
Alarcón, L. R. (2001). Manual de prácticas de
Microbiología básica y Microbiología de
alimentos. Programa de Nutrición. UACJ.
Dávila, G., & Vázquez, R. (2006). Enzimas
lignocelulolíticas fúngicas para fines
ambientales. Mensaje Bioquímico, pp. 29-55.
Gaitán, D., & Pérez, L. (2007). Aislamiento y
evaluación de microorganismos celulolíticos
a partir de residuos vegetales frescos y
compost generados en cultivo de crisantemo.
Tesis pregrado. Bogotá, Colombia: Pontificia
Universidad Javeriana.

Sánchez, C., Mejía, C., Figueroa, C.,

Esquivia, M., Agudelo, L., M, Z., & otros.
(2005). Estudio de cepas nativas amilolíticas.
VITAE, Revista de la Facultad de Química
Farmacéutica, 12 (2), 21-28.