Contenido

Diagnóstico fitosanitario
Detección de β-exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC 255
Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Diagnóstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales 261
Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín y Doris Hernández
Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos nativos
con potencialidad para el control de especies de insectos plaga 265
Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez
Ecología
Dispersión, distribución actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae)
en Cuba 273
Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo,
Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo y Ransés Vázquez
Variabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez
Control biológico
Un medio simplificado a base de soya más azúcar turbinada de caña para la producción del hongo acaropatógeno
Hirsutella nodulosa Petch en fase líquida 285
Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega y Litzy Ayra
Estudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudrición blanda de la papa
(Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez
y Victoria Pazos Álvarez-Rivera
Producción de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentación líquida 295
Rosaima García, María A. Durán y Ramón Riera
Reseña
Caracterización de Ralstonia solanacearum a través del estudio de su diversidad genética 299
Yelaine Tejeda Gómez
Comunicación corta
Primer registro de cecidómido asociado a síntomas de roya en plantas medicinales en Cuba 305
Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa
Observaciones sobre enemigos naturales de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba 307
Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brito
y Janet Alfonso Simonetti
Resumen de tesis
Diagnóstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) 309
Janet Igarza Castro
Comportamiento y control de la enfermedad tizón de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopónicos
en la provincia de Camagüey y su relación con otros patógenos fúngicos presentes en el cultivo 310
Carlos A. Ferrer González
Contents
Phytosanitary diagnosis
Detection of β-Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis 255
Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez and Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Phytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils 261
Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín and Doris Hernández
Isolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potential
for the Control of Pest Insects Species 265
Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos and Aidanet Carr Pérez
Ecology
Dispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom
(Thysanoptera: Thripidae) in Cuba 273
Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol,
Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo and Ransés Vázquez
Variability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
María E. Estrada Martínez and Dolores Piñón Gómez
Biological control
A Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of Fungus
Hirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites 285
Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega and Litzy Ayra
Study of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez
and Victoria Pazos Álvarez-Rivera
Production of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation 295
Rosaima García, María A. Durán and Ramón Riera
Review
Caracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity 299
Yelaine Tejeda Gómez
Short communication
First Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants 305
Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes and María O. López Mesa
Observations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba 307
Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brit
and Janet Alfonso Simonetti
Thesis abstract
Diagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott 309
Janet Igarza Castro
Behavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagüey Province and its Relation
with others Fungi Pathogens Present in the Crop 310
Carlos A. Ferrer González
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
Diagnóstico fitosanitario
DETECCIÓN DE β-EXOTOXINA EN CEPAS NATIVAS
DE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLC
Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cu
RESUMEN
Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) la
presencia de β-exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis,
pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal. La concentración de β-exotoxina en el patrón fue
de 25 µg.mL–1, y en el producto comercial empleado como control
positivo fue de 6 µg.mL–1. En las cepas evaluadas solo la LBT9 y
LBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentraciones
de 34 y 4,5 µg.mL–1 respectivamente.
Palabras claves: Bacillus thuringiensis, β-exotoxina, cromatografía
líquida (HPLC), detección
INTRODUCCIÓN
Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ade- poca reproducibilidad. De todos estos métodos la RP-
más de la δ-endotoxinas o proteínas Cry una exotoxina
termoestable denominada β-exotoxina, la cual se se-
creta al medio de cultivo al inicio del proceso de
esporulación. Esta molécula es un análogo nucleotídico
de ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atri-
buye acción insecticida contra diferentes órdenes de
insectos como Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros,
Hemípteros, además de ácaros, nematodos, proto-
zoarios y platelmintos [Hernández et al., 2003].
Diversos métodos como la cromatografía de intercam-
bio iónico, electroforesis capilar, ELISA y la croma-
tografía líquida de alta resolución (HPLC) se han des-
crito para la determinación de la β-exotoxina, como
alternativas al bioensayo tradicional con Musca domes-
tica, el cual resulta más trabajoso, prolongado en el
tiempo y presenta algunas limitaciones como estima-
ciones inexactas de la potencia de la toxina impura y
ABSTRACT
The presence of β -exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strains
belonging to Plant Health Research Institute collection was analyzed
by high performance liquid chromatography (HPLC). β -exotoxin
concentration in the standard was 25 µg.mL-1, and in a commercial
product, used as positive control, was 6 µg.mL-1. β-exotoxin was only
detected in LBT9 with 34 µg.mL-1 and LBT47 with 4.5 µg.mL-1, among
the strains proved.
Key words: Bacillus thuringiensis, β-exotoxin, liquid chromatography
(HPLC), detection
HPLC se emplea más frecuentemente para la detección y
cuantificación de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].
El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuan-
tificar la presencia de la β-exotoxina en nueve cepas
cubanas de Bacillus thuringiensis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Como material biológico se emplearon nueve cepas de
B. thuringiensis pertenecientes a la colección del Insti-
tuto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cuales
se seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y la
toxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo este-
rilizado a 121ºC frente a un grupo de organismos plaga
(Tabla 1).
El estándar de β-exotoxina I lo suministró el doctor Jorge
Ibarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro de
fitosanidad/255
 Baró y otros
Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Poli-
técnico Nacional de México), obtenido a partir de la
cepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var.
thuringiensis. La concentración final de la solución de
β-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 µg.mL–1.
Como control positivo se utilizó un producto comercial
ruso que contiene β-exotoxina, producido a partir de
una cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y como
control negativo se tomó la cepa HD1, estándar inter-
nacional de B. thuringiensis que no produce β-exotoxina.
Tabla 1. Serotipos de las cepas
en estudio [Fernández-Larrea, 1999]
Cepas Serotipo
LBT-4 kenyae (H4)
LBT-5 thuringiensis (H1)
LBT-7 kenyae (H4)
LBT-9 thuringiensis (H1)
LBT-12 thuringiensis (H1)
LBT-13 no determinado
LBT-16 thuringiensis (H1)
LBT-25 israelensis (H14)
LBT-47 no determinado
Las cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya,
en zaranda orbital a 150 r.min–1 a una temperatura de
crecimiento de 30ºC durante 48 h hasta que se comple-
tó el proceso de esporulación.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación el cultivo
se centrifugó 10 000 r.min–1 en centrifuga refrigerada
durante 20 min. El precipitado se descartó y el
sobrenadante se trató en autoclave a 121ºC durante 15 min.
El pH de las muestras se ajustó a 3 con ácido fosfórico
85%. El sobrenadante se clarificó por centrifugación
a 10 000 r.min–1 y se guardó a –20ºC hasta su uso.
El proceso de separación se realizó según Levinson et
al. (1990), para lo que se utilizó una columna LiChros-
pher RP-18 de fase reversa. La corrida se efectúo a 30ºC
en 50 milimoles.L–1 de KH2PO4 (pH 3) a una velocidad
de flujo de 2 mL.min–1, con detección a 260 nm. El vo-
lumen de inyección fue de 100 µL. Se empleó un detec-
tor UV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A.
Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el soft-
ware EZChrom versión 6.8.
Con el objetivo de evaluar si la β-exotoxina se elimina-
ba durante el procesamiento de la muestra, se adicio-
256/fitosanidad
naron 100 µL de β-exotoxina estándar a la cepa LBT5
de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento del
microorganismo y concluido su desarrollo. La croma-
tografía se desarrolló en las condiciones descritas ante-
riormente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Según los cromatogramas obtenidos en la detección de
β-exotoxina para las cepas en estudio, se observó el
pico correspondiente al patrón de β-exotoxina estándar
a una concentración de 25 µg.mL–1 (Fig. 1(A)). El pico
que se observa en la muestra patrón apareció a un tiem-
po de retención de 11,33 min. El mismo pico apareció
en la muestra correspondiente al producto comercial
ruso a base de β-exotoxina, cepa utilizada como testigo
positivo. Su concentración fue de 6 µg.mL–1 (Fig. 1(B)).
La exotoxina no se detectó en la cepa HD1 estándar
internacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2),
la cual no produce esa exotoxina [Galán et al., 1994;
Glare y Callaghan, 2000].
En el resto de las cepas en estudio, solo se observó el
pico correspondiente a la β-exotoxina en las cepas LBT9
(Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de pro-
ducción del metabolito en estas cepas fueron de 34 y
4,5 µg.mL–1 respectivamente. En la cepa LBT7 tam-
bién se observó la presencia de un pico que pudiera co-
rresponder a la β-exotoxina, ya que presenta uno simi-
lar al del patrón y un tiempo de retención muy cercano.
Las cepas evaluadas presentan serotipos que están infor-
mados en la literatura como productores de la β-exo-
toxina [Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000];
sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido por
Levinson et al. (1990) y Hernández y Ferré (2001), los
cuales mostraron que la producción de la exotoxina
termoestable es más una propiedad específica de la cepa
de B. thuringiensis que una propiedad serotipo especí-
fica. Se ha probado además que su presencia en una
cepa en particular no implica la producción de la exo-
toxina por otras cepas pertenecientes al mismo se-
rovar.
Aunque los estudios que relacionan la producción de la
β-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa de
B. thuringiensis son muy escasos, y en la mayoría de
ellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores plan-
tean que la producción de β-exotoxina está limitada a
ciertos serotipos flagelares presentes en las cepas de
B. thuringiensis [Hernández y Ferré, 2001].
 Detección de β-exotoxina en cepas...

Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β-exotoxina (25 µg.mL–1) (A) y para el producto comercial (6 µg.mL–1)
(control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección
100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). Columna
LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260nm, volumen de inyección
100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 µg.mL–1 (A) y LBT47 4,5 µg.mL–1 (B).
Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fase
móvil KH2PO4, pH 3,0.

fitosanidad/257
 Baró y otros
La clasificación de las cepas de B. thuringiensis en
serovares se desarrolló sobre la base de los antígenos
flagelares; sin embargo, las bases genéticas y bioquímicas
del sistema de antígenos flagelares aún son desconocidas.
Esto hace especialmente difícil encontrar una relación di-
recta entre los genes determinantes del serovar y otros
genes en B. thuringiensis, como los que determinan la sín-
tesis de β-exotoxina [Hernández et al., 2003]. En este es-
tudio no fue posible establecer esta relación debido a que
se emplearon muy pocas cepas, y las dos que resultaron
positivas pertenecen a serotipos diferentes.
En estudios previos realizados en el Instituto de Inves-
tigaciones de Sanidad Vegetal se demostró que el
sobrenadante de cultivos obtenidos a partir de las ce-
pas estudiadas en este trabajo, y esterilizado a 121ºC,
presentaron actividad tóxica contra un grupo de orga-
nismos plaga como ácaros y nematodos [Márquez et al.,
1999; 2003]; sin embargo, resulta interesante destacar
que no pudo observarse en cada una de ellas el pico
correspondiente a la β-exotoxina. Estos resultados pu-
dieran tener explicación con lo afirmado por Levinson
et al. (1990) en cuanto a que los patrones de aparición
de la exotoxina termoestable sugieren que puede estar
involucrado solo un único gen. La producción de
exotoxina puede ser resultado de una sola reacción
enzimática, a partir de moléculas precursoras presen-
tes tanto en las cepas Exo+ como Exo–. Es probable
que estos precursores estén involucrados en el control
de la transcripción de los genes de la esporulación y no
Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5 contaminada con β-exotoxina estándar al inicio del cultivo (A) y una vez concluido el
procesamiento de la muestra (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de
inyección 100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.
258/fitosanidad
como sugirieron Johnson y Peterson (1983) en la pro-
ducción de la exotoxina, lo que implicaría que la β-exo-
toxina no se produzca por todas las cepas de B. thu-
ringiensis.
Otra explicación a la no detección del metabolito en las
restantes cepas pudo deberse también a niveles de con-
centración bajos en el medio de fermentación, a lo cual
se suma la presencia de moléculas contaminantes en la
solución que hace difícil su determinación. Oehler et al.
(1982) emplearon una columna C18 y como fase móvil
H2O y ácido trifluoracético; sin embargo, el método no
dio resultado debido a que los contaminantes del
sobrenadante del cultivo de B. thuringiensis coeluían
con la toxina, lo cual se considera que también pudo
ocurrir en los resultados presentes. Debido a esto y a
su pequeña masa molecular, la utilización de un méto-
do altamente eficiente en el proceso de obtención de la
exotoxina constituye un proceso clave para el recobra-
do y purificación de la β-exotoxina.
La adición de β-exotoxina estándar durante el proceso
de crecimiento de la cepa LBT 5 dio como resultado la
presencia del pico correspondiente a la β-exotoxina a con-
centraciones de 0,42 µg.mL–1 y 35,8 µg.mL–1 (Figs. 4(A)
y (B)). Esto indica que la β-exotoxina no se pierde du-
rante el proceso de obtención previo a la cromatografía.
La adición de β-exotoxina estándar a un grupo de cepas
en estudio también la utilizaron Gohar y Perchat (2001)
para corroborar la presencia de la toxina. A este proce-
dimiento se le denominó método del testigo externo.
 Detección de β-exotoxina en cepas...
Otra explicación a la ausencia del pico típico de la β-exo-
toxina en las cepas LBT4, LBT5, LBT7, LBT12, LBT13,
LBT16 y LBT25 es la presencia de una segunda
exotoxina denominada tipo II, la cual se produce a concen-
traciones mucho más bajas que la β-exotoxina tipo I. Este
resultado fue corroborado por Levinson et al. (1990) al
identificar la β-exotoxina tipo I en un grupo de cepas de
B. thuringiensis; sin embargo, no se pudo detectar en
una cepa de B. thuringiensis var. morrisoni, que exhibió
actividad tóxica en el sobrenadante esterilizado a 121ºC
contra Musca domestica, Diabotrica undecimpuntacta y
Leptinotarsa decemlinneata. El análisis realizado por es-
tos autores dio como resultado la identificación de este
nuevo tipo de exotoxina. Esta molécula es menos
hidrofóbica y se sugiere que sea un análogo de uracilo de
la exotoxina tipo I [Levinson et al., 1990].
La existencia de esta toxina aclaró resultados confusos y
contradictorios reportados en la literatura. Igualmente
Gohar y Perchat (2001) lograron identificar la exotoxina
tipo II al emplear RP-HPLC, pero con la utilización pre-
via de precipitación con solventes orgánicos y una
cromatografía de intercambio aniónico. Estos autores con-
firman que resulta de vital importancia la preparación
previa de la muestra para la detección y cuantificación de
este metabolito, e indican que una alternativa promisoria
sería la utilización de detección fluorescente en lugar de
absorción UV, lo que incrementaría ampliamente la sensi-
bilidad y la selectividad de la determinación.
CONCLUSIONES
• Se detectó la presencia de β-exotoxina en las cepas
LBT9 y LBT47 a concentraciones de 34 µg.mL–1 y
4,5 µg.mL–1 respectivamente.
REFERENCIAS
Fernández-Larrea, O.: «Aislamiento, selección y estudio de cepas de
Bacillus thuringiensis para el control fitosanitario». Informe Final
PNCT, Biotecnología Agrícola, INISAV, Cuba, 1999.
Galán, W.; K. Arévalo: «Uso de un método sencillo para detección de b-
exotoxina en cepas de Bacillus thuringiensis», South Western
Entomologist 19 (4):385-390, 1994.
Glare, T.; M. Callaghan: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and
Safety, Eds. John Wiley and Sons, 2000.
Gohar, M.; S. Perchat: «Sample Preparation for b-Exotoxin Determination
in Bacillus thuringiensis Cultures by Reversed-Phase High Perfor-
mance Liquid Chromatography», Anal. Biochem. 298:112-117, 2001.
Hernández, C.; C. Martínez; H. Porcar; J. Ferré: «Correlation Between
Serovars of Bacillus thuringiensis and Type I â-Exotoxin Production»,
J. Invertebr. Pathol. 82:57-62, 2003.
Hernández, C.; J. Ferré: «Larget-Thiéry Update on the Detection of b-
Exotoxin in Bacillus thuringiensis by HPLC Analysis», J. Appl.
Microbiol. 90:643-647, 2001.
Johnson, D.; R. Peterson: «Limitations of HPLC for the Detection of b-
Exotoxin in Cultures Filtrate of Bacillus thuringiensis», European
Journal of Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:231-234, 1983.
Levinson, B.; K. Kasyan; S. Chiu; T. Curier; J. González: «Identification
of b-Exotoxin Production, Plasmids Encoding b-Exotoxin, and a New
Exotoxin in Bacillus thuringiensis by Using High Performance Liquid
Chromatographic», J. Bacteriol. 172:3172-3179, 1990.
Márquez, María E.; Orietta Fernández-Larrea; Lérida Almaguel: «Pro-
ducción y evaluación de cultivos de Bacillus thuringiensis (Berliner)
con efecto acaricida sobre P. latus (Banks.) (Acarina: Tarso-
nemidae)», Fitosanidad. 3 (3):53-58, 1999.
Márquez, María E.: «Actividad nematicida de cepas de Bacillus
thuringiensis para el control de Meloidogyne incognita en Cuba»
Tesis en opción al título académico de Maestro en Microbiología Ge-
neral, Universidad de La Habana, 2003.
Oehler, D.; R. Gingrich; M. Haufler: «High Performance Liquid
Chromatographic Determination of b-Exotoxin Produced by the Bacterium
Bacillus thuringiensis», J. of Agric. Food Chem. 30:407-408, 1982.
fitosanidad/259
260/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
DIAGNÓSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOS
DE CULTIVOS FRUTALES
Raúl Hernández Hernández1, Gladis del Vallín2 y Doris Hernández2
1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, rhernandez@inisav.cu
2
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11300
RESUMEN
Se diagnosticaron campos agrícolas en fase de presiembra para
conocer los principales géneros de nematodos en suelos previamen-
te sembrados de piña (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica
papaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea ame-
ricana Lin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.)
de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego de
Ávila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Para
la extracción de los nematodos móviles se utilizó el método de
Baermann, mientras el índice de infestación del suelo con el nematodo
de las agallas se valoró mediante la prueba de la planta indicadora
con la contribución de los agricultores. En todas las muestras de
suelo y raíces se observaron nematodos parásitos de plantas con
diversos niveles de densidad de población. Los géneros detectados
con mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylen-
chulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) y
Pratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de población
se correspondieron con los suelos que anteriormente habían sido
cultivados con guayaba.
Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,
Pratylenchus, guayaba, piña
INTRODUCCIÓN
En la agricultura cubana actual se incrementa el fo-
mento y la diversificación de frutales, pero para lograr
cosechas productivas y consistentes es necesario enfren-
tarse a las plagas desde el vivero o ya en la plantación.
Entre ellas se encuentran los nematodos parásitos que
pueden ocasionar pérdidas de rendimiento entre 10 y
30% en los cultivos susceptibles [Fernández, 1991;
INIFAP, 2002].
El fruticultor debe valerse del diagnóstico nematológico
para conocer el tipo y la cantidad de nematodos en el
suelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar me-
didas preemergentes cuando se detectan poblaciones por
ABSTRACT
Pre sowing agricultural fields which were planted with fruits as
pineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.),
guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), man-
go (Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from four
provinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, were
nematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodes
main genera. Motile nematodes extraction was achieved by using
Baermann method, while root-knot nematodes soil infestation was
valorised with indicator plant test and farmers contribution. Different
population densities of plant-parasites nematodes were detected in
all soil and roots samples. Most frequently nematodes were
Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%),
Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soils
before cultivated with guava showed the highest nematode population.
Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helico-
tylenchus, guava, pineapple
encima de los niveles que causan daño económico. Por
esa razón el análisis de laboratorio y campo proporcio-
na la ventaja de realizar tratamientos al suelo con un
ahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling y
Kopittke, 2000]. Además de lo señalado, se deben te-
ner en cuenta otros aspectos como la topografía y el
drenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y la
capacitación de los agricultores.
El presente trabajo muestra la situación nematológica
de diversos campos de producción de frutales, lo que
permite facilitar la aplicación del manejo preventivo de
nematodos en los campos evaluados.
fitosanidad/261
 Hernández y otros

MATERIALES Y MÉTODOS La extracción de los estadios móviles de nematodos

se realizó de acuerdo con el método de Baermann.
Se realizó un diagnóstico de nematodos en presiembra
Se procesaron 18 muestras de 50 g cada una, y los
en suelos que previamente estuvieron sembrados con
nematodos se recuperaron en viales de 15 mL, y
guayabo, en fincas de los municipios de Alquízar y
para la identificación de los géneros se realizaron
Bejucal en la provincia de La Habana; con mango y
observaciones al microscopio estereoscopio de acuer-
aguacate en el municipio de La Lisa, de Ciudad de La
do con las claves taxonómicas [Siddiqi, 2000]. In-
Habana; con piña en Ciego de Ávila, en la propia pro-
mediatamente después se realizó el conteo con un
vincia; con papayo en Jagüey Grande, en Matanzas, y
contador manual y se calculó el promedio de ejem-
con uva en el municipio especial de Isla de la Juventud.
plares por muestra.
Para la evaluación se establecieron parcelas entre 0,5 y
En las muestras de suelo colocadas en bolsas o mace-
1,0 ha/campo, y en sus diagonales se tomaron porcio-
tas se sembraron tres semillas pregerminadas de ca-
nes de suelo de un perfil entre 6 y 30 cm de profundi-
labaza (Cucurbita moschata Lin.) o pepino (Cucumis
dad, con una piocha o pico, y siempre se desechó el sue-
sativus Lin.), a razón de tres bolsas o macetas por
lo de los primeros 5 cm; el número de muestras para
muestra de suelo o materia orgánica, y se colocaron
cada parcela se determinó a partir del producto del va-
sobre una superficie separada del suelo, a fin de evi-
lor del área por 50, con aproximación por exceso, de
tar la contaminación por contacto con el suelo. Las
acuerdo con la metodología establecida por Fernández
plantas se regaron e inspeccionaron periódicamente
(1991). En los puntos donde existía vegetación se ex-
durante 35 días de cultivo (en el verano) o 45 (en el
trajeron entre 100 y 300 g de raíces que aún no estuvie-
invierno); luego se extrajeron con sumo cuidado para
ran muertas, marchitas o con ataques de otros pató-
evitar que se partieran las raíces. La presencia de
genos, conjuntamente con el suelo.
nematodos se determinó mediante inspección visual
Las muestras se depositaron en una o varias bolsas de de acuerdo con una escala de seis grados [Zeck, 1971;
polietileno negro identificadas por área, campo, locali- Püntener, 1981]. A cada planta indicadora se le asig-
dad, provincia, cultivo, variedad, fecha de siembra o nó un grado entre 0 y 5 (Tabla 1), y se calculó el pro-
cosecha, cultivo y variedad anterior, fecha del muestreo medio del grado de agallamiento o índice de agallas
y técnico colector. del total de plantas evaluadas.

Tabla 1. Descripción de las raíces de acuerdo con el grado de infestación

con Meloidogyne spp.
Grado Descripción
0 Raíces sin agallas
1 Pequeñas agallas difíciles de descubrir o distribuidas por todas las raíces
2 Desde numerosas agallas pequeñas distribuidas en las raíces (algunas pueden
estar encadenadas entre sí) hasta numerosas agallas de mayor tamaño
3 Agallas presentes en 25-50% de las raíces contaminadas
4 Desde 75% de las raíces con agallas semejantes a tumoraciones, hasta la raíz
casi totalmente contaminada (aún la planta conserva su aspecto verde)
5 Desde la raíz casi totalmente contaminada y reducida (la planta muestra
síntomas del daño) hasta el deterioro total por la muerte

Se calculó la frecuencia de aparición de los nematodos RESULTADOS Y DISCUSIÓN

por la división de la cantidad de muestras por género
En todas las áreas diagnosticadas se detectaron
detectado entre el total de muestras evaluadas expre-
nematodos parásitos de plantas con diversos niveles de
sado en porciento.

262/fitosanidad
 Diagnóstico de fitonematodos...
densidad de población, que en la mayoría fueron bajos
o moderados, aunque en las muestras correspondien-
tes a los campos de Bejucal y Alquízar de la provincia
Figura 1. Frecuencia de aparición de los diferentes géneros de nematodos en cultivos frutícolas.
El análisis de laboratorio reveló que en los campos de
frutales en fase de presiembra los géneros más frecuen-
tes fueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estu-
vieron presentes en todos los cultivos en algunas de sus
estadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir la
existencia de una estrecha asociación entre estos orga-
nismos y los cultivos frutícolas. Estos resultados son
similares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990)
en los estudios de biodiversidad nematológica. Los com-
plejos formados por estos géneros pudieran represen-
tar un peligro potencial, fundamentalmente para fru-
tales como el guayabo y la piña, debido a los daños que
pueden causar en su sistema radical, que limitan sensi-
blemente la absorción de los nutrientes y por consi-
guiente el desarrollo y la productividad.
Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presen-
tes en las áreas agrícolas que anteriormente se cultiva-
ron con aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco se
presentó en campos de papayo, y Patylenchus no se
detectó en campos de mango (Tabla 2).
En general las mayores poblaciones de nematodos se
apreciaron en los campos de guayabo, con predo-
minancia de Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cual
coincide con Fernández (1991), quien aseveró que este
cultivo es un buen hospedero de ambas especies, y que
las pérdidas económicas que ocasionan estos nematodos
pueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jóvenes, según
Suárez et al. (1998) con valores máximos entre 48 y 57%
en plantaciones establecidas. Los daños incluso pue-
den ser aún mayores en la fase de producción, cuando
de La Habana previamente sembrados de guayaba los
niveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Ta-
bla 2).
se emplean posturas contaminadas, pues la alimenta-
ción y reproducción del nematodo tiene lugar desde el
mismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase de
vivero. En este trabajo se observó una tendencia des-
cendente del índice de agallamiento de Meloidogyne
desde la máxima densidad de población hasta 240 J2/
250 g de suelo, a partir de la cual no se presentó una
infestación visible en raíces (Tabla 2).
En las muestras de los suelos dedicados a la piña se
observaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne.
Estos géneros de nematodos usualmente están asocia-
dos al cultivo con una incidencia negativa en el desa-
rrollo de la planta y el rendimiento agrícola, por lo que
es muy útil realizar el diagnóstico nematológico antes
de la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI,
1989; Araya, 2006].
CONCLUSIONES
• Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respecti-
vamente fueron los géneros de nematodos más fre-
cuentes en las muestras de suelos de frutales en fase
de presiembra.
• Los suelos procedentes del guayabo se distinguieron
notablemente por las elevadas densidades de pobla-
ción de Meloidogyne en comparación con los de piña,
uva, papayo, mango y aguacatero.
• Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron pre-
sentes en las áreas agrícolas anteriormente cultiva-
das con aguacatero y uva, mientras el primero tam-
poco estuvo en papayo y el segundo en mango.
fitosanidad/263
 Hernández y otros

Tabla 2. Fauna de nematodos parásitos de los cultivos frutales detectados. Individuos

por 250 g de suelo
Municipio/ Unidad agrícola Cultivo Variedad Meloidogyne sp. Rotylenchu- Helicoty- Pratylen-
provincia precedente lus sp. lenchus sp. chus sp.
J2 M G J4 M
Alquízar/ Estación GuayaboEnana EEA 2756 4 25
La Habana Experimental 18-40
de Fruticultura 1305 2
620 1
305 0,3 100
Bejucal/ Finca Guayabo Enana EEA 240 0,3 50
La Habana La Milagrosa 18-40 130 0 15 5 15
110 0 10
100 0 40 35
La Lisa/ Finca Mango Super 70 0 10 5
Ciudad de La de Hayden
Habana autoconsumo Hyden 30 0 35 10 5
Aguacatero Catalina- 10 0 5
Govin
Ciego de Ávila/ Empresa Piña Española roja 160 10 0 110 20
Ciego de Ávila de la Piña 5 0 5
Cayena lisa 53 5 0 85 10 5
Jagüey Grande/ Estación Papayo Solosunrise 100 10 5
Matanzas Experimental Maradol 60 5 0 5 5
de Fruticultura
Isla de la Finca orgánica Uva Aramón 140 0
Juventud 90 0
30 0 200
J2: Larva infectiva del segundo estadio. M: Espécimen adulto macho.
G: Grado de infestación con agallas. J4: Hembra adulta joven infectiva.

REFERENCIAS
Araya, M.; Comunicación personal, 2006.
Fernández, E. «Los nematodos del género Meloidogyne Goeldi en el
cultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control». Tesis de
Doctorado en Ciencias Agrícolas, Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal, La Habana, 1991.
Gandoy, P.; J. Ortega: «Nematodos parásitos del cultivo de la piña en
Cuba y posibilidades de su control», Ciencias de la Agricultura
7:19-28, 1980.
INIFAP: «Control de nematodos fitoparásitos en piña. Ficha tecnológica
por sistema tecnológico», estado de Veracruz, México, 2002.
http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.
html#sanidad.
MINAGRI: Instructivo técnico para el cultivo de la piña, Departamento
Independiente de Frutales. Área No Cañera, Centro de Información y
Documentación Agropecuaria, La Habana, 1989.
Petit, P.: «Reconocimiento de nematodos fitoparásitos asociados a fru-
tales de importancia económica en Venezuela», Fitopatol. Venez.
3(1):2-5, 1990.
Püntener, W.: Manual para ensayos de campo de protección vegetal,
2.a ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,
1981.
Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed.,
CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.
Stirling, G. R.; R. Kopittke: «Sampling Procedures and Damage
Thresholds for Root-Knot Nematode (Meloidogyne javanica) on
Pineapple», Aust. J. Exp. Agric. 40(7):1003-1010, 2000.
Suárez, H. Z.; L. C. Rosales; M. S. González: «Nematodos asociados a
los frutales de importancia y su control. I: frutales perennes», Fonaiap
Divulga. 59:13-18, 1998.
Zeck, W. M.: «El esquema de valoración del ataque de cecidios
radicícolas», Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.

264/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
MORFOMÉTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS
MITOSPÓRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROL
DE ESPECIES DE INSECTOS PLAGA
Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de
La Habana, CP 11600
RESUMEN
Se realizó una prospección de hongos entomopatógenos a partir de
especies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos de
gran importancia económica y de muestras de suelo. De un total de
53 muestras se obtuvieron 17 útiles que correspondieron a 15 aisla-
dos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinus
Samson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predo-
minio de aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del amplio
rango de hospedantes de esta especie fúngica y a la cantidad de
muestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei
(broca del café), donde este microorganismo es un patógeno muy
habitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 mues-
tras de suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patro-
nes. Todos los aislados se incorporaron a la Colección de Cepas de
Hongos Entomopatógenos del Instituto de Investigaciones de Sani-
dad Vegetal (INISAV), donde se registraron sus características
macroculturales, microculturales, origen y especie a que pertene-
cen, con el objetivo de conservarlos para futuros estudios como
agentes potenciales de biocontrol de insectos plaga.
Palabras claves: hongos entomopatógenos, hongos mitospóricos, con-
trol biológico, plagas
INTRODUCCIÓN
Los hongos mitospóricos están catalogados como un
grupo mundialmente reconocido de agentes microbianos
a usarse tanto en los programas de control biológico de
plagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP).
Esto es debido a su forma de actuar, que es por contac-
to directo con la cutícula del hospedero y por la dispo-
nibilidad de tecnologías para producirlos masivamen-
te. Algunos géneros además se pueden formular en
aceites y así aplicarse con técnicas de volumen ultrabajo
[Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996].
Está demostrado que para llegar a obtener un produc-
to altamente efectivo para controlar una especie plaga
se debe partir de un amplio rango de aislados, seleccio-
ABSTRACT
A screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspect
insect cadavers in crops of economical importance and soil samples
was carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resulted
successful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.)
Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolates
was a consequence in part of the large amount of samples taken from
Hypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganism
has been found as a very common pathogen as well as the broad host
range this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolate
of fifteen different soil samples tested by insect bait method was
obtained. All the isolates recovered were stored in the Plant Health
Research Institute (INISAV) Culture Collection being previously
recorded in a datasheet with the micro and macro cultural
characteristics, origin and species name, for further research for a
potential use as biological control agents of insect pests.
Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological con-
trol, pests
nados en principio en cuanto a su virulencia. Los aisla-
dos que causan epizootias espectaculares, como es el
caso de algunos de los géneros fúngicos imperfectos
entomopatogénicos, son candidatos promisorios para
usarse en el control de plagas, siempre y cuando logren
clasificar sobre la base de otras características esencia-
les como son un nivel de especificidad de hospedante
estrecho, buena tolerancia a factores ambientales ad-
versos, facilidad de producción, comportamiento en al-
macenaje adecuado y alta seguridad en mamíferos
[Bateman et al., 1996].
Clásicamente hay tres vías de enriquecer el número de
aislados fúngicos para utilizarse como candidatos en el
fitosanidad/265
 Elósegui y otros
control biológico de plagas. La primera es mediante el
aislamiento del hongo a partir de artrópodos y
nematodos micosados, la segunda a través de muestras
de suelo y por último directamente de las colecciones
de cultivo [Rhodes y Smith, 1992].
Una vez aislado el agente es necesaria una correcta iden-
tificación. La identificación tradicional por medio de
las características morfológicas mantiene un peso rele-
vante, aunque se han introducido conceptos nuevos que
conllevan a algún tipo de marcador molecular que per-
mita, entre otras cosas, identificar al agente incluso
después de su liberación [Bridge y Arora, 1998 citados
por Bieliková et al., 2002].
En Cuba, dentro de los hongos entomopatógenos están
autorizados a producirse masivamente solamente dos
cepas de Beauveria bassiana de las que una no es nati-
va, y la otra es de Metarhizium anisopliae. Para el caso
de Lecanicillium lecanii (syn. Verticillium lecanii) se
cuenta con dos cepas en la producción, ambas foráneas.
Por estas razones surge la necesidad de contar con ma-
yor cantidad de aislados e introducir nuevos en la pro-
ducción, que tengan ventajas como controladores de
determinadas plagas agrícolas con respecto a las que
ya se producen masivamente en el país.
Los objetivos del trabajo fueron realizar aislamientos
de hongos patógenos a artrópodos (insectos), con énfa-
sis en especies plaga de relevancia económica, identifi-
carlos taxonómicamente e incorporarlos a la Colección
de Hongos Entomopatógenos y Antagonistas del Ins-
tituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV)
para estudios posteriores.
MATERIALES Y MÉTODOS
En los Laboratorios Provinciales de Sanidad Vegetal
(LAPROSAV) y en el INISAV se recibieron muestras
que consistieron en individuos muertos pertenecientes a
la clase Insecta, sospechosos de micosis, según síntomas
de momificación y/o mecanización, o con esporulación de
naturaleza fúngica en la superficie cuticular; también se
recibieron muestras de suelo. Ambas muestras proce-
dían de zonas donde se habían observado epizootias y no
aplicado productos a base de hongos entomopatógenos,
de acuerdo con registros históricos de campo.
Para el aislamiento del hongo, que ya estaba esporulado
sobre los individuos colectados, se realizaron siembras
en placas Petri de 9 cm de diámetro, por agotamiento
en agar sabouraud dextrosa o agar papa dextrosa
(PDA) o agar extracto de malta (MEA), en presencia de
antibióticos, según el método descrito por Rhodes y
266/fitosanidad
Smith (1992). Para los individuos sospechosos de mico-
sis se realizaron lavados con agua estéril y desinfecciones
con NaHClO a 0,5% durante 1 min. Seguidamente se
realizaron dos lavados por agua estéril y se colocaron en
cámaras húmedas incubadas a 28ºC por 7-9 días. A par-
tir del segundo día se observaron, y en los individuos
donde se detectó emersión de micelio se realizaron trans-
ferencias bajo condiciones asépticas, con siembras por
agotamiento de acuerdo con el método ya mencionado.
Para el aislamiento de hongos entomopatógenos con
Galleria mellonella se siguió el método de trampeo des-
crito por Zimmermann en 1986 [citado por Sun, 2002]
con algunas modificaciones para este trabajo. Las mues-
tras de suelo se obtuvieron a partir de la selección de
una hectárea que fuese representativa de un agroeco-
sistema con registros de infecciones por hongos
entomopatógenos en insectos plaga. Se tomaron cinco
puntos al azar y de cada punto se colectaron 10
submuestras de 10 cm3 de suelo cada una. El material
se colocó en bolsas oscuras y se homogenizaron en una
muestra única en el laboratorio. Se vertieron 6-10 g de
suelo por placa Petri de 12 cm de diámetro y en cada
una se colocó un individuo de Galleria mellonella o
Corcyra cephalonica de primeros estadios larvales, como
insectos cebo o trampeadores. Las placas se observa-
ron a partir del segundo día hasta el noveno, con movi-
miento diario. Si en este intervalo ocurría la muerte se
procedía a la desinfección superficial, incubación y ais-
lamiento del supuesto hongo de forma similar a lo ex-
plicado en el párrafo anterior para los individuos sos-
pechosos de micosis.
Las colonias obtenidas en placa se observaron al mi-
croscopio estereoscópico y se realizaron preparaciones
al microscopio óptico que se compararon con las des-
cripciones de géneros hifomicetos de Carmichael et al.
(1980) y Barnett y Hunter (1998). En caso de pertene-
cer el individuo a un género patogénico de interés, se
realizaba un subcultivo en medio agarizado y se regis-
traba como un nuevo aislado de la colección; en caso
contrario las muestras procesadas se destruían. La iden-
tificación del patógeno a nivel de especie se realizó con
ayuda de las descripciones de especies de hongos
entomopatógenos del CMI, de acuerdo con las caracte-
rísticas macro y microculturales [CMI, 1979].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los aislados de hongos entomopatógenos obtenidos co-
rrespondieron a los géneros Beauveria, Paecilomyces y
Metarhizium, a los que se les estudiaron sus caracterís-
ticas macro y microculturales más notables (Tabla 1).
 Aislamiento, identificación y caracterización...

Tabla 1. Aislados de hongos entomopatógenos obtenidos. Principales características macro y microculturales

Aislado
Características Características
(número de Origen Identificación
macroculturales microculturales
registro de origen)
Bb-102 Metamasius Beauveria En PDA colonias al inicio Células conidiógenas muy típi-
hemipterus bassiana blancas afieltradas que con el cas de la especie, con bases glo-
ceriseus tiempo se tornan crema bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5
(coleóptero), polvorientas. Reverso amarillo (2,1 µm). Conidios hialinos,
Matanzas ligero globosos a subglobosos1,0-2,5
(1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7 µm)
Bb-103 Metamasius Beauveria En PDA colonias algodonosas Muy abundantes conidioforos
hemipterus bassiana y blancas al inicio que se con grupos densos de células
(coleóptero), tornan crema y polvorientas fialídicas. Células conidiógenas
Santiago con el tiempo. Reverso amarillo globosas unas y otras en forma
de Cuba ligero de botella con formas interme-
dias, 1,5-3,0 (2,7 µm) x 2,0-3,0
(22 µm). Conidios hialinos, a
veces con un ápice muy
definido, globosos a elipsoidales
1,5-3,0 (2,3 µm) x 1,5-3,0
(21 µm)
Bb-105 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas muy típi-
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se cas de la especie, con bases glo-
(coleóptero), tornan beis claro y ligeramente bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5
cafetal, zona polvorientas, según esporulan (2,2 µm). Conidios muy homo-
montañosa, con el tiempo. Reverso amarillo géneos, hialinos, globosos,
Granma ligero algunos subglobosos,
2,0-2,0 µm
Bb-106 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas globosas unas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se y otras en forma de botella con
(coleóptero), tornan crema claro y formas intermedias, 2,0-3,5
café, zona ligeramente polvorientas según (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).
montañosa, esporulan con el tiempo. Conidios hialinos, globosos a
Granma Algunos coremios. Reverso subglobosos1,5-2,0
amarillo ligero (1,9 µm)x1,0-2,0 (1,7µm)
Bb-107 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas globosas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se unas y otras en forma de botella
(coleóptero), tornan beis claro y ligeramente con formas intermedias, 2,0-3,5
café, zona polvorientas según esporulan (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm).
montañosa, con el tiempo. Algunos Conidios hialinos, globosos a
Granma coremios Reverso amarillo subglobosos1,5-2,0 (1,9 µm) x
ligero 1,0-2,0 (1,7µm)
Bb-SP Spodoptera Beauveria En PDA colonias algodonosas Células conidiógenas muy
frugiperda bassiana y blancas al inicio que se típicas de la especie, con bases
(lepidóptero), tornan beis y ligeramente globosas, 2,0-3,0
maíz, polvorientas con el tiempo. (2,4 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).
Camagüey Reverso miel Conidios muy homogéneos, hia-
linos, globosos, algunos ligera-
mente subglobosos, 2,0-2,0 µm

fitosanidad/267
 Elósegui y otros

Bb-200603 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas,

hampei bassiana son blancas y algodonosas y se predominan las de forma de bo-
(coleóptero), tornan beis y polvorientas tella, 3,0-4,0 (3,3 µm) x 3,0-2,0
café, zona según esporulan con el tiempo. (2,3 µm). Conidios variables,
montañosa, Reverso amarillo claro aunque predominan formas
Holguín elipsoidales, base apiculada en
ocasiones, hialinos, 2,0-3,0
(2,3 µm) x 2,0-3,0 (23 µm)
Bb-cepa2 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm).
café, zona según esporulan con el tiempo. Conidios globosos a subglobo-
montañosa, Reverso amarillo pálido sos, hialinos, algunos apicu-
Santiago de lados, 2,0-2,5(2,2 µm) x 1,5-2,0
Cuba (1,8 µm)
Bb-cepa3 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
café, zona según esporulan con el tiempo. Conidios subglobosos a
montañosa, Reverso amarillo muy pálido ligeramente elipsoidales,
Santiago de predominando estos últimos,
Cuba hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0
Bb-cepa4 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se predominan las de forma de
(coleóptero), tornan beis claro y polvorientas botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0
café, zona según esporulan con el tiempo. (2,4 µm). Conidios, predominan
montañosa, Reverso amarillo pálido formas elipsoidales, algunos
Santiago de globosos a subglobosos,
Cuba hialinos, en ocasiones
apiculados, 2,0-3,0
(2,5 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm)
Bb-cepa5 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas, predominan
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3)
(coleóptero), tornan beis claro y polvorientas x 3,0-2,0 (2,5 µm). Conidios,
café, zona según esporulan con el tiempo. predominan formas elipsoidales
montañosa, Tendencia discreta a formar con ápice definido, algunos
Santiago de coremios. Reverso amarillo subglobosos, hialinos, 2,0-3,0
Cuba miel (2,6 µm) x 2,0
Bb-1234 Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas típicas de
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se la especie, con bases globosas,
(coleóptero), tornan beis medio y polvo- 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
café, Guamá, rientas según esporulan con el Conidios globosos a subglobosos
Santiago de tiempo. Tendencia a formar ligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 µm
Cuba coremios. Reverso amarillo
Bb-SIM Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas con bases
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se globosas, 2,0-3,0
(coleóptero), café, tornan beis pálido y polvorien- (2,1 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm).
Tercer Frente, tas según esporulan con el tiem- Conidios subglobosos a
Santiago de Cuba po. Reverso amarillo pálido ligeramente elípticos, hialinos,
2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) µm

268/fitosanidad
 Aislamiento, identificación y caracterización...

Bb-SL Hypothenemus Beauveria Colonias en MEA que al inicio Células conidiógenas predo-
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se minan las de forma de botella
(coleóptero), tornan beis pálido y 3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 µm).
café, ligeramente polvorientas según Conidios subglobosos a
San Luis, esporulan con el tiempo. ligeramente elípticos y hasta
Santiago de Tendencia a formar coremios. elipsoidales, hialinos,2,0-3,0
Cuba Reverso amarillo pálido (2,3) x 2,0 µm
Bb-Inv Cylas Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas predominan
formicarius bassiana son blancas y algodonosas y se las de forma de botella, 3,0-4,0
(coleóptero), tornan beis pálido y (3,4) x 3,0-2,0 (2,8 µm). Conidios
boniato, ligeramente costrosas según ligeramente elípticos hasta
Camagüey esporulan con el tiempo. elipsoidales, ápice discreto,
Reverso amarillo pálido hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0
(1,6) µm
Bb-1212 Hypothenemus Beauveria Colonias en PDA que al inicio Células conidiógenas con bases
hampei bassiana son blancas y algodonosas y se globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-
(coleóptero), tornan beis y polvorientas 2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a
café, según esporulan con el tiempo. subglobosos, hialinos, 1,5-2,0
Los Llanos, Reverso amarillo (1,8) x 2,0µm
Guisa, Granma
Pl-01M2 Hypothenemus P aecilomyces Colonias en PDA al inicio Conidioforos solos o en grupos,
hampei, café, lilacinus blanco lanoso que se tornan forman sinemas con verticilos
Santiago de Cuba violeta grisácea con la edad y de hasta seis fiálides, con la
con micelio aéreo irregular. edad se tornan rugosos. Células
Reverso vináceo conidiógenas típicas, 7,0-13,0
(9,5 µm) x 1,5-3,0 (2,8 µm).
Conidios catenulados, gris-violeta
claro, elipsoidales a fusiformes,
algunos con un ápice, 1,5-3,0
(2,2 µm) x 1,5-3,0 (2,4 µm)
Ma-30 Muestra de Metarhizium Colonias en PDA blancas y Patrón conidioforo típico de la
suelo (insecto anisopliae algodonosas al inicio que se especie con verticilos de 2-3
trampa Galleria tornan amarillo verdoso y ramas cada uno, con tonos
mellonella), IPA finalmente verde olivo oscuro y verde olivo oscuro que aclara al
Villena, La costroso con zonas con micelio ápice.
Habana aéreo abundante blanquecino. Células conidiógenas 6,0-10,0
Reverso amarillo intenso (8,1 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm).
Conidios subhialinos a
ligeramente verdes, cilíndricos
a ligeramente elipsoidales,
5,0-8,5 (6,6 µm) x 2,0-3,0
(2,4 µm)

De un total de 53 muestras procesadas de las que 15
fueron de suelo de zonas donde se habían observado
epizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los ais-
lados obtenidos solamente uno correspondió a una
muestra de suelo, que fue obtenido por trampeo con
larvas de Galleria mellonella (Fig. 1).
Con respecto a las especies de interés detectadas se puede
observar que hubo una predominancia de aislados per-
tenecientes a la especie Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2).
En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhizium
anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomy-
ces lilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).
Este comportamiento se puede atribuir a la efectivi-
dad del método de trampeo con insectos susceptibles,
donde se requiere de una cantidad de propágulos via-
bles que garantice la infección, los que deben ser del
orden de 104 unidades por insecto como mínimo según
Bateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Se
sabe que el establecimiento de poblaciones de hongos

fitosanidad/269
 Elósegui y otros

entomopatógenos en el suelo está determinado tanto
por las propiedades físicas y químicas de cada suelo
como por las de la cepa fúngica en cuestión [Rhodes y
Smith, 1992]. También existe la posibilidad de que los
microorganismos competidores con su producción de
metabolitos activos afecten la viabilidad de estos
propágulos fúngicos deseados [Jenkins y Grzywacz,
2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe una
concentración alta de esporas viables del microorga-
nismo de interés en el suelo

Figura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cámara húmeda infectado con el aislado Ma-30 de
Metarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco.

Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.

Sun (2002) logró 6,7% de éxito para Metarhizium y
10% de éxito para Beauveria en trampeos con el termite
Coptotermes formosanus, a partir de 90 muestras origi-
nales de suelo, porcentajes superiores de éxito con res-
pecto al procesamiento de termites muertos sospecho-
sos de micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citado
por Sun, 2002] se refiere al método de trampeo con
270/fitosanidad
Galleria como uno de los más exitosos para detectar
entomopatógenos en termites.
Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan también
el método de trampeo con Galleria en contacto con
muestras de suelo, porque fundamentalmente es el que
lleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cor-
to con un porcentaje de éxito alrededor de 75% para
 Aislamiento, identificación y caracterización...
aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos auto-
res usaron 15 g de suelo aproximadamente por cada
individuo de Galleria y pusieron en contacto con el sue-
lo al insecto trampeador hasta 18 días; sin embargo, en
este trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo útil
por trampeo con Galleria, lo que representó 7% de éxi-
to. Este comportamiento puede deberse a que la canti-
dad de suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo en
contacto con este solo fue de nueve días, además de que
la cantidad de propágulos del hongo de interés presen-
te en el suelo es muy variable y depende de condiciones
específicas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1).
Un método más efectivo para obtener nuevos aislados
de hongos es el aislamiento de colonias fúngicas únicas
(ufc) a partir de muestras de suelo por diluciones
seriadas, según procedimiento detallado por Lecuona
(1996). No obstante, es ampliamente aceptado que este
método es muy caro y se prefiere usar en el aislamiento
y selección de especies bacterianas, como por ejemplo
Bacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ahí
que se decidiera no emplearlo para enriquecer el núme-
ro de aislados de la Colección de Hongos Entomopa-
tógenos del INISAV.
El porcentaje de éxito obtenido en este trabajo para
las muestras de insectos sospechosos de micosis o con
una evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) plan-
tean que aunque este método de aislamiento directo
conlleva mucho tiempo de muestreo en campo y expe-
riencia, la realidad es que entre los más exitosos agen-
tes de control con microorganismos se encuentran
aquellos aislados obtenidos directamente de los insec-
tos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o de
métodos indirectos a través de medios de cultivo se-
lectivos.
La frecuencia alta de aparición de Beauveria bassiana
se debió al amplio rango de hospedantes de este pató-
geno, además de que la mayoría de los aislamientos se
hicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca del
café), y se conoce que esta especie fúngica regularmen-
te se ha encontrado que atacan las poblaciones del in-
secto de forma natural en los cafetales. De hecho, es
esta la razón de que sea uno de los entomopatógenos
más estudiados para el control de esta plaga [Bustillo
et al., 1999].
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. así como Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavoviride
Gams and Rozsypal están entre los hongos entomo-
patógenos más usualmente encontrados en la natura-
leza. Por ello, colecciones de cultivo internacionalmente
reconocidas cuentan con varios cientos de aislados de
estas tres especies como la Colección de Hongos
Entomopatógenos para Investigaciones Agrícolas del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos
(ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection)
y la Colección del IMI (International Mycological
Institute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Bateman
et al., 1996]. En Cuba más del 85% de la Colección de
Hongos Entomopatógenos del INISAV está represen-
tada por aislados de Beauveria y Metarhizium.
En relación con el aislamiento de Paecilomyces lilacinus
obtenido de Hypothenemus hampei se sabe que este
hongo se encuentra comúnmente en las crías de broca
en laboratorio, donde es posible que las condiciones de
hacinamiento, la alta humedad relativa y la falta de
desinfección de las cerezas favorezcan la invasión de esta
especie para atacar a la broca, si bien en la planta de
café en el campo no se ha encontrado [Posada et al.,
1998]. También es cierto que P. lilacinus está cataloga-
do como hongo entomopatógeno oportunista y se ha
usado exitosamente en el control de nematodos
fitopatógenos [López, 1995]. Por esta razón se decidió
incorporarlo a la Colección de Hongos Entomo-
patógenos del INISAV para futuras investigaciones.
Los productos exitosos a base de hongos desarrollados
en el mercado han surgido a partir de un monitoreo de
aislados obtenidos de las regiones geográficas y
agroecosistemas, donde está el organismo plaga por
controlar, así como de las colecciones de cultivos.
Bateman et al. (1996) reportaron la selección de una
sola cepa de M. anisopliae, después de haber ensayado
159 aislados de Beauveria y Metarhizium contra
Schistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto con-
firma la necesidad de contar con abundante cantidad
de aislados de los más diversos orígenes cuando se pre-
cisa obtener agentes microbianos efectivos como
biocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996;
Jenkins y Grzywacz, 2003].
Como se puede apreciar, de acuerdo con las caracterís-
ticas macro y microculturales, para los aislados de
Beauveria existió una alta similitud, por lo que una
separación entre estos por los métodos tradicionales
morfométricos no es factible (Tabla 1). Para lograr la
distinción entre aislados hay que recurrir a métodos de
biología molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Brid-
ge et al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al.,
2002]. Estos métodos moleculares también se usan como
una forma altamente reproducible de reconocer cada
fitosanidad/271
 Elósegui y otros
aislado para patentar, registrar los productos y
monitorear tanto su destino en el ecosistema donde se
libere como las posibles interacciones negativas que
puedan existir entre el aislado liberado y el resto de los
aislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000;
Bielikova et al., 2002].
Finalmente todos los aislados de interés obtenidos se
incorporaron al banco de cepas de hongos entomo-
patógenos, y en la base de datos de esa colección se re-
gistraron las características macroculturales, micro-
culturales, origen y especie a que pertenecen, con el
objetivo de conservarlos como agentes potenciales de
biocontrol de insectos plaga para futuros estudios.
CONCLUSIONES
• Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos ento-
mopatógenos de los que uno fue de Metarhizium
anisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el resto
de Beauveria bassiana.
• El método de aislamiento directo a partir de insec-
tos micosados tuvo 42% de efectividad.
• El método de aislamiento a partir de muestras de
suelo de hongos entomopatógenos mediante trampeo
con larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo,
con 7% de éxito solamente.
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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DISPERSIÓN, DISTRIBUCIÓN ACTUAL Y NUEVOS

RESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM
Ecología

(THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBA

Santiago F. Jiménez Jiménez,1 Liuva Pérez López,2 Martha Toro,3 Criseida Granda,4 Amelia Mateo,5
Héctor Sariol,6 Elisa Rodríguez,7 Rodney Pérez,8 Roquelina Jiménez,9 Ángel Pérez-Alejo10 y Ransés
Vázquez11
1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu
2
Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana
3
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2½, Guantánamo
4
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba
5
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongación de Carbó 40, Alturas de Perera y calle
Holguín, Holguín.
6
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Santiago de Cuba Km 3½, Bayamo,
Granma
7
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diéguez y Antonio Barrera,
Las Tunas, CP 75200.
8
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación
Norte, Camagüey
9
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos
10
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2½, Santa Clara, Villa Clara
11
Instituto de Meteorología. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700

RESUMEN
Durante el período 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentes
provincias de Cuba que permitieron actualizar la situación de F.
schultzei en relación con el grado de dispersión logrado por la espe-
cie, así como las plantas que le sirven de reservorios y su distribu-
ción. Se detectó la presencia de esta especie de trips en la mayoría
de las provincias del país, y se reconoció que su mayor distribución
la alcanza en la región oriental, especialmente en Camagüey, Granma,
Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. Las especies botánicas
sobre los que se detectó F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de las
cuales 84 se informan por primera vez para el país. No obstante, el
insecto se detectó de forma mayoritaria solamente sobre 24 espe-
cies de plantas, básicamente vegetales, hortalizas y ornamentales.
El mayor número de detecciones correspondió a las rosas de dife-
rentes colores, y se realizó también un número considerable de ellas
sobre quimbombó, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca,
tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena y habichuelas, lo que
apunta a las preferencias de F. schultzei. Debido a la posibilidad de
infectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especies
de plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos –demos-
trada por este trips en numerosos países, incluidos algunos de este
hemisferio–, se considera que son ellas las que actualmente poseen
el mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermeda-
des virales.
ABSTRACT
Samplings in different provinces of Cuba were carried out during the
period 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei in
relation with the dispersion grade achieved by the species, as well as
the plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presence
of this trips species was detected in most of the provinces and it was
recognized that its biggest distribution is reached in the oriental
region, especially in Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cuba
and Guantánamo. Botanical species on those F. schultzei was detected
reached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time for
the country. Nevertheless, the insect was only detected in a majority
way on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals.
The biggest number of detections corresponded to different colours
roses, and a considerable number of them on quimbombó (lady’s
fingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations,
pumpkin, carolá, eggplant and kidney beans, what points out to the
preferences of F. schultzei. Keeping in mind the possibility to be
infected with tospovirus that present some of these species of plants
and given the vector capacity of these patogens –demonstrated by
this thrips in numerous countries, including some of our hemisphere–, it
is considered they possess the biggest danger potential to be affected
by this viral group at the moment.
Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thrips

Palabras claves: distribución, Frankliniella schultzei, reservorios,

trips

fitosanidad/273
 Jiménez y otros
INTRODUCCIÓN
Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:
Thripidae) es una especie de trips que, además de
fitófago, se incluye entre las confirmadas como vectores
de tospovirus [Mound, 2002], razón que la convierte en
un insecto plaga doblemente peligroso.
Según Vierbergen y Mantel, 1991 [citados por
Kormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en los
trópicos, extendida a lo largo de África, Asia, Austra-
lia, Caribe, Pacífico y América del Sur. También se in-
forma en la Florida y en zonas de clima templado (in-
troducida) como Gran Bretaña, Italia y Países Bajos.
Palmer et al. (1992) le atribuyen hábitos polífagos (flo-
res), y la informan en ají chile, algodón, compuestas,
cebolla, sorgo y tomate, entre otras.
En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informe
de la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscu-
ra sobre los cultivos de papa y tomate. Posteriormente
Pérez et al. (2004) confirmaron su presencia y la infor-
maron sobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumis
sativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refie-
ren a muestras colectadas en provincias de la zona occi-
dental del país (La Habana y Ciudad de La Habana), y
mencionan una baja intensidad de la especie.
La forma oscura de F. schultzei está reconocida como
vector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted Wilt
Virus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969;
Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus
(TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkamp
et al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus
(CSNV) [Nagata y de Ávila, 2000]. Esta forma oscura
está extendida a lo largo de América del Sur y se indica
como un vector importante de tospovirus en Brasil (De
Ávila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001].
Más recientemente Sakurai (2004) demostró también que
la forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay,
puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser un
vector importante del virus en los campos de tomate.
Este trabajo se realizó como una contribución al cono-
cimiento del grado de dispersión, la distribución actual
y la diversidad de hospedantes que posee F. schultzei
en Cuba, dado el peligro potencial que representa esta
especie, más que como fitófago, como vector de enfer-
medades virales, particularmente de tospovirus.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se llevó a cabo en dos etapas durante el pe-
ríodo comprendido entre los años 2001-2006, y mediante
274/fitosanidad
muestreos efectuados en las diferentes provincias del
país, en los que se realizó la inspección local de áreas
sembradas con plantas ornamentales (jardines domés-
ticos, jardines botánicos, jardines de instalaciones vin-
culadas al turismo y otros); áreas productoras de cul-
tivos en empresas y cooperativas agrícolas; semilleros
y viveros; áreas de floricultura; huertos intensivos,
organopónicos y cultivos protegidos y áreas citrícolas.
En la primera etapa, que comprendió del 2001 al 2003,
los muestreos mensuales se realizaron en el período com-
prendido entre septiembre y marzo, y se tomó una
muestra compuesta por no menos de 10 especies botá-
nicas por provincia. En la segunda etapa, entre el 2004
y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo de
todo el año, y en cada inspección mensual se observa-
ron no menos de 20 especies botánicas.
En los dos períodos se revisaron vegetales, hortalizas,
viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestras
estuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas y
flores, según el caso. Cada una de ellas, después de co-
lectada, se introdujo de modo independiente en bolsas
plásticas que se identificaron de acuerdo con el sitio de
procedencia y la fecha de muestreo.
El material vegetal con los trips se revisó en las Esta-
ciones Territoriales de Protección de Plantas (ETPP)
de las diferentes provincias, con la finalidad de extraer
de cada muestra los especímenes presentes e introdu-
cirlos en viales con alcohol al 70%, en los que se anotó,
para cada caso, el hospedante, el sitio de procedencia
de la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posterior-
mente los viales se enviaron a los Laboratorios Provin-
ciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su iden-
tificación y/o al Laboratorio Central de Cuarentena
para su identificación y/o confirmación, según corres-
pondiera. Para la ejecución del diagnóstico se utiliza-
ron las claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo
(1996), Rodríguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).
En la mapificación de las muestras con detecciones de
F. schultzei se utilizó el Sistema de Cuadrantes
Cartográficos [CNSV, 1997], según su versión digita-
lizada [Vázquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realizó
en estrecha relación con la encuesta nacional de espe-
cies peligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacio-
nal de Sanidad Vegetal.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Durante el período comprendido entre el 2001 y el 2003,
de un total de 4818 muestras positivas para trips, solo
se identificó F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,
 Dispersión, distribución actual...

y estas correspondieron al último año de ese trienio.
Procedían fundamentalmente de las provincias de
Guantánamo y Holguín, en el oriente de Cuba (Tabla 1).
Este resultado constituyó la primera evidencia del co-
mienzo de la dispersión de la especie, cuya presencia en
el país, hasta ese momento, se limitaba a las provincias
habaneras [Suris et al., 2001].
Del total de las muestras obtenidas en el período com-
prendido entre el 2004 y el 2006 se realizaron 313
detecciones de F. schultzei, lo que demostró un nota-
ble incremento respecto al período precedente, así como
una mayor distribución por diferentes provincias del
país (Tabla 1), con la mayor abundancia en la región
oriental.

Tabla 1. Dispersión de F. schultzei en el país (período 2001-2006)

Período I Período II
Provincias
2001 2002 2003 2004 2005 2006
Pinar del Río 0 0 0 0 0 1
La Habana 0 0 0 0 0 13
Ciudad de La Habana 0 0 0 0 0 6
Matanzas 0 0 0 0 0 2
Villa Clara 0 0 1 0 0 0
Cienfuegos 0 0 0 0 0 4
Sancti Spíritus 0 0 0 0 0 0
Ciego de Ávila 0 0 0 0 0 0
Camagüey 0 0 0 0 24 0
Las Tunas 0 0 0 1 0 0
Granma 0 0 2 4 8 2
Holguín 0 0 9 7 48 14
Santiago de Cuba 0 0 0 16 50 54
Guantánamo 0 0 21 37 22 0
Total 0 0 33 65 152 96

La ubicación de las muestras según el sistema de cua-
drantes cartográficos permite visualizar el grado de
dispersión alcanzado por F. schultzei a lo largo del país
en el curso de los años que comprendió el trabajo. En
el mapa se aprecia que la especie se distribuye mayor-
mente en las provincias de la región oriental de Cuba,
básicamente Camagüey, Granma, Holguín, Santiago
de Cuba y Guantánamo, donde se localiza la mayor
cantidad de cuadrantes en los que se ha detectado la
presencia de la especie (Fig. 1).
En relación con los reservorios de F. schultzei, du-
rante el estudio se detectó la presencia del insecto en
93 especies botánicas, de las cuales ocho ya habían
sido informadas anteriormente: Lycopersicum lyco-
persici Mill. [Surís et al., 2001], Vigna sesquipedalis
F. (habichuela), Cucumis sativus L. [Pérez et al.,
2004], Allium sativum L., Beta vulgaris L., Capsicum
annum L., Portulaca oleracea L. y Argemone mexica-
na L. [González y Surís, 2005]. Esto significa que se
informan 85 nuevos reservorios de la especie para el
país (Tabla 2).
La mayor preferencia de F. schultzei, según la frecuen-
cia de detección registrada, se muestra en la Tabla 3,
donde se relacionan las 24 especies de plantas sobre las
cuales la especie se detectó en un número de muestras
mayor o igual a cuatro. Entre ellas se incluyen funda-
mentalmente vegetales, hortalizas y ornamentales. De
todas las referidas, el mayor número de detecciones se
produjo sobre quimbombó (7), abrojo y margaritas
japonesas (8), lirios (9), espinaca (11), tomate (12),
claveles (13), calabaza (15), carolá y berenjena (16),
habichuela (19), y entre todas se destacaron las rosas
de diferentes colores con 42 detecciones en cinco pro-
vincias del país.
En consideración a la posibilidad de infectarse con
tospovirus que presentan algunas de estas especies de
plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos
demostrada por F. schultzei en numerosos países y bá-
sicamente en este hemisferio norte [De Ávila et al., 1998;
Williams et al., 2001; Sakurai, 2004], se considera que
en Cuba son ellas las que, actualmente, poseen el ma-
yor peligro potencial de resultar afectadas por dichas
enfermedades virales.

fitosanidad/275
 Jiménez y otros

Tabla 2. Relación de especies de plantas encontradas como nuevos

reservorios de F. schultzei en Cuba
Nombre científico Nombre común
Acalypha sp. Rabo de gato
Allamanda cathartica Lin. Alamanda
Allium cepa Lin. Cebolla
Allium schoenoprassum Lin. Cebollino
Althaea rosea Car. Varita de San José
Amaranthus spinosus, Lin. Bledo espinoso
Angelonia cubensis Robinson Nomeolvides malva
Argyreia nervosa Boj. Cordón de seda
Bastardia viscosa (L.) Malva bruja
Begonia sp. Begonia
Benincasa hispida Cong. Calabaza china
Beta vulgaris L. var. cicla Acelga
Bidens pilosa L. Romerillo
Cajanus indicus Spreg Frijol guandul
Calendula officinalis Lin. Marigol
Callotropis procera (Ait.) R. Br. Algodón de seda
Capsicum frutescens L. Ají
Cassia fistula Cañandonga
Cestrum nocturnum Lin. Galán de noche
Citrullus vulgaris Schrad. Melón
Codiaeum variegatum Blume. Croton
Crinum sp. Lirio flor
Cucurbita pepo L. Calabaza
Dahlia coccinea Cav. Dalia malva
Datura metel L. Clarín
Daucus carota sativa D. C. Zanahoria
Dianthus caryophyllus L. Clavel
Gardenia jasminoides Ellis Jazmín del cabo (gardenia)
Gerbera jamesonii Hort. Margarita japonesa
Gliricidia sepium L. Júpiter
Gossypium hirsutum L. Algodón
Helianthus annuus Lin. Girasol
Helychrysum bracteatum Andr. Siempreviva
Hibiscus esculentus L. Quimbombó
Hibiscus rosa-sinensis Lin. Marpacífico
Hibiscus sp. Hibiscus, Marpacífico
Tabla 3. Especies botánicas sobre las que se detectó F. schultzei en cuatro o más ocasiones y procedencia
de las muestras
Nombre común Nombre científico Procedencia
Cebolla A. cepa Guantánamo
Acelga B. vulgaris var. cicla Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Romerillo B. pilosa Ciudad de La Habana, Holguín, Guantánamo
Melón C. vulgaris Holguín
Lirio flor Crinum sp. Santiago de Cuba
Pepino C. sativus Holguín, Guantánamo
Calabaza C. pepo Camagüey, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

276/fitosanidad
 Dispersión, distribución actual...

Dalia D. coccinea Granma, Santiago de Cuba

Clavel D. caryophyllus La Habana, Holguín
Margarita japonesa G. jamesonii Cienfuegos, Camagüey, Santiago de Cuba
Quimbombo H. esculentus Holguín, Guantánamo
Marpacífico H. rosa-sinensis Matanzas, Camagüey, Santiago de Cuba
Jazmín Jasminum sp. Holguín, Santiago de Cuba
Lechuga L. sativa Ciudad de La Habana, Holguín, Santiago de Cuba
Tomate L. lycopercisi Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Frijol Phaseolus sp. Holguín, Guantánamo
Rosa Rosa sp. Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba,
Guantánamo
Berenjena S. melongena Santiago de Cuba, Guantánamo
Espinaca S. oleracea Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Carolá T. erecta Pinar del Río, La Habana, Santiago de Cuba, Guantánamo
Copetúa T. patula Holguín
Abrojo terrestre T. cistoides Santiago de Cuba
Habichuela V. sesquipedalis Villa Clara, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo
Vicaria V. rosea Santiago de Cuba

Figura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de F. schultzei en Cuba según la ubicación geográfica de sus reservorios (2001-2006).

CONCLUSIONES
• F. schultzei se dispersó a lo largo de Cuba entre el
2001 y el 2006, y diversificó sus reservorios hasta
alcanzar la cifra de 92 especies botánicas.
• La más amplia distribución de la especie se registró
en los territorios de las provincias de Camagüey,
Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo.
• Se informan 84 especies de plantas que constituyen
nuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entre
las cuales quimbombó, abrojo, margaritas japone-
sas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá,
berenjena, habichuela y especialmente las rosas re-
sultan preferidas por el insecto.
REFERENCIAS
CNSV: «Vigilancia fitosanitaria por cuadrantes cartográficos», Centro Nacio-
nal de Sanidad Vegetal, Ministerio de la Agricultura, La Habana, 1997.

fitosanidad/277
 Jiménez y otros
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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
VARIABILIDAD DE LAS ISOENZIMAS ESTERASAS DE BEAUVERIA
BASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN
María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez
Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar. Carretera CAI Manuel Martínez Prieto
Km 2½, Boyeros, Ciudad de La Habana, CP 19390, fax: (53-7) 260 2571, meem@inica.edu.cu
RESUMEN
Se determinó la variabilidad de las isoenzimas esterasas del
hifomiceto entomopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin
mediante electroforesis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Se
analizaron los zimogramas de 21 aislamientos de diferentes oríge-
nes geográficos y entomológicos. A partir de la matriz de los datos
originales se calculó la distancia genética y se realizó el análisis de
agrupamiento de los individuos mediante el método de los promedios
de las distancias no ponderadas. La presencia de 24 bandas diferen-
ciales y de seis grupos de diversidad molecular evidenciaron la va-
riabilidad genética de B. bassiana para el sistema enzimático estu-
diado.
Palabras claves: Beauveria bassiana, variabilidad, esterasas, Diatraea
saccharalis, caña de azúcar
INTRODUCCIÓN
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hi-
fomiceto entomopatógeno ampliamente utilizado en la
lucha biológica contra los insectos plaga de los cultivos
agrícolas [Moino et al., 2002; Sáenz de Cabezón et al.,
2003; Estrada et al., 2004; Kauffman et al., 2005]. En
Cuba se utiliza para disminuir las poblaciones larvales
de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), ba-
rrenador de la caña de azúcar (Saccharum sp. híbrido).
El estudio de las isoenzimas esterasas contribuye al
conocimiento de la variabilidad genética de diferen-
tes especies entomopatógenas [Estrada et al., 1997;
Bruce et al., 2003]. Este análisis permite establecer
diferencias no detectables desde el punto de vista
morfológico.
El interés agronómico y ecológico de las aplicaciones de
B. bassiana en el cultivo de la caña de azúcar precisa
conocer las diferencias isoenzimáticas entre los aisla-
mientos del hifomiceto, de forma tal que estos puedan
ABSTRACT
Isoenzyme esterases variability of hyphomycete fungus Beauveria
bassiana (Balsamo) Vuillemin was determinated by means vertical
electrophoresis on 8.5% polyacrylamide gel. Twenty one isolates from
different geographical and entomology origin groups were analyzed.
Starting from the matrix of the original data the genetic distance was
calculated. The analysis of individuals cluster was carried out by
means of the unweighted pair–group method, arithmetic average. The
presence of 24 differential bands and six groups of molecular diversity
evidenced the genetic variability of B. bassiana for the studied
enzymatic system.
Keys words: Beauveria bassiana, variability, esterases, Diatraea
saccharalis, sugar cane
ser identificados luego de su aplicación en el agroe-
cosistema cañero. En este sentido en el presente tra-
bajo se determina la variabilidad de las isoenzimas
esterasas de B. bassiana, sistema enzimático repor-
tado polimorfo para esta especie [Fernandes et al.,
2006].
MATERIALES Y MÉTODOS
Se analizaron 21 aislamientos (Tabla 1) de B. bassiana,
los cuales se cultivaron en 50 mL de medio de cultivo
estático Adamek (1965) e incubados a 25oC durante
siete días.
El micelio obtenido se pesó húmedo y seco, después de
filtrarlo por papel Filtrak 390 y llevarlo a sequedad a
temperatura ambiente durante tres días. Un gramo del
secado se maceró con tampón fosfato a pH = 6,5 con
sacarosa a 20% en una proporción de 1:3. El macerado
se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.
fitosanidad/279
 Estrada y Piñón

Tabla 1. Relación de los aislamientos de Beauveria bassiana

(Bals.) Vuill. utilizados en el trabajo
Aislamientos País de origen Hospedante de origen
1 Cuba Diatraea saccharalis
2 Cuba Diatraea saccharalis
3 Cuba Diatraea saccharalis
4 Cuba Diatraea saccharalis
5 Francia Leptinotarsa decemlineata
6 Cuba Diatraea saccharalis
7 Guadalupe Insecta
8 Estados Unidos Artiples flloridus
9 Cuba Diatraea saccharalis
10 Cuba Diatraea saccharalis
11 Cuba Diatraea saccharalis
12 Francia Sitona discoideus
13 Cuba Diatraea saccharalis
14 Cuba Insecta
15 Cuba Diatraea saccharalis
16 Cuba Diatraea saccharalis
17 Cuba Diatraea saccharalis
18 Cuba Hysipyla grandella
19 Cuba Diatraea saccharalis
20 India Insecta
21 Bulgaria Insecta

Se realizaron seis extracciones para cada aislamiento,
las que se examinaron comparativamente por electro-
foresis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. La
electroforesis se realizó entre 50-60 mA durante 4 h.
Para el revelado de los geles se utilizaron como sustratos
α y β-naftil acetato, y se analizaron visualmente, para
lo cual se tuvo en cuenta el número y la posición de las
bandas de cada aislamiento. Las movilidades relativas
de las manchas se calcularon a partir del punto de apli-
cación como:
Rf = Movilidad de la mancha / Movilidad del frente de corrida
Cada banda enzimática se consideró como una varia-
ble cualitativa presente (1) o ausente (0). Se utilizó el
programa NTSYS versión 2.01, y a partir de la ma-
triz de los datos originales se calculó la distancia
genética mediante el coeficiente de similitud SM y se
realizó el análisis de agrupamiento de los individuos
por el método de los promedios de las distancias no
ponderadas (Unweighted Pair-Group Method,
Arithmetic Average). Los patrones de marcadores
moleculares se determinaron según Cornide et al.
(2000).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Fig. 1 corresponde a los zimogramas para esterasas
de los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados. Se apre-
cia un total de 41 bandas. De ellas 24 son polimórficas,
es decir, son bandas únicas para diferentes aislamientos
que representan 58,53% del total de las bandas revela-
das. La presencia de 18 patrones de bandas evidencia el
polimorfismo para esterasas de B. bassiana, lo que ha
sido demostrado por diferentes autores para esta espe-
cie entomopatógena [Liu et al., 2003; Meyling y Eilenberg,
2005].

280/fitosanidad
 Variabilidad de las isoenzimas...

Figura 1. Zimograma para esterasas de 21 aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.

(1-41: bandas; I-XVIII: patrones)

De acuerdo con lo obtenido mediante el análisis de agru-
pamiento de los 21 aislamientos de B. bassiana estu-
diados, se formaron seis grupos de diversidad molecular
(I, II, III, IV, V y VI) (Fig. 2), donde los aislamientos
no aparecen agrupados por su origen geográfico y
entomológico.
La presencia de bandas diferenciales (Tabla 2) permitió
distinguir las bandas de los grupos de diversidad
molecular. Así, por ejemplo, en el grupo I, formado por
los aislamientos 1, 3, 18, 2, 4 y 5, se puede diferenciar
el aislamiento 3 del 5 por la presencia de las bandas
B14 y B34 en el primero, y la ausencia en el segundo.
En el grupo II se evidencia la presencia de bandas dife-
renciales entre los aislamientos que conforman en este
grupo. En el caso del grupo III los aislamientos 11 y 12
se identifican del resto de los aislamientos por presen-
tar las bandas B11, B25 y B35; sin embargo, estos ais-
lamientos no pudieron diferenciarse entre sí. El resto
de los aislamientos que conforman los grupos IV, V y
VI presentaron bandas diferenciales que permitieron
identificarlos entre sí.
fitosanidad/281
 Estrada y Piñón

Figura 2. Análisis de agrupamiento de los 21 aislamientos

de B. bassiana basado en la matriz de similitud.

Tabla 2. Patrones de descriptores moleculares de los aislamientos de B. bassiana con

isoenzimas esterasas
Grupos de Aislamientos B11 B12 B25 B28 B35 B38 B39 B41
diversidad
molecular
I 1 0 1 0 0 1 0 0 0
3 0 1 0 0 0 0 0 0
18 0 1 0 0 0 0 0 0
2 0 1 0 0 0 0 0 0
4 0 1 0 1 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0
II 6 0 0 0 1 1 0 1 0
7 0 0 0 1 0 0 1 0
15 0 0 0 1 0 0 1 0
19 0 0 0 1 0 0 0 1
20 0 0 0 1 0 0 0 1
8 0 0 0 1 0 0 1 0
13 1 0 0 1 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 1 0 0
10 0 0 0 1 0 1 0 1
III 11 1 0 1 0 1 0 0 0
12 1 0 1 0 1 0 0 0
IV 16 0 0 0 0 0 0 1 0
17 0 0 0 0 0 0 0 0
V 21 0 0 0 0 0 0 0 0
VI 14 0 0 0 0 0 0 0 0

Bandas diferenciales entre grupos de diversidad molecular.

Bandas diferenciales entre aislamientos de un mismo grupo de diversidad molecular.

282/fitosanidad
 Variabilidad de las isoenzimas...
La caracterización basada en el estudio de las isoenzimas
esterasas evidenció la variabilidad genética de B. bassia-
na y permitió contar con otro criterio para diferenciar
los aislamientos del hifomiceto por sus patrones de
bandas, lo que resulta de utilidad práctica para la co-
lección de microorganismos entomopatógenos.
La determinación de un carácter discriminante para
B. bassiana a partir de las bandas diferenciales resulta
de interés agronómico, pues fue posible diferenciar el
aislamiento 3 que se aplica en el cultivo de la caña de
azúcar del 5 que se aplica en la agricultura no cañera.
Como B. bassiana se ha aislado a partir de larvas y
crisálidas de D. saccharalis colectadas en diferentes
partes de la planta y a partir de muestras de suelo (Ta-
bla 1), la evaluación de la aplicación del aislamiento 3
en el campo requiere de su caracterización para la dife-
renciación de los aislamientos que aparecen natural-
mente en el agroecosistema cañero.
Generalmente los patrones isoenzimáticos no se
correlacionan con los insectos hospedantes, con el país
de origen ni con otro carácter. Ellos pueden emplearse
como marcadores individuales, y se han utilizados para
conocer la estabilidad genética de especies de hifomicetos
entomopatógenos sometidas a diferentes presiones de
selección [Rakotoniainy et al., 1994].
El conocimiento de la variabilidad de las isoenzimas
esterasas constituye una herramienta para la caracte-
rización de los aislamientos de B. bassiana en el Pro-
grama Nacional de Lucha Biológica contra el barrena-
dor de la caña de azúcar D. saccharalis.
CONCLUSIONES
• La caracterización basada en el estudio de las
isoenzimas esterasas evidenció la variabilidad genética
de B. bassiana y permitió contar con otro criterio
para diferenciar los aislamientos del hifomiceto por
sus patrones de bandas.
• Fue posible diferenciar el aislamiento 3, que se aplica
en el cultivo de la caña de azúcar, del aislamiento 5
que se aplica en la agricultura no cañera.
• La evaluación de la aplicación del aislamiento 3 en el
campo requiere de su caracterización para la dife-
renciación de los aislamientos que aparecen natural-
mente en el agroecosistema cañero.
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fitosanidad/283
 Estrada y Piñón

284/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Control biológico

UN MEDIO SIMPLIFICADO A BASE DE SOYA MÁS AZÚCAR

TURBINADA DE CAÑA PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGO
ACAROPATÓGENO HIRSUTELLA NODULOSA PETCH
EN FASE LÍQUIDA

Reinaldo I. Cabrera,1 Marlén Vega2 y Litzy Ayra1

1
Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, entomopatogeno@iift.cu.
2
Instituto de Investigaciones del Arroz. Autopista Novia del Mediodía Km 16½, Bauta, La Habana,
iiarroz@bauta.esihabana.cu; iiarroz@sba.esihabana.cu

RESUMEN ABSTRACT
The fungus Hirsutella nodulosa Petch is an important natural enemy of
El hongo Hirsutella nodulosa Petch resulta un importante enemigo
many phytophague mites and it is very necessary the determination of
natural de muchos ácaros fitófagos. Para su producción como
a simple, economic and efficient culture medium for its production as
bioplaguicida es muy necesaria la determinación de un medio de
bioplaguicide. Five soybean concentrations have been assayed (6;
cultivo sencillo, económico y eficiente. Se ensayaron cinco concen-
8; 10; 12 and 14% w/v) with turbinated cane sugar (3 and 4% w/v).
traciones de soya (6, 8, 10, 12 y 14% p/v) con dos de azúcar turbinada
Each combination has been distributed separately in three erlenmeyers
de caña (3 y 4% p/v). Cada combinación se distribuyó por separado
of 300 mL with 100 mL of medium each one. They have been sterilized
en tres erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de medio cada uno, y
in autoclave at 121ºC during 25 min and inoculated with a micelial
previa esterilización en autoclave a 121oC durante 25 min; se inocu-
suspension of the fungus at 3% v/v. They were fermented four days
laron con una suspensión micelial del hongo a 3% v/v para su fer-
with a continuous shaker at 27 ± 1ºC and 180 rpm as well as the
mentación durante cuatro días en zaranda de producción continua a
inoculum. Each biomass was recovered on fitter paper by vacuum
27 ± 1oC y 180 rpm como ocurrió con el inóculo. Seguidamente se
filtration. They were put in an oven at 60ºC during 24 h to determine
recuperó cada biomasa en papel de filtro por filtración al vacío y se
dry weight by analytical balance. The results were analyzed by an
colocó en una estufa a 60oC durante 24 h para determinar su peso
ANOVA of double classification, previous data transformation in x + 1 .
seco en balanza analítica. Los resultados se analizaron mediante un
ANOVA de clasificación doble, previa transformación de los datos en Means were compared by Duncan Multiple Range Test for p < 0.05.
x + 1 , y las medias se compararon entre sí por la prueba de rangos
The best combination of soybean plus sugar was 14 and 3% w/v
múltiples de Duncan para p < 0,05. La mejor combinación de soya respectively, with a mean up to 1.14 g (dry weight of mycelium) by
más azúcar fue la de 14 y 3% p/v respectivamente, con resultados each 100 mL of medium. This result allows considering it as economic
que alcanzaron hasta un promedio de 1,14 g (peso seco de micelio) and efficient for the great scale production of this mite pathogen and
por cada 100 mL de medio, lo que permite considerarlo económico y which the first Cuban experience.
eficiente para la producción a gran escala de este acaropatógeno y Key words: Glicine max, Hirsutella nodulosa, submerge culture, cane
como la primera experiencia en Cuba. sugar
Palabras claves: Glicine max, Hirsutella nodulosa, cultivo sumergi-
do, azúcar de caña

INTRODUCCIÓN
Las investigaciones realizadas en Cuba y otros países
con el hongo Hirsutella nodulosa Petch, al que se le con-
sidera un importante enemigo natural de muchos ácaros
fitófagos [Cabrera y Domínguez, 1987 y 1987a; Minter
y Brady, 1980], han motivado el interés por su utiliza-
ción como bioacaricida.
La llegada al país del ácaro tarsonémido del arroz
Steneotarsonemus spinki Smiley a finales de 1997 [Ra-
mos et al., 1998] y los estudios de H. nodulosa como
enemigo natural de este ácaro en Cuba y Sri Lanka
[Cabrera et al., 2002 y 2005], así como lo difícil que
resulta su control por la vía de la lucha química [Ca-

fitosanidad/285
 Cabrera y otros
brera et al., 2002a], potenciaron la necesidad de pro-
fundizar en la posible utilización de H. nodulosa en los
programas de control biológico y manejo integrado con-
tra esta y otras plagas. Para ello se requiere disponer,
en primer lugar, de un medio de cultivo y una tecnolo-
gía barata que permitan la producción de este aca-
ropatógeno a gran escala y en las cantidades requeri-
das para tales fines.
El presente trabajo ofrece los primeros resultados en
Cuba sobre la búsqueda de un medio simplificado, eco-
nómico y eficiente para la producción del hongo H. no-
dulosa en fase líquida y su importancia en la multipli-
cación acelerada de este control biológico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para la determinación del medio se pesaron por separa-
do 36, 48, 60, 72 y 84 g de soya en grano (Glycine max
(Lin.) Merr.) y se echaron en erlenmeyers de 2 L con
500 mL de agua destilada para su cocción en autoclave
a 121oC durante 35 min. Luego el contenido de cada
recipiente se batió en una batidora licuadora durante
20 s y se filtraron separadamente por un paño de lien-
zo, con presión manual para la extracción de cada par-
te líquida, las que se enrazaron con agua destilada a
600 mL para que la soya quedara a 6, 8, 10, 12 y 14% p/v,
respectivamente.
A los primeros 300 mL con cada concentración de soya
se le adicionó entonces el azúcar turbinada de caña a
3% p/v y a los 300 restantes a 4% p/v, y se filtraron al
vacío por papel de filtro Whatmann no.1. Seguidamen-
te se vertieron por separado 100 mL de cada una de las
combinaciones de nutrientes a las diferentes concen-
traciones en erlenmeyers de 300 mL, y se esterilizaron
a 121oC durante 25 min. En las tres repeticiones que
tuvo el ensayo, el pH fluctuó entre 5,8 y 7.
Como inóculo al 3% v/v se utilizó una cepa de H. nodulosa
recién aislada del ácaro S. spinki y reproducida durante
96 h en medio H [McCoy et al.,1972, citado por Cabrera,
2001], colocado en zaranda de producción continua a
180 rpm y una temperatura de 27 ± 1oC.
Transcurridos los primeros cuatro días de fermenta-
ción, bajo las mismas condiciones antes señaladas se
recuperó por filtración al vacío la biomasa producida
en cada medio, y estas se colocaron en estufa a 60oC
durante 24 h para luego determinar, en balanza analíti-
ca, la producción micelial que se obtuvo en cada er-
lenmeyer.
286/fitosanidad
Todo el trabajo se realizó bajo un diseño de bloques al
azar, en mesa de flujo laminar y con pro pipeta automáti-
ca. Para el análisis de los resultados se utilizó un ANOVA
de clasificación doble, previa transformación de los datos
en x + 1 , y las medias se compararon entre sí por la
prueba de rangos múltiples de Duncan para p < 0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se logró la determinación de un medio de cultivo con
buenas características para su utilización en la produc-
ción de H. nodulosa en fase líquida, y cuyos resultados
superan significativamente a los del testigo, sin la pre-
sencia de la conidiación del hongo en los medios líqui-
dos ensayados, pero sí una abundante biomasa en las
diferentes combinaciones de soya más azúcar formada
por sus micelios y conidióforos.
Se presentaron diferencias significativas para p < 0,05
entre el testigo y todas las concentraciones de soya más
azúcar, así como entre algunas de las combinaciones de
estas fuentes de nutrientes, con los mayores resultados
a medida que se incrementaba el contenido de soya (Fig. 1).
La dinámica de desarrollo de este acaropatógeno en las
combinaciones de nutrientes ensayadas fue muy rápi-
da en lo que respecta a la producción de biomasa
micelial, la que alcanzó hasta un promedio de 1,14 g
(peso seco) por cada 100 mL de medio a los cuatro días
de fermentación a 27 ± 1oC y 180 rpm. La mejor com-
binación de soya más azúcar turbinada de caña fue la
de 14% p/v y 3% p/v respectivamente.
La selección de los medios de cultivos a partir de
sustratos naturales y sus buenos resultados no solo
dependerán de su riqueza nutricional, ya sea en nitró-
geno, carbono u otros elementos, sino además de las
características del medio como viscosidad, turbidez y
pH entre otras, según señalara Cabrera (2001).
El procedimiento metodológico utilizado para la extrac-
ción de elementos como el nitrógeno a partir de la soya
fue similar al desarrollado por Cabrera (2001); resultó
eficaz, lo que permitió disponer de un medio simplifica-
do, eficiente y económico para la reproducción de H. no-
dulosa, una vez combinada la soya con el azúcar
turbinada de caña como fuente de carbono. La ausen-
cia de conidias en este caso no es consecuencia de los
medios utilizados, sino de que este acaropatógeno no
presenta conidiación en cultivo líquido, como ocurre con
la mayoría de las cepas de H. thompsonii [Cabrera,
2001].
 Un medio simplificado a base de soya...
Figura 1. Producción de biomasa de H. nodulosa en diferentes concentraciones de soya
y azúcar turbinada de caña más un testigo.
Como se aprecia en la Fig. 1, se presentaron diferencias
significativas entre el testigo y todas las concentracio-
nes de soya, en lo que a la producción de biomasa micelial
se refiere. Ello confirma la importancia del nitrógeno
orgánico en el desarrollo micelial de H. nodulosa, como
se señaló para H. thompsonii por Cabrera (2001).
La posibilidad de sustituir el extracto de levadura y la
peptona como fuentes portadoras de nitrógeno por la
soya, así como la glucosa y la sacarosa, portadoras de
carbono, por el azúcar turbinada de caña, permite dis-
poner de un medio de cultivo mucho más económico y
eficiente para la producción de H. nodulosa, con rendi-
mientos de hasta 1,14 g de biomasa (peso seco) por cada
100 mL de medio a las 96 h de fermentación. Esta cons-
tituye la primera vez que en Cuba se realizan estudios
para la búsqueda de un medio simplificado para la pro-
ducción de este hongo en fase líquida, y cuyos resulta-
dos son de vital importancia para la producción acele-
rada de este control biológico si se toma en consideración
su lento crecimiento tanto en fase sólida como líquida.
CONCLUSIONES
• El medio a base de soya 14% p/v más azúcar de caña
turbinada a 3% p/v resulta el más eficiente y econó-
mico para la producción masiva del hongo H.
nodulosa en fase líquida, lo que valida su utilización
a gran escala.
• Las diferentes concentraciones de soya más azúcar
que se ensayaron permitieron una buena dinámica
de desarrollo del hongo con resultados, en todos los
casos, superiores a los del testigo.
• H. nodulosa produce una abundante masa micelial
en el medio antes señalado, y en ninguno de los casos
se observó la presencia de conidias.
REFERENCIAS
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parásito para el ácaro del cocotero Erióphyes guerreronis», Cienc. y
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fitosanidad/287
288/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR DE BACILLUS SPP.
SOBRE EL DESARROLLO DE LA PUDRICIÓN BLANDA
DE LA PAPA (SOLANUM TUBEROSUM L.)
Yaritza Reinoso Pozo,1 Luis Casadesús Romero,1 Armando García Suárez,2 Ernesto García Pérez1 y
Victoria Pazos Álvarez-Rivera1
1
Facultad de Biología, Departamento de Microbiología y Virología. Calle 25 no. 455 e/ I y J, Plaza
de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400, yreinoso@fbio.uh.cu
2
Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ Lombillo y San Pedro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400
RESUMEN
La pudrición blanda bacteriana, causada por Pectobacterium
carotovorum, ocurre en una amplia variedad de cultivos y es una de
las más severas enfermedades poscosecha de la papa (Solanum
tuberosum L.) en el mundo entero. El control de esta enfermedad se
basa fundamentalmente en la aplicación de químicos que contami-
nan el medio ambiente y deterioran la salud humana. Una de las
alternativas ecológicas adoptadas es el uso de microorganismos
como agentes de control biológico, entre los que se encuentran los
miembros del género Bacillus. El objetivo del presente trabajo fue
determinar el efecto protector de 23 cepas de Bacillus sp. sobre el
desarrollo de la pudrición blanda de la papa. Para ello se trataron
rodajas de papa con cultivos bacterianos de 24 h y posteriormente se
inocularon con una cepa de P. carotovorum a dos concentraciones
diferentes. Las rodajas se mantuvieron durante 24 h en condiciones
de temperatura y humedad favorables para el desarrollo de la
pudrición. Transcurrido este tiempo se evaluó la efectividad de los
tratamientos respecto a los controles no tratados, y se tuvo en cuenta
la aparición o no de los síntomas característicos de la enfermedad.
Las cepas G15, G19 y G25 solamente tuvieron efecto protector en las
rodajas tratadas con la menor concentración de P. carotovorum, mien-
tras que B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo de la pudrición en
las dos variantes analizadas. El resto de las cepas estudiadas no
mostró protección, y en algunos casos se observó un incremento en
la severidad de las lesiones.
Palabras claves: Bacillus, control biológico, Pectobacterium
carotovorum, Solanum tuberosum
INTRODUCCIÓN
La papa (Solanum tuberosum L.) ocupa el cuarto lugar
entre los diez cultivos de mayor importancia en el mun-
do, superada únicamente por el trigo, el arroz y el maíz.
Su producción anual asciende a más de doscientos mi-
llones de toneladas que repercuten en la alimentación
de gran parte de la población mundial [Estévez et al.,
2001]. En la producción de papa el cultivo puede afec-
tarse por una serie de factores bióticos y abióticos que
disminuyen el rendimiento y calidad de las cosechas,
ABSTRACT
Bacterial soft rot, caused by Pectobacterium carotovorum, happens in
a wide variety of cultivations and it is one of the most severe postharvest
diseases of potato (Solanum tuberosum L.) in the world. The control is
based fundamentally on the application of chemical products that
contaminate the environment and deteriorate human health. One of
the ecological alternatives adopted in this sense is the use of
microorganisms as biological control agents, the members of genera
Bacillus are among them. The objective of the present work was to
determine the protective effect of 23 Bacillus sp. strains on the
development of the potato soft rot. Potato slices were treated with 24 h
growth bacterial cultures and were inoculated with a strain of P.
carotovorum, using two different concentrations. The slices stayed
during 24 h in conditions of temperature and favourable humidity for
the development of the soft rot. Lapsed this time the effectiveness of
the treatments was evaluated in comparison with non treated controls
observing the appearance or not of disease characteristic symptoms.
G15, G19 and G25 strains only had protective effect in the slices tried
with the smallest concentration of P. carotovorum. While B1, G10, Q7
and Q18 inhibited soft rot development in two analyzed variants. The
rest of the studied strains did not show protection, so an increment in
lesions severity was observed in some cases.
Key words: Bacillus, biological control, Pectobacterium carotovorum,
Solanum tuberosum
en especial por la presencia de daños en los tubérculos.
Los factores bióticos de mayor importancia son la pre-
sencia de plagas y enfermedades que generan elevados
costos de manejo y control [Gregory y Andrade, 1996].
Las condiciones tropicales y húmedas resultan poco
favorables para el cultivo de la papa debido a que es
propenso a infectarse con numerosos microorganismos
patógenos fúngicos y bacterianos, además de las difi-
cultades que se presentan para conservar los tubércu-
fitosanidad/289
 Reinoso y otros
los. Las enfermedades bacterianas de la papa provocan
generalmente pudriciones húmedas y pueden ser origina-
das por microorganismos pertenecientes a variados géne-
ros [MINAGRI, 2000]. En Cuba la pudrición blanda, cau-
sada por Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi
y Pectobacterium atrosepticum, es una de las enfermeda-
des bacterianas que se presenta con mayor incidencia en
el campo, y las pérdidas durante el almacenamiento de
los tubérculos son considerables [Galán, 2004].
El control de estos patógenos se dificulta mucho debi-
do a que la enfermedad se puede presentar en diferen-
tes etapas del desarrollo de la planta. Estas bacterias
además pueden sobrevivir en el suelo, el agua de riego
y la maquinaria agrícola. Por el momento el control de
la calidad fitosanitaria de los tubérculos-semilla y la
aplicación de productos químicos son medidas que con-
tribuyen a disminuir los daños [Galán, 2004].
Actualmente se aboga por el uso de prácticas agrícolas
ecológicas como el control biológico mediante el uso de
microorganismos antagonistas, los cuales pueden limi-
tar la iniciación y propagación de las enfermedades
causadas por patógenos vegetales mediante mecanis-
mos de competencia, antibiosis, inducción de resisten-
cia, entre otros [Fernández-Larrea, 2001].
Varias especies de los géneros Bacillus, Paenibacillus y
Brevibacillus producen sustancias antimicrobianas, de
Tabla 1. Procedencia de las cepas del género Bacillus utilizadas
Cepas Procedencia
G1 Municipio de Güines
G2 Municipio de Güines
G10 Municipio de Güines
G11 Municipio de Güines
G12 Municipio de Güines
G14 Municipio de Güines
G15 Municipio de Güines
G17 Municipio de Güines
G18 Municipio de Güines
G29 Municipio de Güines
G23 Municipio de Güines
G25 Municipio de Güines
Para el crecimiento de las especies del género Bacillus se
utilizaron frascos erlenmeyers de 1 L de capacidad con
100 mL de medio caldo nutriente (Biocen). Los frascos se
inocularon con una suspensión bacteriana correspondiente
290/fitosanidad
las cuales se han descrito más de de setenta antibióticos
de bajo peso molecular y naturaleza polipeptídica, en-
tre las cuales B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus,
B. circulans, B. cereus, Brevibacillus laterosporus y
Paenibacillus polymyxa son los mayores productores.
Los metabolitos secundarios producidos por algunas
de estas especies inhiben el crecimiento de bacterias y
hongos, por lo que se ha sugerido su uso como un méto-
do suplementario para la protección de las plantas con-
tra microorganismos fitopatógenos [Földes et al., 2000].
El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto pro-
tector de diferentes cepas del género Bacillus sobre el
desarrollo de la pudrición blanda de la papa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron como material biológico 23 cepas del gé-
nero Bacillus conservadas en agar nutriente (Biocen) y
aisladas de suelos procedentes de regiones paperas de
diferentes municipios de la provincia de La Habana
(Tabla 1). Estas cepas se seleccionaron en considera-
ción a su actividad antagónica in vitro frente a cepas de
Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi y
Pectobacterium atrosepticum (datos no publicados). Se
empleó además la cepa P. carotovorum 2046 conservada
en medio GYCA (glucosa, extracto de levadura, carbo-
nato de calcio, agar).
Cepas Procedencia
G29 Municipio de Güines
G30 Municipio de Güines
Q6 Municipio de Quivicán
Q7 Municipio de Quivicán
Q12 Municipio de Quivicán
Q13 Municipio de Quivicán
Q18 Municipio de Quivicán
S1 Municipio de San José
B1 Municipio de Güines
B2 Municipio de Güines
B4 Municipio de Güines
a un valor de 0,5 en la escala de Mac Farland (1 x 108 ufc/mL)
preparada a partir de cultivos de 24 h de crecimiento en
agar nutriente. Los cultivos se colocaron en zaranda orbital
termostatada durante 24 h a 30oC y 120 rpm.
 Estudio del efecto protector...

El inóculo de P. carotovorum se obtuvo a partir de culti- rante 24 h. Transcurrido este tiempo se determinó la
vos de 24 h de la bacteria fitopatógena en medio GYCA. efectividad de los tratamientos mediante inspección
Con agua destilada estéril se prepararon suspensiones visual y observación de la aparición o no de síntomas
ajustadas a un valor de densidad óptica de 0,05 y 0,1 característicos de la enfermedad.
respectivamente, a una longitud de onda de 580 nm.
Tubérculos-semilla certificados de la variedad Spunta RESULTADOS Y DISCUSIÓN
procedentes de Holanda se desinfectaron superficial-
El control biológico de P. carotovorum mediante espe-
mente con alcohol 70%, luego se sumergieron en
cies de microorganismos antagonistas se ha estudiado
hipoclorito de sodio a 3% durante 3 min, se lavaron
por varios grupos de investigación debido al amplio ran-
con abundante agua destilada estéril y se colocaron en
go hospedero y a la gran importancia económica que
un flujo laminar durante 1 h. Rodajas de papa de 1 cm
poseen los cultivos que esta bacteria puede afectar. Se
de grosor se sumergieron durante 1 min en los cultivos
han utilizado como alternativas el empleo de Erwinia
de Bacillus spp. Las rodajas tratadas se colocaron en el
herbicola [Vanneste et al., 1995], Pseudomonas fluo-
flujo laminar durante 30 min para eliminar la hume-
rescens [Abdel-Alim et al., 2001] y Trichoderma hamatum
dad superficial. Posteriormente se inocularon con 10 µL
[Blom, 2001]; sin embargo, los resultados más
de las suspensiones preparadas de la cepa Pectobacterium
promisorios han sido in vitro e in vivo, con especies del
carotovorum 2046. Cada rodaja se inoculó en tres pun-
género Bacillus productores de sustancias con activi-
tos diferentes, y se emplearon como controles rodajas
dad antibacteriana [Bernal et al., 2002] [Sharga y Lyon,
sin tratar inoculadas con la bacteria fitopatógena y
1998] [Abdel-Alim et al., 2001].
previamente sumergidas en agua destilada estéril y
rodajas tratadas con cultivos de Bacillus spp. sin ino- En el estudio realizado el tratamiento de las rodajas de
cular. Se utilizaron seis rodajas por tratamiento y se papa con las cepas B1, G10, Q7 y Q18 previno total-
colocaron en placas Petri con papel de filtro humedeci- mente el desarrollo de la pudrición blanda en todas las
do con agua destilada estéril y se incubaron a 30oC du- variantes del experimento (Fig. 1).

Figura 1. Efecto protector de la cepa G10 en rodajas de papa inoculadas con la mayor
concentración de la cepa P. carotovorum 2046. A la derecha se muestran los controles de
P. carotovorum 2046 y G10.

En experimentos realizados por otros autores se han de papa y raíces de la planta, con el objetivo de inhibir
producido resultados similares. Tal es el caso de Sharga el desarrollo de la pudrición blanda ocasionada por P. ca-
y Lyon (1998), quienes emplearon una cepa de Bacillus rotovorum y P. atrosepticum. Estos autores solamente
subtilis productora de antibióticos para tratar rodajas emplearon en los tratamientos suspensiones de la cepa

fitosanidad/291
 Reinoso y otros

antagonista preparadas con agua y no los cultivos lí-
quidos como en este trabajo. Es por esto quizás que
solamente hubo resultados positivos, que se traducen
en la disminución de la severidad de las lesiones cuan-
do emplearon una alta concentración de Bacillus
subtilis, mientras que en este estudio se pudo evitar
completamente la aparición de lesiones características
de la pudrición blanda con las cepas antes menciona-
das, lo cual pudiera deberse a la acción antibacteriana
de los metabolitos producidos por estos aislados
bacterianos que son excretados al medio de cultivo.
Las cepas B2, G15 y G25 solamente mostraron efecto
protector en aquellas rodajas inoculadas con la menor
concentración de P. carotovorum (Fig. 2). Esta diferen-
cia respecto a los resultados con las cepas B1, G10, Q7
y Q18 puede estar relacionada con la producción de
metabolitos antibacterianos de menor actividad bioló-
gica inhibitoria, cuya acción se ve limitada por la densi-
dad de bacterias fitopatógenas presentes en el medio al
que son vertidos. También es posible que la producción
de estos compuestos en las cepas antes mencionadas co-
mience en etapas más tardías del crecimiento, por lo que
en el momento de tratar las rodajas sus concentraciones
en el medio de cultivo no son suficientes como para lo-
grar un efecto igual al obtenido con B1, G10, Q7 y Q18.
De hecho se plantea que la producción de sustancias con
actividad antimicrobiana por parte de especies del géne-
ro Bacillus está muy relacionada con la fase estacionaria
del crecimiento microbiano y en particular con la etapa
de esporulación [Schallmey et al., 2004].

Figura 2. Efecto protector de la cepa B2 en rodajas de papa

inoculadas con la menor concentración de la cepa P. carotovorum
2046. A la derecha se muestran los controles de P. carotovorum
2046 y B2.

El resto de las cepas de Bacillus spp. estudiadas no
inhibieron el desarrollo de la pudrición blanda. Algu-
nas como G11, G12 y G14 provocaron cambios de colo-
ración de color beis a pardo oscuro en las rodajas trata-
das, aunque no se observaron síntomas de pudrición
blanda. La cepa B4 produjo modificaciones drásticas
en las rodajas tratadas y el control; se observaron cam-
bios de color de beis a marrón con presencia de fetidez
y una gran maceración del tejido del tubérculo. Con
anterioridad otros autores han aislado algunas espe-
cies del género Bacillus, productoras de enzimas
pectinolíticas y proteolíticas, causantes de la pudrición
blanda en algunos cultivos [US EPA, 1997] [Kararah
et al., 1985].

292/fitosanidad
 Estudio del efecto protector...
CONCLUSIONES
• Las cepas B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo
de la pudrición blanda en las rodajas inoculadas con
ambas concentraciones de P. carotovorum utilizadas.
• Las cepas B2, G15 y G25 solamente tuvieron efecto
protector en las rodajas inoculadas con la menor con-
centración de P. carotovorum.
• La cepa B4 produjo un incremento en la severidad
de los síntomas de la enfermedad.
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Vanneste, J.; J. Perry; L. Perry-Meyer; R. Bedford: «Erwinia herbicola
Eh252 as a Biological Control Agent of Bacterial Soft Rot on Potatoes»,
NZPPS Paper 12:13-16, 1995.
fitosanidad/293
 Normas Editoriales
Fitosanidad tiene como objetivo divulgar
de forma sistemática el quehacer de los
investigadores y especialistas del Insti-
tuto de Investigaciones de Sanidad Ve-
getal, así como de otros centros del país
o extranjeros, vinculados al trabajo de
la sanidad vegetal.
El Comité Editorial de esta publicación,
que se edita trimestralmente, agradece
el envío de colaboraciones y observa-
ciones que ayuden a hacer mejor nues-
tra labor.
Los artículos deben reflejar los resulta-
dos de investigaciones básicas o de apli-
cación práctica, asimismo aquellos que
se encuentren en proceso de extensión
o generalización.
Igualmente resultan de importancia los
trabajos en que se comuniquen nuevos
procedimientos o innovaciones, así
como los que aborden temas novedosos.
• Tipo de artículos
La revista acepta manuscritos origina-
les (inéditos) en cualquiera de las espe-
cialidades directa e indirectamente vin-
culadas a la sanidad vegetal. Estos
pueden ser: artículos científicos, rese-
ñas, comunicaciones cortas, resúmenes
de tesis, informes técnicos. Los artícu-
los científicos no deben exceder de sie-
te cuartillas, las reseñas de quince, las
comunicaciones de dos y los informes
técnicos de cinco.
• Lenguaje
El lenguaje oficial de la revista es espa-
ñol, aunque excepcionalmente se acep-
tarán contribuciones en inglés, francés
y portugués. El estilo de escritura debe
ser totalmente impersonal, con criterio
de exactitud, brevedad y párrafos cor-
tos. Debe utilizarse el sistema métrico
decimal. Los nombres científicos se es-
cribirán completos, incluyendo el autor,
y siguiendo los códigos internacionales
(ejemplo: Leucoptera coffeella Guerin
Meneville). Si es necesario utilizarlos en
varias partes del texto, entonces se es-
cribirán completos la primera vez que
aparezcan y luego se abrevian (ejemplo:
L. coffeella). Se escriben en cursiva o se
subrayan.
• Estructura de los artículos
Los artículos científicos tendrán la es-
tructura siguiente: título, autor(es),
afiliación de los autores, resumen y
palabras claves (español e inglés), intro-
ducción, materiales y métodos, resulta-
dos y discusión, conclusiones (si las
hubiera), agradecimientos (si los hubie-
ra), referencias.
Las reseñas adoptarán la siguiente es-
tructura: título, autor(es), afiliación de
294/fitosanidad
los autores, resumen y palabras claves
(español e inglés), introducción, el con-
tenido se estructura a criterio del au-
tor, agradecimientos (si los hubiera),
referencias.
Las comunicaciones cortas incluirán: tí-
tulo, autor(es), afiliación de los auto-
res, texto de la comunicación, incluyen-
do las referencias principales.
La estructura de los informes técnicos
será: título, autor(es), afiliación de los
autores, resumen y palabras claves (es-
pañol e inglés), introducción, desarro-
llo y referencias.
• Elaboración del texto
El título debe ser claro y conciso, pro-
curando que no sea extenso. Debe te-
ner correspondencia con el contenido.
No se incluirán abreviaturas.
De los autores se escribirán nombres y
dos apellidos. Si el autor tiene un se-
gundo nombre, este se abrevia con la
inicial. La afiliación de los autores se
escribirá con su nombre completo, las
siglas sólo se emplearán entre parénte-
sis, si lo consideran necesario. Debe in-
cluirse la dirección postal, fax y correo
electrónico si los posee.
El resumen no debe exceder de 250 pa-
labras, y debe tener una síntesis de los
métodos y resultados, mencionándose
los nombres científicos completos y
valores cuantitativos de los resultados,
es decir, debe tener el contenido sufi-
ciente de forma comprimida.
Las palabras claves son aquellas que per-
miten identificar el contenido del artí-
culo y que facilitan la identificación en
los índices de materia. Debe incluir las
taxas de los entes biológicos.
La introducción debe tener una breve
referencia de los antecedentes específi-
cos del trabajo, así como una revisión
breve de las referencias más recientes
que se relacionan con el tema que se
presenta. También se incluirá el objeti-
vo del trabajo.
Los materiales y métodos deben ser cla-
ros y concretos, se redactarán según un
orden lógico de los métodos empleados.
De igual forma se escribirán claramente
los procedimientos analíticos y estadísti-
cos utilizados. Se pueden citar los méto-
dos y procedimientos, siempre que ha-
yan sido publicados en revistas científicas.
Los resultados se pueden expresar apo-
yados en tablas y/o figuras, con una dis-
cusión a partir de referencias actuales.
Deben presentarse de manera lógica,
interpretando las conclusiones. Las fi-
guras se deben elaborar solamente en
Word u otro programa compatible.
Las referencias sólo serán de publica-
ciones disponibles en las bibliotecas, y
se presentarán en orden alfabético. Se
colocará el primer apellido del autor
principal y luego las iniciales de los nom-
bres; para los demás autores, primero
la inicial y luego los apellidos, en todos
los casos separados por comas. Cuando
una obra lleve más de tres autores, se
pondrá el apellido y nombre del prime-
ro y a continuación et al. (en cursiva). A
continuación, el título del artículo, el
nombre de la revista, así como volumen,
número, páginas y año. En el caso de
los libros y folletos, después del título,
número de la edición, lugar de la publi-
cación (ciudad), casa editorial y pági-
nas. Los títulos de los artículos y po-
nencias se entrecomillarán, mientras
que los referidos a libros y publicacio-
nes periódicas irán en cursiva, o en su
defecto subrayados. En el texto las refe-
rencias se citan con el apellido del pri-
mer autor y el año entre paréntesis; más
de un autor se anota como et al.
• Envío de manuscritos
Deben entregarse un original mecano-
grafiado, a doble espacio, en papel blan-
co tamaño 28 x 21,5 cm, utilizando una
sola cara, con márgenes de dos centíme-
tros a los lados y tres en la parte supe-
rior e inferior. Cada cuartilla debe ser
enumerada. La letra que ha de utilizarse
debe ser Arial, con puntaje 11. Además,
debe entregar una copia en disquete,
utilizando el procesador de texto Word,
ya que el consejo de redacción no dispo-
ne de capacidades para mecanografiar los
artículos. Se acepta el envío de manus-
critos por correo electrónico, como do-
cumentos adjuntos al mensaje o carta de
presentación, siempre que no posean fi-
guras. Los manuscritos se enviarán a:
Instituto de Investigaciones de Sanidad
Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5a.B y 5a.F,
Playa, Ciudad de La Habana
No se aceptan manuscritos que no es-
tén acompañados de la Declaración del
Autor.
También pueden enviarse por correo
electrónico: lvazquez@inisav.cu
• Revisión de los manuscritos
Los trabajos enviados al Comité Edito-
rial serán sometidos a un proceso de
arbitraje y corrección de estilo. Los au-
tores colaborarán con los árbitros y co-
rrectores a evacuar cualquier duda al
respecto y efectuar, si es preciso, las
modificaciones que se le sugieran. El
Comité Editorial se reserva el derecho
de aprobar o rechazar los trabajos pro-
puestos, lo cual será notificado oportu-
namente a los interesados.
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE TRICHODERMA HARZIANUM
POR FERMENTACIÓN LÍQUIDA
Rosaima García,1 María A. Durán1 y Ramón Riera2
1
Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Mérida, Venezuela, AP 25, teléf. 0251-2630090,
rgcrespo@inia.gov.ve.
2
Servicio Autónomo de Sanidad Agropecuaria. Mérida, Venezuela
RESUMEN
Con el objeto de mejorar la eficiencia en la producción masiva de
Trichoderma harzianum Rifai se evaluó la metodología de producción
por fermentación líquida estática en forma artesanal. Para ello se
utilizó como sustrato melaza de trapiche de caña panelera fresca y
levadura panadera granulada (Saccharomyces cerevisiae). Se usa-
ron frascos de vidrio transparente de 500 mL donde se colocaron 100 mL
de solución de melaza a 5%, se llevó a 200 mL con agua destilada y
se ajustó el pH a 5,5. Se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 15 PSI
por 20 min, se dejaron reposar 24 h y luego se agregó 10 g de levadu-
ra (5%). Se inoculó con 5 mL de suspensiones de conidios de
Trichoderma harzianum (1 x 1010 ufc), se agitaron e incubaron en
forma estática inclinada durante 14 días hasta obtener la producción
completa de conidios. Se encontró desarrollo de diferentes estructu-
ras o biomasa del hongo (micelio, conidios y clamidosporas) a partir
de dos días. La producción de conidios se completó entre 8-14
días, de acuerdo con la cepa T 12 = 1,8 x 109 ufc, T 3 = 5,8 x 10 8 ufc,
IUTE = 5,4 x 108 ufc, Natibiol = 4,2 x 108 ufc, T8 = 5,8 x 108 ufc, Inprodi-
ca = 6,4 x 108 ufc, T2 = 3,0 x 108 ufc, T11 = 2,8 x 108 ufc, T1 = 2,6 x 108 ufc
y Bioagrícola = 5 x 107 ufc. Con este proceso se acelera la obtención
de inóculo del hongo para el proceso de producción, lo que se logra
antes de tres días en relación con la producción normal de conidios
por fermentación sólida usados para resuspender y aplicar como
inóculo, el cual se alcanza entre seis y siete días.
Palabras claves: biomasa, Trichoderma, fermentación líquida
INTRODUCCIÓN
La versatilidad, adaptabilidad y la fácil manipulación
de las especies del hongo Trichoderma permite su uso
efectivo en el control biológico. Trichoderma spp. pro-
duce tres tipos de propágalos como son hifas, cla-
midosporas y conidios, que son activas contra
fitopatógenos en diferentes fases del ciclo de vida, des-
de la germinación de las esporas hasta la esporulación
[Fernández-Larrea, 2002].
De acuerdo con Fernández-Larrea (2002) existen dife-
rentes formulaciones de hongos antagonistas, las cua-
les se usan en dependencia del mecanismo de acción para
ABSTRACT
In order to improve the efficiency of Trichoderma harzianum massive
production a methodology by static liquid fermentation in handmade
form was evaluated. French brown sugar loaf cane molasses and
granulated Bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) were utilized
as substratum. In glass bottles of 500 mL were place 100 mL of 5%
molasses solution, it was added distilled water to 200 mL, and pH was
adjusted to 5.5. These were sterilized in autoclave at 121ºC and 15
PSI for 20 minutes, putting at rest for 24 h and then were added 10 g of
yeast (5%). The inoculation was made with 5 mL of Trichoderma
harzianum conidia suspensions (1 x 1010 ufc), shaked and incubated
in inclined static form during 14 days until getting complete production
of conidia. Develop of different structures or fungus biomass
(mycelium, conidia and clamidosphora) since two days was found.
Conidia production finished between 8 and 14 days, in accordance
with strain T 12 = 1.8 x 10 9 ufc, T 3 = 5.8 x 10 8 ufc, IUTE = 5.4 x 108 ufc,
Natibiol = 4.2 x 108 ufc, T8 = 5.8 x 108 ufc, Inprodica = 6.4 x 108ufc, T2 =
3.0 x 108 ufc, T11 = 2.8 x 108 ufc, T1 = 2.6 x 108 ufc and Bioagrícola = 5 x 107
ufc. With this process is speeded up the obtaining of fungus inoculums
for the production process, and it is obtained before three days with
regard to normal conidia production by solid fermentation used to
resuspend and apply as inoculums, which is reached between six
and seven days.
Key words: biomass, Trichoderma, liquid fermentation
uso comercial; pero el material seco es el preferido, de-
bido a que uno de los aspectos más importante en la
comercialización es el peso y la manipulación de los pro-
ductos. Las hifas son poco resistentes al secado, por lo
que se trabaja en las formulaciones de las formas
reproductoras (conidios y clamidosporas) como polvos
humedecibles, polvos secos, formulaciones en aceite y
encapsulados que contienen el hongo.
Los conidios son más resistentes que las clamidosporas
y se producen en mayor cantidad por diferentes vías:
sobre soporte sólido y en cultivos líquidos estáticos y
fitosanidad/295
 García y otros
agitados, aunque más débil debido a que la pared celu-
lar es más delgada, de tal manera que son menos resis-
tentes a las condiciones adversas del ambiente, como
los rayos ultravioletas del sol y a la tecnología de apli-
cación, ya que se puede romper más rápidamente y
dañarse antes de realizar su efecto de biocontrol.
Sin embargo, la producción de Trichoderma líquido re-
presenta una alternativa para cuando la demanda es alta,
ya que de esta manera se acelera el proceso de produc-
ción masiva y se obtiene el producto en un tiempo más
corto, con mayor cantidad y variedad de propágalos, lo
cual indiscutiblemente aumenta su eficiencia.
Por otro lado, una de las formas de acelerar el proceso de
producción es el uso de métodos combinados, es decir, a
través de fermentación bifásica, en que se utiliza un pro-
ceso de fermentación líquida para la obtención de un buen
inóculo que luego se inocula sobre sustratos sólidos.
Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) demues-
tran que en el proceso de fermentación líquida de T. har-
zianum se obtienen sustancias promotoras de crecimien-
to (ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas y
vitaminas), las cuales son una clase de péptido. Cuan-
do aplicaron T. harzianum sobre la rizósfera de plan-
tas inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno se
logró un aumento del tamaño de los nódulos radiculares
y se produjo un incremento en la eficiencia de la fija-
ción de nitrógeno.
El método más comúnmente utilizado en Venezuela
para la producción masiva del hongo Trichoderma es
por fermentación sólida monobásica, con el uso de
sustrato alimenticio sólido tanto para la producción de
inóculo como para la obtención final del biopreparado.
En otros casos se obtienen formulaciones líquidas por
resuspensión de los conidios proveniente de una fermen-
tación sólida [Zambrano, 2005].
El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la meto-
dología de producción líquida estática en forma
artesanal mediante el uso de melaza de caña panelera,
obtenida en la zona (estado de Mérida), más levadura
panadera como sustrato alimenticio líquido para la ob-
tención del inóculo del hongo T. harzianum, a fin de
mejorar la eficiencia en tiempo y producción de biomasa
dentro del proceso de producción masiva.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron 10 cepas de T. harzianum pertenecientes a
la Colección de Hongos Antagonistas del Laboratorio
296/fitosanidad
de Fitopatología del Instituto Nacional de Investiga-
ciones Agrícolas del estado de Mérida (INIA-Mérida).
Para iniciar el trabajo se hizo una reactivación de las
cepas; se sembró por duplicado en el medio de cultivo
agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 27oC de
tres a cinco días. Las cepas de T. harzianum utilizadas
fueron siete no comerciales (T1, T2, T3, T8, T11, T12,
IUTE) y tres comerciales (Natibiol, Inprodica y
Bioagrícola). La producción del inóculo del hongo en
forma líquida se realizó a partir de una solución de 100 mL
de melaza a 5%, que se aforó a 2000 mL con agua des-
tilada, y se ajustó a pH 5,5. La solución se dispensó en
frascos de vidrio de 500 mL, en una cantidad de 200 mL
por frasco y se esterilizó en autoclave a 121ºC y 15 PSI
por 20 min, se dejaron reposar 24 h y entonces se le
añadió 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en
forma aséptica bajo la cámara de flujo laminar.
La producción del hongo en forma líquida se llevó a cabo
a partir de una solución de 100 mL de melaza de trapi-
che de caña panelera fresca a 5% que se diluyó a 2000 mL
de agua destilada y se ajustó el pH a 5,5. La solución se
dispensó en frascos de vidrio de 500 mL, a razón de 200
mL por frasco, se esterilizó en autoclave a 121oC, 15 PSI
por 20 min y se dejaron reposar 24 h; luego se le añadió
5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en forma
aséptica bajo la cámara de flujo laminar.
A las placas de Petri con los cultivos de Trichoderma se
les agregaron 10 mL de agua destilada estéril, se agitó
un poco, se tomaron 5 mL de suspensiones de conidios
de cada cepa (1 x 1010 ufc) y se inoculó en cada frasco
que contenía la solución de melaza más levadura.
Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparon
con algodón y papel aluminio, y sellaron con parafilm
para proporcionarles condiciones asépticas. Se some-
tieron a agitación y se incubaron en forma estática in-
clinada durante 14 días hasta obtener la producción
completa de conidios. Cada tratamiento se repitió diez
veces. Las observaciones se hicieron todos los días para
detectar tipo de estructuras producidas y luego medir
las cantidades.
La determinación de la concentración de conidios por
mililitros se realizó en cámara de Newbauer por medio
del microscopio óptico y un objetivo de 40X, en una di-
lución de 102, y se calculó por la fórmula [Lecuona, 1996]:
Concentración (ufc.mL = Número de conidios x 4 x 106 x dilución)
Se realizaron observaciones directas al microscopio óp-
tico de muestras tomadas a las 24 h de incubación de
 Producción de biomasa de Trichoderma...

las siembras realizadas en placas con PDA para des-
cartar las posibles contaminaciones. Los datos sobre
concentración de conidios se analizaron a través del
programa Estadística 6.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Tabla 1 se observan los resultados sobre produc-
ción de biomasa de Trichoderma bajo fermentación lí-
quida. Se encontró que todas las cepas lograron produ-
cir biomasa del hongo a partir de dos días. La producción
de conidios se alcanzó entre 8-14 días. Hubo alta pro-
ducción de micelios y clamidosporas, y además se en-
contró una alta concentración de conidios que varió
desde 5,7 x 107 en la cepa comercial Bioagrícola hasta
1,81 x 109 ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significa-
tivas entre las cepas en cuanto a producción de conidios.
También se observaron diferencias en forma cualitati-
vas en cuanto a la producción de micelios y clami-
dosporas.
De acuerdo con la prueba de medias de LDS a 5%, to-
das las cepas tuvieron diferentes comportamientos en
cuanto a producción de conidios. La que presentó mejor
producción fue T12, seguida de la comercial Inprodica,
T8 y IUTE. Se encontraron también diferencias signi-
ficativas en el tiempo necesario para la obtención final
de conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la produc-
ción en solo ocho días, que fue la más rápida, seguidas
de T8, T2 y T3 que lo lograron en diez. Las demás nece-
sitaron entre 12 y 14 días.
Lo anterior indica que existe una alta variación en cuan-
to a la obtención final de estructuras reproductivas de
Trichoderma cuando se usa medio líquido, y que ello
está estrechamente relacionado con el comportamiento
de la cepa a pesar de que todas son T. harzianum.
Trabajos similares se han realizado en Cuba para la
obtención de Trichoderma por fermentación líquida con
el uso de melaza de caña de azúcar y levadura torula, y
se logró producir una concentración de 2-3 x 108 conid./mL
[Fernández-Larrea, 2002; Fernández-Larrea et al., 1992;
Stefanova et al., 1999].
Asimismo Prakash y Lumsden (2006), con el objeto de
obtener un preinóculo líquido de especies de Tricho-
derma utilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto de leva-
dura en 100 mL de agua, y lograron una producción de
103-108 ufc. En tanto, en el proceso de producción de
biomasa, cuando utilizaron 2,5 g de extracto de leva-
dura y 500 mL de melaza en 1 L de agua, lograron una
producción de 106 a 107 clamidosporas/mL.

Tabla 1. Producción de biomasa y conidios de diferentes cepas de T. harzianum

bajo fermentación líquida
Producción Tiempo Producción de Tiempo Producción Tiempo
Cepas
de micelios (días) clamidosporas (días) de conidios (días)
T12 +++ 2 ++ 7 1,81 x 109 a 8
Cepa comercial
+ 2 + 8 6,4 x 108 b 12
Inprodica
T3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10
T8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10
IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 108 d 8
Cepa comercial
++ 3 + 8 5,0 x 107 e 14
Biogrícola
Cepa comercial
++ 3 ++ 8 4,2 x 108 f 14
Natibiol
T2 +++ 2 + 9 3,0 x 108 g 10
T11 ++ 2 + 9 2,8 x 108
h 14
T1 ++ 2 + 10 2,6 x 10 i
8 14
CV 4,4%
Sx 0,378
Letras distintas son diferentes en la prueba de LSD con probabilidad menor o igual a 5%.

fitosanidad/297
 García y otros
CONCLUSIONES
• La producción de biomasa del hongo T. harzianum a
través del proceso de fermentación líquida es varia-
ble, depende del comportamiento de la cepa, por lo
que se requiere realizar pruebas preliminares antes
de aplicar este método para reproducción de una cepa
en forma masiva.
• La melaza de trapiche panelera fresca y levadura de
cerveza, probada por primera vez en Venezuela como
suplementos nutricionales de T. harzianum para la ob-
tención de biomasa por fermentación líquida, resultó
exitosa. Se desarrollaron estructuras reproductivas del
hongo: micelio, clamidosporas y conidios. Se requiere
validar el método a mayor escala.
• Debido a la alta cantidad de estructuras reproduc-
tivas obtenidas por este método de fermentación lí-
quida, se puede recomendar su utilización en la fase
de preparación de inóculo dentro del proceso de pro-
ducción para agilizarlo, así como para la producción
final de propágalos a utilizar en campo para el
biocontrol de enfermedades de plantas.
298/fitosanidad
REFERENCIAS
Fernández–Larrea, O.; A. Calderón; M. Fraga: «Metodología de re-
producción de cepas de Trichoderma spp. para el biocontrol de
hongos fitopatógenos». Informe Técnico de Investigación, INISAV,
1992.
Fernández–Larrea, O.: «Control biológico de enfermedades de plan-
tas», Control Biológico de Plagas Agrícolas, Managua, Serie Técni-
ca CATIE no. 53, 2002, pp. 160-184.
Lecuona, R.: Microorganismos patógenos empleados en el control
microbiano de insectos plaga, Talleres Gráficos Mariano MAS, Bue-
nos Aires, 1996.
Prakash Hebbar, K.; D. R. D. Lumsden: «Formulation and Fermentation
of Biocontrol Agents of Cacao Fungal Pathogens: Example of
Trichoderrma Species», http://www.cabi-commodities.org/Acc/
ACCrc/PDFFiles/W-BPD/Ch7.pdf. Revisado en marzo del 2006.
Stefanova, M.; A. Leiva; L. Larrinaga; M. F. Coronado: «Actividad
metabólica de cepas de Trichoderma spp. para el control de hongos
fitopatógenos del suelo», Rev. Fac. Agron. (Luz) 16:509-516, 1999,
Wei Lin, Liang Zhi-Huai; Zhang, Zhi-Guang; Luo, He-Rong: «Effects of
Peptide in the Fermentation Liquid of Trichoderma harzianum on
Nodule Microstructure and Function of Cowpea», Acta Laser Biology
Sinica 1-1, 2006.
Zambrano, C.: «Historia y experiencias del control biológico en Vene-
zuela». Memorias del Curso-Taller Control Biológico: Herramienta
Básica en Una Agricultura Sostenible, Trujillo, 29 y 30 de septiembre
del 2005.
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
CARACTERIZACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUM
A TRAVÉS DEL ESTUDIO DE SU DIVERSIDAD GENÉTICA
Reseña
Yelaine Tejeda Gómez
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ytejeda@inisav.cu
RESUMEN
La bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es causante de la
marchitez bacteriana en diversos cultivos de importancia económica
en regiones de clima tropical y subtropical, así como en diversos
países de clima templado. La especie constituye una unidad
taxonómicamente compleja en la que las cepas muestran una amplia
diversidad a nivel fisiológico, serológico, genético y de rango de
hospedantes. El análisis por RFLP proporciona un nuevo esquema
de clasificación al dividir la especie en los grupos Asiaticum y
Americanum, en relación con el origen geográfico de las cepas. A
partir de estos análisis preliminares se ha incrementado el empleo y
desarrollo de las técnicas moleculares para el estudio de la diversi-
dad genética dentro de esta especie bacteriana. En el presente tra-
bajo se destacan los principales aportes que, con el empleo de téc-
nicas moleculares, han realizado varios grupos de investigación a la
comprensión de las relaciones filogenéticas y evolutivas entre las
cepas.
Palabras claves: Ralstonia solanacearum, bacteria, diversidad
genética
INTRODUCCIÓN
La bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es
causante de la marchitez bacteriana en diversos culti-
vos en regiones de clima tropical y subtropical
[Kelman, 1953], así como en algunos países de clima
templado [Hayward, 1991; Janse, 1996]. La enferme-
dad afecta a varios cientos de especies vegetales dis-
tribuidas en más de cincuenta familias [Hayward,
1994]. Dentro de ellas se encuentran cultivos de im-
portancia económica como papa (Solanum tuberosum,
Sw.), tabaco (Nicotiana tabacum, Lin.), tomate
(Licopersicum esculentum, Mill.), pimiento (Capsicum
annuum, L.), plátano y banano (Musa sp.), berenje-
na (Solanum melongena, L.), además de numerosas
plantas ornamentales, medicinales, malezas y algu-
nas especies silvestres [Kelman, 1953].
ABSTRACT
Ralstonia solanacearum causes bacterial wilt in many important crops
in tropical and subtropical regions, and some mild climate countries.
The species is taxonomically complex and the strains show a high
diversity at different levels as physiological, serological, genetic, and
host range. RFLP analysis has provided a new classification system
in which the species is divided in Americanum and Asiaticum groups,
related to the geographic origin of the strains. Since these preliminary
investigations were performed, the development of molecular
techniques in the study of Ralstonia solanacearum genetic diversity
has increased. In this paper, the most outstanding contributions of
various researches groups in this field are outlined. These
investigations have improved the comprehension of phylogenetic and
evolutionary relationships among Ralstonia solanacearum strains.
Key words: Ralstonia solanacearum, bacteria, genetic diversity
Ralstonia solanacearum es una especie heterogénea que
se encuentra poco relacionada filogenéticamente con
otros grupos del género Pseudomonas. Las únicas espe-
cies que muestran relación con ella son P. picketii –pató-
geno ocasional en humanos– y P. syzygii, causante del
marchitamiento del clavo de olor en Sumatra [Seal et
al., 1993; Taghavi et al., 1996]. Las evidencias sugieren
que R. solanacearum es una especie que surgió tempra-
no en la historia geológica, posiblemente como un pa-
tógeno de los ancestros de las plantas modernas
[Sequeira, 1994]. Buddenhagen y Kelman (1964) con-
cluyeron que las cepas de R. solanacearum son el pro-
ducto de un largo proceso evolutivo que se ha produci-
do de manera independiente en varias áreas geográficas
y en diferentes hospederos. Esta hipótesis se ha confir-
fitosanidad/299
 Tejeda Gómez
mado por estudios del material genético [Cook et al.,
1989].
La especie R.solanacearum constituye una unidad
taxonómicamente compleja en la que las cepas mues-
tran una amplia diversidad a diferentes niveles: fisioló-
gico, serológico, genético y de rango de hospedantes. El
gran número de cepas de R. solanacearum existente en
todo el mundo dificulta el establecimiento de criterios
para la diferenciación de cepas, aspecto esencial para el
trabajo de los taxónomos y del personal de cuarentena.
Con el objetivo de describir esta variabilidad intra-
específica se han propuesto diversos sistemas de clasi-
ficación.
Se conocen cinco razas de R. solanacearum cuya separa-
ción está basada en el rango de los hospedantes y la
habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones
ambientales [Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983;
Buddenhagen, 1985; Pegg y Moffett, 1971]. La utiliza-
ción de tres disacáridos y/u oxidación de tres hexosa
alcoholes ha permitido la separación de los aislamien-
tos en seis biovares [Hayward, 1964; He et al., 1983;
Hayward et al., 1990]. El sistema de clasificación en
razas y biovares es confuso, pues cada biovar contiene
cepas con diferentes rangos de hospedantes, y varias
razas contienen una amplia diversidad de cepas perte-
necientes a diferentes biovares. Solo existe correspon-
dencia entre la raza 3 y el biovar 2. El análisis de ácidos
grasos [Janse, 1991] y del perfil de proteínas [Dianese
et al., 1994] no ha logrado esclarecer las relaciones en-
tre las cepas ni el establecimiento de un criterio de cla-
sificación uniforme. Esto hace que los métodos tradi-
cionales de clasificación no sean lo suficientemente
efectivos [Poussier et al., 1999; Sequeira, 1994].
Estas dificultades condujeron a la búsqueda de un nue-
vo sistema de clasificación basado en el análisis del ma-
terial genético. Muchas de las técnicas moleculares em-
pleadas en la actualidad tienen como fundamento común
la separación de fragmentos de ADN de diferentes pesos
moleculares. El resultado electroforético se representa
por un patrón de bandas en un gel. Estos patrones sue-
len ser muy complejos y de difícil interpretación.
Entre las técnicas utilizadas para el estudio de R. sola-
nacearum se encuentran el polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)) en sus dos variantes: Southern
blotting-RFLP y PCR-RFLP, el ADN polimórfico
aleatoriamente amplificado (Random Amplified
Polymorphic DNA or Arbitrary Primed PCR, RAPD),
300/fitosanidad
el Rep-PCR, el polimorfismo de longitud de fragmen-
tos amplificados (Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)) y la secuenciación de regiones
específicas del genoma. El empleo de cada una de ellas
ha contribuido a una caracterización y diferenciación
más acertadas de las cepas. El análisis a nivel genético
de las cepas ofrece la posibilidad de estudiar las rela-
ciones filogenéticas y evolutivas entre ellas.
Contribución de los estudios de diversidad genética
a la diferenciación intraespecífica de las cepas
de Ralstonia solanacearum
Los primeros trabajos que constituyeron un hito en el
estudio de la diversidad genética del patógeno fueron
reportados por Cook et al. (1989) y Cook y Sequeira
(1994). Estos investigadores utilizaron el Southern
blotting-RFLP con nueve sondas, lo que les permitió
detectar y localizar secuencias específicas en el ADN,
las cuales contenían información esencial para la viru-
lencia y la respuesta de hipersensibilidad. Estas secuen-
cias se sometieron a digestión con enzimas de restric-
ción específicas. La ubicación de los sitios de corte para
una enzima de restricción determinada dentro de un
locus de interés puede variar de una cepa a otra, y traer
como resultado fragmentos que difieren en tamaño en
cepas diferentes [Olive y Bean, 1999]. El análisis de los
patrones electroforéticos obtenidos por este procedi-
miento posibilitó establecer la existencia de dos grupos
o divisiones con un coeficiente de similitud de 13,5%:
la división I, que incluyó los biovares 3, 4 y 5, y la divi-
sión II, formada por las cepas de biovares 1, 2 y N2.
Dentro de cada división los coeficientes de similitud
resultaron ser muy elevados, y fueron mayores den-
tro de la división I. Más del 90% de las cepas de la
división I procedían de Asia y Australia (división
Asiaticum), mientras que 98% de las cepas de la divi-
sión II eran originarias de las Américas (división
Americanum).
Estas divisiones se han confirmado por análisis de la
secuencia del gen que codifica para el ARN ribosomal
16 S [Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Taghavi et al.,
1996]. El análisis de esta secuencia permitió estudiar
las relaciones filogenéticas y evolutivas entre los
microorganismos, dado su elevado contenido infor-
macional, su naturaleza conservativa, su distribución
universal y la accesibilidad de las secuencias en bancos
de genes [Woese, 1987]. Las secuencias de los genes que
codifican para el ARNr 16S son por lo general específi-
cas para cada especie y están presentes en múltiples
 Caracterización de Ralstonia...
copias en el genoma, lo que las hace excelentes para la
identificación de bacterias a nivel de especie. Taghavi et
al. (1996) demostraron la existencia de dos subdivisiones
dentro de la división Americanum: la 2b, que contiene
aislamientos pertenecientes a los biovares 1, 2 y N2
procedentes de Indonesia, y la 2a que incluye el resto
de las cepas de biovares 1, 2 y N2. En este trabajo se
reportó una cepa biovar 2 atípica, similar a las cepas de
biovares 3 y 4 estudiadas, por lo que se agrupó dentro
de la subdivisión Asiaticum.
Fegan et al. (1998) realizaron el análisis de la secuencia
de la región intergénica 16S-23S RNA. Dada la elevada
similitud de secuencia de los genes que codifican para
ARNr 16S en las cepas de R. solanacearum, resulta más
factible el análisis de la región espaciadora entre 16S y
23S, que produce información filogenética más valiosa
al ser mayor su grado de variabilidad entre diferentes
cepas [Barry et al., 1991; Leblond-Bourget et al., 1996].
En este trabajo se analizaron además las secuencias de
los genes que codifican para las enzimas poli-
galacturonasa y endoglucanasa. En todos los casos se
confirmó el sistema de clasificación obtenido por
Taghavi et al. (1996).
El análisis PCR-RFLP de diferentes regiones del
genoma bacteriano demostró también la existencia de
las divisiones Asiaticum y Americanum [Gilling et al.,
1993]. Poussier et al. (1999), por medio del PCR-RFLP,
analizaron regiones del gen hrp relacionado con la res-
puesta de hipersensibilidad, y tuvieron resultados ma-
yormente consistentes con lo reportado por Cook et al.
(1989); sin embargo, encontraron que las cepas biovar 1
del sur de África quedaban agrupadas en una subdivi-
sión diferente, la cual poseía mayor homología con las
cepas de la división Asiaticum que con las de la divi-
sión Americanum. Para esclarecer las relaciones entre
las cepas biovar 1 del sur de África y otras cepas de R. sola-
nacearum ampliaron el estudio con la inclusión de 59
cepas, dentro de las que se encontraban las de biovares
N2 y 5, así como nuevas cepas africanas.
Como resultado de estas nuevas investigaciones,
Poussier et al. (2000) reportaron por primera vez el
empleo de la técnica AFLP para el análisis de una co-
lección de cepas internacionales dentro de un estudio
de diversidad genética. Este método pertenece a la ca-
tegoría de las técnicas de amplificación selectiva de frag-
mentos de restricción, basadas en la ligazón de
adaptadores a fragmentos de restricción genómicos se-
guido de una amplificación por PCR con cebadores es-
pecíficos para los adaptadores [Olive y Bean, 1999]. El
AFLP permitió una fina discriminación entre los ais-
lamientos y logró diferenciar cepas que resultaron
indistinguibles por PCR-RFLP. De las 96 cepas anali-
zadas por AFLP se obtuvieron 60 patrones diferentes,
y se observó el 95% de polimorfismo en las bandas,
mientras que en el análisis por PCR-RFLP, de 178 ce-
pas se obtuvieron 20 patrones diferentes. Incluso al
compararse con lo obtenido por Cook et al. (1989, 1991)
y Cook y Sequeira (1994), donde se produjeron 46 perfi-
les diferentes a partir de 164 cepas analizadas, se
demuestra que el AFLP tiene un nivel de resolu-
ción superior para la diferenciación intraespecífica
de R.solanacearum. El AFLP posibilitó una separa-
ción más definida entre cepas de biovar 2 y N2, y tam-
bién entre cepas de biovares 3, 4 y 5. El AFLP y el
PCR-RFLP confirmaron que el biovar 2 es el menos
diverso genéticamente entre todos los biovares [Cook et
al., 1989; Cook y Sequeira, 1994; Smith et al., 1995; Van
Der Wolf et al., 1998; Thammakijjawat, 2001].
Pese a que los estudios llevados a cabo por Poussier et
al. (2000) confirmaron la clasificación ofrecida por Cook
et al. (1989), se encontraron excepciones en este esque-
ma. Los resultados confirmaron la presencia de una
subdivisión formada por cepas biovar 1 del sur de Áfri-
ca. Aunque el análisis por PCR-RFLP mostró una
mayor homología entre estas cepas y las cepas biovar 1
de la división Asiaticum, el análisis por AFLP y la
secuenciación de genes para ARNr 16S arrojaron un
resultado opuesto. Las cepas biovar 1 del sur de África
fueron por lo tanto incluidas en una nueva subdivisión
–2c– con respecto a lo reportado por Taghavi et al.
(1996). La explicación más probable a la diferencia exis-
tente entre las cepas biovar 1 africanas y americanas es
un desarrollo evolutivo diferenciado debido a la sepa-
ración geográfica. Otros aislamientos africanos que
pertenecen a la división Americanum pueden haber sido
introducidas al continente africano por medio de inter-
cambios comerciales.
No obstante la gran cantidad de investigaciones que
apoyaron y enriquecieron los estudios preliminares de
Cook y colaboradores, el análisis de nuevos aislamien-
tos aportó resultados que demuestran el elevado grado
de complejidad taxonómica de esta especie bacteriana.
En 1998 Tsuchiya y Horita reportaron el análisis de 64
cepas japonesas por medio de diferentes técnicas
moleculares: el Southern blotting-RFLP con cuatro
sondas específicas para DNAr 23S y 16S (también co-
fitosanidad/301
 Tejeda Gómez
nocido como ribotyping), el PCR-RFLP y el Rep-PCR.
Las cepas analizadas correspondían a raza 1 (biovares
1, 2, 3 y 4) y raza 3 (biovar 2). Según el esquema de
clasificación de Cook et al. (1989), las cepas raza 1 de-
bían pertenecer a la división Asiaticum y las cepas raza 3
a la división Americanum. Como resultado del empleo
de las técnicas mencionadas anteriormente se logró
obtener una clara diferenciación entre las cepas de raza
1 y raza 3. Con Southern blotting-RFLP el coeficiente
de similitud entre raza 1 y 3 fue de 15,4%, y dentro de
la raza 1 de 75,5%. Los patrones electroforéticos obte-
nidos a partir de cepas raza 1 (biovares 1, 2, 3 y 4)
fueron similares a los patrones de los biovares 3, 4 y 5
de la división Asiaticum. Los patrones de las cepas raza
3/biovar 2 fueron similares a los de las cepas biovar 1 de
la división Americanum, lo que apoya la hipótesis plan-
teada por Buddenhagen (1985), quien sugirió que la raza
3 se originó en la región andina de Sudamérica, de don-
de es originaria la papa, su principal hospedante, y que
la aparición de raza 3 fuera de esta región es resultado
del comercio internacional. La distribución de las ce-
pas japonesas raza 1 (biovares 1 y 2) no se corresponde
con lo reportado por Cook et al. (1989). Las nueve ce-
pas japonesas raza 1/biovar 2 resultaron ser homogé-
neas a la cepa atípica perteneciente a la división
Asiaticum reportada por Taghavi et al. (1996). Con res-
pecto a las cepas raza 1/biovar 1, fueron semejantes a
las cepas japonesas raza 1/biovar 4, y no a los biovares
1 americanos. Estas cepas pueden ser mutantes de raza
1/biovar 4 que perdieron la capacidad de degradar las
tres hexosas alcoholes.
Thammakijjawat et al. (2001) realizaron el análisis
PCR-RFLP de cepas tailandesas y otras internaciona-
les tuvieron con Cook et al. (1989) resultados consis-
tentes. Las excepciones fueron dos cepas biovar 1
atípicas y tres cepas biovar N2 de Japón, que se agru-
paron dentro de la división Asiaticum. Excepciones de
este tipo fueron reportadas por Horita y Tsuchiya
(2001).
Aunque actualmente existe una mejor comprensión de
la diversidad intraespecífica de la bacteria R.sola-
nacearum, las investigaciones en este campo continúan
con la búsqueda de nuevas metodologías de mayor sen-
sibilidad. Lee et al. (2001) reportaron el aislamiento de
una secuencia de inserción –IS1405– a partir de una
cepa de raza 1. Este tipo de secuencia constituye un
componente importante de la mayoría de los genomas
bacterianos. Las mutaciones y reordenamientos pro-
vocados por las secuencias de inserción es uno de los
302/fitosanidad
mecanismos más importantes en la generación de di-
versidad genética [Galas et al., 1989]. En algunos casos
la localización de secuencias de inserción específicas en
sitios definidos del cromosoma es lo suficientemente
estable como para permitir su análisis por RFLP
[Mahillon y Chandler, 1998]. La caracterización
molecular de cepas con el uso de secuencias de inserción
puede reflejar mejor la organización del genoma
bacteriano que la búsqueda de diferencias en las se-
cuencias [Lee et al., 2001]. En este trabajo la IS1405 se
empleó como sonda en un análisis por RFLP, lo que
permitió clasificar cepas de raza 1 de Taiwán.
El estudio de la diversidad genética entre las cepas de
R. solanacearum no solo permitió conocer más clara-
mente las relaciones filogenéticas y evolutivas entre
ellas, sino que proporcionaron nuevas herramientas
para el esclarecimiento de numerosas interrogantes
como la posible correlación entre diversidad genética y
la virulencia de las cepas [Darrase et al., 1998].
CONCLUSIONES
• Los métodos de estudio de la diversidad genética de
R. solanacearum se han desarrollado vertiginosamen-
te desde finales del pasado siglo a partir de los estu-
dios preliminares realizados en este campo, los que
lograron suministrar un sistema de clasificación con
el empleo del RFLP que fue de gran utilidad para
estudios posteriores.
• El sistema de clasificación se ha corroborado por los
resultados de otros investigadores, y se ha enrique-
cido en el transcurso de los años con la definición de
nuevas subdivisiones.
• Los métodos moleculares para la caracterización
genética han probado ser imprescindibles, reflejado
en su amplia adopción por diversos grupos de inves-
tigación y los resultados promisorios de su empleo.
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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Comunicación corta

PRIMER REGISTRO DE CECIDÓMIDO ASOCIADO A SÍNTOMAS

DE ROYA EN PLANTAS MEDICINALES EN CUBA

Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600

En los cultivos de plantas medicinales como tilo (Justi-
cia pectoralis Jacq.), caléndula (Calendula officinalis L.)
y verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis (L.)
Vahl.) se asocian numerosos patógenos fúngicos, entre
los cuales están los que ocasionan el síntoma denomi-
nado roya.
En Cuba se informa sobre tilo a Puccinia sp. [Fornet y
Gutiérrez, 1984] y Puccinia justiciae, del cual se des-
criben sus síntomas, así como su importancia en las
condiciones de la Granja Estatal de Plantas Medicina-
les en Alquízar [Veitía et al., 2003]. En caléndula se ha
registrado a Puccinia melampodii Diet. & How. en Cuba
[Acosta, 1995] y en el resto del mundo [Farr et al., 1995].
En verbena cimarrona es de importancia Puccinia
urbaniana P. Henn. por el número de áreas donde se
presenta y los síntomas que provoca en las condiciones
del país [Veitía et al., 2003]. Con anterioridad se regis-
tró en este cultivo por Secades et al. (1989), quienes
describen sus síntomas. Acosta (1995) lo menciona como
un patógeno de importancia porque sus daños intensos
los causa en el follaje y los tallos, que son las partes
utilizadas para fines medicinales.
En colectas realizadas en áreas de producción de plan-
tas medicinales y en patios particulares en los munici-
pios de Alquízar y San Antonio de los Baños, en la
provincia de La Habana, y en la de Cienfuegos, se en-
contró en la mayoría de las ocasiones las larvas de un
cecidómido (Diptera: Cecidomyiidae) cuando se alimen-
taba de las pústulas ocasionadas por especies de
Puccinia (Fig. 1).

Figura 1. Larvas de cecidómido asociado a pústulas de roya (Puccinia urbaniana) en

verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis).

fitosanidad/305
 Veitía y otros

En más del 50% de las observaciones efectuadas para
este trabajo, la alta población de larvas coincidió con la
elevada infestación por roya (Tabla 1). En verbena ci-
marrona se encontraron hasta nueve larvas asociadas a
los síntomas y de una a tres por pústula en tilo.
Según Alayo y Garcés (1989), en Cuba se mencionan las
especies Neolasioptera Felt, Ctenodactylomyia Felt,
Bruggmannia Tavares, Johnsonomyia Felt, Meinertomyia
Felt y Retinodiplosis Keiffer, aunque no se descarta la
presencia de otras especies en el resto de las Antillas.
Nieves-Aldrey (1998) refiere que los cecidómidos com-
prenden especies micófagas y zoófagas. Asimismo
Barranco (2003) menciona especies de cecidómidos que
viven en asociación con ciertos hongos.

Tabla 1. Localidades donde se detectó la presencia de cecidómido asociado a pústulas de roya

Lugar Cultivo Ocurrencia
Roya Cecidómido
Granja Estatal de Plantas Tilo +++ ++
Medicinales Valle Grande, en Caléndula + +
Alquízar
División Experimental del Tilo + –
Instituto de Investigaciones de Verbena cimarrona +++ ++
Sanidad Vegetal
Patio en Guanímar, Alquízar Verbena cimarrona +++ ++
Estación Experimental de Plantas Tilo (en parcelas) ++ +
Medicinales Dr. J. T. Roig, en San Tilo (en vivero a la sombra) +++ ++
Antonio de los Baños
Verbena cimarrona (en vivero a la + –
sombra)
Huerto de plantas medicinales del Verbena cimarrona +++ ++
Instituto Politécnico Agropecuario
O. Jiménez, en Lajas, Cienfuegos
Leyenda para población de cecidómido:
– No se observan larvas.
+ Se observa una larva en una mancha por hoja.
++ Se observa más de una larva en varias manchas por hoja.
Leyenda para infestación por roya:
+ Ligera incidencia de roya en algunas plantas en el campo.
++ Incidencia media: plantas con más del 25% y hasta el 50% del follaje con síntomas.
+++ Incidencia alta de plantas con más del 50% del follaje con síntomas de roya.

REFERENCIAS Fornet, E.; C. Gutiérrez: «Sobre la micoflora de plantas medicinales II»,

Acosta, L.: Proporciónese salud: cultive plantas medicinales,
Ed. Científico-Técnica, La Habana, 1995.
Alayo, P.; G. Garcés: Introducción al estudio del orden Diptera en
Cuba, Ed. Oriente, Santiago de Cuba, 1989.
Barranco, P. V.: «Dípteros de interés agronómico. Agromícidos plaga
de cultivos hortícolas intensivos», Bol. SEA 33: 293-307, 2003. Dis-
ponible en http://entomologia.rediris.es/aracnet/e2/11/21/
Farr, D. F.; G. F. Bills; G. P. Chamuris; A. Y. Rossman: Fungi on Plants and
Plants Products in the United States, APS Press, St. Paul, Minn., EE.UU.,
1995.
revista Plantas Medicinales 4:10-13, Cuba, 1984.
Nieves-Aldrey, J. L. «Insectos que inducen la formación de agallas en
las plantas: una fascinante interacción ecológica y evolutiva», Bole-
tín SEA 23:3-12, 1998.
Secades, M.; C. Gutiérrez; I. de la Osa; M. Martínez: «Hongos patógenos en
plantas medicinales IV», Revista Cubana de Farmacia 23 (1-2):173-177,
enero-agosto, 1989.
Veitía, M. et al.: «Incidencia, comportamiento y control de plagas en los
cultivos de caléndula (Calendula officinalis L.), tilo (Justicia pectoralis)
y verbena (Staquitarpheta jamaicensis). Informe Final de Proyecto,
División Experimental del INISAV, Alquízar, La Habana, enero del 2003.

306/fitosanidad
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
OBSERVACIONES SOBRE ENEMIGOS NATURALES DE LA BROCA
DEL CAFÉ (HYPOTHENEMUS HAMPEI FERRARI) EN CUBA
Luis L. Vázquez Moreno,1 Eleazar Blanco Jiménez,2 Orestes Elósegui Claro,1 Yaril Matienzo Brito1 y
Janet Alfonso Simonetti1
1
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600
2
Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona Km 3½, Capdevila, Boyeros, AP 8029, Ciudad
de La Habana, CP 10800
La broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari)
(Coleoptera: Scolytidae) está considerada como una de
las principales plagas del cultivo del cafeto en el mundo
[Le Pelley, 1968; Baker, 1999] debido a los daños direc-
tos que ocasiona al fruto de esta planta, el nivel tan
elevado de sus poblaciones, las dificultades para reali-
zar un control eficiente y las limitaciones para la
comercialización del café afectado, entre otras [Jaramillo
et al., 2006].
En África, región de origen de H. hampei, se han estu-
diado diversas especies de enemigos naturales, las que
se han utilizado exitosamente en programas de control
biológico clásico en otras regiones del mundo, princi-
palmente los parasitoides Cephalonomia stephanoderis
Betrem (Hymenoptera: Bethylidae), Heterospilus
coffeicola Schenedeken (Hymenoptera: Braconidae),
Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulo-
phidae) y el hongo entomopatógeno Beauveria basiana
(Balsamo) Vuillemin (Hyphomycetes: Moniliales), en-
tre otros [Baker, 1999; Vega et al., 1999].
Con el propósito de conocer la ocurrencia de enemigos
naturales en poblaciones de H. hampei bajo las condi-
ciones de cafetales en Cuba, se realizaron observaciones
en frutos perforados en las localidades de Buey Arriba,
Granma (agosto de 1998), Trinidad, Sancti Spíritus (fe-
brero del 2006) y Bahía Honda, Pinar del Río (2005, 2006).
Como entomopatógeno solamente se observó a B. bassia-
na (Fig. 1) que se había detectado anteriormente como
causante de una epizootia en Buey Arriba, Granma
[Mario García, comunicación personal]. Posteriormen-
te esta patología se ha manifestado en todos los muni-
cipios cafetaleros del país, entre uno y tres años des-
pués de la detección de H. hampei en esos territorios.
En observaciones realizadas en campos de cafeto donde
se manifestaba esta epizootia en Bahía Honda, en Pinar
del Río, se pudo comprobar que los campos donde exis-
tía sombra de árboles de mayor porte y mixta (Theobroma
cacao, Citrus spp., Mangifera indica, Musa spp. y otros),
la enfermedad se manifestaba más intensa y prolonga-
da, en comparación con los campos donde la sombra era
de menor porte y de una especie (Gliricidia sepium).
La epizootia por este hongo entomopatógeno se ha ob-
servado igualmente en otros países cafetaleros como
México [Barrera et al., 1990] y Colombia [Bustillo et
al., 1998; 2002], entre otros, donde se refiere que su
manifestación es de forma variada en los diferentes años,
la que depende de las condiciones climáticas. Se consi-
dera que varios años después de su introducción en
Colombia, es el principal factor de mortalidad natural
de H. hampei.
Como predadores, los más comunes han sido las hor-
migas Pheidole megacephala (F.), Wasmania auropunctata
Roger, Solenopsis geminata (F.) y Pseudomyrmex sp.
(Hymenoptera: Formicidae), insectos que se introdu-
cen en las perforaciones en la etapa en que predominan
los estados inmaduros de la broca, los que devora, y en
muchos casos realizan sus nidos en el interior del fruto,
donde además come sus partes, que están necrosadas o
donde crecen hongos saprófitos.
Otros predadores que se han encontrado en muy bajas
poblaciones han sido Laemophloeus sp. (Coleoptera:
Laemophloeidae) y Cathartus sp. (Coleoptera: Cucuji-
dae), cuyas larvas devoran los huevos y las larvas del
primer estadio de H. hampei, principalmente las que
habitan en frutos donde existen altas poblaciones de la
plaga y en etapas finales del período de fructificación.
fitosanidad/307
 Vázquez y otros
Figura 1. Corte de un fruto de café donde se aprecia la
hembra adulta de H. hampei infectada con B. bassiana.
También se realizó un hallazgo de una chinchita
predadora de la familia Anthocoridae (Hemiptera), la
que al parecer picaba y chupaba la hemolinfa de las
larvas de H. hampei, pues estas se observaron defor-
mes y muertas en el interior de las perforaciones.
Estos son los primeros informes de tales enemigos na-
turales de H. hampei bajo las condiciones de Cuba, y
sobre los cuales existen algunos antecedentes en otros
países, pues Vega et al. (1999) refirió hallazgos de varias
especies de estas familias en Togo y Costa de Ivore en
África, pero sin atribuirle importancia en la regulación
de las poblaciones de esta plaga en esa región.
Igualmente en Colombia, Bustillo et al. (2002) encon-
traron hormigas de los géneros Solenopsis, Pheidole,
Wasmannia, Paratrechina, Crematogaster, Brachymyrmex
y Prenolepis, así como el cucújido Cathartus quadricollis
(Guérin-Méneville) y un antocórido no identificado,
asociados a perforaciones de H. hampei, los que obser-
varon con actividad como predadores de inmaduros.
En la búsqueda de la posible existencia de parasitoides,
en 1998 se hallaron cuatro especies de las familias
Bethylidae y Encyrtidae (Hymenoptera) que emer-
gieron de frutos donde había adultos e inmaduros de
H. hampei en plantaciones de Buey Arriba, Granma.
Aunque estos parasitoides no se lograron identificar,
pueden ser nuevas especies de enemigos naturales de
308/fitosanidad
otras especies de Hypothenemus, que habitan en los
ecosistemas donde se cultiva cafeto en el país.
De la familia Encyrtidae se ha descubierto a Coccidoc-
tonus sp. en Togo y un Anagyrini en Costa de Ivore, mien-
tras que de la familia Bethylidae hay informes en África
de parasitoides de los géneros Prorops, Cephalonomia y
Goniozus, los dos primeros utilizados en programas de
control biológico clásico [Vega et al., 1999].
REFERENCIAS
Baker, P. S.: «La broca del café en Colombia». Informe Final del Proyec-
to MIP para el café DFID-CENICAFE-CABI BIOSCIENCE (CNTR 93/
1536A), Chinchiná, Colombia, 1999.
Barrera, J. F.; D. Moore; Y. J. Abraham; S. T. Murphy; C. Prior: «Biological
Control of the Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei, in Mexico
and Possibilities for Further Action», Brighton Crop Protection Conf.
Pests and Diseases, 1990, pp. 391-396.
Bustillo, A. E.; R. Cárdenas; D. Villalba; P. Benavides; J. Orozco; F. J.
Posada: «Manejo integrado de la broca del café, Hypothenemus
hampei (Ferrari) en Colombia», Chinchiná, Cenicafé, 1998.
Bustillo, A.; R. Cárdenas; F. J. Posada: «Natural Enemies and Competitors
of Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in Co-
lombia», Neotropical Entomology 31(4):635-639, Oct./Dec." 2002.
Jaramillo, J.; C. Borgemeister; P. Baker: «Coffee Berry Borer
Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae): Searching for
Sustainable Control Strategies», Bulletin of Entomological Research.
96 (3):223-233, 2006.
Le Pelley, R. H.: Pests of Coffee, Longmans, Londres, 1968.
Vega, F. E.; G. Mercadier; A. Damon; A. Kirt: «Natural Enemies of the
Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:
Scolytidae) in Togo and Cote d Ivoire and Other Insects Associated
with Coffee Beans», African Entomology 7 (2):243-248, 1999.
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Resumen de tesis

DIAGNÓSTICO Y SANEAMIENTO DEL VIRUS DASHEEN

MOSAIC EN MALANGA (XANTHOSOMA SPP. Y COLOCASIA
ESCULENTA (L.) SCHOTT)

Janet Igarza Castro

Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnológicos
del CITMA. Carretera a Mayabe, Jardín Botánico, Holguín, Cuba
Tesis presentada en opción al grado académico de Máster en Biotecnología Vegetal.

El cultivo de la malanga es de gran importancia económi-
ca en nuestro país. La propagación acelerada por vías
biotecnológicas de clones de interés comercial es uno de
los principales retos en la agricultura, pero este cultivo se
ha visto afectado por la enfermedad viral conocida como
Dasheen Mosaic Virus (DMV), lo que disminuye los ren-
dimientos. Para la obtención de plantas libres del virus se
aplican técnicas de saneamiento y se confirman con otras
de diagnóstico, por lo que en esta investigación se compa-
ran distintas técnicas para la eliminación de virus como
son la extracción de meristemos, la termoterapia, la
electroterapia y la quimioterapia en los clones México 8 y
Camerún 14, para conocer su efectividad en la obtención
de plantas libres al DMV, y se confirman con la utiliza-
ción de diagnósticos de alta sensibilidad.
Los resultados permitieron confirmar la efectividad
de la electroterapia 5 y 10 vol/5 min y la quimiotera-
pia 3 mg/L. El diagnóstico inmunoquímico utilizado,
con grandes ventajas sobre otros tipos de análisis, tie-
ne un límite de sensibilidad que puede permitir el esca-
pe de material enfermo; pero con la introducción de
técnicas moleculares se pueden detectar concentracio-
nes virales ínfimas en vitroplantas sanas. En la pre-
sente investigación se realiza la detección del DMV por
RT-PCR, la cual servirá de base para la aplicación fu-
tura de una técnica confirmativa de mayor sensibili-
dad durante el saneamiento. Finalmente se propone una
metodología de diagnóstico y saneamiento al DMV que
permite la introducción de líneas puras en biofábricas
para su propagación en campo.

fitosanidad/309
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

COMPORTAMIENTO Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD TIZÓN

DE FUEGO CAUSADA POR EL HONGO CORYNESPORA
CASSIICOLA (BERK. & CURT.) WEI. EN EL CULTIVO DEL PEPINO
(CUCUMIS SATIVUS L.) EN SISTEMAS DE ORGANOPÓNICOS
EN LA PROVINCIA DE CAMAGÜEY Y SU RELACIÓN
CON OTROS PATÓGENOS FÚNGICOS PRESENTES EN EL CULTIVO

Carlos A. Ferrer González

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación
Norte, Reparto Puerto Príncipe, Camagüey, Cuba, sanivecm@enet.cu
Tesis en opción al grado académico de Máster en Hortalizas.

La necesidad de implementar un sistema de manejo de
la enfermedad tizón de fuego del pepino, causado por el
hongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. den-
tro de una agricultura sostenible, implica la búsqueda
del conocimiento de aspectos relacionados con la inci-
dencia, comportamiento y control que permitan trazar
estrategias en la solución de esta problemática. Se rea-
lizaron investigaciones para determinar la importancia
de C. cassiicola en comparación con otros patógenos
fúngicos presentes en el cultivo, su comportamiento y
control en los organopónicos de la Empresa de Cultivos
Varios de Camagüey y en el Laboratorio Provincial de
Sanidad Vegetal durante el período 2001 a 2003. Se de-
terminó que los hongos causantes de afectaciones en
este cultivo son Pseudoperonospora cubensis (Berk. &
Curt.) Rostow con 10%, Collectotrichum lagenarium
(Pass.) Ell & Halst y Alternaria cucumerina (Ell. & Ev.)
S. A. Elliott con 1% cada uno, y C. cassIicola como el
de mayor importancia con 100% de incidencia y afec-
taciones de 85%. Su comportamiento se caracterizó por
la permanencia durante todo el ciclo del cultivo con un
incremento a medida que avanza la edad fenológica de
la plantación, aspecto estrechamente relacionado con los
cambios climáticos dentro de los cuales el efecto de la tem-
peratura máxima entre 28 y 30oC, y la humedad relativa
media superior a 80% resultaron favorables para el desa-
rrollo de esta enfermedad. El crecimiento micelial y la
esporulación del hongo en condiciones in vitro coinciden
con temperaturas de 30oC. La mayor circulación y distri-
bución de los conidios en condiciones naturales se observa
a las diez de la mañana. Los ensayos de sensibilidad de
C. cassiicola ante diferentes productos fungicidas en con-
diciones de laboratorio y campo arrojaron mejores resul-
tados de inhibición del crecimiento de las colonias y del
control de la enfermedad con mancozeb PH 80% y
benomyl PH 80% a 5 ppm y 2 kg/ha i. a. El control bioló-
gico con Trichoderma harzianum R. (cepa A-34) a dosis de
10 kg/ha y del producto natural hidrato de cal a dosis de
5 kg/ha en tratamientos foliares, alcanzaron eficacias de
42 y 47% respectivamente, e incrementaron los rendimien-
tos en 50%. Todos estos resultados fueron utilizados en la
elaboración de estrategias de control de la enfermedad con
vistas a su inclusión en un esquema de manejo integrado
para el control de C. cassiicola en el cultivo del pepino.

310/fitosanidad