UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE BIOANÁLISIS
DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO PROFESIONAL
ASIGNATURA: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

PRESENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A METICILINA EN

MUESTRAS AMBIENTALES DE UN CENTRO HOSPITALARIO VALENCIA,
ESTADO CARABOBO 2018 – 2019

Autores:
Hernández, Ixaelys
Nuñez, Luis
Tutor(es):
Padrón, Gladiel
Gaerste, Yosainix
Asesora:
Nicita, Graciela

Valencia, Agosto 2019.

 CAPÍTULO I Commented [yg1]: Rose Luis…en amarillo mis correcciones

EL PROBLEMA

Planteamiento del Problema

Los antibióticos y las vacunas representan el mayor de los éxitos de la medicina para
el control de las enfermedades bacterianas, sin embargo, la emergencia de la resistencia
antibiótica (RAB) en grupos bacterianos de importancia médica (humana y veterinaria) ha
generado una situación de inquietud entre los organismos internacionales como la
Organización Mundial de la Salud (OMS), la Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura (FAO) y Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), por
las repercusiones a nivel nacional y global. Al respecto, desde el 2003 hasta la fecha, estas
organizaciones se han pronunciado mediante un plan de acción mundial sobre la resistencia
a los antimicrobianos (1,2).

Entre las consecuencias asociadas a la resistencia antibiótica, se citan casos en que no Commented [yg2]: Es cierto lo que escriben, pero lo que me
causa un poco de ruido es la manera en la que esta redactada….la
es posible tratar adecuadamente a los pacientes infectados con ninguno de los antibióticos siento como muy coloquial…..hya que ver la opinión de gladiel

disponibles. Esta resistencia podría ralentizar y dificultar el tratamiento, pudiendo causar

complicaciones o incluso la muerte. Por otra parte, es posible que el paciente necesite
cuidados adicionales o antibióticos alternativos más costosos, que podrían tener efectos
secundarios más graves, o bien requiera tratamientos más invasivos, como inyecciones
intravenosas, que deben administrarse en hospitales (3).

La RAB, es un fenómeno natural, sin embargo, su emergencia ha estado asociada a

la actividad humana. Entre las causas asociada a la RAB se puede mencionar el uso excesivo
y mal uso de estos medicamentos, debido a la prescripción inadecuada de antibióticos,
tratamientos inconclusos y automedicación a los que se suman también la deficiente
aplicación de las normas de control de las infecciones nosocomiales, la falta de higiene y
saneamiento intrahospitalario por parte de los humanos (ref 4 Rather). Por otro lado, en el
sector pecuario, la utilización de antibióticos en la cría de ganado vacuno, piscicultura como
promotores de crecimiento y medida profiláctica (ref 5 Schwarz S).

2
 Adicionalmente existe una ralentización en el desarrollo de nuevos medicamentos
antibacterianos por parte de la industria farmacéutica, debido a la misma naturaleza de la
resistencia antibacteriana y el alto costo de inversión para la investigación y poca
recuperación del capital invertido, ya que las enfermedades bacterianas generalmente son
agudas, en comparación con otras patologías como lo son la hipertensión y diabetes, cuyo
carácter crónico garantiza la recuperación del capital invertido (ref moncayo).

Actualmente, los antibióticos están siendo considerados contaminantes emergentes y

por esta razón, investigaciones realizadas en este campo, han categorizado algunos entornos
particulares como "puntos calientes", tales como la industria farmacéutica y el ambiente
hospitalario, siendo una de las vías principales de los antibióticos en el medio ambiente, la
eliminación deficiente de los productos no utilizados y la excreción humana. Además, se
debe incluir la inadecuada eliminación de antibióticos caducados a través de sanitarios,
contenedores de basura doméstica y áreas en las que se utilizan productos farmacéuticos para
la acuicultura, la agricultura, la avicultura y plantas de tratamiento de aguas residuales. Según
las propiedades físico-químicas de los fármacos, sus metabolitos, productos de degradación
y las características de los suelos, estas sustancias pueden llegar a alcanzar las aguas
subterráneas y contaminar los acuíferos o bien quedar retenidas en el suelo y acumularse
pudiendo afectar al ecosistema y a los humanos a través de la cadena trófica (7 Larson, 8 Gil).

En cuanto al ambiente hospitalario, las infecciones nosocomiales se encuentran entre

las principales causas de defunción y de aumento de la morbilidad en pacientes
hospitalizados, y estas son causadas a menudo por microorganismos resistentes a los
antibióticos. En el ambiente hospitalario, se necesitan medidas de control específicas, debido
a la presencia de numerosos vehículos potencialmente infecciosos tales como los dispositivos
médicos, los alimentos, las superficies, los sanitarios, otros pacientes, los sistemas de
ventilación, los instrumentos que contactan con piel y mucosas del paciente y las soluciones
estériles que le son administradas por inoculación, entre otros.
La contención de resistencia en el ambiente hospitalario está estrechamente
relacionada con la limpieza y saneamiento del entorno hospitalario, desinfección de los
equipos y el cumplimiento por parte del personal de salud de protocolos de antisepsia,
3
limpieza y utilización de guantes, uso de indumentaria dentro de los espacios
correspondientes, entre otros (9, 10).
En términos de RAB, el ambiente hospitalario proporciona un entorno adecuado para
la presión selectiva de bacterias resistentes, siendo las más frecuentemente asociadas a
infecciones intrahospitalarias Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) e
incluso los estafilococos coagulasa negativos con resistencia a meticilina (ECNRM),
enterococos con resistencia a vancomicina, Acinetobacter, Pseudomonas y varias
enterobacterias como Klebsiella pneumoniae y E. coli productoras de β-lactamasa de Commented [yg3]: Es as habira que meterle información de la
importancia del monitoreo amniestal de la resistencia para el la
espectro expandido (BLEE). Aqui debe ir una referencia relacionada seria la ref 11que bvana aplicación de medidas de contencio y control…..gladiel destacate

buscar
Actualmente, la resistencia antibiótica es comprendida como un problema global, que
afecta al humano, animales y al ecosistema en el que se encuentra (enfoque “One health” de
la OMS), el ambiente fue por mucho tiempo considerado el principal vector de bacterias
resistentes (11). La OMS publicó un listado de 12 patógenos prioritarios para la investigación Commented [yg4]: Esta referencia no dice nada del ambiente
como vector de bacterias resistentes….asi que sugiero que
y desarrollo de nuevos antibióticos, debido a las escasas opciones de tratamientos mofifiquen esto….y además este párrafo no tiene nada que ver o no
hay un enlace que me vincule con la siguiente oración donde
disponibles, en la que Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) está incluido exponen a los organisos de la lista
Si en el parafo anterior hablan del ambiente hospitslario….hagan un
enlace con los patógenos de la lista
en la lista de prioridad elevada, además de otras bacterias como
Gladiel que te parece este párrafo y mi comentario…agregue el
Acinetobacter, Pseudomonas y varias enterobacterias como Klebsiella pneumoniae, E. párrafo que empieza En términos de RAB, el ambiente hsopitalario
..
coli, Serratia y Proteus (10).

El género Staphylococcus agrupa unas 47 especies, considerados microorganismos

oportunistas, de los cuales se destacan como patógenos humanos asociados a infección
intrahospitalaria S. aureus en el grupo de los estafilococos coagulasa positivos (ECP) y S.
epidermidis, S. lugdunensis, S. saprophyticus S hominis y S. haemolyticus en la categoría de
estafilococos coagulasa negativas (ECN). En pacientes hospitalizados, puede causar
problemas graves, como bacteriemia asociada a catéteres, neumonía relacionada a
ventilación mecánica y frecuentemente infecciones en el sitio quirúrgico (ref Becker 2014)
(Kuehnert ).

Las bacterias de este género son resistentes a la desecación y pH y algunos estudios

han descrito que S. aureus y SARM puede permanecer viable por semanas en el ambiente
hospitalario y que hay mayor riesgo de infección cuando se ocupa un espacio previamente
4
ocupado por pacientes con infección por SARM, de allí que, como medida de prevención,
algunos centros de salud indican evaluación del estado de portación y organizan los pacientes
con infecciones por SARM en salas de otras áreas (ref chaibenjawong) busque una referencia
que hable del riesgo de contaminación de un paciente con SARM después que otro lo
ocupo…yo lo lei…pero no recuerdo el autor y se los van a preguntar
Hay evidencia de que SARM recuperado de superficies y artículos confinados al
ambiente hospitalario representa un mayor riesgo de infecciones nosocomial

(referencia French). El muestreo del medio ambiente y de las superficies solo se

han indicado como parte del programa de investigación en casos de brotes, sin embargo, es
menos frecuente en situaciones endémicas y menos como estrategia de vigilancia y
prevención de infecciones nosocomiales. Identificar los posibles sitios ambientales con
contaminación por SARM podría contribuir en varias medidas higiénicas, por lo tanto,
reducir la prevalencia de infecciones por SARM.
Con la rápida propagación y la amplia distribución de la resistencia a los antibióticos,
la identificación ambiental del SARM y de otras bacterias resistentes de interés médico-
sanitario es esencial, la implementación de medidas de control para la expansión del SARM.
En el presente trabajo se busca determinar la presencia de S. aureus resistente a meticilina en
muestras ambientales de un centro hospitalario de la ciudad de Valencia.

5
 OBJETIVOS
Objetivo General

Determinar la prevalencia de Staphylococcus aureus con resistencia a meticilina de

muestras ambientales de un centro hospitalario.

Objetivos Específicos

1. Detectar Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM) en áreas de

quirófano, unidad de tratamientos intensivos neonatales (UTIN) y unidad de cuidados
intensivos (UCI) de un centro hospitalario.

2. Determinar la resistencia por el método de difusión del disco a la familia de

macrólidos y lincosamidas (ML).

3. Determinar la prevalencia de los fenotipos de resistencia a la familia de macrólidos y

lincosamidas (resistencia constitutiva e inducible). Commented [yg5]: Gladiel, chicos que opinan de este
objetivo…queda a tu criterio gladiel

4. Establecer la prevalencia de SARM de las áreas de un centro hospitalario.

6
 Justificación

En la actualidad, la resistencia a los antibióticos, es considerada un problema de salud

global y a largo plazo, se estima que podría haber hasta 700.000 muertes por año, y se
evidencia que el medio ambiente es la fuente y el reservorio de resistencia más grande (14).
En algunos países como los de la Unión Europea, el control de SARM en el ambiente
Commented [yg6]: Chicos yo creo que en la justificación no se
colocan referencias…aquí es redactar cual es la finalidad del
trabajo……por fa gladiel lee esta justificación….la cambie toda….a
ver que te parece…

hospitalario incluye la vigilancia activa de la colonización de los pacientes y del personal de

salud y la aplicación de terapias de descolonización. Además, otra medida de control de
SARM incluye la evaluación de la efectividad de los procedimientos de limpieza de áreas
críticas del hospital, lo que finalmente contribuye a la reducción de los índices de
colonización y contaminación con SARM y por tanto de las infecciones intrahospitalarias
asociadas con esta bacteria.

A nivel mundial, los métodos fenotípicos y génicos aplicados a la epidemiología de

las infecciones asociadas a SARM ha expuesto cambios sobre la prevalencia de las dos
categorías epidemiológicas de SARM [SARM asociado a infecciones nosocomiales (SARM-
AH) y de la comunidad (SARM-AC)] y se ha desvanecido la sectorización que se evidenció
en la década de los años 80 entre comunidad y ambiente hospitalario.

Latinoamérica es una de las áreas geográficas con elevados niveles de SARM.

Venezuela además de otros países de la región, carecen de datos sobre la prevalencia de
infecciones por SARM, así como también información en otras matrices (animales de
producción y “puntos ambientales calientes”) actualmente consideradas de interés en el
marco de la resistencia antibiótica y del programa de “Una sola salud” propuesta por la OMS,
FAO y OIE.; a pesar de contar con programas de vigilancia tales como el Programa
Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana a los Antimicrobianos.

En este sentido, es conveniente realizar estudios de identificación de SARM y perfil

de resistencia a los principales antibióticos a nivel fenotípico en el ambiente hospitalario para
contribuir con estos centros de salud en la aplicación de medidas de contención, ya que
presenta un factor de riesgo para la diseminación del microorganismo en el ámbito
hospitalario, colonización de nuevos pacientes e inclusive el desarrollo de cuadros clínicos

7
infecciosos en pacientes intervenidos en áreas críticas del centro de salud como lo son la
unidad de cuidados intensivos tanto de adultos como neonatales y quirófanos.

Hasta aquí llegue

8
 CAPITULO II

MARCO TEÓRICO

Antecedentes

Las infecciones nosocomiales pueden afectar a pacientes en cualquier tipo de entorno

en el que reciban atención sanitaria, ocurriendo en las 48-72 horas después del ingreso del
paciente o pueden aparecer después que el paciente reciba el alta y suceden con más
frecuencia en pacientes que se encuentran en terapia intensiva, pabellones quirúrgicos,
centros ortopédicos y en unidades de neonatología, asimismo las infecciones ocupacionales
contraídas por el personal de salud entre ellos, médicos, enfermeras y asistentes de guardia
están particularmente más predispuestos a la colonización de múltiples gérmenes, como el
evento adverso más frecuente durante la prestación de atención sanitaria, siendo el S. aureus
el microorganismo de interés en esta investigación por su fácil diseminación (18).

Por tal motivo diversos investigadores han estudiado a S. aureus como agente
etiológico de infecciones nosocomiales, así pues, Genet y col. (2012) realizaron una
investigación del grado de contaminación bacteriana y patrón de susceptibilidad a los
antibióticos de aislamientos de superficies de limpieza en quirófanos y salas de cirugía en el
Hospital Especializado de la Universidad Jimma, en el suroeste de Etiopía, tomando en
cuenta que el papel del entorno hospitalario como reservorio de patógenos potenciales ha
recibido una atención cada vez mayor y la contaminación de una amplia variedad de sitios
ambientales, que conducen a la propagación nosocomial, es por ello que determinaron
mediante 144 muestras de superficies de piso y de mesa para la identificación de especies
bacterianas siguiendo procedimientos estándar y se realizaron pruebas de sensibilidad
antimicrobiana utilizando una técnica de difusión por disco. S. aureus fue la bacteria
frecuentemente aislada, con un 33,3%, además, S. aureus mostró un 100% de resistencia a la
meticilina, debido a este aumento de la contaminación bacteriana del hospital, los
investigadores sugirieron que se deben tomar medidas adecuadas de control de la infección
para mantener el nivel de contaminación dentro de la norma propuesta, y que es una fuente
de infección importante (19).

9
 Posteriormente, B. Sapkota y col. (2016), investigaron la carga microbiológica en el
aire, en varias unidades de un hospital de atención terciaria en Nepal. Por lo tanto, los
procedimientos de control del ambiente hospitalario son medidas efectivas para reducir las
infecciones nosocomiales. Fue un estudio descriptivo de corte transversal que se llevó a cabo
en varias salas entre enero y septiembre de 2015, para explorar la carga microbiológica en
objetos inanimados. Cada semana se seleccionó una unidad para el estudio. La cama, el grifo,
toda la habitación, el carro, la computadora, el teléfono, los mangos de las rejillas, la mesa,
la silla, la puerta, el estetoscopio, la máscara de oxígeno, la bata, los mangos de los armarios
y los lavamanos. Se seleccionaron para las pruebas de cultivo de aire. En donde el S. aureus,
Micrococcus, estafilococos coagulasa negativos (CONS), Bacillus, Pseudomonas
aeruginosa, levadura y Acinetobacter fueron los organismos más comúnmente detectados.
En la sala postoperatoria, el S. aureus fue el microorganismo detectado con mayor frecuencia.
Al igual en la unidad de rayos X, se detectó S. aureus en tres de cuatro salas (20).

Así mismo, Loyola y col. (2018) Estudiaron a bacterias resistentes a múltiples

fármacos aisladas de teléfonos celulares en cinco unidades de cuidados intensivos, con
análisis exploratorio de dispersión, el cual son susceptibles a la contaminación bacteriana.
Para llevar a cabo el cumplimiento del objetivo, se caracterizaron los aislamientos
bacterianos y exploraron su dispersión en las cinco UCI a lo largo del tiempo, realizando un
análisis secundario de bacterias gramnegativas no fermentadoras y cocos grampositivos
aislados de un estudio observacional de cohorte de 5 meses desarrollado entre teléfonos
celulares de trabajadores de la salud en cinco UCI, tomando hisopados cada 15 días; la
resistencia antimicrobiana fue determinada mediante el método de concentración mínima
inhibitoria, además de construir fenotipos de resistencia para agrupar los aislamientos según
las especies. El resultado principal de esta investigación fue que, a partir de 491 muestras
telefónicas, Un total de 30 para S. aureus y la resistencia a múltiples fármacos fue del 46,7%
para S. aureus. La resistencia a la meticilina en S. aureus y a la vancomicina en Enterococcus
spp. fue de 26.7% y 42.3%, respectivamente. Todos los aislamientos de S. aureus se
agruparon en ocho fenotipos. Curiosamente, observamos aislamientos de S. aureus con el
mismo fenotipo en fechas de muestreo consecutivas y separadas en el mismo teléfono celular,
así mismo se obtuvo que los teléfonos celulares están contaminados con bacterias altamente

10
dañinas y potencialmente pueden mantenerse por períodos prolongados de tiempo, además
de considerarse como una fuente potencial de infecciones nosocomiales en las UCI (21).

Por otra parte, Afle FCD y col. (2019), indagaron sobre infecciones asociadas a la
atención médica en la caracterización bacteriológica de las superficies hospitalarias en el
Hospital Universitario de Abomey-Calavi/so-ava en el sur de Benín (África occidental), en
dicho estudio se basó en identificar las especies bacterianas de las superficies de los
hospitales para prevenir eficazmente las infecciones asociadas a la asistencia sanitaria,
debido a que la diseminación de patógenos depende de los "reservorios", las diferentes vías
de transmisión de los agentes infecciosos y los factores que los favorecen. Se tomaron 160
muestras de superficie, 65% fueron positivas para bacterias. La frecuencia de aislamiento fue
predominante en la pediatría (87,5%). Las muestras positivas fueron 64,2% de bacterias
grampositivas y de predominó a Staphylococcus aureus (27,3%). La proporción de otros
microorganismos fue despreciable. para S. aureus y Staphylococcus spp. estando presentes
en todas las unidades asistenciales. Así mismo se culminó que las bacterias que se encuentran
en las superficies del entorno de atención de dicho hospital, sugieren un riesgo de infecciones
asociadas con la atención médica (22).

Bases Teóricas

Generalidades del género Staphylococcus

Los estafilococos son cocos grampositivos de 0,5-1 mm de diámetro, inmóviles,

aerobios y anaerobios facultativos, no esporulantes, con actividad catalasa y coagulasa, que
generalmente se dispone en racimos irregulares semejantes a los de uvas (23, 24).

Clasificación

La principal especie, S. aureus, es un estafilococo patogénico responsable de la

mayoría de las infecciones de este grupo, es habitante natural de piel y las membranas
mucosas, alrededor del 30% de las personas es portador del S. aureus en un momento dado
de su vida, generalmente en fosas nasales, pero este porcentaje puede aumentar
considerablemente entre el personal de la salud y los pacientes hospitalizados. Y las especies
S. epidermidis y S. saprophyticus, son estafilococos oportunistas. S. epidermidis asociada

11
generalmente a infecciones por implantación de dispositivos y S. saprophyiticus causante de
infecciones del tracto urinario en mujeres jóvenes y uretritis en varones (23, 24, 25).

Estafilococos coagulasa positivos

La coagulasa es una enzima presente en la bacteria, siendo un factor de patogenicidad

hacia el huésped; la coagulasa libre actúa cubriendo a la célula de fibrina y por tanto
haciéndola más resistente a la opsonización y fagocitosis (24). Entre las especies que
conforman los estafilococos coagulasa positivos tenemos el S. aureus asociado a humanos,
y asociados a animales se encuentran S. intermedius, S. hyicus y otros (25).

Se estudia la presencia de la enzima, mediante una prueba con el objetivo de separar

S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genéricamente se
las denomina estafilococos coagulasa negativos (ScoN), por ejemplo, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus (23, 24).

El S. aureus posee dos tipos de coagulasa: Una endocoagulasa o coagulasa ligada o

“clumping factor”, que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el
fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una
suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina). Y una exocoagulasa o coagulasa
libre que actúa mediante la activación de un factor sérico (CRF), formándose un complejo
coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina
(test en tubo) (24).

Factores de virulencia

Debido a los siguientes factores de virulencia, el S. aureus es capaz de producir más

de 30 exoproteínas extracelulares: enzimas y citotoxinas entre las que se encuentran
hemolisinas, nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasas y colagenasa. La principal función
de estas proteínas sería la de convertir los tejidos locales del hospedador en nutrientes para
el crecimiento de la bacteria. Además, otras exoproteínas, como las enterotoxinas, las toxinas
exfoliativas y la leucocidina, ejercen efectos potentes sobre células del sistema inmune y
cuya principal función parece ser la de inhibir las respuestas inmunitarias del hospedador
frente a S. aureus (23).

12
 Estos factores se han clasificado en tres categorías (Tabla 1):

1. Los involucrados en la adherencia a la célula huésped o matriz extracelular, como

las proteínas de unión a fibrinógeno, fibronectina, colágeno y coagulasa.

2. Aquellos que están involucrados en la evasión de las defensas del huésped, como
las enterotoxinas estafilocócicas; la TSST-1, la leucocidina de Panton-Valentine (PVL),
proteína A, lipasas y polisacáridos capsulares.

3. Los involucrados en la invasión de la célula huésped y penetración de los tejidos,

como la toxina a, hemolisinas b, g y d.

Tabla 1. Factores de virulencia (23, 24, 28).

Estructurales Enzimas Toxinas

Peptidoglucano Catalasa Toxina α (Hemolisina α)
Proteína A Hialuronidasa Hemolisina β
Factores de adhesión Lipasas Hemolisina γ
Ácidos teicoicos Coagulasa Hemolisina δ
Polisacáridos capsulares Nucleasas Leucocidina de Pantone-Valentine
(PVL)
Proteasas Enterotoxinas estafilocócicas (SE)
Estafilocinasa Toxina 1 del síndrome del shock tóxico
(TSST-1)
Colagenasa Toxinas exfoliativas (ETA y ETB)

Identificación en el laboratorio

En los medios de cultivo tradicionales la mayoría de las especies crecen después de

incubarse durante 18-24 horas, formando colonias de 0.5-1.5 mm de diámetro. Las colonias
de S. aureus se observan lisas, elevadas, brillantes y de bordes enteros, presentan consistencia
cremosa y pigmentación que va del amarillo a dorado debido a la producción de carotenoides,
la mayoría de las cepas producen β-hemólisis o hemólisis total alrededor de las colonias
cuando se cultivan en agar sangre (26, 27).
13
 S. aureus se diferencia de las demás especies por producir coagulasa, es resistente al
calor, a la desecación y puede crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7.5%). S.
aureus crece bien en medios de cultivos no selectivos, como el agar sangre, agar chocolate,
cerebro corazón infusión agar (BHI, por sus siglas en inglés) y medios líquidos para
hemocultivo donde se recupera fácilmente. Se debe usar un medio selectivo en muestras
clínicas donde hay bacterias Gram negativas junto con S. aureus (26, 27).

El medio recomendable y usado por la mayoría de los laboratorios es el agar manitol

salado o medio de Chapman por su elevado contenido de sal que inhibe el crecimiento de la
mayoría de las bacterias Gram negativas. Este medio permite realizar la identificación
presuntiva de S. aureus por la pigmentación amarilla característica de S. aureus. Debido a
que esta bacteria fermenta el manitol se genera un cambio de color en el medio que vira de
rojo pálido a amarillo. Los Staphylococcus coagulasa negativos no fermentan el manitol y
crecen en el medio formando colonias pequeñas de color que varía de blanco a rosado (26, 27).

Enfermedades causadas por S. aureus

La consecuencia del encuentro entre la bacteria y el huésped, cuando es

desbalanceado a favor de la primera, es la enfermedad infecciosa.

La infección se puede presentar como:

 Infecciones superficiales (cutáneas, mucosas, subcutáneas).

 Infecciones profundas, que representan la progresión natural de la infección a
partir de los superficiales.
 Focos metastásicos, ya en el torrente sanguíneo los estafilococos pueden
establecerse en cualquier órgano profundo.
 Endocarditis aguda, la infección más grave, con alta mortalidad.
 Osteomielitis, infección a nivel de los huesos largos.
 Neumonía, pueden producirse por 3 mecanismos: vía aérea, metastásica y por
aspiración de contenido bucal (alcohólicos, epilépticos).

Las toxiinfecciones e intoxicaciones se presentan de tres maneras:

 Shock tóxico, causado por la toxina del shock tóxico o enterotoxina F.

14
  Síndrome de piel escaldada (Enfermedad de Ritter), causado por la toxina exfoliatina.
 Intoxicación alimentaria estafilocócica, es la más frecuente intoxicación alimentaria
(27, 28).

Tratamiento terapéutico (antibióticos) y su resistencia para el tratamiento de

infecciones por estafilococos en humanos.

Los antibióticos actúan sobre los microorganismos por inhibición de la síntesis de la

pared celular y activación de enzimas que destruyen esa pared, aumento de la permeabilidad
de la membrana celular, interferencia con la síntesis de proteínas y alteración del
metabolismo de los ácidos nucleicos. Aunque la etiología se puede deducir con frecuencia
por los síntomas, los cultivos y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos son esenciales
para la selección correcta de un fármaco destinado al tratamiento de infecciones graves. Los
microorganismos pueden desarrollar resistencia a cualquier fármaco, con rapidez o después
de ciclos largos o repetidos de tratamiento. La resistencia se evita mediante el control rápido
de las infecciones. Las dosis inapropiadas favorecen el desarrollo de resistencia; más
adelante, incluso dosis de mayor magnitud pueden no conseguir el control de la infección (27).

S. aureus puede poseer resistencia para diferentes antimicrobianos. En general, los

estafilococos aislados de infecciones comunitarias, hasta hace poco tiempo, no poseían
muchos genes de resistencia salvo por la producción de penicilinasa. Sin embargo,
actualmente asistimos a la emergencia de cepas comunitarias resistentes a meticilina u
oxacilina. En cuanto a los aislamientos de origen nosocomial, un elevado porcentaje de los
mismos tienen varios determinantes de resistencia y fundamentalmente resistencia a
meticilina, asociada a resistencia a aminoglucósidos, macrólidos y quinolonas (27).

Resistencia a Penicilinas: ß-lactamasa estafilocócica

Si bien al comienzo de la era antibiótica los estafilococos eran 100% sensibles a la

Penicilina, rápidamente desarrollaron resistencia. Esta se debe a la producción de ß-
lactamasas (penicilinasas) que desdoblan el anillo ß-lactámico, inactivando el antibiótico por
transformación en ácido penicilinoico. El gen que codifica esta actividad se encuentra en
plásmidos, los cuales pueden trasmitirse de una cepa a otra por transducción. De ahí la amplia
y rápida difusión de esta resistencia. Actualmente, más del 90% de las cepas son resistentes
15
a la Penicilina, a la Ampicilina y a la Amoxicilina. Existen variados mecanismos que median
resistencia a β-lactámicos. La producción de β-lactamasa inactiva ciertos β-lactámicos por
medio de la hidrólisis del anillo β-lactámico. Estas enzimas atacan a la penicilina G,
ampicilinas, carboxipenicilinas y ureidopenicilinas. El producto de hidrólisis carece de
actividad antibacteriana. Más del 90% de los aislamientos de S. aureus produce este tipo de
enzimas, también llamadas penicilinasas. Parte de la enzima que se produce es excretada al
medio externo y parte permanece adherida a la membrana celular. Se han reconocido cuatro
variantes de β-lactamasa llamadas A, B, C y D. En la mayoría de los aislamientos esta enzima
es codificada por plásmidos, pero también se puede encontrar a nivel cromosómico como
parte de un elemento transponible (27, 28).

Por otro lado, se tiene la resistencia a meticilina u oxacilina. Ésta consiste en la

producción de una nueva proteína fijadora de penicilina (penicillin-binding protein) PBP,
llamada PBP2a o PBP2’, no presente en las cepas sensibles. Esta nueva PBP tiene una
afinidad disminuida por la mayoría de los β-lactámicos y cefalosporinas. Se trata de una
transpeptidasa, la cual se encarga de la síntesis de la pared cuando las otras PBPs están
inactivas por estar ligadas a la β-lactámico. Esta nueva PBP está codificada por un gen
llamado mecA que está presente en el cromosoma de todas las cepas de SARM (26, 27, 28).

Presumiblemente, la región mec se originó en estafilococos coagulasa negativos y

luego se transfirió a S. aureus. Cuando una cepa es resistente a meticilina significa que la
cepa es resistente a todos los antibióticos β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas y
carbapenems) (28).

Penicilinas semisintéticas, resistentes a ß-lactamasas

La Meticilina fue el primer compuesto de esta serie. Le siguieron la Oxacilina y la

Cloxacilina, y actualmente el más empleado es la Dicloxacilina. Este fármaco es de elección
en infecciones profundas. A nivel hospitalario algunas cepas han desarrollado resistencia,
pero en la población esto es muy inusual (27, 28).

16
 Cefalosporinas

Son ß-lactámicos que no son afectados por las ß-lactamasas estafilocócicas, que son
penicilinasas. Las cefalosporinas de 1ª generación (Cefradina, Cefazolina) y de 2ª generación
(Cefuroxime) tienen buena actividad antiestafilocócica, no así las de 3a generación. Son
ampliamente usadas, sin embargo, en procesos graves es preferible una Penicilina
semisintética (27, 28).

Aminoglucósidos

Son sensibles y suelen emplearse junto con una Cefalosporina, en tratamiento de

casos profundos. Se insiste en que es mejor una Penicilina semisintética. La combinación
Cefalosporina aminoglucósido es un recurso muy usado como esquema empírico cuando se
desconoce la etiología del proceso (27, 28, 29).

Lincosamidas

Inhibiendo la replicación temprana de la cadena peptídica a través de la inhibición

de la reacción de la transpeptidasa. La clindamicina es un derivado semisintético de la
lincomicina que difiere estructuralmente por la sustitución de un átomo de cloro por un grupo
hidroxilo y la inversión del carbono en la posición 7. Tienen una acción similar a los
macrólidos (27, 28, 29).

Macrólidos: eritromicina y otros

En general no están indicados, salvo en procesos superficiales en caso de alergia a ß-

lactámicos. Un 10% de las cepas presentan resistencia, y es de esperar que este porcentaje
aumente al extenderse el uso de los nuevos macrólidos. En S. aureus la resistencia a la
eritromicina tiene dos fenotipos. El primero es conferido por una modificación del rRNA
blanco por enzimas constitutivas o inducibles que metilan un residuo específico en el rRNA.
Este evento resulta en una disminución de la unión a la eritromicina, a otros macrólidos y a
las lincosaminas. Los genes que codifican esta resistencia se encuentran tanto en plásmidos
como en el cromosoma. El segundo fenotipo abarca una resistencia inducible a macrólidos.
Se trata de un gen localizado en un plásmido que codifica una bomba de flujo ATP-
dependiente (27, 28, 29).

17
 Otros

Vancomicina: Está indicado en los casos de infección grave con alergia a ß-

lactámicos (27).

ß-lactámicos + inhibidores de ß-lactamasas: Ampicilina o Amoxicilina con

Sulbactam o Acido Clavulánico. No se ha demostrado ventaja sobre otros antimicrobianos
en el tratamiento de estafilococias. Se ha recomendado su empleo como preventivo en
algunos tipos de cirugía (27).

Trimetoprim sulfas, Tetraciclinas y cloranfenicol: En general los estafilococos son

sensibles a estos fármacos, sin embargo, actualmente tienen escasa aplicación (27).

Quinolonas: Estos importantes fármacos no tienen aplicación alguna en el

tratamiento de las infecciones estafilocócicas (27, 28).

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y la proteína PBP 2a

Cuando este microorganismo es resistente a la meticilina (SARM) produce una

proteína alterada que se une a la penicilina (PBP 2a) y le confiere susceptibilidad tanto a las
penicilinas (incluida la meticilina) como a las cefalosporinas. Esta proteína es codificada por
el gen mecA. Todas las cepas de SARM que son completamente resistentes a la meticilina
contienen el gen mecA y producen PBP 2ª (28).

La proteína PBP 2a, con un peso de 78 kDa, posee baja afinidad y, por consiguiente,
resistencia a prácticamente todos los antibióticos β-lactámicos. Esta proteína conserva su
actividad transpeptidasa y carboxipeptidasa, contribuye a la síntesis de la pared celular,
generando un peptidoglucano estable, mientras que las PBP 1, 2 y 3 son inactivados por los
antibióticos β-lactámicos (28).

18
 Definición de Términos.

 Antisepsia: Eliminación o inhibición de microorganismos mediante el empleo de

agentes químicos (antisépticos), que por su baja toxicidad pueden aplicarse en tejidos
vivos, piel, mucosas, etc. Es un tipo concreto de desinfección empleado,
habitualmente, en el tratamiento de heridas o en la limpieza de la piel previa a una
operación.

 Clumping Factor A: El factor de agrupamiento A, o ClfA (pos sus siglas en inglés),

es un factor de virulencia de S. aureus que se une al fibrinógeno. También se ha
demostrado que ClfA se une al complemento de la proteína reguladora I. Es
responsable de la acumulación de plasma sanguíneo que se observa al agregar S.
aureus al plasma humano.

 Leucocidina: La leucocidina de Panton-Valentine (PVL), es una toxina citolítica

formadora de poros. Su presencia está asociada con un incremento en la virulencia de
ciertas cepas de S. aureus. La leucocidina está presente en cerca del 5% de las cepas
de SARM circulantes en hospitales y en prácticamente todas las de SARM asociado
a la comunidad. La lisis celular que causa está mediada por la «formación de poros
con aumento de la permeabilidad a los cationes y la inestabilidad osmótica».

 Opsonización: Es un fenómeno celular que incrementa la eficiencia de la fagocitosis.

Para lograrlo, es necesaria la presencia de las opsoninas, que son anticuerpos u otras
moléculas que tienen capacidad adherente a la superficie de la célula del
microorganismo que debe ser destruido.

 Plásmido: Es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran

en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano
y se replican independientemente de ella. Por lo general, tienen sólo un número
pequeño de genes, algunos de ellos asociados con resistencia a los antibióticos. Los
plásmidos se pueden transmitir entre las distintas células bacterianas.

19
 Operacionalización de Variables

OBJETIVO VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIONES INDICADORES ITEMS

CONCEPTUAL
Coco Gram positivos
Staphylococcus que forman parte de la  Ausencia 1. +
aureus flora normal  Presencia Prueba Coagulasa 2. -
transitoria de la piel y
mucosa.
Identificación de
Determinar la Muestras bacterias que generan  Ausencia de 1. Colonias
prevalencia de ambientales de contaminación debido Crecimiento Agar Manitol Salado Rosadas
Staphylococcus superficies a la presencia de estos  Presencia de 2. Colonias
aureus con en el área hospitalaria. Crecimiento Amarillas
resistencia a Determina la
meticilina de susceptibilidad de una
muestras bacteria a un grupo
ambientales antibiótico, calculando  Sensible Diámetro del halo de 1. ≥ 22 mm
Sensibilidad el diámetro de  Resistente inhibición 2. ≤ 21 mm
inhibición que se (mm)
produce en el
antibiograma.
Concentración más
Concentración baja de un antibiótico  Sensible 1. 2 – 4 – 8
Mínima Inhibitoria que inhibe el  Intermedio Concentración 2. 16
crecimiento de una  Resistente μg/ml 3. 32
determinada cepa
bacteriana.
 CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO

Toda investigación requiere de la definición de un conjunto de actividades y

procedimientos que configuren a su dimensión metodológica, por lo tanto, la metodología
del proyecto incluye el tipo de investigación, técnicas y procedimientos que serán utilizados
para llevar a cabo la indagación; es el cómo se realizará el estudio para responder al problema
planteado (29).

Tipo de Investigación

La presente investigación será de tipo descriptiva, consiste en la caracterización de

un hecho, fenómeno o grupo con el fin de establecer su estructura y comportamiento, que
deberán estudiarse en una población, la presencia o ausencia de algo, la frecuencia con que
ocurre el fenómeno y en quiénes (29, 30).

Diseño de la Investigación

El diseño de esta investigación será No Experimental, ya que se realiza sin manipular

deliberadamente las variables, es decir, no se hacen variar intencionalmente las variables,
sólo se observará fenómenos tal y como se dan en el contexto natural para después
analizarlos. Así mismo será de tipo transversal, pues se realizará un muestreo en un solo
momento y en un tiempo único, su propósito es describir variables e interrelación en un
momento dado (30, 31).

Población y Muestra

Población

Es el conjunto de sujetos o unidades de observación que reúnen las características que

se deben estudiar, que cumplen con los criterios de selección y de los cuales se desea
extrapolar los resultados medidos y observados en la muestra (30).

En relación con lo antes expuesto, la población objeto de estudio, estará conformada

por 182 hisopados extraídos de las áreas de Quirófano, UCI y UTIN.
 Muestra

La muestra es un subconjunto representativo de un universo o población, y tomando

en consideración que la población es finita, no se recurrirá a ningún criterio muestral, por lo
que la muestra a estudiar será igual a la población (29).

Procedimiento Metodológico

Técnicas de muestreo

Los procedimientos empleados para la recolección se basan en lo propuesto por

STANDARD METHODS y las Normas técnicas NTP 203 Y 409 sobre evaluación
microbiológica en ambiente cerrado, sugeridas por el Ministerio del Trabajo Español (32, 33).

Método de impactación para el recuento de bacterias en superficies

Para la evaluación de superficies se realizaron hisopado de cortinas, monitores, mesas

de faena, incubadoras, camillas, entre otros. Posteriormente se inocularon en medios de
cultivos específicos a partir de los cuales se aislaron los microorganismos representativos
para su identificación.

Aislamiento e Identificación:

Se realizará sobre Agar Manitol Salado, el cual es un medio selectivo que inhibe el
crecimiento de bacterias Gram negativas. Serán sembradas por agotamiento en estría e
incubadas a 36ºC ± 1 en aerobiosis durante 24 horas. Las colonias que presenten una
coloración amarilla serán sospechosas de Staphylococcus aureus (34).

Pruebas de Identificación:

Tinción de Gram: es una técnica de contraste o diferencial, que se basa en las

diferencias entre las paredes celulares de las bacterias grampositivas y gramnegativas, las
primeras poseen una capa de peptidoglucano gruesa las cuales al ser teñidas con un colorante
básico como cristal violeta son capaces de retener el colorante después de aplicar el alcohol-
acetona, mostrándose de color azul, mientras que las bacterias gramnegativas poseen una
pared celular delgada, por lo tanto, eliminarán la tinción después de adicionar el decolorante,

22
haciendo necesario realizar una coloración de contraste con fucsina básica, mostrando un
aspecto rojo pálido (34, 35).

Dicha técnica se realiza mediante un extensión de la muestra con un asa de platino

sobre un portaobjetos, la cual se fijará por calor, sucesivamente se tiñe con un colorante
básico, cristal violeta o violeta de genciana, el cual se dejará actuar por 30 segundos, al
transcurrir el tiempo se lava la lámina con agua corriente, luego se coloca lugol sobre la
muestra y se deja por 30 segundos, la preparación se decolorará con alcohol o acetona,
después de secada la lámina se tiñe la misma con un colorante de contraste como la safranina
o fucsina básica por 30 segundos, terminado el tiempo se enjuaga la lámina con agua
corriente y se deja secar, último se observa la lámina al microscopio. Las bacterias
pertenecientes a la especie en estudio se observarán como cocos, con forma casi esférica,
formando racimos, viéndose como bacterias grampositivas. Sin flagelos o esporas y
excepcionalmente pueden tener cápsula (35, 36).

Catalasa: con esta prueba se investiga la presencia en el microorganismo de la

enzima catalasa, capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada (H2O2)
en agua (H2O) y oxígeno (O2), que se desprende en forma de burbujas en el medio. Es
positiva para los géneros Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria y negativa para
Streptococcus y Enterococcus, que morfológicamente pueden aparecer de forma similar. Para
la realización de esta prueba se tomará un portaobjeto y se colocará una gota de peróxido de
hidrógeno (H2O2), con ayuda de un aplicador de madera se tomará una porción de la colonia
a estudiar poniéndola en contacto con el H2O2, si se observa la aparición de burbujas esto
indica que la bacteria en estudio posee la enzima catalasa que descompone el H2O2 en
oxígeno y agua, indicando así la positividad de la prueba (36).

Coagulasa: es un enzima capaz de desnaturalizar el fibrinógeno del plasma, se utiliza

para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otras especies del género
Staphylococcus. Para su realización se dispondrá en un tubo 0,5ml de plasma fresco de
humano obtenido con EDTA o citrato de sodio, luego se colocará una pequeña cantidad de
la colonia a estudiar proveniente de un medio sólido, se mezcla e incuba a 37ºC, al cabo de
30min a 4 horas en caso de ser positiva la prueba se observará la formación de un coagulo
visible, debido que las cepas de S. aureus posee una enzima con actividad semejante a la
23
protrombina. Si la prueba resulta negativa, es decir, el plasma permanece igual se descartará
la posibilidad que sea S. aureus (36).

DNAsa: El Agar DNAsa es un medio de cultivo que contiene DNA (ácido

desoxirribonucleico por sus siglas en inglés), y se utiliza para detectar la presencia de
desoxirribonucleasa, en bacterias. S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa
si posee esta enzima, con el consiguiente aclaramiento del medio. Esta prueba se realizará
sembrando la cepa a estudiar en una placa de DNAsa con una línea recta, se incubará durante
24 horas a 37ºC, posteriormente se adicionará HCl 1M, si aparece un halo claro indica que
la bacteria produce DNAsa que hidroliza el ADN, mientras que si ocurre una precipitación
se considerará la prueba como negativa (35).

Antibiograma: en esta prueba la bacteria a estudiar se inocula sobre la superficie de

un medio con agar Mueller Hinton, y se enfrenta con discos de papel de filtro, celulosa o
pastillas impregnados con concentraciones estándar de antibiótico. A medida que las
bacterias se multiplican durante la incubación, el antibiótico muestra difusión en el agar.
Posterior a la incubación se observará que alrededor de cada disco aparecerá un halo de
inhibición cuyo diámetro será proporcional a la susceptibilidad del organismo frente al
antibiótico contenido en el disco. Mediante criterios estandarizados, se comparará el
diámetro de inhibición con la resistencia o sensibilidad del germen frente al antibiótico (34, 35,
36).

El antibiograma se realizará según el método de Kirby y Bauer, en agar Mueller

Hinton, siguiendo las normas establecidas por la CLSI (Clinical and Laboratory Standard
Institute por sus siglas en íngles), primeramente se obtendrá el patrón de turbidez 0.5
McFarland por medio de una suspensión directa de la cepa aislada, luego se inoculará la
superficie de la placa con el hisopo impregnado de la suspensión pasándolo uniformemente
por toda la placa en tres direcciones, posteriormente con una pinza estéril se colocara el disco
de cefoxitina, dejar las placas aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, con el
fin de que el antibiótico comience a difundir, se llevará a estufa a 37ºC por 24 horas en
aerobiosis. Transcurrida la incubación se procederá a medir el halo de inhibición, siguiendo
las normas de la CLSI para determinar la resistencia o sensibilidad del microorganismo hacia
el antimicrobiano enfrentado. La cefoxitina se utilizará para evaluar si la resistencia a
24
oxacilina es mediada por el gen mecA, por lo tanto, un halo menor a 21mm indicará que la
cepa es mecA positiva, por el contrario, un halo mayor a 22mm indicará que la cepa es mecA
negativa (34, 36, 37).

Por lo tanto, cepas de Staphylococcus aureus consideradas positivas para el gen mecA
serán reportadas oxacilino resistentes y resistentes a todos los β-lactámicos. Se utilizarán
cepas control de calidad recomendadas por la CLSI, las cuales son S. aureus ATCC 25923
mecA negativas y S. aureus ATCC 43300 mecA positivas, con el fin de confirmar los
resultados obtenidos (37).

25
 CAPÍTULO IV

MARCO ADMINISTRATIVO

Factibilidad:

El presente proyecto de investigación es factible y viable, ya que dispone con todos

los recursos necesarios para cumplir los objetivos y metas planteadas de dicha investigación,
contándose con los recursos humanos, institucionales, materiales y financieros.

Recursos Humanos:

Para la realización de este Proyecto de Investigación se cuenta con la participación

de:

• Prof. Gaerste Yosainix.

• Prof. Nicita Graciela.

• Hernández Ixaelys.

• Núñez Luis.

Recursos Institucionales:

Los organismos que prestarán su apoyo para el desarrollo de este trabajo son:

• Departamento de Microbiología de la Universidad de Carabobo, Sede Valencia.

• Centro de Investigaciones Microbiológicas Aplicadas (CIMA) de la Universidad de

Carabobo.

Recursos Materiales:

Los recursos materiales que se utilizarán para el desarrollo del trabajo, son los
siguientes:

• Solución salina fisiológica (SSF).

• Hisopos estériles.

• Tubos de ensayos.
26
• Gradillas metálicas.

• Placas de Petri desechables y vidrio.

• Asas de platino.

• Pinza estéril.

• Laminas portaobjetos.

• Discos de sensibilidad de oxacilina, cefoxitina, eritromicina y clindamicina.

• Agar Manitol salado.

• Agar cerebro-corazón.

• Agar Mueller-Hilton.

• Agar DNAsa.

• Plasma.

• Cristal violeta.

• Fucsina básica.

• Lugol.

• Alcohol-acetona.

• Ácido clorhídrico HCl 1M.

• Peróxido de hidrogeno al 30% (H2O2).

• Autoclave.

• Estufa.

• Mechero.

• Microscopio

• Campana de extracción.

27
• Balanza.

Recursos Financieros:

La presente investigación será autofinanciada por los propios investigadores y contará

con la colaboración del departamento de Centro de Investigaciones Microbiológicas
Aplicadas, en donde se realizarán los procedimientos necesarios para la obtención de
resultado.

28
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