Вы находитесь на странице: 1из 58

Contenido

Diagnóstico fitosanitario
Detección de β-exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC 255
Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Diagnóstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales 261
Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín y Doris Hernández
Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos nativos
con potencialidad para el control de especies de insectos plaga 265
Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez
Ecología
Dispersión, distribución actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae)
en Cuba 273
Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo,
Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo y Ransés Vázquez
Variabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez
Control biológico
Un medio simplificado a base de soya más azúcar turbinada de caña para la producción del hongo acaropatógeno
Hirsutella nodulosa Petch en fase líquida 285
Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega y Litzy Ayra
Estudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudrición blanda de la papa
(Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez
y Victoria Pazos Álvarez-Rivera
Producción de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentación líquida 295
Rosaima García, María A. Durán y Ramón Riera
Reseña
Caracterización de Ralstonia solanacearum a través del estudio de su diversidad genética 299
Yelaine Tejeda Gómez
Comunicación corta
Primer registro de cecidómido asociado a síntomas de roya en plantas medicinales en Cuba 305
Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa
Observaciones sobre enemigos naturales de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba 307
Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brito
y Janet Alfonso Simonetti
Resumen de tesis
Diagnóstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) 309
Janet Igarza Castro
Comportamiento y control de la enfermedad tizón de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopónicos
en la provincia de Camagüey y su relación con otros patógenos fúngicos presentes en el cultivo 310
Carlos A. Ferrer González
Contents
Phytosanitary diagnosis
Detection of β-Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis 255
Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez and Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Phytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils 261
Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín and Doris Hernández
Isolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potential
for the Control of Pest Insects Species 265
Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos and Aidanet Carr Pérez
Ecology
Dispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom
(Thysanoptera: Thripidae) in Cuba 273
Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol,
Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo and Ransés Vázquez
Variability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
María E. Estrada Martínez and Dolores Piñón Gómez
Biological control
A Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of Fungus
Hirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites 285
Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega and Litzy Ayra
Study of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez
and Victoria Pazos Álvarez-Rivera
Production of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation 295
Rosaima García, María A. Durán and Ramón Riera
Review
Caracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity 299
Yelaine Tejeda Gómez
Short communication
First Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants 305
Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes and María O. López Mesa
Observations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba 307
Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brit
and Janet Alfonso Simonetti
Thesis abstract
Diagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott 309
Janet Igarza Castro
Behavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagüey Province and its Relation
with others Fungi Pathogens Present in the Crop 310
Carlos A. Ferrer González
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Diagnóstico fitosanitario

DETECCIÓN DE β-EXOTOXINA EN CEPAS NATIVAS


DE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLC

Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera


Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cu

RESUMEN ABSTRACT
Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) la The presence of β -exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strains
presencia de β-exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis, belonging to Plant Health Research Institute collection was analyzed
pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones de by high performance liquid chromatography (HPLC). β -exotoxin
Sanidad Vegetal. La concentración de β-exotoxina en el patrón fue concentration in the standard was 25 µg.mL-1, and in a commercial
de 25 µg.mL–1, y en el producto comercial empleado como control product, used as positive control, was 6 µg.mL-1. β-exotoxin was only
positivo fue de 6 µg.mL–1. En las cepas evaluadas solo la LBT9 y detected in LBT9 with 34 µg.mL-1 and LBT47 with 4.5 µg.mL-1, among
LBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentraciones the strains proved.
de 34 y 4,5 µg.mL–1 respectivamente.
Key words: Bacillus thuringiensis, β-exotoxin, liquid chromatography
Palabras claves: Bacillus thuringiensis, β-exotoxina, cromatografía (HPLC), detection
líquida (HPLC), detección

INTRODUCCIÓN
Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ade- poca reproducibilidad. De todos estos métodos la RP-
más de la δ-endotoxinas o proteínas Cry una exotoxina HPLC se emplea más frecuentemente para la detección y
termoestable denominada β-exotoxina, la cual se se- cuantificación de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].
creta al medio de cultivo al inicio del proceso de El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuan-
esporulación. Esta molécula es un análogo nucleotídico tificar la presencia de la β-exotoxina en nueve cepas
de ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atri- cubanas de Bacillus thuringiensis.
buye acción insecticida contra diferentes órdenes de
insectos como Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros,
Hemípteros, además de ácaros, nematodos, proto- MATERIALES Y MÉTODOS
zoarios y platelmintos [Hernández et al., 2003]. Como material biológico se emplearon nueve cepas de
Diversos métodos como la cromatografía de intercam- B. thuringiensis pertenecientes a la colección del Insti-
bio iónico, electroforesis capilar, ELISA y la croma- tuto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cuales
tografía líquida de alta resolución (HPLC) se han des- se seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y la
crito para la determinación de la β-exotoxina, como toxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo este-
alternativas al bioensayo tradicional con Musca domes- rilizado a 121ºC frente a un grupo de organismos plaga
tica, el cual resulta más trabajoso, prolongado en el (Tabla 1).
tiempo y presenta algunas limitaciones como estima- El estándar de β-exotoxina I lo suministró el doctor Jorge
ciones inexactas de la potencia de la toxina impura y Ibarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro de

fitosanidad/255
Baró y otros

Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Poli- naron 100 µL de β-exotoxina estándar a la cepa LBT5
técnico Nacional de México), obtenido a partir de la de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento del
cepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var. microorganismo y concluido su desarrollo. La croma-
thuringiensis. La concentración final de la solución de tografía se desarrolló en las condiciones descritas ante-
β-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 µg.mL–1. riormente.
Como control positivo se utilizó un producto comercial
ruso que contiene β-exotoxina, producido a partir de
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
una cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y como
control negativo se tomó la cepa HD1, estándar inter- Según los cromatogramas obtenidos en la detección de
nacional de B. thuringiensis que no produce β-exotoxina. β-exotoxina para las cepas en estudio, se observó el
pico correspondiente al patrón de β-exotoxina estándar
Tabla 1. Serotipos de las cepas a una concentración de 25 µg.mL–1 (Fig. 1(A)). El pico
en estudio [Fernández-Larrea, 1999] que se observa en la muestra patrón apareció a un tiem-
po de retención de 11,33 min. El mismo pico apareció
Cepas Serotipo en la muestra correspondiente al producto comercial
LBT-4 kenyae (H4) ruso a base de β-exotoxina, cepa utilizada como testigo
LBT-5 thuringiensis (H1) positivo. Su concentración fue de 6 µg.mL–1 (Fig. 1(B)).
LBT-7 kenyae (H4) La exotoxina no se detectó en la cepa HD1 estándar
LBT-9 thuringiensis (H1) internacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2),
LBT-12 thuringiensis (H1) la cual no produce esa exotoxina [Galán et al., 1994;
LBT-13 no determinado
Glare y Callaghan, 2000].
LBT-16 thuringiensis (H1)
LBT-25 israelensis (H14) En el resto de las cepas en estudio, solo se observó el
LBT-47 no determinado pico correspondiente a la β-exotoxina en las cepas LBT9
(Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de pro-
ducción del metabolito en estas cepas fueron de 34 y
4,5 µg.mL–1 respectivamente. En la cepa LBT7 tam-
Las cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya, bién se observó la presencia de un pico que pudiera co-
en zaranda orbital a 150 r.min–1 a una temperatura de rresponder a la β-exotoxina, ya que presenta uno simi-
crecimiento de 30ºC durante 48 h hasta que se comple- lar al del patrón y un tiempo de retención muy cercano.
tó el proceso de esporulación.
Las cepas evaluadas presentan serotipos que están infor-
Una vez transcurrido el tiempo de incubación el cultivo mados en la literatura como productores de la β-exo-
se centrifugó 10 000 r.min–1 en centrifuga refrigerada toxina [Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000];
durante 20 min. El precipitado se descartó y el sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido por
sobrenadante se trató en autoclave a 121ºC durante 15 min. Levinson et al. (1990) y Hernández y Ferré (2001), los
El pH de las muestras se ajustó a 3 con ácido fosfórico cuales mostraron que la producción de la exotoxina
85%. El sobrenadante se clarificó por centrifugación termoestable es más una propiedad específica de la cepa
a 10 000 r.min–1 y se guardó a –20ºC hasta su uso. de B. thuringiensis que una propiedad serotipo especí-
El proceso de separación se realizó según Levinson et fica. Se ha probado además que su presencia en una
al. (1990), para lo que se utilizó una columna LiChros- cepa en particular no implica la producción de la exo-
pher RP-18 de fase reversa. La corrida se efectúo a 30ºC toxina por otras cepas pertenecientes al mismo se-
en 50 milimoles.L–1 de KH2PO4 (pH 3) a una velocidad rovar.
de flujo de 2 mL.min–1, con detección a 260 nm. El vo- Aunque los estudios que relacionan la producción de la
lumen de inyección fue de 100 µL. Se empleó un detec- β-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa de
tor UV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A. B. thuringiensis son muy escasos, y en la mayoría de
Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el soft- ellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores plan-
ware EZChrom versión 6.8. tean que la producción de β-exotoxina está limitada a
Con el objetivo de evaluar si la β-exotoxina se elimina- ciertos serotipos flagelares presentes en las cepas de
ba durante el procesamiento de la muestra, se adicio- B. thuringiensis [Hernández y Ferré, 2001].

256/fitosanidad
Detección de β-exotoxina en cepas...

Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β-exotoxina (25 µg.mL–1) (A) y para el producto comercial (6 µg.mL–1)
(control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección
100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). Columna
LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260nm, volumen de inyección
100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 µg.mL–1 (A) y LBT47 4,5 µg.mL–1 (B).
Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fase
móvil KH2PO4, pH 3,0.

fitosanidad/257
Baró y otros

La clasificación de las cepas de B. thuringiensis en como sugirieron Johnson y Peterson (1983) en la pro-
serovares se desarrolló sobre la base de los antígenos ducción de la exotoxina, lo que implicaría que la β-exo-
flagelares; sin embargo, las bases genéticas y bioquímicas toxina no se produzca por todas las cepas de B. thu-
del sistema de antígenos flagelares aún son desconocidas. ringiensis.
Esto hace especialmente difícil encontrar una relación di- Otra explicación a la no detección del metabolito en las
recta entre los genes determinantes del serovar y otros restantes cepas pudo deberse también a niveles de con-
genes en B. thuringiensis, como los que determinan la sín- centración bajos en el medio de fermentación, a lo cual
tesis de β-exotoxina [Hernández et al., 2003]. En este es- se suma la presencia de moléculas contaminantes en la
tudio no fue posible establecer esta relación debido a que solución que hace difícil su determinación. Oehler et al.
se emplearon muy pocas cepas, y las dos que resultaron (1982) emplearon una columna C18 y como fase móvil
positivas pertenecen a serotipos diferentes. H2O y ácido trifluoracético; sin embargo, el método no
En estudios previos realizados en el Instituto de Inves- dio resultado debido a que los contaminantes del
tigaciones de Sanidad Vegetal se demostró que el sobrenadante del cultivo de B. thuringiensis coeluían
sobrenadante de cultivos obtenidos a partir de las ce- con la toxina, lo cual se considera que también pudo
pas estudiadas en este trabajo, y esterilizado a 121ºC, ocurrir en los resultados presentes. Debido a esto y a
presentaron actividad tóxica contra un grupo de orga- su pequeña masa molecular, la utilización de un méto-
nismos plaga como ácaros y nematodos [Márquez et al., do altamente eficiente en el proceso de obtención de la
1999; 2003]; sin embargo, resulta interesante destacar exotoxina constituye un proceso clave para el recobra-
que no pudo observarse en cada una de ellas el pico do y purificación de la β-exotoxina.
correspondiente a la β-exotoxina. Estos resultados pu- La adición de β-exotoxina estándar durante el proceso
dieran tener explicación con lo afirmado por Levinson de crecimiento de la cepa LBT 5 dio como resultado la
et al. (1990) en cuanto a que los patrones de aparición presencia del pico correspondiente a la β-exotoxina a con-
de la exotoxina termoestable sugieren que puede estar centraciones de 0,42 µg.mL–1 y 35,8 µg.mL–1 (Figs. 4(A)
involucrado solo un único gen. La producción de y (B)). Esto indica que la β-exotoxina no se pierde du-
exotoxina puede ser resultado de una sola reacción rante el proceso de obtención previo a la cromatografía.
enzimática, a partir de moléculas precursoras presen- La adición de β-exotoxina estándar a un grupo de cepas
tes tanto en las cepas Exo+ como Exo–. Es probable en estudio también la utilizaron Gohar y Perchat (2001)
que estos precursores estén involucrados en el control para corroborar la presencia de la toxina. A este proce-
de la transcripción de los genes de la esporulación y no dimiento se le denominó método del testigo externo.

Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5 contaminada con β-exotoxina estándar al inicio del cultivo (A) y una vez concluido el
procesamiento de la muestra (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de
inyección 100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

258/fitosanidad
Detección de β-exotoxina en cepas...

Otra explicación a la ausencia del pico típico de la β-exo- REFERENCIAS


toxina en las cepas LBT4, LBT5, LBT7, LBT12, LBT13,
LBT16 y LBT25 es la presencia de una segunda Fernández-Larrea, O.: «Aislamiento, selección y estudio de cepas de
exotoxina denominada tipo II, la cual se produce a concen- Bacillus thuringiensis para el control fitosanitario». Informe Final
traciones mucho más bajas que la β-exotoxina tipo I. Este PNCT, Biotecnología Agrícola, INISAV, Cuba, 1999.

resultado fue corroborado por Levinson et al. (1990) al Galán, W.; K. Arévalo: «Uso de un método sencillo para detección de b-
identificar la β-exotoxina tipo I en un grupo de cepas de exotoxina en cepas de Bacillus thuringiensis», South Western
Entomologist 19 (4):385-390, 1994.
B. thuringiensis; sin embargo, no se pudo detectar en
una cepa de B. thuringiensis var. morrisoni, que exhibió Glare, T.; M. Callaghan: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and
actividad tóxica en el sobrenadante esterilizado a 121ºC Safety, Eds. John Wiley and Sons, 2000.

contra Musca domestica, Diabotrica undecimpuntacta y Gohar, M.; S. Perchat: «Sample Preparation for b-Exotoxin Determination
Leptinotarsa decemlinneata. El análisis realizado por es- in Bacillus thuringiensis Cultures by Reversed-Phase High Perfor-
mance Liquid Chromatography», Anal. Biochem. 298:112-117, 2001.
tos autores dio como resultado la identificación de este
nuevo tipo de exotoxina. Esta molécula es menos Hernández, C.; C. Martínez; H. Porcar; J. Ferré: «Correlation Between
Serovars of Bacillus thuringiensis and Type I â-Exotoxin Production»,
hidrofóbica y se sugiere que sea un análogo de uracilo de J. Invertebr. Pathol. 82:57-62, 2003.
la exotoxina tipo I [Levinson et al., 1990].
Hernández, C.; J. Ferré: «Larget-Thiéry Update on the Detection of b-
La existencia de esta toxina aclaró resultados confusos y Exotoxin in Bacillus thuringiensis by HPLC Analysis», J. Appl.
contradictorios reportados en la literatura. Igualmente Microbiol. 90:643-647, 2001.
Gohar y Perchat (2001) lograron identificar la exotoxina Johnson, D.; R. Peterson: «Limitations of HPLC for the Detection of b-
tipo II al emplear RP-HPLC, pero con la utilización pre- Exotoxin in Cultures Filtrate of Bacillus thuringiensis», European
via de precipitación con solventes orgánicos y una Journal of Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:231-234, 1983.
cromatografía de intercambio aniónico. Estos autores con- Levinson, B.; K. Kasyan; S. Chiu; T. Curier; J. González: «Identification
firman que resulta de vital importancia la preparación of b-Exotoxin Production, Plasmids Encoding b-Exotoxin, and a New
previa de la muestra para la detección y cuantificación de Exotoxin in Bacillus thuringiensis by Using High Performance Liquid
Chromatographic», J. Bacteriol. 172:3172-3179, 1990.
este metabolito, e indican que una alternativa promisoria
sería la utilización de detección fluorescente en lugar de Márquez, María E.; Orietta Fernández-Larrea; Lérida Almaguel: «Pro-
ducción y evaluación de cultivos de Bacillus thuringiensis (Berliner)
absorción UV, lo que incrementaría ampliamente la sensi- con efecto acaricida sobre P. latus (Banks.) (Acarina: Tarso-
bilidad y la selectividad de la determinación. nemidae)», Fitosanidad. 3 (3):53-58, 1999.
Márquez, María E.: «Actividad nematicida de cepas de Bacillus
thuringiensis para el control de Meloidogyne incognita en Cuba»
CONCLUSIONES Tesis en opción al título académico de Maestro en Microbiología Ge-
neral, Universidad de La Habana, 2003.
• Se detectó la presencia de β-exotoxina en las cepas
LBT9 y LBT47 a concentraciones de 34 µg.mL–1 y Oehler, D.; R. Gingrich; M. Haufler: «High Performance Liquid
Chromatographic Determination of b-Exotoxin Produced by the Bacterium
4,5 µg.mL–1 respectivamente. Bacillus thuringiensis», J. of Agric. Food Chem. 30:407-408, 1982.

fitosanidad/259
260/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DIAGNÓSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOS


DE CULTIVOS FRUTALES

Raúl Hernández Hernández1, Gladis del Vallín2 y Doris Hernández2


1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, rhernandez@inisav.cu
2
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11300

RESUMEN ABSTRACT
Se diagnosticaron campos agrícolas en fase de presiembra para Pre sowing agricultural fields which were planted with fruits as
conocer los principales géneros de nematodos en suelos previamen- pineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.),
te sembrados de piña (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), man-
papaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea ame- go (Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from four
ricana Lin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.) provinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, were
de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego de nematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodes
Ávila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Para main genera. Motile nematodes extraction was achieved by using
la extracción de los nematodos móviles se utilizó el método de Baermann method, while root-knot nematodes soil infestation was
Baermann, mientras el índice de infestación del suelo con el nematodo valorised with indicator plant test and farmers contribution. Different
de las agallas se valoró mediante la prueba de la planta indicadora population densities of plant-parasites nematodes were detected in
con la contribución de los agricultores. En todas las muestras de all soil and roots samples. Most frequently nematodes were
suelo y raíces se observaron nematodos parásitos de plantas con Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%),
diversos niveles de densidad de población. Los géneros detectados Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soils
con mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylen- before cultivated with guava showed the highest nematode population.
chulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) y
Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helico-
Pratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de población
tylenchus, guava, pineapple
se correspondieron con los suelos que anteriormente habían sido
cultivados con guayaba.
Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,
Pratylenchus, guayaba, piña

INTRODUCCIÓN
En la agricultura cubana actual se incrementa el fo- encima de los niveles que causan daño económico. Por
mento y la diversificación de frutales, pero para lograr esa razón el análisis de laboratorio y campo proporcio-
cosechas productivas y consistentes es necesario enfren- na la ventaja de realizar tratamientos al suelo con un
tarse a las plagas desde el vivero o ya en la plantación. ahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling y
Entre ellas se encuentran los nematodos parásitos que Kopittke, 2000]. Además de lo señalado, se deben te-
pueden ocasionar pérdidas de rendimiento entre 10 y ner en cuenta otros aspectos como la topografía y el
30% en los cultivos susceptibles [Fernández, 1991; drenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y la
INIFAP, 2002]. capacitación de los agricultores.
El fruticultor debe valerse del diagnóstico nematológico El presente trabajo muestra la situación nematológica
para conocer el tipo y la cantidad de nematodos en el de diversos campos de producción de frutales, lo que
suelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar me- permite facilitar la aplicación del manejo preventivo de
didas preemergentes cuando se detectan poblaciones por nematodos en los campos evaluados.

fitosanidad/261
Hernández y otros

MATERIALES Y MÉTODOS La extracción de los estadios móviles de nematodos


se realizó de acuerdo con el método de Baermann.
Se realizó un diagnóstico de nematodos en presiembra
Se procesaron 18 muestras de 50 g cada una, y los
en suelos que previamente estuvieron sembrados con
nematodos se recuperaron en viales de 15 mL, y
guayabo, en fincas de los municipios de Alquízar y
para la identificación de los géneros se realizaron
Bejucal en la provincia de La Habana; con mango y
observaciones al microscopio estereoscopio de acuer-
aguacate en el municipio de La Lisa, de Ciudad de La
do con las claves taxonómicas [Siddiqi, 2000]. In-
Habana; con piña en Ciego de Ávila, en la propia pro-
mediatamente después se realizó el conteo con un
vincia; con papayo en Jagüey Grande, en Matanzas, y
contador manual y se calculó el promedio de ejem-
con uva en el municipio especial de Isla de la Juventud.
plares por muestra.
Para la evaluación se establecieron parcelas entre 0,5 y
En las muestras de suelo colocadas en bolsas o mace-
1,0 ha/campo, y en sus diagonales se tomaron porcio-
tas se sembraron tres semillas pregerminadas de ca-
nes de suelo de un perfil entre 6 y 30 cm de profundi-
labaza (Cucurbita moschata Lin.) o pepino (Cucumis
dad, con una piocha o pico, y siempre se desechó el sue-
sativus Lin.), a razón de tres bolsas o macetas por
lo de los primeros 5 cm; el número de muestras para
muestra de suelo o materia orgánica, y se colocaron
cada parcela se determinó a partir del producto del va-
sobre una superficie separada del suelo, a fin de evi-
lor del área por 50, con aproximación por exceso, de
tar la contaminación por contacto con el suelo. Las
acuerdo con la metodología establecida por Fernández
plantas se regaron e inspeccionaron periódicamente
(1991). En los puntos donde existía vegetación se ex-
durante 35 días de cultivo (en el verano) o 45 (en el
trajeron entre 100 y 300 g de raíces que aún no estuvie-
invierno); luego se extrajeron con sumo cuidado para
ran muertas, marchitas o con ataques de otros pató-
evitar que se partieran las raíces. La presencia de
genos, conjuntamente con el suelo.
nematodos se determinó mediante inspección visual
Las muestras se depositaron en una o varias bolsas de de acuerdo con una escala de seis grados [Zeck, 1971;
polietileno negro identificadas por área, campo, locali- Püntener, 1981]. A cada planta indicadora se le asig-
dad, provincia, cultivo, variedad, fecha de siembra o nó un grado entre 0 y 5 (Tabla 1), y se calculó el pro-
cosecha, cultivo y variedad anterior, fecha del muestreo medio del grado de agallamiento o índice de agallas
y técnico colector. del total de plantas evaluadas.

Tabla 1. Descripción de las raíces de acuerdo con el grado de infestación


con Meloidogyne spp.
Grado Descripción
0 Raíces sin agallas
1 Pequeñas agallas difíciles de descubrir o distribuidas por todas las raíces
2 Desde numerosas agallas pequeñas distribuidas en las raíces (algunas pueden
estar encadenadas entre sí) hasta numerosas agallas de mayor tamaño
3 Agallas presentes en 25-50% de las raíces contaminadas
4 Desde 75% de las raíces con agallas semejantes a tumoraciones, hasta la raíz
casi totalmente contaminada (aún la planta conserva su aspecto verde)
5 Desde la raíz casi totalmente contaminada y reducida (la planta muestra
síntomas del daño) hasta el deterioro total por la muerte

Se calculó la frecuencia de aparición de los nematodos RESULTADOS Y DISCUSIÓN


por la división de la cantidad de muestras por género
En todas las áreas diagnosticadas se detectaron
detectado entre el total de muestras evaluadas expre-
nematodos parásitos de plantas con diversos niveles de
sado en porciento.

262/fitosanidad
Diagnóstico de fitonematodos...

densidad de población, que en la mayoría fueron bajos de La Habana previamente sembrados de guayaba los
o moderados, aunque en las muestras correspondien- niveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Ta-
tes a los campos de Bejucal y Alquízar de la provincia bla 2).

Figura 1. Frecuencia de aparición de los diferentes géneros de nematodos en cultivos frutícolas.

El análisis de laboratorio reveló que en los campos de se emplean posturas contaminadas, pues la alimenta-
frutales en fase de presiembra los géneros más frecuen- ción y reproducción del nematodo tiene lugar desde el
tes fueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estu- mismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase de
vieron presentes en todos los cultivos en algunas de sus vivero. En este trabajo se observó una tendencia des-
estadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir la cendente del índice de agallamiento de Meloidogyne
existencia de una estrecha asociación entre estos orga- desde la máxima densidad de población hasta 240 J2/
nismos y los cultivos frutícolas. Estos resultados son 250 g de suelo, a partir de la cual no se presentó una
similares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990) infestación visible en raíces (Tabla 2).
en los estudios de biodiversidad nematológica. Los com- En las muestras de los suelos dedicados a la piña se
plejos formados por estos géneros pudieran represen- observaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne.
tar un peligro potencial, fundamentalmente para fru- Estos géneros de nematodos usualmente están asocia-
tales como el guayabo y la piña, debido a los daños que dos al cultivo con una incidencia negativa en el desa-
pueden causar en su sistema radical, que limitan sensi- rrollo de la planta y el rendimiento agrícola, por lo que
blemente la absorción de los nutrientes y por consi- es muy útil realizar el diagnóstico nematológico antes
guiente el desarrollo y la productividad. de la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI,
Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presen- 1989; Araya, 2006].
tes en las áreas agrícolas que anteriormente se cultiva-
ron con aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco se CONCLUSIONES
presentó en campos de papayo, y Patylenchus no se
• Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respecti-
detectó en campos de mango (Tabla 2).
vamente fueron los géneros de nematodos más fre-
En general las mayores poblaciones de nematodos se cuentes en las muestras de suelos de frutales en fase
apreciaron en los campos de guayabo, con predo- de presiembra.
minancia de Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cual • Los suelos procedentes del guayabo se distinguieron
coincide con Fernández (1991), quien aseveró que este notablemente por las elevadas densidades de pobla-
cultivo es un buen hospedero de ambas especies, y que ción de Meloidogyne en comparación con los de piña,
las pérdidas económicas que ocasionan estos nematodos uva, papayo, mango y aguacatero.
pueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jóvenes, según • Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron pre-
Suárez et al. (1998) con valores máximos entre 48 y 57% sentes en las áreas agrícolas anteriormente cultiva-
en plantaciones establecidas. Los daños incluso pue- das con aguacatero y uva, mientras el primero tam-
den ser aún mayores en la fase de producción, cuando poco estuvo en papayo y el segundo en mango.
fitosanidad/263
Hernández y otros

Tabla 2. Fauna de nematodos parásitos de los cultivos frutales detectados. Individuos


por 250 g de suelo
Municipio/ Unidad agrícola Cultivo Variedad Meloidogyne sp. Rotylenchu- Helicoty- Pratylen-
provincia precedente lus sp. lenchus sp. chus sp.
J2 M G J4 M
Alquízar/ Estación GuayaboEnana EEA 2756 4 25
La Habana Experimental 18-40
de Fruticultura 1305 2
620 1
305 0,3 100
Bejucal/ Finca Guayabo Enana EEA 240 0,3 50
La Habana La Milagrosa 18-40 130 0 15 5 15
110 0 10
100 0 40 35
La Lisa/ Finca Mango Super 70 0 10 5
Ciudad de La de Hayden
Habana autoconsumo Hyden 30 0 35 10 5
Aguacatero Catalina- 10 0 5
Govin
Ciego de Ávila/ Empresa Piña Española roja 160 10 0 110 20
Ciego de Ávila de la Piña 5 0 5
Cayena lisa 53 5 0 85 10 5
Jagüey Grande/ Estación Papayo Solosunrise 100 10 5
Matanzas Experimental Maradol 60 5 0 5 5
de Fruticultura
Isla de la Finca orgánica Uva Aramón 140 0
Juventud 90 0
30 0 200
J2: Larva infectiva del segundo estadio. M: Espécimen adulto macho.
G: Grado de infestación con agallas. J4: Hembra adulta joven infectiva.

REFERENCIAS
Araya, M.; Comunicación personal, 2006. Petit, P.: «Reconocimiento de nematodos fitoparásitos asociados a fru-
tales de importancia económica en Venezuela», Fitopatol. Venez.
Fernández, E. «Los nematodos del género Meloidogyne Goeldi en el 3(1):2-5, 1990.
cultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control». Tesis de
Doctorado en Ciencias Agrícolas, Instituto de Investigaciones de Püntener, W.: Manual para ensayos de campo de protección vegetal,
Sanidad Vegetal, La Habana, 1991. 2.a ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,
1981.
Gandoy, P.; J. Ortega: «Nematodos parásitos del cultivo de la piña en
Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed.,
Cuba y posibilidades de su control», Ciencias de la Agricultura
CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.
7:19-28, 1980.
Stirling, G. R.; R. Kopittke: «Sampling Procedures and Damage
INIFAP: «Control de nematodos fitoparásitos en piña. Ficha tecnológica
Thresholds for Root-Knot Nematode (Meloidogyne javanica) on
por sistema tecnológico», estado de Veracruz, México, 2002.
Pineapple», Aust. J. Exp. Agric. 40(7):1003-1010, 2000.
http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.
Suárez, H. Z.; L. C. Rosales; M. S. González: «Nematodos asociados a
html#sanidad. los frutales de importancia y su control. I: frutales perennes», Fonaiap
MINAGRI: Instructivo técnico para el cultivo de la piña, Departamento Divulga. 59:13-18, 1998.
Independiente de Frutales. Área No Cañera, Centro de Información y Zeck, W. M.: «El esquema de valoración del ataque de cecidios
Documentación Agropecuaria, La Habana, 1989. radicícolas», Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.

264/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN


MORFOMÉTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS
MITOSPÓRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROL
DE ESPECIES DE INSECTOS PLAGA

Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez


Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de
La Habana, CP 11600

RESUMEN ABSTRACT
Se realizó una prospección de hongos entomopatógenos a partir de A screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspect
especies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos de insect cadavers in crops of economical importance and soil samples
gran importancia económica y de muestras de suelo. De un total de was carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resulted
53 muestras se obtuvieron 17 útiles que correspondieron a 15 aisla- successful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.)
dos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinus Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhizium
Samson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predo- anisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolates
minio de aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del amplio was a consequence in part of the large amount of samples taken from
rango de hospedantes de esta especie fúngica y a la cantidad de Hypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganism
muestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei has been found as a very common pathogen as well as the broad host
(broca del café), donde este microorganismo es un patógeno muy range this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolate
habitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 mues- of fifteen different soil samples tested by insect bait method was
tras de suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patro- obtained. All the isolates recovered were stored in the Plant Health
nes. Todos los aislados se incorporaron a la Colección de Cepas de Research Institute (INISAV) Culture Collection being previously
Hongos Entomopatógenos del Instituto de Investigaciones de Sani- recorded in a datasheet with the micro and macro cultural
dad Vegetal (INISAV), donde se registraron sus características characteristics, origin and species name, for further research for a
macroculturales, microculturales, origen y especie a que pertene- potential use as biological control agents of insect pests.
cen, con el objetivo de conservarlos para futuros estudios como
agentes potenciales de biocontrol de insectos plaga. Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological con-
trol, pests
Palabras claves: hongos entomopatógenos, hongos mitospóricos, con-
trol biológico, plagas

INTRODUCCIÓN
Los hongos mitospóricos están catalogados como un nados en principio en cuanto a su virulencia. Los aisla-
grupo mundialmente reconocido de agentes microbianos dos que causan epizootias espectaculares, como es el
a usarse tanto en los programas de control biológico de caso de algunos de los géneros fúngicos imperfectos
plagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP). entomopatogénicos, son candidatos promisorios para
Esto es debido a su forma de actuar, que es por contac- usarse en el control de plagas, siempre y cuando logren
to directo con la cutícula del hospedero y por la dispo- clasificar sobre la base de otras características esencia-
nibilidad de tecnologías para producirlos masivamen- les como son un nivel de especificidad de hospedante
te. Algunos géneros además se pueden formular en estrecho, buena tolerancia a factores ambientales ad-
aceites y así aplicarse con técnicas de volumen ultrabajo versos, facilidad de producción, comportamiento en al-
[Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996]. macenaje adecuado y alta seguridad en mamíferos
[Bateman et al., 1996].
Está demostrado que para llegar a obtener un produc-
to altamente efectivo para controlar una especie plaga Clásicamente hay tres vías de enriquecer el número de
se debe partir de un amplio rango de aislados, seleccio- aislados fúngicos para utilizarse como candidatos en el

fitosanidad/265
Elósegui y otros

control biológico de plagas. La primera es mediante el Smith (1992). Para los individuos sospechosos de mico-
aislamiento del hongo a partir de artrópodos y sis se realizaron lavados con agua estéril y desinfecciones
nematodos micosados, la segunda a través de muestras con NaHClO a 0,5% durante 1 min. Seguidamente se
de suelo y por último directamente de las colecciones realizaron dos lavados por agua estéril y se colocaron en
de cultivo [Rhodes y Smith, 1992]. cámaras húmedas incubadas a 28ºC por 7-9 días. A par-
tir del segundo día se observaron, y en los individuos
Una vez aislado el agente es necesaria una correcta iden-
donde se detectó emersión de micelio se realizaron trans-
tificación. La identificación tradicional por medio de
ferencias bajo condiciones asépticas, con siembras por
las características morfológicas mantiene un peso rele-
agotamiento de acuerdo con el método ya mencionado.
vante, aunque se han introducido conceptos nuevos que
conllevan a algún tipo de marcador molecular que per- Para el aislamiento de hongos entomopatógenos con
mita, entre otras cosas, identificar al agente incluso Galleria mellonella se siguió el método de trampeo des-
después de su liberación [Bridge y Arora, 1998 citados crito por Zimmermann en 1986 [citado por Sun, 2002]
por Bieliková et al., 2002]. con algunas modificaciones para este trabajo. Las mues-
tras de suelo se obtuvieron a partir de la selección de
En Cuba, dentro de los hongos entomopatógenos están
una hectárea que fuese representativa de un agroeco-
autorizados a producirse masivamente solamente dos
sistema con registros de infecciones por hongos
cepas de Beauveria bassiana de las que una no es nati-
entomopatógenos en insectos plaga. Se tomaron cinco
va, y la otra es de Metarhizium anisopliae. Para el caso
puntos al azar y de cada punto se colectaron 10
de Lecanicillium lecanii (syn. Verticillium lecanii) se submuestras de 10 cm3 de suelo cada una. El material
cuenta con dos cepas en la producción, ambas foráneas. se colocó en bolsas oscuras y se homogenizaron en una
Por estas razones surge la necesidad de contar con ma- muestra única en el laboratorio. Se vertieron 6-10 g de
yor cantidad de aislados e introducir nuevos en la pro- suelo por placa Petri de 12 cm de diámetro y en cada
ducción, que tengan ventajas como controladores de una se colocó un individuo de Galleria mellonella o
determinadas plagas agrícolas con respecto a las que Corcyra cephalonica de primeros estadios larvales, como
ya se producen masivamente en el país. insectos cebo o trampeadores. Las placas se observa-
Los objetivos del trabajo fueron realizar aislamientos ron a partir del segundo día hasta el noveno, con movi-
de hongos patógenos a artrópodos (insectos), con énfa- miento diario. Si en este intervalo ocurría la muerte se
sis en especies plaga de relevancia económica, identifi- procedía a la desinfección superficial, incubación y ais-
carlos taxonómicamente e incorporarlos a la Colección lamiento del supuesto hongo de forma similar a lo ex-
de Hongos Entomopatógenos y Antagonistas del Ins- plicado en el párrafo anterior para los individuos sos-
tituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) pechosos de micosis.
para estudios posteriores. Las colonias obtenidas en placa se observaron al mi-
croscopio estereoscópico y se realizaron preparaciones
MATERIALES Y MÉTODOS al microscopio óptico que se compararon con las des-
cripciones de géneros hifomicetos de Carmichael et al.
En los Laboratorios Provinciales de Sanidad Vegetal (1980) y Barnett y Hunter (1998). En caso de pertene-
(LAPROSAV) y en el INISAV se recibieron muestras cer el individuo a un género patogénico de interés, se
que consistieron en individuos muertos pertenecientes a realizaba un subcultivo en medio agarizado y se regis-
la clase Insecta, sospechosos de micosis, según síntomas traba como un nuevo aislado de la colección; en caso
de momificación y/o mecanización, o con esporulación de contrario las muestras procesadas se destruían. La iden-
naturaleza fúngica en la superficie cuticular; también se
tificación del patógeno a nivel de especie se realizó con
recibieron muestras de suelo. Ambas muestras proce-
ayuda de las descripciones de especies de hongos
dían de zonas donde se habían observado epizootias y no
entomopatógenos del CMI, de acuerdo con las caracte-
aplicado productos a base de hongos entomopatógenos,
de acuerdo con registros históricos de campo. rísticas macro y microculturales [CMI, 1979].

Para el aislamiento del hongo, que ya estaba esporulado


sobre los individuos colectados, se realizaron siembras RESULTADOS Y DISCUSIÓN
en placas Petri de 9 cm de diámetro, por agotamiento Los aislados de hongos entomopatógenos obtenidos co-
en agar sabouraud dextrosa o agar papa dextrosa rrespondieron a los géneros Beauveria, Paecilomyces y
(PDA) o agar extracto de malta (MEA), en presencia de Metarhizium, a los que se les estudiaron sus caracterís-
antibióticos, según el método descrito por Rhodes y ticas macro y microculturales más notables (Tabla 1).

266/fitosanidad
Aislamiento, identificación y caracterización...

Tabla 1. Aislados de hongos entomopatógenos obtenidos. Principales características macro y microculturales


Aislado
Características Características
(número de Origen Identificación
macroculturales microculturales
registro de origen)
Bb-102 Metamasius Beauveria En PDA colonias al inicio Células conidiógenas muy típi-
hemipterus bassiana blancas afieltradas que con el cas de la especie, con bases glo-
ceriseus tiempo se tornan crema bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5
(coleóptero), polvorientas. Reverso amarillo (2,1 µm). Conidios hialinos,
Matanzas ligero globosos a subglobosos1,0-2,5
(1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7 µm)
Bb-103 Metamasius Beauveria En PDA colonias algodonosas Muy abundantes conidioforos
hemipterus bassiana y blancas al inicio que se con grupos densos de células
(coleóptero), tornan crema y polvorientas fialídicas. Células conidiógenas
Santiago con el tiempo. Reverso amarillo globosas unas y otras en forma
de Cuba ligero de botella con formas interme-
dias, 1,5-3,0 (2,7 µm) x 2,0-3,0
(22 µm). Conidios hialinos, a
veces con un ápice muy
definido, globosos a elipsoidales
1,5-3,0 (2,3 µm) x 1,5-3,0
(21 µm)
Bb-105 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas muy típi-
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se cas de la especie, con bases glo-
(coleóptero), tornan beis claro y ligeramente bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5
cafetal, zona polvorientas, según esporulan (2,2 µm). Conidios muy homo-
montañosa, con el tiempo. Reverso amarillo géneos, hialinos, globosos,
Granma ligero algunos subglobosos,
2,0-2,0 µm
Bb-106 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas globosas unas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se y otras en forma de botella con
(coleóptero), tornan crema claro y formas intermedias, 2,0-3,5
café, zona ligeramente polvorientas según (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).
montañosa, esporulan con el tiempo. Conidios hialinos, globosos a
Granma Algunos coremios. Reverso subglobosos1,5-2,0
amarillo ligero (1,9 µm)x1,0-2,0 (1,7µm)
Bb-107 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas globosas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se unas y otras en forma de botella
(coleóptero), tornan beis claro y ligeramente con formas intermedias, 2,0-3,5
café, zona polvorientas según esporulan (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).
montañosa, con el tiempo. Algunos Conidios hialinos, globosos a
Granma coremios Reverso amarillo subglobosos1,5-2,0 (1,9 µm) x
ligero 1,0-2,0 (1,7µm)
Bb-SP Spodoptera Beauveria En PDA colonias algodonosas Células conidiógenas muy
frugiperda bassiana y blancas al inicio que se típicas de la especie, con bases
(lepidóptero), tornan beis y ligeramente globosas, 2,0-3,0
maíz, polvorientas con el tiempo. (2,4 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).
Camagüey Reverso miel Conidios muy homogéneos, hia-
linos, globosos, algunos ligera-
mente subglobosos, 2,0-2,0 µm

fitosanidad/267
Elósegui y otros

Bb-200603 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas,


hampei bassiana son blancas y algodonosas y se predominan las de forma de bo-
(coleóptero), tornan beis y polvorientas tella, 3,0-4,0 (3,3 µm) x 3,0-2,0
café, zona según esporulan con el tiempo. (2,3 µm). Conidios variables,
montañosa, Reverso amarillo claro aunque predominan formas
Holguín elipsoidales, base apiculada en
ocasiones, hialinos, 2,0-3,0
(2,3 µm) x 2,0-3,0 (23 µm)
Bb-cepa2 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).
café, zona según esporulan con el tiempo. Conidios globosos a subglobo-
montañosa, Reverso amarillo pálido sos, hialinos, algunos apicu-
Santiago de lados, 2,0-2,5(2,2 µm) x 1,5-2,0
Cuba (1,8 µm)
Bb-cepa3 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
café, zona según esporulan con el tiempo. Conidios subglobosos a
montañosa, Reverso amarillo muy pálido ligeramente elipsoidales,
Santiago de predominando estos últimos,
Cuba hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0
Bb-cepa4 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se predominan las de forma de
(coleóptero), tornan beis claro y polvorientas botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0
café, zona según esporulan con el tiempo. (2,4 µm). Conidios, predominan
montañosa, Reverso amarillo pálido formas elipsoidales, algunos
Santiago de globosos a subglobosos,
Cuba hialinos, en ocasiones
apiculados, 2,0-3,0
(2,5 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm)
Bb-cepa5 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas, predominan
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3)
(coleóptero), tornan beis claro y polvorientas x 3,0-2,0 (2,5 µm). Conidios,
café, zona según esporulan con el tiempo. predominan formas elipsoidales
montañosa, Tendencia discreta a formar con ápice definido, algunos
Santiago de coremios. Reverso amarillo subglobosos, hialinos, 2,0-3,0
Cuba miel (2,6 µm) x 2,0
Bb-1234 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis medio y polvo- 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
café, Guamá, rientas según esporulan con el Conidios globosos a subglobosos
Santiago de tiempo. Tendencia a formar ligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 µm
Cuba coremios. Reverso amarillo
Bb-SIM Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas con bases
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se globosas, 2,0-3,0
(coleóptero), café, tornan beis pálido y polvorien- (2,1 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
Tercer Frente, tas según esporulan con el tiem- Conidios subglobosos a
Santiago de Cuba po. Reverso amarillo pálido ligeramente elípticos, hialinos,
2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) µm

268/fitosanidad
Aislamiento, identificación y caracterización...

Bb-SL Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas predo-
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se minan las de forma de botella
(coleóptero), tornan beis pálido y 3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 µm).
café, ligeramente polvorientas según Conidios subglobosos a
San Luis, esporulan con el tiempo. ligeramente elípticos y hasta
Santiago de Tendencia a formar coremios. elipsoidales, hialinos,2,0-3,0
Cuba Reverso amarillo pálido (2,3) x 2,0 µm
Bb-Inv Cylas Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas predominan
formicarius bassiana son blancas y algodonosas y se las de forma de botella, 3,0-4,0
(coleóptero), tornan beis pálido y (3,4) x 3,0-2,0 (2,8 µm). Conidios
boniato, ligeramente costrosas según ligeramente elípticos hasta
Camagüey esporulan con el tiempo. elipsoidales, ápice discreto,
Reverso amarillo pálido hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0
(1,6) µm
Bb-1212 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas con bases
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a
café, según esporulan con el tiempo. subglobosos, hialinos, 1,5-2,0
Los Llanos, Reverso amarillo (1,8) x 2,0µm
Guisa, Granma
Pl-01M2 Hypothenemus P aecilomyces Colonias en PDA al inicio Conidioforos solos o en grupos,
hampei, café, lilacinus blanco lanoso que se tornan forman sinemas con verticilos
Santiago de Cuba violeta grisácea con la edad y de hasta seis fiálides, con la
con micelio aéreo irregular. edad se tornan rugosos. Células
Reverso vináceo conidiógenas típicas, 7,0-13,0
(9,5 µm) x 1,5-3,0 (2,8 µm).
Conidios catenulados, gris-violeta
claro, elipsoidales a fusiformes,
algunos con un ápice, 1,5-3,0
(2,2 µm) x 1,5-3,0 (2,4 µm)
Ma-30 Muestra de Metarhizium Colonias en PDA blancas y Patrón conidioforo típico de la
suelo (insecto anisopliae algodonosas al inicio que se especie con verticilos de 2-3
trampa Galleria tornan amarillo verdoso y ramas cada uno, con tonos
mellonella), IPA finalmente verde olivo oscuro y verde olivo oscuro que aclara al
Villena, La costroso con zonas con micelio ápice.
Habana aéreo abundante blanquecino. Células conidiógenas 6,0-10,0
Reverso amarillo intenso (8,1 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm).
Conidios subhialinos a
ligeramente verdes, cilíndricos
a ligeramente elipsoidales,
5,0-8,5 (6,6 µm) x 2,0-3,0
(2,4 µm)

De un total de 53 muestras procesadas de las que 15 En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhizium
fueron de suelo de zonas donde se habían observado anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomy-
epizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los ais- ces lilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).
lados obtenidos solamente uno correspondió a una Este comportamiento se puede atribuir a la efectivi-
muestra de suelo, que fue obtenido por trampeo con dad del método de trampeo con insectos susceptibles,
larvas de Galleria mellonella (Fig. 1). donde se requiere de una cantidad de propágulos via-
Con respecto a las especies de interés detectadas se puede bles que garantice la infección, los que deben ser del
observar que hubo una predominancia de aislados per- orden de 104 unidades por insecto como mínimo según
tenecientes a la especie Beauveria bassiana (Balsamo) Bateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Se
Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2). sabe que el establecimiento de poblaciones de hongos

fitosanidad/269
Elósegui y otros

entomopatógenos en el suelo está determinado tanto metabolitos activos afecten la viabilidad de estos
por las propiedades físicas y químicas de cada suelo propágulos fúngicos deseados [Jenkins y Grzywacz,
como por las de la cepa fúngica en cuestión [Rhodes y 2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe una
Smith, 1992]. También existe la posibilidad de que los concentración alta de esporas viables del microorga-
microorganismos competidores con su producción de nismo de interés en el suelo

Figura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cámara húmeda infectado con el aislado Ma-30 de
Metarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco.

Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.

Sun (2002) logró 6,7% de éxito para Metarhizium y Galleria como uno de los más exitosos para detectar
10% de éxito para Beauveria en trampeos con el termite entomopatógenos en termites.
Coptotermes formosanus, a partir de 90 muestras origi- Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan también
nales de suelo, porcentajes superiores de éxito con res- el método de trampeo con Galleria en contacto con
pecto al procesamiento de termites muertos sospecho- muestras de suelo, porque fundamentalmente es el que
sos de micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citado lleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cor-
por Sun, 2002] se refiere al método de trampeo con to con un porcentaje de éxito alrededor de 75% para
270/fitosanidad
Aislamiento, identificación y caracterización...

aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos auto- leza. Por ello, colecciones de cultivo internacionalmente
res usaron 15 g de suelo aproximadamente por cada reconocidas cuentan con varios cientos de aislados de
individuo de Galleria y pusieron en contacto con el sue- estas tres especies como la Colección de Hongos
lo al insecto trampeador hasta 18 días; sin embargo, en Entomopatógenos para Investigaciones Agrícolas del
este trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo útil Departamento de Agricultura de Estados Unidos
por trampeo con Galleria, lo que representó 7% de éxi- (ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection)
to. Este comportamiento puede deberse a que la canti- y la Colección del IMI (International Mycological
dad de suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo en Institute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Bateman
contacto con este solo fue de nueve días, además de que et al., 1996]. En Cuba más del 85% de la Colección de
la cantidad de propágulos del hongo de interés presen- Hongos Entomopatógenos del INISAV está represen-
te en el suelo es muy variable y depende de condiciones tada por aislados de Beauveria y Metarhizium.
específicas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1). En relación con el aislamiento de Paecilomyces lilacinus
Un método más efectivo para obtener nuevos aislados obtenido de Hypothenemus hampei se sabe que este
de hongos es el aislamiento de colonias fúngicas únicas hongo se encuentra comúnmente en las crías de broca
(ufc) a partir de muestras de suelo por diluciones en laboratorio, donde es posible que las condiciones de
seriadas, según procedimiento detallado por Lecuona hacinamiento, la alta humedad relativa y la falta de
(1996). No obstante, es ampliamente aceptado que este desinfección de las cerezas favorezcan la invasión de esta
método es muy caro y se prefiere usar en el aislamiento especie para atacar a la broca, si bien en la planta de
y selección de especies bacterianas, como por ejemplo café en el campo no se ha encontrado [Posada et al.,
Bacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ahí 1998]. También es cierto que P. lilacinus está cataloga-
que se decidiera no emplearlo para enriquecer el núme- do como hongo entomopatógeno oportunista y se ha
ro de aislados de la Colección de Hongos Entomopa- usado exitosamente en el control de nematodos
tógenos del INISAV. fitopatógenos [López, 1995]. Por esta razón se decidió
incorporarlo a la Colección de Hongos Entomo-
El porcentaje de éxito obtenido en este trabajo para
patógenos del INISAV para futuras investigaciones.
las muestras de insectos sospechosos de micosis o con
una evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) plan- Los productos exitosos a base de hongos desarrollados
tean que aunque este método de aislamiento directo en el mercado han surgido a partir de un monitoreo de
conlleva mucho tiempo de muestreo en campo y expe- aislados obtenidos de las regiones geográficas y
riencia, la realidad es que entre los más exitosos agen- agroecosistemas, donde está el organismo plaga por
tes de control con microorganismos se encuentran controlar, así como de las colecciones de cultivos.
aquellos aislados obtenidos directamente de los insec- Bateman et al. (1996) reportaron la selección de una
tos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o de sola cepa de M. anisopliae, después de haber ensayado
métodos indirectos a través de medios de cultivo se- 159 aislados de Beauveria y Metarhizium contra
lectivos. Schistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto con-
firma la necesidad de contar con abundante cantidad
La frecuencia alta de aparición de Beauveria bassiana de aislados de los más diversos orígenes cuando se pre-
se debió al amplio rango de hospedantes de este pató- cisa obtener agentes microbianos efectivos como
geno, además de que la mayoría de los aislamientos se biocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996;
hicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca del Jenkins y Grzywacz, 2003].
café), y se conoce que esta especie fúngica regularmen-
te se ha encontrado que atacan las poblaciones del in- Como se puede apreciar, de acuerdo con las caracterís-
secto de forma natural en los cafetales. De hecho, es ticas macro y microculturales, para los aislados de
esta la razón de que sea uno de los entomopatógenos Beauveria existió una alta similitud, por lo que una
más estudiados para el control de esta plaga [Bustillo separación entre estos por los métodos tradicionales
et al., 1999]. morfométricos no es factible (Tabla 1). Para lograr la
distinción entre aislados hay que recurrir a métodos de
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. así como Metarhizium biología molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Brid-
anisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavoviride ge et al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al.,
Gams and Rozsypal están entre los hongos entomo- 2002]. Estos métodos moleculares también se usan como
patógenos más usualmente encontrados en la natura- una forma altamente reproducible de reconocer cada
fitosanidad/271
Elósegui y otros

aislado para patentar, registrar los productos y Bustillo, A.; M. Bernal; P. Benavides; B. Chaves: «Dynamics of Beauveria
bassiana and Metarhizium anisopliae Infecting Hypothenemus
monitorear tanto su destino en el ecosistema donde se hampei (Coleoptera: Scolytidae) Population Emerging from Fallen
libere como las posibles interacciones negativas que Coffee Berries», Fla. Entomol. 82:491-498, 1999.
puedan existir entre el aislado liberado y el resto de los Carmichael, J. W.; W. B. Kendrick; I. L. Connors; L. Sigler: Genera of
Hyphomycetes, Univ. Alberta Press, Edmonton, Canada, 1980.
aislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000;
Bielikova et al., 2002]. CMI: Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. The Cambrian
News, Commonwealth Agricultural Bureaux, Surrey, Inglaterra, 1979.
Finalmente todos los aislados de interés obtenidos se Dhoj, Y.; S. Keller; P. Nagel: «Pathogenicity of Entomopathogenic Fungi
incorporaron al banco de cepas de hongos entomo- to White Grubs of Maize Based Cropping System in Nepal.
Inauguraldissertation zur Erlangung der Würde eines Doktors der
patógenos, y en la base de datos de esa colección se re- Philosophie vorgelegt der Philosophisch-Naturwissenschaftlichen
gistraron las características macroculturales, micro- Fakultät der Universität Basel, June 2006, http://www.umad.de/
infos/cleanair13/pdf/full_348.pdf.
culturales, origen y especie a que pertenecen, con el
objetivo de conservarlos como agentes potenciales de Humber, R. A.: «Collection of Entomopathogenic Fungi Cultures, Catalo-
gue of Strains 1992», USDA Agricultural Research Service ARS-110,
biocontrol de insectos plaga para futuros estudios. Plant Portection Research Unit, Ithaca, New York, 1992.
Jackson, T. A.; S. B. Alves; R. M. Pereira: «Success in Biological Control
of Soil-Dwelling Insects by Pathogens and Nematodes», Biological
CONCLUSIONES Control: Measures of Success, Kluwer Academic Public Publishers,
Boston, EE.UU., 2000, pp. 271-296.
• Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos ento-
Jenkins, N. E.; D. Grzywacz: «Quality Control of Fungal and Viral
mopatógenos de los que uno fue de Metarhizium Biocontrol Agents-Assurance of Product Performance», Biocontrol
anisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el resto Science and Technology 10:753-777, 2000.

de Beauveria bassiana. ––––: «Towards the Standardization of Quality Control of Fungal and
Viral Biocontrol Agents», Quality Control and Production of Biological
• El método de aislamiento directo a partir de insec- Control Agents: Theory and Testing Procedures, CAB International,
tos micosados tuvo 42% de efectividad. 2003.
• El método de aislamiento a partir de muestras de Johnson, C.; A. H. Bishop: «A Technique for the Effective Enrichment
suelo de hongos entomopatógenos mediante trampeo and Isolation of Bacillus thuringiensis», FEMS Microbiology
Letters142:173-177, 1996.
con larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo,
Lecuona, R.: Microorganismos patógenos empleados en el control de
con 7% de éxito solamente. insectos plaga, Talleres Gráficos Mariano Mas, Buenos Aires, 1996.
López, Miriam: «Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson: caracteriza-
REFERENCIAS ción, reproducción y obtención de un biopreparado con efecto
nematicida». Tesis en opción al grado científico de Doctor en Cien-
Barnett, H. L.; B. B. Hunter: Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 4th cias Agrícolas, INISAV, La Habana, 1995.
Edition, The American Phytopahological Society Press, 1998.
Moore, D.; R. W. Caudwell: «Formulation of Entomopathogens for the
Bateman, R.; M. Carey; D. Moore; C. Prior: «The Enhanced Infectivity of Control of Grasshoppers and Locusts, Memoirs of the Entomological
Metarhizium flavoviride in Oil Formulations to Desert Locusts at Low Society of Canada 171:49-67, 1997.
Humidities», Annals of Applied Biology 122:145-52, 1993.
Posada, F. F.; M. P. Marín; S. M. Pérez: «Paecilomyces lilacinus, ene-
Bateman, R; M. Carey; D. Batt; C. Prior; Y. Abraham; D. Moore; N. E. migo natural de adultos de Hypothenemus hampei», Cenicafé (Co-
Jenkins; J. Fenlon: «Screening for Virulent Isolates of Entomopa- lombia): 49(1):72-77, 1998.
thogenic Fungi Against the Dessert Locust Schistocerca gregaria
(Forskal)», Biocontrol Science and Technology 6:549-60, 1996. Rhodes, D. J.; J. D. Smith: «Techniques for Quantifying the Ecological
and Pathological Characteristics of Entomopathogenic Fungal
Bieliková, L.; Z. Landa; L. S. Osborne; V. Èurn: «Characterization and Strains». Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-
Identification of Entomopathogenic and Mycoparasitic Fungi Using Pests and Diseases, 351-356, 1992
RAPD-PCR Technique», Plant Protection Science 38 (1):1-12, 2002.
Sun, Jianzhong: «Screening and Characterization of Pathogenic Fungi
Bridge, P. D.; M. A. J. Williams; C. Prior; R. R. M. Paterson: «Morphological, for Possible Control of Coptotermes formosanus». A Dissertation
Biochemical, and Molecular Characteristics of Metarhizium anisopliae Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University
and M. flavoviride», J. Gen. Microbiol.139:1163-1169, 1993. and Agricultural and Mechanical College in partial fulfilment of the
requirements for the degree of Doctor of Philosophy in The Department
Bridge, P. D.; D. K. Arora: «PCR for Species Definition», Applicatios of
of Entomology, May, 2002, http://etd.lsu.edu/docs/submitted/etd-
PCR in Mycology, CAB International, Wallingford, 1998, pp. 63-84.
0415102-230223/unrestricted/Sun_dis.pdf

272/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DISPERSIÓN, DISTRIBUCIÓN ACTUAL Y NUEVOS


RESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM
Ecología

(THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBA

Santiago F. Jiménez Jiménez,1 Liuva Pérez López,2 Martha Toro,3 Criseida Granda,4 Amelia Mateo,5
Héctor Sariol,6 Elisa Rodríguez,7 Rodney Pérez,8 Roquelina Jiménez,9 Ángel Pérez-Alejo10 y Ransés
Vázquez11
1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu
2
Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana
3
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2½, Guantánamo
4
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba
5
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongación de Carbó 40, Alturas de Perera y calle
Holguín, Holguín.
6
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Santiago de Cuba Km 3½, Bayamo,
Granma
7
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diéguez y Antonio Barrera,
Las Tunas, CP 75200.
8
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación
Norte, Camagüey
9
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos
10
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2½, Santa Clara, Villa Clara
11
Instituto de Meteorología. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700

RESUMEN ABSTRACT
Durante el período 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentes Samplings in different provinces of Cuba were carried out during the
provincias de Cuba que permitieron actualizar la situación de F. period 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei in
schultzei en relación con el grado de dispersión logrado por la espe- relation with the dispersion grade achieved by the species, as well as
cie, así como las plantas que le sirven de reservorios y su distribu- the plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presence
ción. Se detectó la presencia de esta especie de trips en la mayoría of this trips species was detected in most of the provinces and it was
de las provincias del país, y se reconoció que su mayor distribución recognized that its biggest distribution is reached in the oriental
la alcanza en la región oriental, especialmente en Camagüey, Granma, region, especially in Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cuba
Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. Las especies botánicas and Guantánamo. Botanical species on those F. schultzei was detected
sobre los que se detectó F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de las reached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time for
cuales 84 se informan por primera vez para el país. No obstante, el the country. Nevertheless, the insect was only detected in a majority
insecto se detectó de forma mayoritaria solamente sobre 24 espe- way on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals.
cies de plantas, básicamente vegetales, hortalizas y ornamentales. The biggest number of detections corresponded to different colours
El mayor número de detecciones correspondió a las rosas de dife- roses, and a considerable number of them on quimbombó (lady’s
rentes colores, y se realizó también un número considerable de ellas fingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations,
sobre quimbombó, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca, pumpkin, carolá, eggplant and kidney beans, what points out to the
tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena y habichuelas, lo que preferences of F. schultzei. Keeping in mind the possibility to be
apunta a las preferencias de F. schultzei. Debido a la posibilidad de infected with tospovirus that present some of these species of plants
infectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especies and given the vector capacity of these patogens –demonstrated by
de plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos –demos- this thrips in numerous countries, including some of our hemisphere–, it
trada por este trips en numerosos países, incluidos algunos de este is considered they possess the biggest danger potential to be affected
hemisferio–, se considera que son ellas las que actualmente poseen by this viral group at the moment.
el mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermeda-
des virales. Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thrips

Palabras claves: distribución, Frankliniella schultzei, reservorios,


trips

fitosanidad/273
Jiménez y otros

INTRODUCCIÓN muestreos efectuados en las diferentes provincias del


país, en los que se realizó la inspección local de áreas
Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:
sembradas con plantas ornamentales (jardines domés-
Thripidae) es una especie de trips que, además de
ticos, jardines botánicos, jardines de instalaciones vin-
fitófago, se incluye entre las confirmadas como vectores culadas al turismo y otros); áreas productoras de cul-
de tospovirus [Mound, 2002], razón que la convierte en tivos en empresas y cooperativas agrícolas; semilleros
un insecto plaga doblemente peligroso. y viveros; áreas de floricultura; huertos intensivos,
Según Vierbergen y Mantel, 1991 [citados por organopónicos y cultivos protegidos y áreas citrícolas.
Kormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en los En la primera etapa, que comprendió del 2001 al 2003,
trópicos, extendida a lo largo de África, Asia, Austra- los muestreos mensuales se realizaron en el período com-
lia, Caribe, Pacífico y América del Sur. También se in- prendido entre septiembre y marzo, y se tomó una
forma en la Florida y en zonas de clima templado (in- muestra compuesta por no menos de 10 especies botá-
troducida) como Gran Bretaña, Italia y Países Bajos. nicas por provincia. En la segunda etapa, entre el 2004
Palmer et al. (1992) le atribuyen hábitos polífagos (flo- y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo de
res), y la informan en ají chile, algodón, compuestas, todo el año, y en cada inspección mensual se observa-
cebolla, sorgo y tomate, entre otras. ron no menos de 20 especies botánicas.
En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informe En los dos períodos se revisaron vegetales, hortalizas,
de la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscu- viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestras
ra sobre los cultivos de papa y tomate. Posteriormente estuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas y
Pérez et al. (2004) confirmaron su presencia y la infor- flores, según el caso. Cada una de ellas, después de co-
maron sobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumis lectada, se introdujo de modo independiente en bolsas
sativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refie- plásticas que se identificaron de acuerdo con el sitio de
ren a muestras colectadas en provincias de la zona occi- procedencia y la fecha de muestreo.
dental del país (La Habana y Ciudad de La Habana), y
mencionan una baja intensidad de la especie. El material vegetal con los trips se revisó en las Esta-
ciones Territoriales de Protección de Plantas (ETPP)
La forma oscura de F. schultzei está reconocida como de las diferentes provincias, con la finalidad de extraer
vector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted Wilt de cada muestra los especímenes presentes e introdu-
Virus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969; cirlos en viales con alcohol al 70%, en los que se anotó,
Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus para cada caso, el hospedante, el sitio de procedencia
(TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkamp de la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posterior-
et al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus mente los viales se enviaron a los Laboratorios Provin-
(CSNV) [Nagata y de Ávila, 2000]. Esta forma oscura ciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su iden-
está extendida a lo largo de América del Sur y se indica tificación y/o al Laboratorio Central de Cuarentena
como un vector importante de tospovirus en Brasil (De para su identificación y/o confirmación, según corres-
Ávila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001]. pondiera. Para la ejecución del diagnóstico se utiliza-
Más recientemente Sakurai (2004) demostró también que ron las claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo
la forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay, (1996), Rodríguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).
puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser un En la mapificación de las muestras con detecciones de
vector importante del virus en los campos de tomate. F. schultzei se utilizó el Sistema de Cuadrantes
Este trabajo se realizó como una contribución al cono- Cartográficos [CNSV, 1997], según su versión digita-
cimiento del grado de dispersión, la distribución actual lizada [Vázquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realizó
y la diversidad de hospedantes que posee F. schultzei en estrecha relación con la encuesta nacional de espe-
en Cuba, dado el peligro potencial que representa esta cies peligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacio-
especie, más que como fitófago, como vector de enfer- nal de Sanidad Vegetal.
medades virales, particularmente de tospovirus.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS Durante el período comprendido entre el 2001 y el 2003,
El trabajo se llevó a cabo en dos etapas durante el pe- de un total de 4818 muestras positivas para trips, solo
ríodo comprendido entre los años 2001-2006, y mediante se identificó F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,

274/fitosanidad
Dispersión, distribución actual...

y estas correspondieron al último año de ese trienio. Del total de las muestras obtenidas en el período com-
Procedían fundamentalmente de las provincias de prendido entre el 2004 y el 2006 se realizaron 313
Guantánamo y Holguín, en el oriente de Cuba (Tabla 1). detecciones de F. schultzei, lo que demostró un nota-
Este resultado constituyó la primera evidencia del co- ble incremento respecto al período precedente, así como
mienzo de la dispersión de la especie, cuya presencia en una mayor distribución por diferentes provincias del
el país, hasta ese momento, se limitaba a las provincias país (Tabla 1), con la mayor abundancia en la región
habaneras [Suris et al., 2001]. oriental.

Tabla 1. Dispersión de F. schultzei en el país (período 2001-2006)


Período I Período II
Provincias
2001 2002 2003 2004 2005 2006
Pinar del Río 0 0 0 0 0 1
La Habana 0 0 0 0 0 13
Ciudad de La Habana 0 0 0 0 0 6
Matanzas 0 0 0 0 0 2
Villa Clara 0 0 1 0 0 0
Cienfuegos 0 0 0 0 0 4
Sancti Spíritus 0 0 0 0 0 0
Ciego de Ávila 0 0 0 0 0 0
Camagüey 0 0 0 0 24 0
Las Tunas 0 0 0 1 0 0
Granma 0 0 2 4 8 2
Holguín 0 0 9 7 48 14
Santiago de Cuba 0 0 0 16 50 54
Guantánamo 0 0 21 37 22 0
Total 0 0 33 65 152 96

La ubicación de las muestras según el sistema de cua- La mayor preferencia de F. schultzei, según la frecuen-
drantes cartográficos permite visualizar el grado de cia de detección registrada, se muestra en la Tabla 3,
dispersión alcanzado por F. schultzei a lo largo del país donde se relacionan las 24 especies de plantas sobre las
en el curso de los años que comprendió el trabajo. En cuales la especie se detectó en un número de muestras
el mapa se aprecia que la especie se distribuye mayor- mayor o igual a cuatro. Entre ellas se incluyen funda-
mente en las provincias de la región oriental de Cuba, mentalmente vegetales, hortalizas y ornamentales. De
básicamente Camagüey, Granma, Holguín, Santiago todas las referidas, el mayor número de detecciones se
de Cuba y Guantánamo, donde se localiza la mayor produjo sobre quimbombó (7), abrojo y margaritas
cantidad de cuadrantes en los que se ha detectado la japonesas (8), lirios (9), espinaca (11), tomate (12),
presencia de la especie (Fig. 1). claveles (13), calabaza (15), carolá y berenjena (16),
habichuela (19), y entre todas se destacaron las rosas
En relación con los reservorios de F. schultzei, du- de diferentes colores con 42 detecciones en cinco pro-
rante el estudio se detectó la presencia del insecto en vincias del país.
93 especies botánicas, de las cuales ocho ya habían
En consideración a la posibilidad de infectarse con
sido informadas anteriormente: Lycopersicum lyco-
tospovirus que presentan algunas de estas especies de
persici Mill. [Surís et al., 2001], Vigna sesquipedalis
plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos
F. (habichuela), Cucumis sativus L. [Pérez et al.,
demostrada por F. schultzei en numerosos países y bá-
2004], Allium sativum L., Beta vulgaris L., Capsicum sicamente en este hemisferio norte [De Ávila et al., 1998;
annum L., Portulaca oleracea L. y Argemone mexica- Williams et al., 2001; Sakurai, 2004], se considera que
na L. [González y Surís, 2005]. Esto significa que se en Cuba son ellas las que, actualmente, poseen el ma-
informan 85 nuevos reservorios de la especie para el yor peligro potencial de resultar afectadas por dichas
país (Tabla 2). enfermedades virales.

fitosanidad/275
Jiménez y otros

Tabla 2. Relación de especies de plantas encontradas como nuevos


reservorios de F. schultzei en Cuba
Nombre científico Nombre común
Acalypha sp. Rabo de gato
Allamanda cathartica Lin. Alamanda
Allium cepa Lin. Cebolla
Allium schoenoprassum Lin. Cebollino
Althaea rosea Car. Varita de San José
Amaranthus spinosus, Lin. Bledo espinoso
Angelonia cubensis Robinson Nomeolvides malva
Argyreia nervosa Boj. Cordón de seda
Bastardia viscosa (L.) Malva bruja
Begonia sp. Begonia
Benincasa hispida Cong. Calabaza china
Beta vulgaris L. var. cicla Acelga
Bidens pilosa L. Romerillo
Cajanus indicus Spreg Frijol guandul
Calendula officinalis Lin. Marigol
Callotropis procera (Ait.) R. Br. Algodón de seda
Capsicum frutescens L. Ají
Cassia fistula Cañandonga
Cestrum nocturnum Lin. Galán de noche
Citrullus vulgaris Schrad. Melón
Codiaeum variegatum Blume. Croton
Crinum sp. Lirio flor
Cucurbita pepo L. Calabaza
Dahlia coccinea Cav. Dalia malva
Datura metel L. Clarín
Daucus carota sativa D. C. Zanahoria
Dianthus caryophyllus L. Clavel
Gardenia jasminoides Ellis Jazmín del cabo (gardenia)
Gerbera jamesonii Hort. Margarita japonesa
Gliricidia sepium L. Júpiter
Gossypium hirsutum L. Algodón
Helianthus annuus Lin. Girasol
Helychrysum bracteatum Andr. Siempreviva
Hibiscus esculentus L. Quimbombó
Hibiscus rosa-sinensis Lin. Marpacífico
Hibiscus sp. Hibiscus, Marpacífico
Tabla 3. Especies botánicas sobre las que se detectó F. schultzei en cuatro o más ocasiones y procedencia
de las muestras
Nombre común Nombre científico Procedencia
Cebolla A. cepa Guantánamo
Acelga B. vulgaris var. cicla Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Romerillo B. pilosa Ciudad de La Habana, Holguín, Guantánamo
Melón C. vulgaris Holguín
Lirio flor Crinum sp. Santiago de Cuba
Pepino C. sativus Holguín, Guantánamo
Calabaza C. pepo Camagüey, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

276/fitosanidad
Dispersión, distribución actual...

Dalia D. coccinea Granma, Santiago de Cuba


Clavel D. caryophyllus La Habana, Holguín
Margarita japonesa G. jamesonii Cienfuegos, Camagüey, Santiago de Cuba
Quimbombo H. esculentus Holguín, Guantánamo
Marpacífico H. rosa-sinensis Matanzas, Camagüey, Santiago de Cuba
Jazmín Jasminum sp. Holguín, Santiago de Cuba
Lechuga L. sativa Ciudad de La Habana, Holguín, Santiago de Cuba
Tomate L. lycopercisi Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Frijol Phaseolus sp. Holguín, Guantánamo
Rosa Rosa sp. Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba,
Guantánamo
Berenjena S. melongena Santiago de Cuba, Guantánamo
Espinaca S. oleracea Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Carolá T. erecta Pinar del Río, La Habana, Santiago de Cuba, Guantánamo
Copetúa T. patula Holguín
Abrojo terrestre T. cistoides Santiago de Cuba
Habichuela V. sesquipedalis Villa Clara, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Vicaria V. rosea Santiago de Cuba

Figura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de F. schultzei en Cuba según la ubicación geográfica de sus reservorios (2001-2006).

CONCLUSIONES
• F. schultzei se dispersó a lo largo de Cuba entre el las cuales quimbombó, abrojo, margaritas japone-
2001 y el 2006, y diversificó sus reservorios hasta sas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá,
alcanzar la cifra de 92 especies botánicas. berenjena, habichuela y especialmente las rosas re-
• La más amplia distribución de la especie se registró sultan preferidas por el insecto.
en los territorios de las provincias de Camagüey,
Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. REFERENCIAS
• Se informan 84 especies de plantas que constituyen CNSV: «Vigilancia fitosanitaria por cuadrantes cartográficos», Centro Nacio-
nuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entre nal de Sanidad Vegetal, Ministerio de la Agricultura, La Habana, 1997.

fitosanidad/277
Jiménez y otros
De Ávila, A. C.; L. Pozzer; I. Bezerra; R. Kormelink; M. Prins; D. Peters; Rodríguez, E.; L. L. Vázquez; Isabel Pérez; H. Sariol; S. Fernández; D.
T. Nagata; E. W. Kitajima; R. de O. Resende: «Diversity of tospoviruses Plá; María de los A. Rodríguez; J. Cortiñas: «Diagnóstico de los in-
in Brazil», Recent Progress in Tospovirus and Thrips Research (D. sectos de los géneros Thrips y Frankliniella (Tfysanoptera:
Peters and R. Goldbach, eds.), Wageningen Agricultural University, Thripidae) que inciden en plantas cultivadas en Cuba», Memorias del
Wageningen, Netherlands, 1998, pp. 32-34. IV Simposio de Zoología, La Habana, 1997.
González, C.; Moraima Suris: «New Reservoirs of Frankliniella Sakimura, K.: «A Comment on the Color Forms of Frankliniella schultzei
schultzei Trybom and Heliothips haemorrhoidalis Bouché in Cuba», (Thysanoptera: Thripidae) in Relation to Transmission of the Tomato-
Rev. Protección Vegetal 20 (1):71, 2005. Spotted Wilt Virus», Pacific Insects 11:761-762, 1969.
Kormelink, K.; D. Peters; R. Goldbach: «Tospovirus genus. Figuras». Sakurai, T.: «Transmission of Tomato Spotted Wilt Virus by the Dark
Accesible en http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno Form of Frankliniella schultzei (Thysanoptera: Thripidae) Originating
=363. in Tomato Fields in Paraguay», Applied Entomology and Zoology 39
(1):189-194, 2004.
Mound, L. A.; Rita Marullo: «The Thrips of Central and South America:
an Introduction (Insecta: Thysanoptera)», Memoirs on Entomology Samuel, G.; J. G. Bald; H. A. Pittman: «Investigations on «Spotted Wilt»
International, vol. 6, Associated Publishers, 1996. of Tomatoes in Australia», Commonw. Aust. Counc. Sci. and Ind.
Res. Bull. 44:8-11, 1930.
Mound, L. A.; G. Kibby: Thysanoptera. An Identification Guide, 2th. ed.,
CAB International, 1998. Surís, Moraima; María de los A. Martínez; H. Rodríguez: «Identificación
de nuevas especies de Frankliniella para Cuba», Memorias del IV
Mound, L. A.: «So Many Thrips–So Few Tospoviruses?, Thrips and Seminario Internacional de Sanidad Vegetal, 10-15 junio, Varadero,
Tospoviruses: Proceedings of the 7th International Symposium on Cuba, 2001.
Thysanoptera (R. Marullo and L. Mound eds.), Australian National
Insect Collection, Canberra, 2002, pp. 15-18. Vázquez, R.; E. Pérez; T. Puente: «Sistema cartográfico digital por
cuadrantes geográficos para la salud agropecuaria», Memorias del
Nagata, T.; A. C. de Ávila: «Transmission Of Chrysanthemum Stem X Congreso Latinoamericano e Ibérico de Meteorología II Congreso
Necrosis Virus, a Recently Discovered Tospovirus, by Thrips Cubano de Meteorología, 3-7 de marzo, La Habana, 2003.
Species», J. Phytopathol. 148:123-125, 2000.
Wijkamp, I.; N. Almarza; R. Goldbach; D. Peters: «Distinct Levels of
Palmer, M.; D. Heaume: Guides to Insects of Importance to Man, CAB Specificity in Thrips-Transmission of Tospoviruses», Phytopathology
International, Institute of Entomology, 1992. 85:1069-1074, 1995.
Pérez, Isabel; E. Blanco; Matilde Rodríguez: «Especies del género Williams, L. V.; P. M. L. Lambertini; K. Shohara; E. B. Biderbost:
Frankliniella Karny en Cuba. Resultados de la encuesta de detec- «Occurrence and Geographical Distribution of Tospovirus Species
ción de especies peligrosas de trips en el período 1998-2000», Infecting Tomato Crops in Argentina», Plant Dis. 85:1227-1229, 2001.
Fitosanidad 8(3):19-23, 2004.

278/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

VARIABILIDAD DE LAS ISOENZIMAS ESTERASAS DE BEAUVERIA


BASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN

María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez


Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar. Carretera CAI Manuel Martínez Prieto
Km 2½, Boyeros, Ciudad de La Habana, CP 19390, fax: (53-7) 260 2571, meem@inica.edu.cu

RESUMEN ABSTRACT
Se determinó la variabilidad de las isoenzimas esterasas del Isoenzyme esterases variability of hyphomycete fungus Beauveria
hifomiceto entomopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin bassiana (Balsamo) Vuillemin was determinated by means vertical
mediante electroforesis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Se electrophoresis on 8.5% polyacrylamide gel. Twenty one isolates from
analizaron los zimogramas de 21 aislamientos de diferentes oríge- different geographical and entomology origin groups were analyzed.
nes geográficos y entomológicos. A partir de la matriz de los datos Starting from the matrix of the original data the genetic distance was
originales se calculó la distancia genética y se realizó el análisis de calculated. The analysis of individuals cluster was carried out by
agrupamiento de los individuos mediante el método de los promedios means of the unweighted pair–group method, arithmetic average. The
de las distancias no ponderadas. La presencia de 24 bandas diferen- presence of 24 differential bands and six groups of molecular diversity
ciales y de seis grupos de diversidad molecular evidenciaron la va- evidenced the genetic variability of B. bassiana for the studied
riabilidad genética de B. bassiana para el sistema enzimático estu- enzymatic system.
diado.
Keys words: Beauveria bassiana, variability, esterases, Diatraea
Palabras claves: Beauveria bassiana, variabilidad, esterasas, Diatraea saccharalis, sugar cane
saccharalis, caña de azúcar

INTRODUCCIÓN
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hi- ser identificados luego de su aplicación en el agroe-
fomiceto entomopatógeno ampliamente utilizado en la cosistema cañero. En este sentido en el presente tra-
lucha biológica contra los insectos plaga de los cultivos bajo se determina la variabilidad de las isoenzimas
agrícolas [Moino et al., 2002; Sáenz de Cabezón et al., esterasas de B. bassiana, sistema enzimático repor-
2003; Estrada et al., 2004; Kauffman et al., 2005]. En tado polimorfo para esta especie [Fernandes et al.,
Cuba se utiliza para disminuir las poblaciones larvales 2006].
de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), ba-
rrenador de la caña de azúcar (Saccharum sp. híbrido). MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio de las isoenzimas esterasas contribuye al Se analizaron 21 aislamientos (Tabla 1) de B. bassiana,
conocimiento de la variabilidad genética de diferen- los cuales se cultivaron en 50 mL de medio de cultivo
tes especies entomopatógenas [Estrada et al., 1997; estático Adamek (1965) e incubados a 25oC durante
Bruce et al., 2003]. Este análisis permite establecer siete días.
diferencias no detectables desde el punto de vista
El micelio obtenido se pesó húmedo y seco, después de
morfológico.
filtrarlo por papel Filtrak 390 y llevarlo a sequedad a
El interés agronómico y ecológico de las aplicaciones de temperatura ambiente durante tres días. Un gramo del
B. bassiana en el cultivo de la caña de azúcar precisa secado se maceró con tampón fosfato a pH = 6,5 con
conocer las diferencias isoenzimáticas entre los aisla- sacarosa a 20% en una proporción de 1:3. El macerado
mientos del hifomiceto, de forma tal que estos puedan se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.

fitosanidad/279
Estrada y Piñón

Tabla 1. Relación de los aislamientos de Beauveria bassiana


(Bals.) Vuill. utilizados en el trabajo
Aislamientos País de origen Hospedante de origen
1 Cuba Diatraea saccharalis
2 Cuba Diatraea saccharalis
3 Cuba Diatraea saccharalis
4 Cuba Diatraea saccharalis
5 Francia Leptinotarsa decemlineata
6 Cuba Diatraea saccharalis
7 Guadalupe Insecta
8 Estados Unidos Artiples flloridus
9 Cuba Diatraea saccharalis
10 Cuba Diatraea saccharalis
11 Cuba Diatraea saccharalis
12 Francia Sitona discoideus
13 Cuba Diatraea saccharalis
14 Cuba Insecta
15 Cuba Diatraea saccharalis
16 Cuba Diatraea saccharalis
17 Cuba Diatraea saccharalis
18 Cuba Hysipyla grandella
19 Cuba Diatraea saccharalis
20 India Insecta
21 Bulgaria Insecta

Se realizaron seis extracciones para cada aislamiento, por el método de los promedios de las distancias no
las que se examinaron comparativamente por electro- ponderadas (Unweighted Pair-Group Method,
foresis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. La Arithmetic Average). Los patrones de marcadores
electroforesis se realizó entre 50-60 mA durante 4 h. moleculares se determinaron según Cornide et al.
Para el revelado de los geles se utilizaron como sustratos (2000).
α y β-naftil acetato, y se analizaron visualmente, para
lo cual se tuvo en cuenta el número y la posición de las
bandas de cada aislamiento. Las movilidades relativas RESULTADOS Y DISCUSIÓN
de las manchas se calcularon a partir del punto de apli- La Fig. 1 corresponde a los zimogramas para esterasas
cación como: de los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados. Se apre-
Rf = Movilidad de la mancha / Movilidad del frente de corrida cia un total de 41 bandas. De ellas 24 son polimórficas,
es decir, son bandas únicas para diferentes aislamientos
Cada banda enzimática se consideró como una varia- que representan 58,53% del total de las bandas revela-
ble cualitativa presente (1) o ausente (0). Se utilizó el das. La presencia de 18 patrones de bandas evidencia el
programa NTSYS versión 2.01, y a partir de la ma- polimorfismo para esterasas de B. bassiana, lo que ha
triz de los datos originales se calculó la distancia sido demostrado por diferentes autores para esta espe-
genética mediante el coeficiente de similitud SM y se cie entomopatógena [Liu et al., 2003; Meyling y Eilenberg,
realizó el análisis de agrupamiento de los individuos 2005].

280/fitosanidad
Variabilidad de las isoenzimas...

Figura 1. Zimograma para esterasas de 21 aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.


(1-41: bandas; I-XVIII: patrones)

De acuerdo con lo obtenido mediante el análisis de agru- el aislamiento 3 del 5 por la presencia de las bandas
pamiento de los 21 aislamientos de B. bassiana estu- B14 y B34 en el primero, y la ausencia en el segundo.
diados, se formaron seis grupos de diversidad molecular En el grupo II se evidencia la presencia de bandas dife-
(I, II, III, IV, V y VI) (Fig. 2), donde los aislamientos renciales entre los aislamientos que conforman en este
no aparecen agrupados por su origen geográfico y grupo. En el caso del grupo III los aislamientos 11 y 12
entomológico. se identifican del resto de los aislamientos por presen-
tar las bandas B11, B25 y B35; sin embargo, estos ais-
La presencia de bandas diferenciales (Tabla 2) permitió lamientos no pudieron diferenciarse entre sí. El resto
distinguir las bandas de los grupos de diversidad de los aislamientos que conforman los grupos IV, V y
molecular. Así, por ejemplo, en el grupo I, formado por VI presentaron bandas diferenciales que permitieron
los aislamientos 1, 3, 18, 2, 4 y 5, se puede diferenciar identificarlos entre sí.
fitosanidad/281
Estrada y Piñón

Figura 2. Análisis de agrupamiento de los 21 aislamientos


de B. bassiana basado en la matriz de similitud.

Tabla 2. Patrones de descriptores moleculares de los aislamientos de B. bassiana con


isoenzimas esterasas
Grupos de Aislamientos B11 B12 B25 B28 B35 B38 B39 B41
diversidad
molecular
I 1 0 1 0 0 1 0 0 0
3 0 1 0 0 0 0 0 0
18 0 1 0 0 0 0 0 0
2 0 1 0 0 0 0 0 0
4 0 1 0 1 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0
II 6 0 0 0 1 1 0 1 0
7 0 0 0 1 0 0 1 0
15 0 0 0 1 0 0 1 0
19 0 0 0 1 0 0 0 1
20 0 0 0 1 0 0 0 1
8 0 0 0 1 0 0 1 0
13 1 0 0 1 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 1 0 0
10 0 0 0 1 0 1 0 1
III 11 1 0 1 0 1 0 0 0
12 1 0 1 0 1 0 0 0
IV 16 0 0 0 0 0 0 1 0
17 0 0 0 0 0 0 0 0
V 21 0 0 0 0 0 0 0 0
VI 14 0 0 0 0 0 0 0 0

Bandas diferenciales entre grupos de diversidad molecular.

Bandas diferenciales entre aislamientos de un mismo grupo de diversidad molecular.

282/fitosanidad
Variabilidad de las isoenzimas...

La caracterización basada en el estudio de las isoenzimas • La evaluación de la aplicación del aislamiento 3 en el


esterasas evidenció la variabilidad genética de B. bassia- campo requiere de su caracterización para la dife-
na y permitió contar con otro criterio para diferenciar renciación de los aislamientos que aparecen natural-
los aislamientos del hifomiceto por sus patrones de mente en el agroecosistema cañero.
bandas, lo que resulta de utilidad práctica para la co-
lección de microorganismos entomopatógenos. REFERENCIAS
La determinación de un carácter discriminante para Adamek, L.: «Submerse Cultivation of the Fungus Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorok», Folia Microbiológica 10: 255-257, 1965.
B. bassiana a partir de las bandas diferenciales resulta
de interés agronómico, pues fue posible diferenciar el Bruce, L.; M. Skinner; S. D. Costa; S. Gouli; W. Reid; M. El Bouhssini:
«Entomopathogenic Fungi of Eurygaster integriceps Puton (Hemiptera:
aislamiento 3 que se aplica en el cultivo de la caña de Scutelleridae): Collection and Characterization for Development»,
azúcar del 5 que se aplica en la agricultura no cañera. Biological Control 27 (3):260-272, 2003.

Como B. bassiana se ha aislado a partir de larvas y Cornide, M. T.; O. Coto; D. Calvo, E. Canales; F. de Prada; G. Pérez:
«Molecular Markers for the Identification and Assisted Management
crisálidas de D. saccharalis colectadas en diferentes of Genetic Resources for Sugarcane Breeding», Plant Varieties
partes de la planta y a partir de muestras de suelo (Ta- and Seeds 13:113-123, 2000.
bla 1), la evaluación de la aplicación del aislamiento 3 Estrada, M. E.; D. Piñón; M. Capote: «Variabilidad de las esterasas de
en el campo requiere de su caracterización para la dife- Metarhizium anisopliae», Revista Iberoamericana de Micología
14(1):29-30, 1997.
renciación de los aislamientos que aparecen natural-
Estrada, M. E.; M. Romero; M. J. Rivero; F. Barroso: «Presencia natural
mente en el agroecosistema cañero. de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin en el cultivo de la caña
de azúcar (Saccharum sp hibrido) en Cuba», Revista Iberoameri-
Generalmente los patrones isoenzimáticos no se cana de Micología 21(1):42-43, 2004.
correlacionan con los insectos hospedantes, con el país Fernandes, E. K.; G. L. Costa; A. M. Moraes, V. Zahner; V. R. Pinheiro:
de origen ni con otro carácter. Ellos pueden emplearse «Study on Morphology, Pathogenicity and Genetic Variability of
Beauveria bassiana Isolates Obtained from Boophilus microplus
como marcadores individuales, y se han utilizados para Tick», Parasitology Research 98 (4):324-832, 2006.
conocer la estabilidad genética de especies de hifomicetos Kauffman, P. E.; R. Collen; A. Donald; J. Rutz; K. Ketzis; J. James:
entomopatógenos sometidas a diferentes presiones de «Evaluation of Beauveria bassiana Applications Against Adult House
selección [Rakotoniainy et al., 1994]. Fly, Musca domestica, in Commercial Caged-Layer Poultry Facilities
in New York State», Biological Control 33 (3):360-367, 2005.
El conocimiento de la variabilidad de las isoenzimas Liu, H.; M. Skinner; M. Brownbridge; B. L. Parker: «Characterization of
esterasas constituye una herramienta para la caracte- Beauveria bassiana and Metarhizium anisoplaie Isolates for
rización de los aislamientos de B. bassiana en el Pro- Management of Tarnished Plant Bug Lygus lieolaris (Hemiptera:
Miridae)», Journal of Invertebrate Pathology 82 (3):139-147, 2003.
grama Nacional de Lucha Biológica contra el barrena-
dor de la caña de azúcar D. saccharalis. Meyling, N. V; J. Eilenberg: «Isolation and Characterization of Beauveria
bassiana Isolates from Phylloplanes of Hedgerow Vegetation»,
Mycological Research 110 (2):188-195, 2005.

CONCLUSIONES Moino Jr., A.; S. B. Alves; R. B. Lopes; P. M. O. J. Neves; R. M. Pereira; S.


A. Vieira: «External Development of the Entomopathogenic Fungi
• La caracterización basada en el estudio de las Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in the Subterranean
isoenzimas esterasas evidenció la variabilidad genética Termite Heterotermes tenuis», Scientia Agricola 59 (2):267-273, 2002.

de B. bassiana y permitió contar con otro criterio Rakotoniainy, M. S.; M. L. Cariou; Y. Brigoo; G. Riba: «Phylogenetic
para diferenciar los aislamientos del hifomiceto por Relationships Within the Genus Metarhizium Based on 28S RNA
Sequences and Isozyme Comparison», Mycological Research 98
sus patrones de bandas. (2):225-230, 1994.
• Fue posible diferenciar el aislamiento 3, que se aplica Sáenz-de-Cabezón, J. F.; V. M. Mancebón; I. P. Moreno: «The
en el cultivo de la caña de azúcar, del aislamiento 5 Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana and Its Compatibility
que se aplica en la agricultura no cañera. with Triflumuron: Effects on the Two Spotted Spider Mite Tetranycus
urticae», Biological Control 26:168-173, 2003.

fitosanidad/283
Estrada y Piñón

284/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Control biológico

UN MEDIO SIMPLIFICADO A BASE DE SOYA MÁS AZÚCAR


TURBINADA DE CAÑA PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGO
ACAROPATÓGENO HIRSUTELLA NODULOSA PETCH
EN FASE LÍQUIDA

Reinaldo I. Cabrera,1 Marlén Vega2 y Litzy Ayra1


1
Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, entomopatogeno@iift.cu.
2
Instituto de Investigaciones del Arroz. Autopista Novia del Mediodía Km 16½, Bauta, La Habana,
iiarroz@bauta.esihabana.cu; iiarroz@sba.esihabana.cu

RESUMEN ABSTRACT
The fungus Hirsutella nodulosa Petch is an important natural enemy of
El hongo Hirsutella nodulosa Petch resulta un importante enemigo
many phytophague mites and it is very necessary the determination of
natural de muchos ácaros fitófagos. Para su producción como
a simple, economic and efficient culture medium for its production as
bioplaguicida es muy necesaria la determinación de un medio de
bioplaguicide. Five soybean concentrations have been assayed (6;
cultivo sencillo, económico y eficiente. Se ensayaron cinco concen-
8; 10; 12 and 14% w/v) with turbinated cane sugar (3 and 4% w/v).
traciones de soya (6, 8, 10, 12 y 14% p/v) con dos de azúcar turbinada
Each combination has been distributed separately in three erlenmeyers
de caña (3 y 4% p/v). Cada combinación se distribuyó por separado
of 300 mL with 100 mL of medium each one. They have been sterilized
en tres erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de medio cada uno, y
in autoclave at 121ºC during 25 min and inoculated with a micelial
previa esterilización en autoclave a 121oC durante 25 min; se inocu-
suspension of the fungus at 3% v/v. They were fermented four days
laron con una suspensión micelial del hongo a 3% v/v para su fer-
with a continuous shaker at 27 ± 1ºC and 180 rpm as well as the
mentación durante cuatro días en zaranda de producción continua a
inoculum. Each biomass was recovered on fitter paper by vacuum
27 ± 1oC y 180 rpm como ocurrió con el inóculo. Seguidamente se
filtration. They were put in an oven at 60ºC during 24 h to determine
recuperó cada biomasa en papel de filtro por filtración al vacío y se
dry weight by analytical balance. The results were analyzed by an
colocó en una estufa a 60oC durante 24 h para determinar su peso
ANOVA of double classification, previous data transformation in x + 1 .
seco en balanza analítica. Los resultados se analizaron mediante un
ANOVA de clasificación doble, previa transformación de los datos en Means were compared by Duncan Multiple Range Test for p < 0.05.
x + 1 , y las medias se compararon entre sí por la prueba de rangos
The best combination of soybean plus sugar was 14 and 3% w/v
múltiples de Duncan para p < 0,05. La mejor combinación de soya respectively, with a mean up to 1.14 g (dry weight of mycelium) by
más azúcar fue la de 14 y 3% p/v respectivamente, con resultados each 100 mL of medium. This result allows considering it as economic
que alcanzaron hasta un promedio de 1,14 g (peso seco de micelio) and efficient for the great scale production of this mite pathogen and
por cada 100 mL de medio, lo que permite considerarlo económico y which the first Cuban experience.
eficiente para la producción a gran escala de este acaropatógeno y Key words: Glicine max, Hirsutella nodulosa, submerge culture, cane
como la primera experiencia en Cuba. sugar
Palabras claves: Glicine max, Hirsutella nodulosa, cultivo sumergi-
do, azúcar de caña

INTRODUCCIÓN
Las investigaciones realizadas en Cuba y otros países La llegada al país del ácaro tarsonémido del arroz
con el hongo Hirsutella nodulosa Petch, al que se le con- Steneotarsonemus spinki Smiley a finales de 1997 [Ra-
sidera un importante enemigo natural de muchos ácaros mos et al., 1998] y los estudios de H. nodulosa como
fitófagos [Cabrera y Domínguez, 1987 y 1987a; Minter enemigo natural de este ácaro en Cuba y Sri Lanka
y Brady, 1980], han motivado el interés por su utiliza- [Cabrera et al., 2002 y 2005], así como lo difícil que
ción como bioacaricida. resulta su control por la vía de la lucha química [Ca-

fitosanidad/285
Cabrera y otros

brera et al., 2002a], potenciaron la necesidad de pro- Todo el trabajo se realizó bajo un diseño de bloques al
fundizar en la posible utilización de H. nodulosa en los azar, en mesa de flujo laminar y con pro pipeta automáti-
programas de control biológico y manejo integrado con- ca. Para el análisis de los resultados se utilizó un ANOVA
tra esta y otras plagas. Para ello se requiere disponer, de clasificación doble, previa transformación de los datos
en primer lugar, de un medio de cultivo y una tecnolo- en x + 1 , y las medias se compararon entre sí por la
gía barata que permitan la producción de este aca- prueba de rangos múltiples de Duncan para p < 0,05.
ropatógeno a gran escala y en las cantidades requeri-
das para tales fines.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El presente trabajo ofrece los primeros resultados en
Se logró la determinación de un medio de cultivo con
Cuba sobre la búsqueda de un medio simplificado, eco-
buenas características para su utilización en la produc-
nómico y eficiente para la producción del hongo H. no-
ción de H. nodulosa en fase líquida, y cuyos resultados
dulosa en fase líquida y su importancia en la multipli-
superan significativamente a los del testigo, sin la pre-
cación acelerada de este control biológico.
sencia de la conidiación del hongo en los medios líqui-
dos ensayados, pero sí una abundante biomasa en las
MATERIALES Y MÉTODOS diferentes combinaciones de soya más azúcar formada
Para la determinación del medio se pesaron por separa- por sus micelios y conidióforos.
do 36, 48, 60, 72 y 84 g de soya en grano (Glycine max Se presentaron diferencias significativas para p < 0,05
(Lin.) Merr.) y se echaron en erlenmeyers de 2 L con entre el testigo y todas las concentraciones de soya más
500 mL de agua destilada para su cocción en autoclave azúcar, así como entre algunas de las combinaciones de
a 121oC durante 35 min. Luego el contenido de cada estas fuentes de nutrientes, con los mayores resultados
recipiente se batió en una batidora licuadora durante a medida que se incrementaba el contenido de soya (Fig. 1).
20 s y se filtraron separadamente por un paño de lien- La dinámica de desarrollo de este acaropatógeno en las
zo, con presión manual para la extracción de cada par- combinaciones de nutrientes ensayadas fue muy rápi-
te líquida, las que se enrazaron con agua destilada a da en lo que respecta a la producción de biomasa
600 mL para que la soya quedara a 6, 8, 10, 12 y 14% p/v, micelial, la que alcanzó hasta un promedio de 1,14 g
respectivamente. (peso seco) por cada 100 mL de medio a los cuatro días
A los primeros 300 mL con cada concentración de soya de fermentación a 27 ± 1oC y 180 rpm. La mejor com-
se le adicionó entonces el azúcar turbinada de caña a binación de soya más azúcar turbinada de caña fue la
3% p/v y a los 300 restantes a 4% p/v, y se filtraron al de 14% p/v y 3% p/v respectivamente.
vacío por papel de filtro Whatmann no.1. Seguidamen- La selección de los medios de cultivos a partir de
te se vertieron por separado 100 mL de cada una de las sustratos naturales y sus buenos resultados no solo
combinaciones de nutrientes a las diferentes concen- dependerán de su riqueza nutricional, ya sea en nitró-
traciones en erlenmeyers de 300 mL, y se esterilizaron geno, carbono u otros elementos, sino además de las
a 121oC durante 25 min. En las tres repeticiones que características del medio como viscosidad, turbidez y
tuvo el ensayo, el pH fluctuó entre 5,8 y 7. pH entre otras, según señalara Cabrera (2001).
Como inóculo al 3% v/v se utilizó una cepa de H. nodulosa El procedimiento metodológico utilizado para la extrac-
recién aislada del ácaro S. spinki y reproducida durante ción de elementos como el nitrógeno a partir de la soya
96 h en medio H [McCoy et al.,1972, citado por Cabrera, fue similar al desarrollado por Cabrera (2001); resultó
2001], colocado en zaranda de producción continua a eficaz, lo que permitió disponer de un medio simplifica-
180 rpm y una temperatura de 27 ± 1oC. do, eficiente y económico para la reproducción de H. no-
Transcurridos los primeros cuatro días de fermenta- dulosa, una vez combinada la soya con el azúcar
ción, bajo las mismas condiciones antes señaladas se turbinada de caña como fuente de carbono. La ausen-
recuperó por filtración al vacío la biomasa producida cia de conidias en este caso no es consecuencia de los
en cada medio, y estas se colocaron en estufa a 60oC medios utilizados, sino de que este acaropatógeno no
durante 24 h para luego determinar, en balanza analíti- presenta conidiación en cultivo líquido, como ocurre con
ca, la producción micelial que se obtuvo en cada er- la mayoría de las cepas de H. thompsonii [Cabrera,
lenmeyer. 2001].

286/fitosanidad
Un medio simplificado a base de soya...

Figura 1. Producción de biomasa de H. nodulosa en diferentes concentraciones de soya


y azúcar turbinada de caña más un testigo.

Como se aprecia en la Fig. 1, se presentaron diferencias de desarrollo del hongo con resultados, en todos los
significativas entre el testigo y todas las concentracio- casos, superiores a los del testigo.
nes de soya, en lo que a la producción de biomasa micelial • H. nodulosa produce una abundante masa micelial
se refiere. Ello confirma la importancia del nitrógeno en el medio antes señalado, y en ninguno de los casos
orgánico en el desarrollo micelial de H. nodulosa, como se observó la presencia de conidias.
se señaló para H. thompsonii por Cabrera (2001).
La posibilidad de sustituir el extracto de levadura y la REFERENCIAS
peptona como fuentes portadoras de nitrógeno por la Cabrera, R. I.; D. Domínguez: «El hongo Hirsutella nodulosa, nuevo
parásito para el ácaro del cocotero Erióphyes guerreronis», Cienc. y
soya, así como la glucosa y la sacarosa, portadoras de Técn. en la Agricultura, Cítricos y Otros Frutales 10(1): 41-51, 1987.
carbono, por el azúcar turbinada de caña, permite dis- ––––: «Hirsutella nodulosa e Hirsutella kirchneri, dos nuevos hon-
poner de un medio de cultivo mucho más económico y gos patógenos del moho P. oleivora», Cienc. y Técn. en la Agricul-
eficiente para la producción de H. nodulosa, con rendi- tura, Cítricos y Otros Frutales 10(2):139-142, 1987a.

mientos de hasta 1,14 g de biomasa (peso seco) por cada Cabrera, R. I.: «Hirsutella thompsonii Fisher y los plaguicidas químicos
en una nueva estrategia para el manejo integrado del ácaro del moho
100 mL de medio a las 96 h de fermentación. Esta cons- Phyllocoptruta oleivora Asmead (Acarina: Eriophyidae) en cítricos».
tituye la primera vez que en Cuba se realizan estudios Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas,
Instituto de Investigaciones de Cítricos y Otros Frutales, 2001.
para la búsqueda de un medio simplificado para la pro-
Cabrera, R. I.; L. Nugaliyadde; M. Ramos: «Presencia de Hirsutella
ducción de este hongo en fase líquida, y cuyos resulta- nodulosa sobre el ácaro Steneotarsonemus spinki (Acari:
dos son de vital importancia para la producción acele- Tarsonemidae) en Sri Lanka». Memorias II Encuentro Internacional
de Arroz, Palacio de las Convenciones, 8-12 de julio, La Habana,
rada de este control biológico si se toma en consideración 2002, pp 186-188.
su lento crecimiento tanto en fase sólida como líquida. Cabrera, R. I.; J. Hernández; A. García: «Resultado de las aplicaciones
aéreas de Triazophos y Bacillus thuringiensis para combatir el áca-
ro Steneotarsonemus spinki (Acari: Tarsonemidae) en el cultivo del
CONCLUSIONES arroz». Memorias II Encuentro Internacional de Arroz, Palacio de las
Convenciones, 8-12 de julio, La Habana, 2002a, pp. 206-208.
• El medio a base de soya 14% p/v más azúcar de caña Cabrera R. I.; A. García; G. Otero Colina; L. Almaguel; A. Ginarte:
turbinada a 3% p/v resulta el más eficiente y econó- «Hirsutella nodulosa y otros hongos asociados al ácaro Tarsonemido
del arroz Steneotarsonemus spinki (Acari: Tarsonemidae) en Cuba»,
mico para la producción masiva del hongo H. Folia Entomológica Mexicana 44(2):115-121, 2005.
nodulosa en fase líquida, lo que valida su utilización Minter, D. W.; B. L. Brady: «Mononematous species oh Hirsutella»,
a gran escala. Trans. Br. Micol. Soc. 74(2):271-282, 1980.
• Las diferentes concentraciones de soya más azúcar Ramos, M.; H. Rodríguez; R. Chico: «Steneotarsonemus spinki Smiley
(Acari: Tarsonemidae). Nuevo informe para Cuba en el cultivo del
que se ensayaron permitieron una buena dinámica arroz», Revista Protección Vegetal. 13(1):25-28, 1998.

fitosanidad/287
288/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR DE BACILLUS SPP.


SOBRE EL DESARROLLO DE LA PUDRICIÓN BLANDA
DE LA PAPA (SOLANUM TUBEROSUM L.)

Yaritza Reinoso Pozo,1 Luis Casadesús Romero,1 Armando García Suárez,2 Ernesto García Pérez1 y
Victoria Pazos Álvarez-Rivera1
1
Facultad de Biología, Departamento de Microbiología y Virología. Calle 25 no. 455 e/ I y J, Plaza
de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400, yreinoso@fbio.uh.cu
2
Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ Lombillo y San Pedro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400

RESUMEN ABSTRACT
La pudrición blanda bacteriana, causada por Pectobacterium Bacterial soft rot, caused by Pectobacterium carotovorum, happens in
carotovorum, ocurre en una amplia variedad de cultivos y es una de a wide variety of cultivations and it is one of the most severe postharvest
las más severas enfermedades poscosecha de la papa (Solanum diseases of potato (Solanum tuberosum L.) in the world. The control is
tuberosum L.) en el mundo entero. El control de esta enfermedad se based fundamentally on the application of chemical products that
basa fundamentalmente en la aplicación de químicos que contami- contaminate the environment and deteriorate human health. One of
nan el medio ambiente y deterioran la salud humana. Una de las the ecological alternatives adopted in this sense is the use of
alternativas ecológicas adoptadas es el uso de microorganismos microorganisms as biological control agents, the members of genera
como agentes de control biológico, entre los que se encuentran los Bacillus are among them. The objective of the present work was to
miembros del género Bacillus. El objetivo del presente trabajo fue determine the protective effect of 23 Bacillus sp. strains on the
determinar el efecto protector de 23 cepas de Bacillus sp. sobre el development of the potato soft rot. Potato slices were treated with 24 h
desarrollo de la pudrición blanda de la papa. Para ello se trataron growth bacterial cultures and were inoculated with a strain of P.
rodajas de papa con cultivos bacterianos de 24 h y posteriormente se carotovorum, using two different concentrations. The slices stayed
inocularon con una cepa de P. carotovorum a dos concentraciones during 24 h in conditions of temperature and favourable humidity for
diferentes. Las rodajas se mantuvieron durante 24 h en condiciones the development of the soft rot. Lapsed this time the effectiveness of
de temperatura y humedad favorables para el desarrollo de la the treatments was evaluated in comparison with non treated controls
pudrición. Transcurrido este tiempo se evaluó la efectividad de los observing the appearance or not of disease characteristic symptoms.
tratamientos respecto a los controles no tratados, y se tuvo en cuenta G15, G19 and G25 strains only had protective effect in the slices tried
la aparición o no de los síntomas característicos de la enfermedad. with the smallest concentration of P. carotovorum. While B1, G10, Q7
Las cepas G15, G19 y G25 solamente tuvieron efecto protector en las and Q18 inhibited soft rot development in two analyzed variants. The
rodajas tratadas con la menor concentración de P. carotovorum, mien- rest of the studied strains did not show protection, so an increment in
tras que B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo de la pudrición en lesions severity was observed in some cases.
las dos variantes analizadas. El resto de las cepas estudiadas no
mostró protección, y en algunos casos se observó un incremento en Key words: Bacillus, biological control, Pectobacterium carotovorum,
la severidad de las lesiones. Solanum tuberosum

Palabras claves: Bacillus, control biológico, Pectobacterium


carotovorum, Solanum tuberosum

INTRODUCCIÓN
La papa (Solanum tuberosum L.) ocupa el cuarto lugar en especial por la presencia de daños en los tubérculos.
entre los diez cultivos de mayor importancia en el mun- Los factores bióticos de mayor importancia son la pre-
do, superada únicamente por el trigo, el arroz y el maíz. sencia de plagas y enfermedades que generan elevados
Su producción anual asciende a más de doscientos mi- costos de manejo y control [Gregory y Andrade, 1996].
llones de toneladas que repercuten en la alimentación Las condiciones tropicales y húmedas resultan poco
de gran parte de la población mundial [Estévez et al., favorables para el cultivo de la papa debido a que es
2001]. En la producción de papa el cultivo puede afec- propenso a infectarse con numerosos microorganismos
tarse por una serie de factores bióticos y abióticos que patógenos fúngicos y bacterianos, además de las difi-
disminuyen el rendimiento y calidad de las cosechas, cultades que se presentan para conservar los tubércu-

fitosanidad/289
Reinoso y otros

los. Las enfermedades bacterianas de la papa provocan las cuales se han descrito más de de setenta antibióticos
generalmente pudriciones húmedas y pueden ser origina- de bajo peso molecular y naturaleza polipeptídica, en-
das por microorganismos pertenecientes a variados géne- tre las cuales B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus,
ros [MINAGRI, 2000]. En Cuba la pudrición blanda, cau- B. circulans, B. cereus, Brevibacillus laterosporus y
sada por Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi Paenibacillus polymyxa son los mayores productores.
y Pectobacterium atrosepticum, es una de las enfermeda- Los metabolitos secundarios producidos por algunas
des bacterianas que se presenta con mayor incidencia en de estas especies inhiben el crecimiento de bacterias y
el campo, y las pérdidas durante el almacenamiento de hongos, por lo que se ha sugerido su uso como un méto-
los tubérculos son considerables [Galán, 2004]. do suplementario para la protección de las plantas con-
El control de estos patógenos se dificulta mucho debi- tra microorganismos fitopatógenos [Földes et al., 2000].
do a que la enfermedad se puede presentar en diferen- El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto pro-
tes etapas del desarrollo de la planta. Estas bacterias tector de diferentes cepas del género Bacillus sobre el
además pueden sobrevivir en el suelo, el agua de riego desarrollo de la pudrición blanda de la papa.
y la maquinaria agrícola. Por el momento el control de
la calidad fitosanitaria de los tubérculos-semilla y la
MATERIALES Y MÉTODOS
aplicación de productos químicos son medidas que con-
tribuyen a disminuir los daños [Galán, 2004]. Se utilizaron como material biológico 23 cepas del gé-
nero Bacillus conservadas en agar nutriente (Biocen) y
Actualmente se aboga por el uso de prácticas agrícolas
aisladas de suelos procedentes de regiones paperas de
ecológicas como el control biológico mediante el uso de
diferentes municipios de la provincia de La Habana
microorganismos antagonistas, los cuales pueden limi-
(Tabla 1). Estas cepas se seleccionaron en considera-
tar la iniciación y propagación de las enfermedades
ción a su actividad antagónica in vitro frente a cepas de
causadas por patógenos vegetales mediante mecanis-
Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi y
mos de competencia, antibiosis, inducción de resisten-
Pectobacterium atrosepticum (datos no publicados). Se
cia, entre otros [Fernández-Larrea, 2001].
empleó además la cepa P. carotovorum 2046 conservada
Varias especies de los géneros Bacillus, Paenibacillus y en medio GYCA (glucosa, extracto de levadura, carbo-
Brevibacillus producen sustancias antimicrobianas, de nato de calcio, agar).

Tabla 1. Procedencia de las cepas del género Bacillus utilizadas


Cepas Procedencia Cepas Procedencia
G1 Municipio de Güines G29 Municipio de Güines
G2 Municipio de Güines G30 Municipio de Güines
G10 Municipio de Güines Q6 Municipio de Quivicán
G11 Municipio de Güines Q7 Municipio de Quivicán
G12 Municipio de Güines Q12 Municipio de Quivicán
G14 Municipio de Güines Q13 Municipio de Quivicán
G15 Municipio de Güines Q18 Municipio de Quivicán
G17 Municipio de Güines S1 Municipio de San José
G18 Municipio de Güines B1 Municipio de Güines
G29 Municipio de Güines B2 Municipio de Güines
G23 Municipio de Güines B4 Municipio de Güines
G25 Municipio de Güines

Para el crecimiento de las especies del género Bacillus se a un valor de 0,5 en la escala de Mac Farland (1 x 108 ufc/mL)
utilizaron frascos erlenmeyers de 1 L de capacidad con preparada a partir de cultivos de 24 h de crecimiento en
100 mL de medio caldo nutriente (Biocen). Los frascos se agar nutriente. Los cultivos se colocaron en zaranda orbital
inocularon con una suspensión bacteriana correspondiente termostatada durante 24 h a 30oC y 120 rpm.

290/fitosanidad
Estudio del efecto protector...

El inóculo de P. carotovorum se obtuvo a partir de culti- rante 24 h. Transcurrido este tiempo se determinó la
vos de 24 h de la bacteria fitopatógena en medio GYCA. efectividad de los tratamientos mediante inspección
Con agua destilada estéril se prepararon suspensiones visual y observación de la aparición o no de síntomas
ajustadas a un valor de densidad óptica de 0,05 y 0,1 característicos de la enfermedad.
respectivamente, a una longitud de onda de 580 nm.
Tubérculos-semilla certificados de la variedad Spunta RESULTADOS Y DISCUSIÓN
procedentes de Holanda se desinfectaron superficial-
El control biológico de P. carotovorum mediante espe-
mente con alcohol 70%, luego se sumergieron en
cies de microorganismos antagonistas se ha estudiado
hipoclorito de sodio a 3% durante 3 min, se lavaron
por varios grupos de investigación debido al amplio ran-
con abundante agua destilada estéril y se colocaron en
go hospedero y a la gran importancia económica que
un flujo laminar durante 1 h. Rodajas de papa de 1 cm
poseen los cultivos que esta bacteria puede afectar. Se
de grosor se sumergieron durante 1 min en los cultivos
han utilizado como alternativas el empleo de Erwinia
de Bacillus spp. Las rodajas tratadas se colocaron en el
herbicola [Vanneste et al., 1995], Pseudomonas fluo-
flujo laminar durante 30 min para eliminar la hume-
rescens [Abdel-Alim et al., 2001] y Trichoderma hamatum
dad superficial. Posteriormente se inocularon con 10 µL
[Blom, 2001]; sin embargo, los resultados más
de las suspensiones preparadas de la cepa Pectobacterium
promisorios han sido in vitro e in vivo, con especies del
carotovorum 2046. Cada rodaja se inoculó en tres pun-
género Bacillus productores de sustancias con activi-
tos diferentes, y se emplearon como controles rodajas
dad antibacteriana [Bernal et al., 2002] [Sharga y Lyon,
sin tratar inoculadas con la bacteria fitopatógena y
1998] [Abdel-Alim et al., 2001].
previamente sumergidas en agua destilada estéril y
rodajas tratadas con cultivos de Bacillus spp. sin ino- En el estudio realizado el tratamiento de las rodajas de
cular. Se utilizaron seis rodajas por tratamiento y se papa con las cepas B1, G10, Q7 y Q18 previno total-
colocaron en placas Petri con papel de filtro humedeci- mente el desarrollo de la pudrición blanda en todas las
do con agua destilada estéril y se incubaron a 30oC du- variantes del experimento (Fig. 1).

Figura 1. Efecto protector de la cepa G10 en rodajas de papa inoculadas con la mayor
concentración de la cepa P. carotovorum 2046. A la derecha se muestran los controles de
P. carotovorum 2046 y G10.

En experimentos realizados por otros autores se han de papa y raíces de la planta, con el objetivo de inhibir
producido resultados similares. Tal es el caso de Sharga el desarrollo de la pudrición blanda ocasionada por P. ca-
y Lyon (1998), quienes emplearon una cepa de Bacillus rotovorum y P. atrosepticum. Estos autores solamente
subtilis productora de antibióticos para tratar rodajas emplearon en los tratamientos suspensiones de la cepa

fitosanidad/291
Reinoso y otros

antagonista preparadas con agua y no los cultivos lí- y Q18 puede estar relacionada con la producción de
quidos como en este trabajo. Es por esto quizás que metabolitos antibacterianos de menor actividad bioló-
solamente hubo resultados positivos, que se traducen gica inhibitoria, cuya acción se ve limitada por la densi-
en la disminución de la severidad de las lesiones cuan- dad de bacterias fitopatógenas presentes en el medio al
do emplearon una alta concentración de Bacillus que son vertidos. También es posible que la producción
subtilis, mientras que en este estudio se pudo evitar de estos compuestos en las cepas antes mencionadas co-
completamente la aparición de lesiones características mience en etapas más tardías del crecimiento, por lo que
de la pudrición blanda con las cepas antes menciona- en el momento de tratar las rodajas sus concentraciones
das, lo cual pudiera deberse a la acción antibacteriana en el medio de cultivo no son suficientes como para lo-
de los metabolitos producidos por estos aislados grar un efecto igual al obtenido con B1, G10, Q7 y Q18.
bacterianos que son excretados al medio de cultivo. De hecho se plantea que la producción de sustancias con
Las cepas B2, G15 y G25 solamente mostraron efecto actividad antimicrobiana por parte de especies del géne-
protector en aquellas rodajas inoculadas con la menor ro Bacillus está muy relacionada con la fase estacionaria
concentración de P. carotovorum (Fig. 2). Esta diferen- del crecimiento microbiano y en particular con la etapa
cia respecto a los resultados con las cepas B1, G10, Q7 de esporulación [Schallmey et al., 2004].

Figura 2. Efecto protector de la cepa B2 en rodajas de papa


inoculadas con la menor concentración de la cepa P. carotovorum
2046. A la derecha se muestran los controles de P. carotovorum
2046 y B2.

El resto de las cepas de Bacillus spp. estudiadas no bios de color de beis a marrón con presencia de fetidez
inhibieron el desarrollo de la pudrición blanda. Algu- y una gran maceración del tejido del tubérculo. Con
nas como G11, G12 y G14 provocaron cambios de colo- anterioridad otros autores han aislado algunas espe-
ración de color beis a pardo oscuro en las rodajas trata- cies del género Bacillus, productoras de enzimas
das, aunque no se observaron síntomas de pudrición pectinolíticas y proteolíticas, causantes de la pudrición
blanda. La cepa B4 produjo modificaciones drásticas blanda en algunos cultivos [US EPA, 1997] [Kararah
en las rodajas tratadas y el control; se observaron cam- et al., 1985].

292/fitosanidad
Estudio del efecto protector...

CONCLUSIONES Fernández-Larrea, O.: «Microorganismos antagonistas para el control


fitosanitario», Manejo Integrado de plagas 62:96-100, 2001.
• Las cepas B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo Földes, T.; I. Banhegyi; Z. Varga; J. Szageti: «Isolatin of Bacillus Strains
de la pudrición blanda en las rodajas inoculadas con from the Rhizosfere of Cereals and in vitro Screening for Antagonism
Against Phytopathogenic, Food-Borne Pathogenic and Epoilage
ambas concentraciones de P. carotovorum utilizadas. Microorganisms», Journal of Applied Microbiology 89:840-845, 2000.
• Las cepas B2, G15 y G25 solamente tuvieron efecto Galán, I.: «Bacillus spp., antagonistas de las bacterias de podredum-
protector en las rodajas inoculadas con la menor con- bre blanda de la papa». Tesis de Diploma, Facultad de Biología, Uni-
versidad de La Habana, 2004.
centración de P. carotovorum.
• La cepa B4 produjo un incremento en la severidad Gregory, P.; H. Andrade: «Principales enfermedades, nematodos e in-
sectos de la papa», CIP, 1996.
de los síntomas de la enfermedad.
Kararah, M.; F. Barakat; M. Mikhail; H. Fouly: «Pathophysiology in Garlic
Cloves Inoculated with Bacillus subtilis, Bacillus pumillus and
REFERENCIAS Erwinia carotovora», Egyptian Journal of Phyopathology 17:131-
140, 1985.
Abdel-Alim, A.; M. Mikhail; P. Laux; W. Zeller: «Biological Control of
Ministerio de la Agricultura: «Guía técnica para la producción de papa
Erwinia carotovora subsp. carotovora on Potatoes by Fluorescent
en Cuba» Instituto de Investigación Hortícolas Liliana Dimitrova, 2000,
Pseudomonads and Bacillus subtilis», IOBC WPRS Bulletin, 25:139-
pp. 1-37.
144, 2001.
Schallmey, M.; A. Singh; O. Ward: «Development in the Use of Bacillus
Bernal, G.; A. Illanes; L. Campi: «Isolation and Partial Purification of a
Species for Industrial Production», Canadian Journal of Microbiology
Metabolite from a Mutant Strain of Bacillus sp. with Antibiotic Activity 50:1-17, 2004.
Against Plant Pathogenic Agents», Electronic Journal of
Biotechnology (online), vol. 5, no. 1, 2002. Disponible en http:// Sharga, B.; G. Lyon: «Bacillus subtilis BS 107 as an Antagonist of
www.ejbiotechnology.info/content/vol5/issue1/full/4/index.html#12 Potato Blackleg and Soft Rot Bacteria», Canadian Journal of
Microbiology 44:777-783, 1998.
Blom, T. J.: «Studies on the Epidemiology of Erwinia Soft-Rot and Their
Control in Ornamental Crops», Special Research Program, Canada US EPA: «Final Risk Assessment of Bacillus subtilis», www.epa.gov/
Ministry of Agriculture and Food, 2003, pp. 24-27. oppt/biotech/pubs/pdf/fra009.pdf, 1997.
Estévez, A.; M. González; M. Hernández; J. Castillo; O. Moré; M. Corde- Vanneste, J.; J. Perry; L. Perry-Meyer; R. Bedford: «Erwinia herbicola
ro: «Estrategia para el desarrollo del mejoramiento de la papa», Eh252 as a Biological Control Agent of Bacterial Soft Rot on Potatoes»,
Granma Ciencia 5:21-30, 2001. NZPPS Paper 12:13-16, 1995.

fitosanidad/293
Normas Editoriales
Fitosanidad tiene como objetivo divulgar los autores, resumen y palabras claves Las referencias sólo serán de publica-
de forma sistemática el quehacer de los (español e inglés), introducción, el con- ciones disponibles en las bibliotecas, y
investigadores y especialistas del Insti- tenido se estructura a criterio del au- se presentarán en orden alfabético. Se
tuto de Investigaciones de Sanidad Ve- tor, agradecimientos (si los hubiera), colocará el primer apellido del autor
getal, así como de otros centros del país referencias. principal y luego las iniciales de los nom-
o extranjeros, vinculados al trabajo de bres; para los demás autores, primero
Las comunicaciones cortas incluirán: tí- la inicial y luego los apellidos, en todos
la sanidad vegetal. tulo, autor(es), afiliación de los auto- los casos separados por comas. Cuando
El Comité Editorial de esta publicación, res, texto de la comunicación, incluyen- una obra lleve más de tres autores, se
que se edita trimestralmente, agradece do las referencias principales. pondrá el apellido y nombre del prime-
el envío de colaboraciones y observa- La estructura de los informes técnicos ro y a continuación et al. (en cursiva). A
ciones que ayuden a hacer mejor nues- será: título, autor(es), afiliación de los continuación, el título del artículo, el
tra labor. autores, resumen y palabras claves (es- nombre de la revista, así como volumen,
Los artículos deben reflejar los resulta- pañol e inglés), introducción, desarro- número, páginas y año. En el caso de
dos de investigaciones básicas o de apli- llo y referencias. los libros y folletos, después del título,
cación práctica, asimismo aquellos que • Elaboración del texto número de la edición, lugar de la publi-
se encuentren en proceso de extensión cación (ciudad), casa editorial y pági-
o generalización. El título debe ser claro y conciso, pro- nas. Los títulos de los artículos y po-
curando que no sea extenso. Debe te- nencias se entrecomillarán, mientras
Igualmente resultan de importancia los ner correspondencia con el contenido.
trabajos en que se comuniquen nuevos que los referidos a libros y publicacio-
No se incluirán abreviaturas. nes periódicas irán en cursiva, o en su
procedimientos o innovaciones, así
como los que aborden temas novedosos. De los autores se escribirán nombres y defecto subrayados. En el texto las refe-
dos apellidos. Si el autor tiene un se- rencias se citan con el apellido del pri-
• Tipo de artículos gundo nombre, este se abrevia con la mer autor y el año entre paréntesis; más
La revista acepta manuscritos origina- inicial. La afiliación de los autores se de un autor se anota como et al.
les (inéditos) en cualquiera de las espe- escribirá con su nombre completo, las
• Envío de manuscritos
cialidades directa e indirectamente vin- siglas sólo se emplearán entre parénte-
culadas a la sanidad vegetal. Estos sis, si lo consideran necesario. Debe in- Deben entregarse un original mecano-
pueden ser: artículos científicos, rese- cluirse la dirección postal, fax y correo grafiado, a doble espacio, en papel blan-
ñas, comunicaciones cortas, resúmenes electrónico si los posee. co tamaño 28 x 21,5 cm, utilizando una
de tesis, informes técnicos. Los artícu- sola cara, con márgenes de dos centíme-
El resumen no debe exceder de 250 pa-
los científicos no deben exceder de sie- tros a los lados y tres en la parte supe-
labras, y debe tener una síntesis de los
te cuartillas, las reseñas de quince, las rior e inferior. Cada cuartilla debe ser
métodos y resultados, mencionándose
comunicaciones de dos y los informes los nombres científicos completos y enumerada. La letra que ha de utilizarse
técnicos de cinco. valores cuantitativos de los resultados, debe ser Arial, con puntaje 11. Además,
es decir, debe tener el contenido sufi- debe entregar una copia en disquete,
• Lenguaje
ciente de forma comprimida. utilizando el procesador de texto Word,
El lenguaje oficial de la revista es espa- ya que el consejo de redacción no dispo-
ñol, aunque excepcionalmente se acep- Las palabras claves son aquellas que per- ne de capacidades para mecanografiar los
tarán contribuciones en inglés, francés miten identificar el contenido del artí- artículos. Se acepta el envío de manus-
y portugués. El estilo de escritura debe culo y que facilitan la identificación en critos por correo electrónico, como do-
ser totalmente impersonal, con criterio los índices de materia. Debe incluir las cumentos adjuntos al mensaje o carta de
de exactitud, brevedad y párrafos cor- taxas de los entes biológicos. presentación, siempre que no posean fi-
tos. Debe utilizarse el sistema métrico La introducción debe tener una breve guras. Los manuscritos se enviarán a:
decimal. Los nombres científicos se es- referencia de los antecedentes específi- Instituto de Investigaciones de Sanidad
cribirán completos, incluyendo el autor, cos del trabajo, así como una revisión Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5a.B y 5a.F,
y siguiendo los códigos internacionales breve de las referencias más recientes Playa, Ciudad de La Habana
(ejemplo: Leucoptera coffeella Guerin que se relacionan con el tema que se
Meneville). Si es necesario utilizarlos en No se aceptan manuscritos que no es-
presenta. También se incluirá el objeti- tén acompañados de la Declaración del
varias partes del texto, entonces se es- vo del trabajo.
cribirán completos la primera vez que Autor.
aparezcan y luego se abrevian (ejemplo: Los materiales y métodos deben ser cla- También pueden enviarse por correo
L. coffeella). Se escriben en cursiva o se ros y concretos, se redactarán según un electrónico: lvazquez@inisav.cu
subrayan. orden lógico de los métodos empleados.
De igual forma se escribirán claramente • Revisión de los manuscritos
• Estructura de los artículos los procedimientos analíticos y estadísti- Los trabajos enviados al Comité Edito-
Los artículos científicos tendrán la es- cos utilizados. Se pueden citar los méto- rial serán sometidos a un proceso de
tructura siguiente: título, autor(es), dos y procedimientos, siempre que ha- arbitraje y corrección de estilo. Los au-
afiliación de los autores, resumen y yan sido publicados en revistas científicas. tores colaborarán con los árbitros y co-
palabras claves (español e inglés), intro- Los resultados se pueden expresar apo- rrectores a evacuar cualquier duda al
ducción, materiales y métodos, resulta- yados en tablas y/o figuras, con una dis- respecto y efectuar, si es preciso, las
dos y discusión, conclusiones (si las cusión a partir de referencias actuales. modificaciones que se le sugieran. El
hubiera), agradecimientos (si los hubie- Deben presentarse de manera lógica, Comité Editorial se reserva el derecho
ra), referencias. interpretando las conclusiones. Las fi- de aprobar o rechazar los trabajos pro-
Las reseñas adoptarán la siguiente es- guras se deben elaborar solamente en puestos, lo cual será notificado oportu-
tructura: título, autor(es), afiliación de Word u otro programa compatible. namente a los interesados.

294/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE TRICHODERMA HARZIANUM


POR FERMENTACIÓN LÍQUIDA

Rosaima García,1 María A. Durán1 y Ramón Riera2


1
Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Mérida, Venezuela, AP 25, teléf. 0251-2630090,
rgcrespo@inia.gov.ve.
2
Servicio Autónomo de Sanidad Agropecuaria. Mérida, Venezuela

RESUMEN ABSTRACT
Con el objeto de mejorar la eficiencia en la producción masiva de In order to improve the efficiency of Trichoderma harzianum massive
Trichoderma harzianum Rifai se evaluó la metodología de producción production a methodology by static liquid fermentation in handmade
por fermentación líquida estática en forma artesanal. Para ello se form was evaluated. French brown sugar loaf cane molasses and
utilizó como sustrato melaza de trapiche de caña panelera fresca y granulated Bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) were utilized
levadura panadera granulada (Saccharomyces cerevisiae). Se usa- as substratum. In glass bottles of 500 mL were place 100 mL of 5%
ron frascos de vidrio transparente de 500 mL donde se colocaron 100 mL molasses solution, it was added distilled water to 200 mL, and pH was
de solución de melaza a 5%, se llevó a 200 mL con agua destilada y adjusted to 5.5. These were sterilized in autoclave at 121ºC and 15
se ajustó el pH a 5,5. Se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 15 PSI PSI for 20 minutes, putting at rest for 24 h and then were added 10 g of
por 20 min, se dejaron reposar 24 h y luego se agregó 10 g de levadu- yeast (5%). The inoculation was made with 5 mL of Trichoderma
ra (5%). Se inoculó con 5 mL de suspensiones de conidios de harzianum conidia suspensions (1 x 1010 ufc), shaked and incubated
Trichoderma harzianum (1 x 1010 ufc), se agitaron e incubaron en in inclined static form during 14 days until getting complete production
forma estática inclinada durante 14 días hasta obtener la producción of conidia. Develop of different structures or fungus biomass
completa de conidios. Se encontró desarrollo de diferentes estructu- (mycelium, conidia and clamidosphora) since two days was found.
ras o biomasa del hongo (micelio, conidios y clamidosporas) a partir Conidia production finished between 8 and 14 days, in accordance
de dos días. La producción de conidios se completó entre 8-14 with strain T 12 = 1.8 x 10 9 ufc, T 3 = 5.8 x 10 8 ufc, IUTE = 5.4 x 108 ufc,
días, de acuerdo con la cepa T 12 = 1,8 x 109 ufc, T 3 = 5,8 x 10 8 ufc, Natibiol = 4.2 x 108 ufc, T8 = 5.8 x 108 ufc, Inprodica = 6.4 x 108ufc, T2 =
IUTE = 5,4 x 108 ufc, Natibiol = 4,2 x 108 ufc, T8 = 5,8 x 108 ufc, Inprodi- 3.0 x 108 ufc, T11 = 2.8 x 108 ufc, T1 = 2.6 x 108 ufc and Bioagrícola = 5 x 107
ca = 6,4 x 108 ufc, T2 = 3,0 x 108 ufc, T11 = 2,8 x 108 ufc, T1 = 2,6 x 108 ufc ufc. With this process is speeded up the obtaining of fungus inoculums
y Bioagrícola = 5 x 107 ufc. Con este proceso se acelera la obtención for the production process, and it is obtained before three days with
de inóculo del hongo para el proceso de producción, lo que se logra regard to normal conidia production by solid fermentation used to
antes de tres días en relación con la producción normal de conidios resuspend and apply as inoculums, which is reached between six
por fermentación sólida usados para resuspender y aplicar como and seven days.
inóculo, el cual se alcanza entre seis y siete días.
Key words: biomass, Trichoderma, liquid fermentation
Palabras claves: biomasa, Trichoderma, fermentación líquida

INTRODUCCIÓN
La versatilidad, adaptabilidad y la fácil manipulación uso comercial; pero el material seco es el preferido, de-
de las especies del hongo Trichoderma permite su uso bido a que uno de los aspectos más importante en la
efectivo en el control biológico. Trichoderma spp. pro- comercialización es el peso y la manipulación de los pro-
duce tres tipos de propágalos como son hifas, cla- ductos. Las hifas son poco resistentes al secado, por lo
midosporas y conidios, que son activas contra que se trabaja en las formulaciones de las formas
fitopatógenos en diferentes fases del ciclo de vida, des- reproductoras (conidios y clamidosporas) como polvos
de la germinación de las esporas hasta la esporulación humedecibles, polvos secos, formulaciones en aceite y
[Fernández-Larrea, 2002]. encapsulados que contienen el hongo.
De acuerdo con Fernández-Larrea (2002) existen dife- Los conidios son más resistentes que las clamidosporas
rentes formulaciones de hongos antagonistas, las cua- y se producen en mayor cantidad por diferentes vías:
les se usan en dependencia del mecanismo de acción para sobre soporte sólido y en cultivos líquidos estáticos y

fitosanidad/295
García y otros

agitados, aunque más débil debido a que la pared celu- de Fitopatología del Instituto Nacional de Investiga-
lar es más delgada, de tal manera que son menos resis- ciones Agrícolas del estado de Mérida (INIA-Mérida).
tentes a las condiciones adversas del ambiente, como Para iniciar el trabajo se hizo una reactivación de las
los rayos ultravioletas del sol y a la tecnología de apli- cepas; se sembró por duplicado en el medio de cultivo
cación, ya que se puede romper más rápidamente y agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 27oC de
dañarse antes de realizar su efecto de biocontrol. tres a cinco días. Las cepas de T. harzianum utilizadas
Sin embargo, la producción de Trichoderma líquido re- fueron siete no comerciales (T1, T2, T3, T8, T11, T12,
presenta una alternativa para cuando la demanda es alta, IUTE) y tres comerciales (Natibiol, Inprodica y
ya que de esta manera se acelera el proceso de produc- Bioagrícola). La producción del inóculo del hongo en
ción masiva y se obtiene el producto en un tiempo más forma líquida se realizó a partir de una solución de 100 mL
corto, con mayor cantidad y variedad de propágalos, lo de melaza a 5%, que se aforó a 2000 mL con agua des-
cual indiscutiblemente aumenta su eficiencia. tilada, y se ajustó a pH 5,5. La solución se dispensó en
Por otro lado, una de las formas de acelerar el proceso de frascos de vidrio de 500 mL, en una cantidad de 200 mL
producción es el uso de métodos combinados, es decir, a por frasco y se esterilizó en autoclave a 121ºC y 15 PSI
través de fermentación bifásica, en que se utiliza un pro- por 20 min, se dejaron reposar 24 h y entonces se le
ceso de fermentación líquida para la obtención de un buen añadió 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en
inóculo que luego se inocula sobre sustratos sólidos. forma aséptica bajo la cámara de flujo laminar.
La producción del hongo en forma líquida se llevó a cabo
Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) demues-
a partir de una solución de 100 mL de melaza de trapi-
tran que en el proceso de fermentación líquida de T. har-
che de caña panelera fresca a 5% que se diluyó a 2000 mL
zianum se obtienen sustancias promotoras de crecimien-
de agua destilada y se ajustó el pH a 5,5. La solución se
to (ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas y
dispensó en frascos de vidrio de 500 mL, a razón de 200
vitaminas), las cuales son una clase de péptido. Cuan-
mL por frasco, se esterilizó en autoclave a 121oC, 15 PSI
do aplicaron T. harzianum sobre la rizósfera de plan-
tas inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno se por 20 min y se dejaron reposar 24 h; luego se le añadió
logró un aumento del tamaño de los nódulos radiculares 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en forma
y se produjo un incremento en la eficiencia de la fija- aséptica bajo la cámara de flujo laminar.
ción de nitrógeno. A las placas de Petri con los cultivos de Trichoderma se
les agregaron 10 mL de agua destilada estéril, se agitó
El método más comúnmente utilizado en Venezuela
un poco, se tomaron 5 mL de suspensiones de conidios
para la producción masiva del hongo Trichoderma es
de cada cepa (1 x 1010 ufc) y se inoculó en cada frasco
por fermentación sólida monobásica, con el uso de
que contenía la solución de melaza más levadura.
sustrato alimenticio sólido tanto para la producción de
inóculo como para la obtención final del biopreparado. Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparon
En otros casos se obtienen formulaciones líquidas por con algodón y papel aluminio, y sellaron con parafilm
resuspensión de los conidios proveniente de una fermen- para proporcionarles condiciones asépticas. Se some-
tación sólida [Zambrano, 2005]. tieron a agitación y se incubaron en forma estática in-
El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la meto- clinada durante 14 días hasta obtener la producción
dología de producción líquida estática en forma completa de conidios. Cada tratamiento se repitió diez
artesanal mediante el uso de melaza de caña panelera, veces. Las observaciones se hicieron todos los días para
obtenida en la zona (estado de Mérida), más levadura detectar tipo de estructuras producidas y luego medir
panadera como sustrato alimenticio líquido para la ob- las cantidades.
tención del inóculo del hongo T. harzianum, a fin de La determinación de la concentración de conidios por
mejorar la eficiencia en tiempo y producción de biomasa mililitros se realizó en cámara de Newbauer por medio
dentro del proceso de producción masiva. del microscopio óptico y un objetivo de 40X, en una di-
lución de 102, y se calculó por la fórmula [Lecuona, 1996]:
MATERIALES Y MÉTODOS Concentración (ufc.mL = Número de conidios x 4 x 106 x dilución)

Se utilizaron 10 cepas de T. harzianum pertenecientes a Se realizaron observaciones directas al microscopio óp-


la Colección de Hongos Antagonistas del Laboratorio tico de muestras tomadas a las 24 h de incubación de
296/fitosanidad
Producción de biomasa de Trichoderma...

las siembras realizadas en placas con PDA para des- ficativas en el tiempo necesario para la obtención final
cartar las posibles contaminaciones. Los datos sobre de conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la produc-
concentración de conidios se analizaron a través del ción en solo ocho días, que fue la más rápida, seguidas
programa Estadística 6.0. de T8, T2 y T3 que lo lograron en diez. Las demás nece-
sitaron entre 12 y 14 días.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Lo anterior indica que existe una alta variación en cuan-
to a la obtención final de estructuras reproductivas de
En la Tabla 1 se observan los resultados sobre produc-
Trichoderma cuando se usa medio líquido, y que ello
ción de biomasa de Trichoderma bajo fermentación lí-
está estrechamente relacionado con el comportamiento
quida. Se encontró que todas las cepas lograron produ-
de la cepa a pesar de que todas son T. harzianum.
cir biomasa del hongo a partir de dos días. La producción
de conidios se alcanzó entre 8-14 días. Hubo alta pro- Trabajos similares se han realizado en Cuba para la
ducción de micelios y clamidosporas, y además se en- obtención de Trichoderma por fermentación líquida con
contró una alta concentración de conidios que varió el uso de melaza de caña de azúcar y levadura torula, y
desde 5,7 x 107 en la cepa comercial Bioagrícola hasta se logró producir una concentración de 2-3 x 108 conid./mL
1,81 x 109 ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significa- [Fernández-Larrea, 2002; Fernández-Larrea et al., 1992;
tivas entre las cepas en cuanto a producción de conidios. Stefanova et al., 1999].
También se observaron diferencias en forma cualitati- Asimismo Prakash y Lumsden (2006), con el objeto de
vas en cuanto a la producción de micelios y clami- obtener un preinóculo líquido de especies de Tricho-
dosporas. derma utilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto de leva-
De acuerdo con la prueba de medias de LDS a 5%, to- dura en 100 mL de agua, y lograron una producción de
das las cepas tuvieron diferentes comportamientos en 103-108 ufc. En tanto, en el proceso de producción de
cuanto a producción de conidios. La que presentó mejor biomasa, cuando utilizaron 2,5 g de extracto de leva-
producción fue T12, seguida de la comercial Inprodica, dura y 500 mL de melaza en 1 L de agua, lograron una
T8 y IUTE. Se encontraron también diferencias signi- producción de 106 a 107 clamidosporas/mL.

Tabla 1. Producción de biomasa y conidios de diferentes cepas de T. harzianum


bajo fermentación líquida
Producción Tiempo Producción de Tiempo Producción Tiempo
Cepas
de micelios (días) clamidosporas (días) de conidios (días)
T12 +++ 2 ++ 7 1,81 x 109 a 8
Cepa comercial
+ 2 + 8 6,4 x 108 b 12
Inprodica
T3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10
T8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10
IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 108 d 8
Cepa comercial
++ 3 + 8 5,0 x 107 e 14
Biogrícola
Cepa comercial
++ 3 ++ 8 4,2 x 108 f 14
Natibiol
T2 +++ 2 + 9 3,0 x 108 g 10
T11 ++ 2 + 9 2,8 x 108
h 14
T1 ++ 2 + 10 2,6 x 10 i
8 14
CV 4,4%
Sx 0,378
Letras distintas son diferentes en la prueba de LSD con probabilidad menor o igual a 5%.

fitosanidad/297
García y otros

CONCLUSIONES REFERENCIAS
• La producción de biomasa del hongo T. harzianum a Fernández–Larrea, O.; A. Calderón; M. Fraga: «Metodología de re-
producción de cepas de Trichoderma spp. para el biocontrol de
través del proceso de fermentación líquida es varia- hongos fitopatógenos». Informe Técnico de Investigación, INISAV,
ble, depende del comportamiento de la cepa, por lo 1992.
que se requiere realizar pruebas preliminares antes Fernández–Larrea, O.: «Control biológico de enfermedades de plan-
de aplicar este método para reproducción de una cepa tas», Control Biológico de Plagas Agrícolas, Managua, Serie Técni-
ca CATIE no. 53, 2002, pp. 160-184.
en forma masiva.
Lecuona, R.: Microorganismos patógenos empleados en el control
• La melaza de trapiche panelera fresca y levadura de microbiano de insectos plaga, Talleres Gráficos Mariano MAS, Bue-
cerveza, probada por primera vez en Venezuela como nos Aires, 1996.
suplementos nutricionales de T. harzianum para la ob- Prakash Hebbar, K.; D. R. D. Lumsden: «Formulation and Fermentation
tención de biomasa por fermentación líquida, resultó of Biocontrol Agents of Cacao Fungal Pathogens: Example of
Trichoderrma Species», http://www.cabi-commodities.org/Acc/
exitosa. Se desarrollaron estructuras reproductivas del ACCrc/PDFFiles/W-BPD/Ch7.pdf. Revisado en marzo del 2006.
hongo: micelio, clamidosporas y conidios. Se requiere Stefanova, M.; A. Leiva; L. Larrinaga; M. F. Coronado: «Actividad
validar el método a mayor escala. metabólica de cepas de Trichoderma spp. para el control de hongos
• Debido a la alta cantidad de estructuras reproduc- fitopatógenos del suelo», Rev. Fac. Agron. (Luz) 16:509-516, 1999,

tivas obtenidas por este método de fermentación lí- Wei Lin, Liang Zhi-Huai; Zhang, Zhi-Guang; Luo, He-Rong: «Effects of
Peptide in the Fermentation Liquid of Trichoderma harzianum on
quida, se puede recomendar su utilización en la fase Nodule Microstructure and Function of Cowpea», Acta Laser Biology
de preparación de inóculo dentro del proceso de pro- Sinica 1-1, 2006.
ducción para agilizarlo, así como para la producción Zambrano, C.: «Historia y experiencias del control biológico en Vene-
final de propágalos a utilizar en campo para el zuela». Memorias del Curso-Taller Control Biológico: Herramienta
Básica en Una Agricultura Sostenible, Trujillo, 29 y 30 de septiembre
biocontrol de enfermedades de plantas. del 2005.

298/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

CARACTERIZACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUM


A TRAVÉS DEL ESTUDIO DE SU DIVERSIDAD GENÉTICA
Reseña

Yelaine Tejeda Gómez


Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ytejeda@inisav.cu

RESUMEN ABSTRACT
La bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es causante de la Ralstonia solanacearum causes bacterial wilt in many important crops
marchitez bacteriana en diversos cultivos de importancia económica in tropical and subtropical regions, and some mild climate countries.
en regiones de clima tropical y subtropical, así como en diversos The species is taxonomically complex and the strains show a high
países de clima templado. La especie constituye una unidad diversity at different levels as physiological, serological, genetic, and
taxonómicamente compleja en la que las cepas muestran una amplia host range. RFLP analysis has provided a new classification system
diversidad a nivel fisiológico, serológico, genético y de rango de in which the species is divided in Americanum and Asiaticum groups,
hospedantes. El análisis por RFLP proporciona un nuevo esquema related to the geographic origin of the strains. Since these preliminary
de clasificación al dividir la especie en los grupos Asiaticum y investigations were performed, the development of molecular
Americanum, en relación con el origen geográfico de las cepas. A techniques in the study of Ralstonia solanacearum genetic diversity
partir de estos análisis preliminares se ha incrementado el empleo y has increased. In this paper, the most outstanding contributions of
desarrollo de las técnicas moleculares para el estudio de la diversi- various researches groups in this field are outlined. These
dad genética dentro de esta especie bacteriana. En el presente tra- investigations have improved the comprehension of phylogenetic and
bajo se destacan los principales aportes que, con el empleo de téc- evolutionary relationships among Ralstonia solanacearum strains.
nicas moleculares, han realizado varios grupos de investigación a la
Key words: Ralstonia solanacearum, bacteria, genetic diversity
comprensión de las relaciones filogenéticas y evolutivas entre las
cepas.
Palabras claves: Ralstonia solanacearum, bacteria, diversidad
genética

INTRODUCCIÓN
La bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es Ralstonia solanacearum es una especie heterogénea que
causante de la marchitez bacteriana en diversos culti- se encuentra poco relacionada filogenéticamente con
vos en regiones de clima tropical y subtropical otros grupos del género Pseudomonas. Las únicas espe-
[Kelman, 1953], así como en algunos países de clima cies que muestran relación con ella son P. picketii –pató-
templado [Hayward, 1991; Janse, 1996]. La enferme- geno ocasional en humanos– y P. syzygii, causante del
dad afecta a varios cientos de especies vegetales dis- marchitamiento del clavo de olor en Sumatra [Seal et
tribuidas en más de cincuenta familias [Hayward, al., 1993; Taghavi et al., 1996]. Las evidencias sugieren
1994]. Dentro de ellas se encuentran cultivos de im- que R. solanacearum es una especie que surgió tempra-
portancia económica como papa (Solanum tuberosum, no en la historia geológica, posiblemente como un pa-
Sw.), tabaco (Nicotiana tabacum, Lin.), tomate tógeno de los ancestros de las plantas modernas
(Licopersicum esculentum, Mill.), pimiento (Capsicum [Sequeira, 1994]. Buddenhagen y Kelman (1964) con-
annuum, L.), plátano y banano (Musa sp.), berenje- cluyeron que las cepas de R. solanacearum son el pro-
na (Solanum melongena, L.), además de numerosas ducto de un largo proceso evolutivo que se ha produci-
plantas ornamentales, medicinales, malezas y algu- do de manera independiente en varias áreas geográficas
nas especies silvestres [Kelman, 1953]. y en diferentes hospederos. Esta hipótesis se ha confir-

fitosanidad/299
Tejeda Gómez

mado por estudios del material genético [Cook et al., el Rep-PCR, el polimorfismo de longitud de fragmen-
1989]. tos amplificados (Amplified Fragment Length
La especie R.solanacearum constituye una unidad Polymorphism (AFLP)) y la secuenciación de regiones
taxonómicamente compleja en la que las cepas mues- específicas del genoma. El empleo de cada una de ellas
tran una amplia diversidad a diferentes niveles: fisioló- ha contribuido a una caracterización y diferenciación
gico, serológico, genético y de rango de hospedantes. El más acertadas de las cepas. El análisis a nivel genético
gran número de cepas de R. solanacearum existente en de las cepas ofrece la posibilidad de estudiar las rela-
todo el mundo dificulta el establecimiento de criterios ciones filogenéticas y evolutivas entre ellas.
para la diferenciación de cepas, aspecto esencial para el Contribución de los estudios de diversidad genética
trabajo de los taxónomos y del personal de cuarentena. a la diferenciación intraespecífica de las cepas
Con el objetivo de describir esta variabilidad intra- de Ralstonia solanacearum
específica se han propuesto diversos sistemas de clasi-
Los primeros trabajos que constituyeron un hito en el
ficación.
estudio de la diversidad genética del patógeno fueron
Se conocen cinco razas de R. solanacearum cuya separa- reportados por Cook et al. (1989) y Cook y Sequeira
ción está basada en el rango de los hospedantes y la (1994). Estos investigadores utilizaron el Southern
habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones blotting-RFLP con nueve sondas, lo que les permitió
ambientales [Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983; detectar y localizar secuencias específicas en el ADN,
Buddenhagen, 1985; Pegg y Moffett, 1971]. La utiliza- las cuales contenían información esencial para la viru-
ción de tres disacáridos y/u oxidación de tres hexosa lencia y la respuesta de hipersensibilidad. Estas secuen-
alcoholes ha permitido la separación de los aislamien- cias se sometieron a digestión con enzimas de restric-
tos en seis biovares [Hayward, 1964; He et al., 1983; ción específicas. La ubicación de los sitios de corte para
Hayward et al., 1990]. El sistema de clasificación en una enzima de restricción determinada dentro de un
razas y biovares es confuso, pues cada biovar contiene locus de interés puede variar de una cepa a otra, y traer
cepas con diferentes rangos de hospedantes, y varias como resultado fragmentos que difieren en tamaño en
razas contienen una amplia diversidad de cepas perte- cepas diferentes [Olive y Bean, 1999]. El análisis de los
necientes a diferentes biovares. Solo existe correspon- patrones electroforéticos obtenidos por este procedi-
dencia entre la raza 3 y el biovar 2. El análisis de ácidos miento posibilitó establecer la existencia de dos grupos
grasos [Janse, 1991] y del perfil de proteínas [Dianese o divisiones con un coeficiente de similitud de 13,5%:
et al., 1994] no ha logrado esclarecer las relaciones en- la división I, que incluyó los biovares 3, 4 y 5, y la divi-
tre las cepas ni el establecimiento de un criterio de cla- sión II, formada por las cepas de biovares 1, 2 y N2.
sificación uniforme. Esto hace que los métodos tradi- Dentro de cada división los coeficientes de similitud
cionales de clasificación no sean lo suficientemente resultaron ser muy elevados, y fueron mayores den-
efectivos [Poussier et al., 1999; Sequeira, 1994]. tro de la división I. Más del 90% de las cepas de la
Estas dificultades condujeron a la búsqueda de un nue- división I procedían de Asia y Australia (división
vo sistema de clasificación basado en el análisis del ma- Asiaticum), mientras que 98% de las cepas de la divi-
terial genético. Muchas de las técnicas moleculares em- sión II eran originarias de las Américas (división
pleadas en la actualidad tienen como fundamento común Americanum).
la separación de fragmentos de ADN de diferentes pesos Estas divisiones se han confirmado por análisis de la
moleculares. El resultado electroforético se representa secuencia del gen que codifica para el ARN ribosomal
por un patrón de bandas en un gel. Estos patrones sue- 16 S [Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Taghavi et al.,
len ser muy complejos y de difícil interpretación. 1996]. El análisis de esta secuencia permitió estudiar
Entre las técnicas utilizadas para el estudio de R. sola- las relaciones filogenéticas y evolutivas entre los
nacearum se encuentran el polimorfismo de longitud de microorganismos, dado su elevado contenido infor-
fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length macional, su naturaleza conservativa, su distribución
Polymorphism (RFLP)) en sus dos variantes: Southern universal y la accesibilidad de las secuencias en bancos
blotting-RFLP y PCR-RFLP, el ADN polimórfico de genes [Woese, 1987]. Las secuencias de los genes que
aleatoriamente amplificado (Random Amplified codifican para el ARNr 16S son por lo general específi-
Polymorphic DNA or Arbitrary Primed PCR, RAPD), cas para cada especie y están presentes en múltiples

300/fitosanidad
Caracterización de Ralstonia...

copias en el genoma, lo que las hace excelentes para la pecíficos para los adaptadores [Olive y Bean, 1999]. El
identificación de bacterias a nivel de especie. Taghavi et AFLP permitió una fina discriminación entre los ais-
al. (1996) demostraron la existencia de dos subdivisiones lamientos y logró diferenciar cepas que resultaron
dentro de la división Americanum: la 2b, que contiene indistinguibles por PCR-RFLP. De las 96 cepas anali-
aislamientos pertenecientes a los biovares 1, 2 y N2 zadas por AFLP se obtuvieron 60 patrones diferentes,
procedentes de Indonesia, y la 2a que incluye el resto y se observó el 95% de polimorfismo en las bandas,
de las cepas de biovares 1, 2 y N2. En este trabajo se mientras que en el análisis por PCR-RFLP, de 178 ce-
reportó una cepa biovar 2 atípica, similar a las cepas de pas se obtuvieron 20 patrones diferentes. Incluso al
biovares 3 y 4 estudiadas, por lo que se agrupó dentro compararse con lo obtenido por Cook et al. (1989, 1991)
de la subdivisión Asiaticum. y Cook y Sequeira (1994), donde se produjeron 46 perfi-
Fegan et al. (1998) realizaron el análisis de la secuencia les diferentes a partir de 164 cepas analizadas, se
de la región intergénica 16S-23S RNA. Dada la elevada demuestra que el AFLP tiene un nivel de resolu-
similitud de secuencia de los genes que codifican para ción superior para la diferenciación intraespecífica
ARNr 16S en las cepas de R. solanacearum, resulta más de R.solanacearum. El AFLP posibilitó una separa-
factible el análisis de la región espaciadora entre 16S y ción más definida entre cepas de biovar 2 y N2, y tam-
23S, que produce información filogenética más valiosa bién entre cepas de biovares 3, 4 y 5. El AFLP y el
al ser mayor su grado de variabilidad entre diferentes PCR-RFLP confirmaron que el biovar 2 es el menos
cepas [Barry et al., 1991; Leblond-Bourget et al., 1996]. diverso genéticamente entre todos los biovares [Cook et
En este trabajo se analizaron además las secuencias de al., 1989; Cook y Sequeira, 1994; Smith et al., 1995; Van
los genes que codifican para las enzimas poli- Der Wolf et al., 1998; Thammakijjawat, 2001].
galacturonasa y endoglucanasa. En todos los casos se Pese a que los estudios llevados a cabo por Poussier et
confirmó el sistema de clasificación obtenido por al. (2000) confirmaron la clasificación ofrecida por Cook
Taghavi et al. (1996). et al. (1989), se encontraron excepciones en este esque-
El análisis PCR-RFLP de diferentes regiones del ma. Los resultados confirmaron la presencia de una
genoma bacteriano demostró también la existencia de subdivisión formada por cepas biovar 1 del sur de Áfri-
las divisiones Asiaticum y Americanum [Gilling et al., ca. Aunque el análisis por PCR-RFLP mostró una
1993]. Poussier et al. (1999), por medio del PCR-RFLP, mayor homología entre estas cepas y las cepas biovar 1
analizaron regiones del gen hrp relacionado con la res- de la división Asiaticum, el análisis por AFLP y la
puesta de hipersensibilidad, y tuvieron resultados ma- secuenciación de genes para ARNr 16S arrojaron un
yormente consistentes con lo reportado por Cook et al. resultado opuesto. Las cepas biovar 1 del sur de África
(1989); sin embargo, encontraron que las cepas biovar 1 fueron por lo tanto incluidas en una nueva subdivisión
del sur de África quedaban agrupadas en una subdivi- –2c– con respecto a lo reportado por Taghavi et al.
sión diferente, la cual poseía mayor homología con las (1996). La explicación más probable a la diferencia exis-
cepas de la división Asiaticum que con las de la divi- tente entre las cepas biovar 1 africanas y americanas es
sión Americanum. Para esclarecer las relaciones entre un desarrollo evolutivo diferenciado debido a la sepa-
las cepas biovar 1 del sur de África y otras cepas de R. sola- ración geográfica. Otros aislamientos africanos que
nacearum ampliaron el estudio con la inclusión de 59 pertenecen a la división Americanum pueden haber sido
cepas, dentro de las que se encontraban las de biovares introducidas al continente africano por medio de inter-
N2 y 5, así como nuevas cepas africanas. cambios comerciales.

Como resultado de estas nuevas investigaciones, No obstante la gran cantidad de investigaciones que
Poussier et al. (2000) reportaron por primera vez el apoyaron y enriquecieron los estudios preliminares de
empleo de la técnica AFLP para el análisis de una co- Cook y colaboradores, el análisis de nuevos aislamien-
lección de cepas internacionales dentro de un estudio tos aportó resultados que demuestran el elevado grado
de diversidad genética. Este método pertenece a la ca- de complejidad taxonómica de esta especie bacteriana.
tegoría de las técnicas de amplificación selectiva de frag- En 1998 Tsuchiya y Horita reportaron el análisis de 64
mentos de restricción, basadas en la ligazón de cepas japonesas por medio de diferentes técnicas
adaptadores a fragmentos de restricción genómicos se- moleculares: el Southern blotting-RFLP con cuatro
guido de una amplificación por PCR con cebadores es- sondas específicas para DNAr 23S y 16S (también co-

fitosanidad/301
Tejeda Gómez

nocido como ribotyping), el PCR-RFLP y el Rep-PCR. mecanismos más importantes en la generación de di-
Las cepas analizadas correspondían a raza 1 (biovares versidad genética [Galas et al., 1989]. En algunos casos
1, 2, 3 y 4) y raza 3 (biovar 2). Según el esquema de la localización de secuencias de inserción específicas en
clasificación de Cook et al. (1989), las cepas raza 1 de- sitios definidos del cromosoma es lo suficientemente
bían pertenecer a la división Asiaticum y las cepas raza 3 estable como para permitir su análisis por RFLP
a la división Americanum. Como resultado del empleo [Mahillon y Chandler, 1998]. La caracterización
de las técnicas mencionadas anteriormente se logró molecular de cepas con el uso de secuencias de inserción
obtener una clara diferenciación entre las cepas de raza puede reflejar mejor la organización del genoma
1 y raza 3. Con Southern blotting-RFLP el coeficiente bacteriano que la búsqueda de diferencias en las se-
de similitud entre raza 1 y 3 fue de 15,4%, y dentro de cuencias [Lee et al., 2001]. En este trabajo la IS1405 se
la raza 1 de 75,5%. Los patrones electroforéticos obte- empleó como sonda en un análisis por RFLP, lo que
nidos a partir de cepas raza 1 (biovares 1, 2, 3 y 4) permitió clasificar cepas de raza 1 de Taiwán.
fueron similares a los patrones de los biovares 3, 4 y 5 El estudio de la diversidad genética entre las cepas de
de la división Asiaticum. Los patrones de las cepas raza R. solanacearum no solo permitió conocer más clara-
3/biovar 2 fueron similares a los de las cepas biovar 1 de mente las relaciones filogenéticas y evolutivas entre
la división Americanum, lo que apoya la hipótesis plan- ellas, sino que proporcionaron nuevas herramientas
teada por Buddenhagen (1985), quien sugirió que la raza para el esclarecimiento de numerosas interrogantes
3 se originó en la región andina de Sudamérica, de don- como la posible correlación entre diversidad genética y
de es originaria la papa, su principal hospedante, y que la virulencia de las cepas [Darrase et al., 1998].
la aparición de raza 3 fuera de esta región es resultado
del comercio internacional. La distribución de las ce-
pas japonesas raza 1 (biovares 1 y 2) no se corresponde CONCLUSIONES
con lo reportado por Cook et al. (1989). Las nueve ce- • Los métodos de estudio de la diversidad genética de
pas japonesas raza 1/biovar 2 resultaron ser homogé- R. solanacearum se han desarrollado vertiginosamen-
neas a la cepa atípica perteneciente a la división te desde finales del pasado siglo a partir de los estu-
Asiaticum reportada por Taghavi et al. (1996). Con res- dios preliminares realizados en este campo, los que
pecto a las cepas raza 1/biovar 1, fueron semejantes a lograron suministrar un sistema de clasificación con
las cepas japonesas raza 1/biovar 4, y no a los biovares el empleo del RFLP que fue de gran utilidad para
1 americanos. Estas cepas pueden ser mutantes de raza estudios posteriores.
1/biovar 4 que perdieron la capacidad de degradar las • El sistema de clasificación se ha corroborado por los
tres hexosas alcoholes. resultados de otros investigadores, y se ha enrique-
Thammakijjawat et al. (2001) realizaron el análisis cido en el transcurso de los años con la definición de
PCR-RFLP de cepas tailandesas y otras internaciona- nuevas subdivisiones.
les tuvieron con Cook et al. (1989) resultados consis- • Los métodos moleculares para la caracterización
tentes. Las excepciones fueron dos cepas biovar 1 genética han probado ser imprescindibles, reflejado
atípicas y tres cepas biovar N2 de Japón, que se agru- en su amplia adopción por diversos grupos de inves-
paron dentro de la división Asiaticum. Excepciones de tigación y los resultados promisorios de su empleo.
este tipo fueron reportadas por Horita y Tsuchiya
(2001). REFERENCIAS
Aunque actualmente existe una mejor comprensión de Abdel-Kader, D.; L. Seigner; M. Zellner: «Epidemiological Field Studies
on Bacterial Ring Rot (Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus)
la diversidad intraespecífica de la bacteria R.sola- and Brown Rot (Ralstonia solanacearum) of Potato», Gesunde
nacearum, las investigaciones en este campo continúan Pflanzen 52:240-247, 2000.

con la búsqueda de nuevas metodologías de mayor sen- Barry, T.; G. Colleran; M. Glennon; L. K Dunican; F. Gannon: «The 16S/
23S Ribosomal Spacer Region As a Target for DNA Probes to Identify
sibilidad. Lee et al. (2001) reportaron el aislamiento de Eubacteria», PCR Methods and Applications 1:51-56, 1991.
una secuencia de inserción –IS1405– a partir de una Buddenhagen, I. W.: «Bacterial Wilt Revisited», Bacterial Wilt Disease
cepa de raza 1. Este tipo de secuencia constituye un in Asia and the South Pacific. ACIAR no. 13, Canberra, Australia,
1985, pp.126-143.
componente importante de la mayoría de los genomas
Buddenhagen, I. W.; A. Kelman: «Biological and Physiological Aspects
bacterianos. Las mutaciones y reordenamientos pro- of Bacterial Wilt Caused by Pseudomonas solanacearum», Annu.
vocados por las secuencias de inserción es uno de los Rev. Phytopathol. 2:203-230, 1964.

302/fitosanidad
Caracterización de Ralstonia...
Buddenhagen, I. W.; L. Sequeira; A. Kelman: «Designation of Races in Leblond-Bourget, N.; H. Philippe; I. Mangin; B. Decaris: «16 rRNA and
Pseudomonas solanacearum», Phytopathology 52:162, 1962. 16S to 23S Internal Transcribed Spacer Sequence Analysis Reveal
inter-and Intraspecific Bifidobacterium Phylogeny», Int. J. Syst.
Cook, D.; E. Barlow; L. Sequeira: «Genetic Diversity of Pseudomonas Bacteriol. 46:102-111, 1996.
solanacearum: Detection of Restriction Fragment Length Polymorphisms
with DNA Probes that Specify Virulence and the Hypersensitive Lee, Y.; S. Fan; L. Chiu; K. Hsia: «Isolation of an Insertion Sequence
Response», Mol. Plant-Microbe Interact. 2:113-121, 1989. from Ralstonia solanacearum Race 1 and Its Potential Use for Strain
Characterization and Detection», Applied and Environmental
––––: «DNA Probes As Tools for the Study of Host Pathogen Evolution: Microbiology 67 (9) 3943-3950, 2001.
the Example of Ps. Solanacearum», Advances in Molecular Genetics
Li, X.; M. Dorsch; T. del Dot; L. Sly; E. Stackebrandt; A. C. Hayward:
of Plant-Microbe Interactions 1:103-108, Dordrecht, Kluwer, 1991.
«Phylogenetic Studies of the rRNA Group II Pseudomonads Based on
Cook, D.; L. Sequeira: «Strain Differentiation of Pseudomonas 16S rRNA Gene Sequences», J. Appl. Bacteriol. 74:324-329, 1993.
solanacearum by Molecular Genetic Methods, Bacterial Wilt, the Mahillon J.; M. Chandler: «Insertion Sequences», Microbiology and
Disease and Its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum, Molecular Biology Reviews 62 (3):725-774, 1998.
CAB International, Wallingford, Inglaterra, 1994, pp. 77-93.
Olive, D. M.; P. Bean: «Principles and Applications of Methods for DNA-
Darrase, A.; A. Trigalet; P. Prior: «Phylogeny, Diversity and Molecular Based Typing of Microbial Organisms», Journal of Clinical
Diagnostics of R. solanaceaum», Bacterial Wilt Disease: Molecular Microbiology 37 (6):1661-1669, 1999.
and Ecological Aspects, INRA Editions, París, 1998, pp. 19-33.
Pegg, K.; M. Moffett: «Host Range of the Ginger Strain of Pseudomonas
Dianese, J. C.; M. C. G. Dristig: «Strain Characterization of Pseudomonas solanacearum in Queensland», Aust. J. Exp. Agric. Anim. Husb.
solanacearum Based on Membrane Protein Patterns», Bacterial Wilt, 11:696-698, 1971.
the Disease and Its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum,
Poussier, S.; D. Trigalet-Demery; P. Vandewalle; G. Bruno; L. Jacques;
CAB International, Wallingford, Inglaterra, 1994, pp. 113-121.
A. Trigalet: «Genetic Diversity of Ralstonia solanacearum As
Fegan, M.; M. Taghavi; L. I. Sly; A. C. Hayward: «Phylogeny, Diversity Assessed by PCR-RFLP of the hrp Gene Region, AFLP and 16S
and Molecular Diagnostics of R. solanaceaum», Bacterial Wilt rRNA Sequence Analysis, and Identification of an African
Disease: Molecular and Ecological Aspects, INRA Editions, París, Subdivision», Microbiology 146:1679-1692, 2000.
1998, pp. 19-33. Poussier, S.; P. Vandewalle; J. Luisetti: «Genetic Diversity of African
Galas, D. J.; M. Chandler: «Bacterial Insertion Sequences», Mobile and Worldwide Strains of Ralstonia solanacearum As Determined
DNA, American Society for Microbiology, Washington, 1989, pp. 109- by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of the
hrp Gene Region», Applied and Environmental Microbiology 65
162.
(5):2184-2194, 1999.
Gilling, M.; P. Fahy; C. Davies: «Restriction Analysis of Amplified
Seal, S. E.; L. A. Jackson; J. P. W. Young; M. J. Daniels: «Diffentiation of
Polygalacturonase Gene Fragment Differentiates Strains of the Ps. Solanacearum, Ps. Syzygii, Ps. Pickettii and the Blood Didease
Phytopathogenic Bacterium Pseudomonas solanacearum. Lett.», Bacterium by Partial 16S rRNA Sequencing: Construction of
Appl. Microbiol. 17:44-48, 1993. Oligonucleotide Primers for Sensitive Detection by PCR», Journal of
Hayward, A. C.: «Characteristics of Pseudomonas solanacearum», J. General Microbiology 139, 1587-1594, 1993.
Appl. Bacteriol. 27:265-277, 1964. Sequeira, L.: «The Life and Times of Pseudomonas solanacearum», Plant
Pathogenic Bacteria no. 66, INRA Editions, París, 1994, pp. 37-44.
Hayward, A. C.; H. M. El-Nashaar; U. Nydegger; L. de Lindo: «Variation
in Nitrate Metabolism in Biovars of Pseudomonas solanacearum», J. Smith, J. J.; L. C. Offord; M. Holderness; G. S. Saddler: «Genetic Diversity of
Appl. Bacteriol. 69:269-280, 1990. Burkholderia solanacearum (Synonym Pseudomonas solanacearum)
Race 3 in Kenya», Appl. Environ. Microbiol. 61:4263-4268, 1995.
Hayward, A. C.: «Biology and Epidemiology of Bacterial Wilt Caused by
Pseudomonas solanacearum», Ann. Rev. Phytopathol. 29:65-87, Taghavi, M.; C. Hayward; L. I. Sly; M. Fegan: «Analysis of the
1991. Phylogenetic Relationships of Strains of Burkholderia solanacearum,
Pseudomonas syzygii and the Blood Disease Bacterium of Banana
––––: «The Hosts of Pseudomonas solanacearum», Bacterial Wilt, the Based on 16S rRNA Gene Sequences», Int. J. System. Bacteriol.
Disease and Its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum, CAB 46:10-15, 1996.
International, Wallingford, Inglaterra, 1994, pp. 9-25.
Thammakijjawat, P.; N. Thaveechai; W. Kositratana; J. Chunwongse; R.
He, L. Y.; L. Sequeira; A. Kelman: «Characteristics of Strains of Pseudomonas D. Frederick; N. W. Schaad: «Genetic Analysis of Ralstonia
solanacearum from China», Plant Dis. 67:1357-1361, 1983. solanacearum Strains from Different Hosts in Thailand Using PCR-
Restriction Fragment Length Polymorphism», Kasetsart J. (Nat. Sci.)
Horita, M.; K. Tsuchiya: «Genetic Diversity of Japanese Strains of 35:397-408, 2001.
Ralstonia solanacearum», Phytopathology 91:399-407,2001.
Tsuchiya, K.; M. Horita: «Genetic Diversity of R. solanacearum in
Janse, J. D.: «Infra and Intraspecific Classification of Pseudomonas Japan», Bacterial Wilt Disease: Molecular and Ecological Aspects,
solanacearum Strains Using Whole Cell Fatty Acid Analysis», Syst. INRA Editions, París, 1998, pp. 61-73.
Appl. Microbiol. 14:335-345, 1991.
Van Der Wolf, J. M.; P. J. M. Bonants; J. J. Smith; M. Hagenaar; E. Nijhuis;
––––: «Potato Brown Rot in Western Europe-History, Present Occurrence J. R. C. M. Van Beckhoven; G. S. Saddler; A. Trigalet; R. Feuillade:
and Some Remarks on Possible Origin, Epidemiology and Control «Genetic Diversity of R. solanacearum Race 3 in Western Europe
Strategies», Bulletin OEPP/EPPO, Bulletin 26:679-695, 1996. Determined by AFLP, RC-PFGE and Rep-PCR», Bacterial Wilt
Disease: Molecular and Ecological Aspects, INRA Editions, París,
Kelman, A.: «The Bacterial Wilt Caused by Pseudomonas solana- 1998, pp. 44-49.
cearum», Technical Bulletin. North Carolina no. 99, North Carolina
Agricultural Experiment Station, Estados Unidos, 1953. Woese, C. R.: «Bacterial Evolution», Microbiological Reviews 51:221-
271, 1987.

fitosanidad/303
304/fitosanidad
Tgxkuvc"Fitosanidad
KPKUCX""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""SOLICITUD DE SUSCRIPCIÓN

Tgpqxct"uwuetkrekôp Pwgxc"uwuetkrekôp Cevwcnk|ct"fcvqu

Còqu"swg"uqnkekvc____________________________________ RTGEKQ"FG"UWUETKREKłP
Fkuvtkdwekôp"pcekqpcn<"
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""Hqtocu"fg"rciq""" Ejemplar MN: $10.00 – USD: $10.00
"
Anual MN: $40.00 – USD: $40.00
¾ Rciq"gp"nc"kpuvkvwekôp"fktgevcogpvg"q"rqt"kpvgtogfkctkq"
"
¾ Ejgswg"gp"OP<"Kpuvkvwvq"fg"Kpxguvkicekqpgu"fg"Ucpkfcf"Xgigvcn0"" Gpxîq"fg"glgornct"uwgnvq"cn"gzvgtkqt<"
Ecnng"332"pq0"736"g1"7c0"D"{"7c0"H."Rnc{c."Ekwfcf"fg"Nc"Jcdcpc." América: $ 15.00 Europa: $ 20.00
ER0"338220"""""""""""""""Ewgpvc"Pq0":44"""""" Resto del Mundo: $25.00
""
¾ Ejgswg"gp"ONE<"Gortguc"ECVGE."ewgpvc"DKEUC"Pq0"54323368222 Uwuetkrekôp"cpwcn"{"gpxîq"cn"gzvgtkqt<"
" América: $45.00 Europa: $50.00
""""""""Ug"cegrvcp"ejgswgu"gp"ewcnswkgt"oqpgfc"nkdtgogpvg"eqpxgtvkdng."" Resto del Mundo: $55.00
""""""""gzegrvq"eqpvtc"cigpekcu"dcpectkcu"eqortqogvkfcu"eqp"gn"ukuvgoc"
""""""""pqtvgcogtkecpq"fg"rciqu0"
(Incluye costo de envío)"
"
"""""""Pqodtg"{"Crgnnkfqu1Pcog"cpf"Uwtpcog000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"
"""""""Kpuvkvwekôp1Kpuvkvwvkqp"000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"
"""""""Rtqhgukôp1Rtqhguukqp"00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"
"""""""Fktgeekôp1Cfftguu"000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"
"""""""Eôfkiq"Rquvcn1\kr"Eqfg"000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"""Ekwfcf1Ekv{"000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000"
"""""""Rcîu1Eqwpvt{"000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000""""Vgngh01Vgngrjqpg"””””””””””””0"""Vgnghcz"”””””””””"
"""""""Gockn"””””””””””””””””””””””0"
"""""""Pûogtq"fg"Ewgpvc"{"Cigpekc"Dcpectkc"00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000""
"
Nota: Envíe por correo postal / Cada suscripción tendrá un acuse de recibo
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Comunicación corta

PRIMER REGISTRO DE CECIDÓMIDO ASOCIADO A SÍNTOMAS


DE ROYA EN PLANTAS MEDICINALES EN CUBA

Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600

En los cultivos de plantas medicinales como tilo (Justi- presenta y los síntomas que provoca en las condiciones
cia pectoralis Jacq.), caléndula (Calendula officinalis L.) del país [Veitía et al., 2003]. Con anterioridad se regis-
y verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis (L.) tró en este cultivo por Secades et al. (1989), quienes
Vahl.) se asocian numerosos patógenos fúngicos, entre describen sus síntomas. Acosta (1995) lo menciona como
los cuales están los que ocasionan el síntoma denomi- un patógeno de importancia porque sus daños intensos
nado roya. los causa en el follaje y los tallos, que son las partes
utilizadas para fines medicinales.
En Cuba se informa sobre tilo a Puccinia sp. [Fornet y
Gutiérrez, 1984] y Puccinia justiciae, del cual se des- En colectas realizadas en áreas de producción de plan-
criben sus síntomas, así como su importancia en las tas medicinales y en patios particulares en los munici-
condiciones de la Granja Estatal de Plantas Medicina- pios de Alquízar y San Antonio de los Baños, en la
les en Alquízar [Veitía et al., 2003]. En caléndula se ha provincia de La Habana, y en la de Cienfuegos, se en-
registrado a Puccinia melampodii Diet. & How. en Cuba contró en la mayoría de las ocasiones las larvas de un
[Acosta, 1995] y en el resto del mundo [Farr et al., 1995]. cecidómido (Diptera: Cecidomyiidae) cuando se alimen-
En verbena cimarrona es de importancia Puccinia taba de las pústulas ocasionadas por especies de
urbaniana P. Henn. por el número de áreas donde se Puccinia (Fig. 1).

Figura 1. Larvas de cecidómido asociado a pústulas de roya (Puccinia urbaniana) en


verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis).

fitosanidad/305
Veitía y otros

En más del 50% de las observaciones efectuadas para Bruggmannia Tavares, Johnsonomyia Felt, Meinertomyia
este trabajo, la alta población de larvas coincidió con la Felt y Retinodiplosis Keiffer, aunque no se descarta la
elevada infestación por roya (Tabla 1). En verbena ci- presencia de otras especies en el resto de las Antillas.
marrona se encontraron hasta nueve larvas asociadas a Nieves-Aldrey (1998) refiere que los cecidómidos com-
los síntomas y de una a tres por pústula en tilo. prenden especies micófagas y zoófagas. Asimismo
Según Alayo y Garcés (1989), en Cuba se mencionan las Barranco (2003) menciona especies de cecidómidos que
especies Neolasioptera Felt, Ctenodactylomyia Felt, viven en asociación con ciertos hongos.

Tabla 1. Localidades donde se detectó la presencia de cecidómido asociado a pústulas de roya


Lugar Cultivo Ocurrencia
Roya Cecidómido
Granja Estatal de Plantas Tilo +++ ++
Medicinales Valle Grande, en Caléndula + +
Alquízar
División Experimental del Tilo + –
Instituto de Investigaciones de Verbena cimarrona +++ ++
Sanidad Vegetal
Patio en Guanímar, Alquízar Verbena cimarrona +++ ++
Estación Experimental de Plantas Tilo (en parcelas) ++ +
Medicinales Dr. J. T. Roig, en San Tilo (en vivero a la sombra) +++ ++
Antonio de los Baños
Verbena cimarrona (en vivero a la + –
sombra)
Huerto de plantas medicinales del Verbena cimarrona +++ ++
Instituto Politécnico Agropecuario
O. Jiménez, en Lajas, Cienfuegos
Leyenda para población de cecidómido:
– No se observan larvas.
+ Se observa una larva en una mancha por hoja.
++ Se observa más de una larva en varias manchas por hoja.
Leyenda para infestación por roya:
+ Ligera incidencia de roya en algunas plantas en el campo.
++ Incidencia media: plantas con más del 25% y hasta el 50% del follaje con síntomas.
+++ Incidencia alta de plantas con más del 50% del follaje con síntomas de roya.

REFERENCIAS Fornet, E.; C. Gutiérrez: «Sobre la micoflora de plantas medicinales II»,


revista Plantas Medicinales 4:10-13, Cuba, 1984.
Acosta, L.: Proporciónese salud: cultive plantas medicinales,
Ed. Científico-Técnica, La Habana, 1995. Nieves-Aldrey, J. L. «Insectos que inducen la formación de agallas en
las plantas: una fascinante interacción ecológica y evolutiva», Bole-
Alayo, P.; G. Garcés: Introducción al estudio del orden Diptera en tín SEA 23:3-12, 1998.
Cuba, Ed. Oriente, Santiago de Cuba, 1989.
Secades, M.; C. Gutiérrez; I. de la Osa; M. Martínez: «Hongos patógenos en
Barranco, P. V.: «Dípteros de interés agronómico. Agromícidos plaga
plantas medicinales IV», Revista Cubana de Farmacia 23 (1-2):173-177,
de cultivos hortícolas intensivos», Bol. SEA 33: 293-307, 2003. Dis-
enero-agosto, 1989.
ponible en http://entomologia.rediris.es/aracnet/e2/11/21/
Veitía, M. et al.: «Incidencia, comportamiento y control de plagas en los
Farr, D. F.; G. F. Bills; G. P. Chamuris; A. Y. Rossman: Fungi on Plants and cultivos de caléndula (Calendula officinalis L.), tilo (Justicia pectoralis)
Plants Products in the United States, APS Press, St. Paul, Minn., EE.UU.,
y verbena (Staquitarpheta jamaicensis). Informe Final de Proyecto,
1995.
División Experimental del INISAV, Alquízar, La Habana, enero del 2003.

306/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

OBSERVACIONES SOBRE ENEMIGOS NATURALES DE LA BROCA


DEL CAFÉ (HYPOTHENEMUS HAMPEI FERRARI) EN CUBA

Luis L. Vázquez Moreno,1 Eleazar Blanco Jiménez,2 Orestes Elósegui Claro,1 Yaril Matienzo Brito1 y
Janet Alfonso Simonetti1
1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600
2
Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona Km 3½, Capdevila, Boyeros, AP 8029, Ciudad
de La Habana, CP 10800

La broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) En observaciones realizadas en campos de cafeto donde
(Coleoptera: Scolytidae) está considerada como una de se manifestaba esta epizootia en Bahía Honda, en Pinar
las principales plagas del cultivo del cafeto en el mundo del Río, se pudo comprobar que los campos donde exis-
[Le Pelley, 1968; Baker, 1999] debido a los daños direc- tía sombra de árboles de mayor porte y mixta (Theobroma
tos que ocasiona al fruto de esta planta, el nivel tan cacao, Citrus spp., Mangifera indica, Musa spp. y otros),
elevado de sus poblaciones, las dificultades para reali- la enfermedad se manifestaba más intensa y prolonga-
zar un control eficiente y las limitaciones para la da, en comparación con los campos donde la sombra era
comercialización del café afectado, entre otras [Jaramillo de menor porte y de una especie (Gliricidia sepium).
et al., 2006]. La epizootia por este hongo entomopatógeno se ha ob-
En África, región de origen de H. hampei, se han estu- servado igualmente en otros países cafetaleros como
diado diversas especies de enemigos naturales, las que México [Barrera et al., 1990] y Colombia [Bustillo et
se han utilizado exitosamente en programas de control al., 1998; 2002], entre otros, donde se refiere que su
biológico clásico en otras regiones del mundo, princi- manifestación es de forma variada en los diferentes años,
palmente los parasitoides Cephalonomia stephanoderis la que depende de las condiciones climáticas. Se consi-
Betrem (Hymenoptera: Bethylidae), Heterospilus dera que varios años después de su introducción en
coffeicola Schenedeken (Hymenoptera: Braconidae), Colombia, es el principal factor de mortalidad natural
Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulo- de H. hampei.
phidae) y el hongo entomopatógeno Beauveria basiana Como predadores, los más comunes han sido las hor-
(Balsamo) Vuillemin (Hyphomycetes: Moniliales), en- migas Pheidole megacephala (F.), Wasmania auropunctata
tre otros [Baker, 1999; Vega et al., 1999]. Roger, Solenopsis geminata (F.) y Pseudomyrmex sp.
Con el propósito de conocer la ocurrencia de enemigos (Hymenoptera: Formicidae), insectos que se introdu-
naturales en poblaciones de H. hampei bajo las condi- cen en las perforaciones en la etapa en que predominan
ciones de cafetales en Cuba, se realizaron observaciones los estados inmaduros de la broca, los que devora, y en
en frutos perforados en las localidades de Buey Arriba, muchos casos realizan sus nidos en el interior del fruto,
Granma (agosto de 1998), Trinidad, Sancti Spíritus (fe- donde además come sus partes, que están necrosadas o
brero del 2006) y Bahía Honda, Pinar del Río (2005, 2006). donde crecen hongos saprófitos.
Como entomopatógeno solamente se observó a B. bassia- Otros predadores que se han encontrado en muy bajas
na (Fig. 1) que se había detectado anteriormente como poblaciones han sido Laemophloeus sp. (Coleoptera:
causante de una epizootia en Buey Arriba, Granma Laemophloeidae) y Cathartus sp. (Coleoptera: Cucuji-
[Mario García, comunicación personal]. Posteriormen- dae), cuyas larvas devoran los huevos y las larvas del
te esta patología se ha manifestado en todos los muni- primer estadio de H. hampei, principalmente las que
cipios cafetaleros del país, entre uno y tres años des- habitan en frutos donde existen altas poblaciones de la
pués de la detección de H. hampei en esos territorios. plaga y en etapas finales del período de fructificación.
fitosanidad/307
Vázquez y otros

Figura 1. Corte de un fruto de café donde se aprecia la


hembra adulta de H. hampei infectada con B. bassiana.

También se realizó un hallazgo de una chinchita otras especies de Hypothenemus, que habitan en los
predadora de la familia Anthocoridae (Hemiptera), la ecosistemas donde se cultiva cafeto en el país.
que al parecer picaba y chupaba la hemolinfa de las
larvas de H. hampei, pues estas se observaron defor- De la familia Encyrtidae se ha descubierto a Coccidoc-
mes y muertas en el interior de las perforaciones. tonus sp. en Togo y un Anagyrini en Costa de Ivore, mien-
tras que de la familia Bethylidae hay informes en África
Estos son los primeros informes de tales enemigos na- de parasitoides de los géneros Prorops, Cephalonomia y
turales de H. hampei bajo las condiciones de Cuba, y Goniozus, los dos primeros utilizados en programas de
sobre los cuales existen algunos antecedentes en otros control biológico clásico [Vega et al., 1999].
países, pues Vega et al. (1999) refirió hallazgos de varias
especies de estas familias en Togo y Costa de Ivore en REFERENCIAS
África, pero sin atribuirle importancia en la regulación
Baker, P. S.: «La broca del café en Colombia». Informe Final del Proyec-
de las poblaciones de esta plaga en esa región. to MIP para el café DFID-CENICAFE-CABI BIOSCIENCE (CNTR 93/
1536A), Chinchiná, Colombia, 1999.
Igualmente en Colombia, Bustillo et al. (2002) encon- Barrera, J. F.; D. Moore; Y. J. Abraham; S. T. Murphy; C. Prior: «Biological
traron hormigas de los géneros Solenopsis, Pheidole, Control of the Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei, in Mexico
Wasmannia, Paratrechina, Crematogaster, Brachymyrmex and Possibilities for Further Action», Brighton Crop Protection Conf.
Pests and Diseases, 1990, pp. 391-396.
y Prenolepis, así como el cucújido Cathartus quadricollis
Bustillo, A. E.; R. Cárdenas; D. Villalba; P. Benavides; J. Orozco; F. J.
(Guérin-Méneville) y un antocórido no identificado, Posada: «Manejo integrado de la broca del café, Hypothenemus
asociados a perforaciones de H. hampei, los que obser- hampei (Ferrari) en Colombia», Chinchiná, Cenicafé, 1998.

varon con actividad como predadores de inmaduros. Bustillo, A.; R. Cárdenas; F. J. Posada: «Natural Enemies and Competitors
of Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in Co-
En la búsqueda de la posible existencia de parasitoides, lombia», Neotropical Entomology 31(4):635-639, Oct./Dec." 2002.

en 1998 se hallaron cuatro especies de las familias Jaramillo, J.; C. Borgemeister; P. Baker: «Coffee Berry Borer
Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae): Searching for
Bethylidae y Encyrtidae (Hymenoptera) que emer- Sustainable Control Strategies», Bulletin of Entomological Research.
gieron de frutos donde había adultos e inmaduros de 96 (3):223-233, 2006.

H. hampei en plantaciones de Buey Arriba, Granma. Le Pelley, R. H.: Pests of Coffee, Longmans, Londres, 1968.
Vega, F. E.; G. Mercadier; A. Damon; A. Kirt: «Natural Enemies of the
Aunque estos parasitoides no se lograron identificar, Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:
pueden ser nuevas especies de enemigos naturales de Scolytidae) in Togo and Cote d Ivoire and Other Insects Associated
with Coffee Beans», African Entomology 7 (2):243-248, 1999.

308/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Resumen de tesis

DIAGNÓSTICO Y SANEAMIENTO DEL VIRUS DASHEEN


MOSAIC EN MALANGA (XANTHOSOMA SPP. Y COLOCASIA
ESCULENTA (L.) SCHOTT)

Janet Igarza Castro


Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnológicos
del CITMA. Carretera a Mayabe, Jardín Botánico, Holguín, Cuba
Tesis presentada en opción al grado académico de Máster en Biotecnología Vegetal.

El cultivo de la malanga es de gran importancia económi- Los resultados permitieron confirmar la efectividad
ca en nuestro país. La propagación acelerada por vías de la electroterapia 5 y 10 vol/5 min y la quimiotera-
biotecnológicas de clones de interés comercial es uno de pia 3 mg/L. El diagnóstico inmunoquímico utilizado,
los principales retos en la agricultura, pero este cultivo se con grandes ventajas sobre otros tipos de análisis, tie-
ha visto afectado por la enfermedad viral conocida como ne un límite de sensibilidad que puede permitir el esca-
Dasheen Mosaic Virus (DMV), lo que disminuye los ren- pe de material enfermo; pero con la introducción de
dimientos. Para la obtención de plantas libres del virus se técnicas moleculares se pueden detectar concentracio-
aplican técnicas de saneamiento y se confirman con otras nes virales ínfimas en vitroplantas sanas. En la pre-
de diagnóstico, por lo que en esta investigación se compa- sente investigación se realiza la detección del DMV por
ran distintas técnicas para la eliminación de virus como RT-PCR, la cual servirá de base para la aplicación fu-
son la extracción de meristemos, la termoterapia, la tura de una técnica confirmativa de mayor sensibili-
electroterapia y la quimioterapia en los clones México 8 y dad durante el saneamiento. Finalmente se propone una
Camerún 14, para conocer su efectividad en la obtención metodología de diagnóstico y saneamiento al DMV que
de plantas libres al DMV, y se confirman con la utiliza- permite la introducción de líneas puras en biofábricas
ción de diagnósticos de alta sensibilidad. para su propagación en campo.

fitosanidad/309
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

COMPORTAMIENTO Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD TIZÓN


DE FUEGO CAUSADA POR EL HONGO CORYNESPORA
CASSIICOLA (BERK. & CURT.) WEI. EN EL CULTIVO DEL PEPINO
(CUCUMIS SATIVUS L.) EN SISTEMAS DE ORGANOPÓNICOS
EN LA PROVINCIA DE CAMAGÜEY Y SU RELACIÓN
CON OTROS PATÓGENOS FÚNGICOS PRESENTES EN EL CULTIVO

Carlos A. Ferrer González


Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación
Norte, Reparto Puerto Príncipe, Camagüey, Cuba, sanivecm@enet.cu
Tesis en opción al grado académico de Máster en Hortalizas.

La necesidad de implementar un sistema de manejo de la plantación, aspecto estrechamente relacionado con los
la enfermedad tizón de fuego del pepino, causado por el cambios climáticos dentro de los cuales el efecto de la tem-
hongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. den- peratura máxima entre 28 y 30oC, y la humedad relativa
tro de una agricultura sostenible, implica la búsqueda media superior a 80% resultaron favorables para el desa-
del conocimiento de aspectos relacionados con la inci- rrollo de esta enfermedad. El crecimiento micelial y la
dencia, comportamiento y control que permitan trazar esporulación del hongo en condiciones in vitro coinciden
estrategias en la solución de esta problemática. Se rea- con temperaturas de 30oC. La mayor circulación y distri-
lizaron investigaciones para determinar la importancia bución de los conidios en condiciones naturales se observa
de C. cassiicola en comparación con otros patógenos a las diez de la mañana. Los ensayos de sensibilidad de
fúngicos presentes en el cultivo, su comportamiento y C. cassiicola ante diferentes productos fungicidas en con-
control en los organopónicos de la Empresa de Cultivos diciones de laboratorio y campo arrojaron mejores resul-
Varios de Camagüey y en el Laboratorio Provincial de tados de inhibición del crecimiento de las colonias y del
Sanidad Vegetal durante el período 2001 a 2003. Se de- control de la enfermedad con mancozeb PH 80% y
terminó que los hongos causantes de afectaciones en benomyl PH 80% a 5 ppm y 2 kg/ha i. a. El control bioló-
este cultivo son Pseudoperonospora cubensis (Berk. & gico con Trichoderma harzianum R. (cepa A-34) a dosis de
Curt.) Rostow con 10%, Collectotrichum lagenarium 10 kg/ha y del producto natural hidrato de cal a dosis de
(Pass.) Ell & Halst y Alternaria cucumerina (Ell. & Ev.) 5 kg/ha en tratamientos foliares, alcanzaron eficacias de
S. A. Elliott con 1% cada uno, y C. cassIicola como el 42 y 47% respectivamente, e incrementaron los rendimien-
de mayor importancia con 100% de incidencia y afec- tos en 50%. Todos estos resultados fueron utilizados en la
taciones de 85%. Su comportamiento se caracterizó por elaboración de estrategias de control de la enfermedad con
la permanencia durante todo el ciclo del cultivo con un vistas a su inclusión en un esquema de manejo integrado
incremento a medida que avanza la edad fenológica de para el control de C. cassiicola en el cultivo del pepino.

310/fitosanidad