Universidad Latina.

Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud.

Dr. William C. Gorgas.
Laboratorio # 8
Separación de Células Sanguíneas.
Profesor: Luis R. Lozano. U.

Introducción: Las células de los mamíferos, están suspendidas en la sangre en diferentes cantidades y tipos, las mismas
tienen diferentes características y función. Técnicas eficientes de separación son necesarias para la purificación de cada tipo
de célula en orden de estudio y en su función de obtener diferentes tipos de células purificadas en suspensión, usando una
baja velocidad de centrifugación en una rutina de trabajo.

Objetivo: Dar a conocer al estudiante las técnicas y procedimiento para separación celular utilizando productos comerciales
ajustados a una densidad de 1077.

Objetivos Específicos:
 Enumerar los pasos para separar células Sanguíneas.
 Realizar por si solo, la separación de células obtenidas, luego de la separación.
 Aplicar la técnica de viabilidad a las células obtenidas, luego de la separación.
 Aplicar la forma correcta de aspirar una pipeta de glóbulos blancos.
 Efectuar la forma correcta de servir una cámara de Neubauer.
 Practicar la forma correcta de Lectura en la cámara de Neubauer.
 Graficar su fuerza G con el diagrama de Fuerzas Centrífuga.
 Calcular sus revoluciones por minutos. (r.p.m.)
 Realizar un recuento celular en la cámara de Neubauer
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Materiales: 1.-Reactivo de Ficoll-Histopaque 1077. (Separador celular para mononucleares, linfocitos.)

2.- Extraer 4 c.c. de Sangre con EDTA o 8 c.c. de sangre con perlas de vidrio.
3.- Tubos de química de 16 x 100.
4.- Tubo cónico de 15 ml graduado con tapa de rosca.
5.- Solución salina, PBS, o RPMI 1640.
6.- Pipetas de 5 o 10 ml.
7.- Pipetas Pasteur de 15 " con bulbo para aspiración.
8.- Porta pipeta serológicas.
9.- Centrífuga.
10.- Gradilla para tubos.
11.- Placas o portaobjetos, cubre objetos.
12.- Microscopio.

Principio: En 1968, Boyum A. describió los métodos de separación mononuclear de las células que circulan en la sangre y
la médula ósea.
En general, este procedimiento emplea mezclas de polisacáridos y medio de contraste Radiopaque (Histopaque) 1077. Esta
es una solución de Ficoll y diatrizoato de sodio, ajustada a una densidad de 1.077 + o – 0.001.
Este medio facilita una rápida recuperación de células mononucleares viables en medianos volúmenes de sangre.
El procedimiento de Histopaque 1077 apropiado para el estudio de células mediada por Linfólisis y estudio de Tipificación
de Antígenos de Histocompatibilidad. También puede ser empleada para el inicio de la separación del 1er. Paso de los
linfocitos T y B y las células nulas.
La Sangre venosa con anticoagulante es separada en capas sobre el Histopaque 1077. Durante la centrifugación los
eritrocitos y granulocitos están agregados por Ficoll y rápidamente sedimentan puesto que los linfocitos y otras células
mononucleares permanecen en el plasma y en la interfaz del Histopaque 77.
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Procedimiento:
1.- Extraiga 4 cc de sangre con EDTA, en tubo de hematología o 6cc de sangre en tubo de química con aproximadamente 25
perlas de vidrio.
2.- Mezcle la mitad o la totalidad de la sangre extraída con salina fisiológica o PBS (partes iguales, de sangre y salina).
3.- Una vez obtenida esta mezcla servir sobre el Ficoll (3cc a 4cc) en tubo cónico de 15 ml o en tubo de química
(Transparente). Siempre en una relación de 2:1(mezcla de salina-sangre sobre el Ficoll).
4.- Centrifugue a 400 x g exactamente 30 minutos a temperatura ambiente. En
la centrifugación a 4 oC. se obtienen resultados en la recuperación de grupos de células muy pobres.
5.- Después de terminada la centrifugación, aspire suavemente con pipeta Pasteur, la capa superior de 0.5 cm de la parte
Opaca de la interfase la cual contiene células mononucleares. Descarte la capa superior (plasma + salina o PBS)
6.- Transfiera la parte opaca extraída con la pipeta Pasteur a un tubo cónico de centrífuga, limpio y seco.
7.- Adicione solución Salina o PBS (lavado) mezcle y centrifugue a 250 x g por 10 minutos.
8.- Aspire el sobrenadante y descarte.
9.- Resuspenda el botón de células con 5 ml de PBS o salina mezcle con pipeta Pasteur y centrifugue nuevamente a 250 x G
por 10 minutos.
10.- Terminada la centrifugación descartar el sobrenadante y resuspenda las células en 0.5 con solución salina o PBS.

Medición de la Viabilidad Celular.

Objetivo: Dar a conocer al estudiante, la forma de medir la viabilidad celular de los linfocitos, después de haber sido
sometido a tensión osmótica, centrifugación y separación por medios químicos y físicos.

Materiales: 1.- solución de mononucleares o linfocitos.

2.- Tinte de Azul Tripano.
3.- Porta objeto, cubre objeto.
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4.- Pipeta Pasteur.

5.- microscopio.
6.- Contador celular manual de 1 tecla.

Procedimiento:
1.- De la solución obtenida con anterioridad de Linfocitos, agitar suavemente y aspirar, dispensar una gota en un porta
objeto y agregar una gota de azul tripano, mezclar, esperar unos minutos y observar al microscopio.
2.- En el microscopio debe observar y diferenciar las células vivas de las muertas. (Células vivas: se ven de color natural,
brillantes, refringentes.
Las células muertas: se ven de color azul, opacas no refringentes ni brillantes.
Debe tener un 98 +o- 4 % de células vivas en un conteo, de lo contrario debe tomar una nueva muestra y realizar todos
los pasos anteriores.

NOTA: El Azul Tripano (Trypan Blue Stain) es teratogénico, posiblemente carcinogénico. Modo de contaminación: por
contacto e inhalación. Para su manejo debe utilizar guantes y mascara.

Recuento Celular de Mononucleares (Linfocitos)

Introducción: Debido a la gran cantidad de Mononucleares obtenidos en 1 mm3 en la técnica de separación celular,
utilizando soluciones con densidad de 1077. Es necesario conocer cuanto tenemos en 1 mm3 para ajustar la población de las
células a la concentración que la técnica a desarrollar necesite. (Técnicas como HLA, Poblaciones de Linfocitos T y
subpoblación y los linfocitos B.)
Objetivos: Dar a conocer al estudiante la forma de obtener la población mononuclear (linfocitos) necesaria para el
desarrollo de la técnica o procedimiento a efectuar.
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Principio: El Recuento Total de linfocitos (mononucleares), implica diluir de la muestra de los linfocitos obtenidos,
tomando una parte con una pipeta de Thoma y luego diluyendo la misma con una solución de ácido acético al 2% y violeta
genciana o azul de metileno; esta solución de Turk. Su finalidad es disolver los glóbulos rojos y teñir los mononucleares
para el conteo.

Materiales: 1.- solución de mononucleares o linfocitos.

2.- Pipeta de Thoma para Glóbulos Blancos. (Servir los linfocitos con esta pipeta aspirando hasta la marca de 0.5 (1:20) ,
terminado esto se sirve la solución Turk hasta la marca de 1.
3.- porta – pipeta o boquilla para pipeta de G. Blanco.
4.- Cámara de Neubauer cubre hemacitómetro.
5.-Solución Turk.
6.- agitador de pipetas.
7.- Contador Celular de 1 tecla.
8.- Microscopio.

Procedimiento:
1.- Del tubo cónico de 15 ml. de donde resuspendió el botón de mononucleares (linfocitos). Agitar suavemente y
tomar por aspiración con una pipeta de Glóbulos Blancos hasta la marca de 0.5 (dilución 1:20), limpiar la pipeta
por fuera y enrasar la punta hasta que quede exactamente en la línea de 0.5, luego aspire hasta la marca de 11
con el ácido acético.
2.- Colocar la pipeta en el agitador y agitar por 30 segundos.
3.- Terminada la agitación, descartar de 3 a 4 gotas y servir con la 5ta. Gota la cámara de Neubauer en el lado A y
B, dejar en reposo x 2 minutos.
4.- Colocar bajo el microscopio y observar con el bajo poder.
5.- Realizar el conteo en los 4 cuadrantes grandes que rodean al retículo de Thoma.
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6.- Terminado el conteo o recuento, el valor obtenido se multiplica por el factor de corrección en este caso es de 50.
y el valor obtenido se expresa en mm3.

Nota:
Anote sus observaciones en cada prueba, describa lo observado y dibuje.

Guía:
1.- Presente un dibujo de la Cámara de Neubauer e indique el área de lectura de los glóbulos blancos y rojos,
2.-Presente un dibujo de la separación de las células luego de la centrifugación e identifique cada una de las capas.
3.- Presente un dibujo de la prueba de viabilidad celular: observe las características de las células vivas y las muertas.

Investigación: - 1.- Presente un esquema de la Ontogenia de los Linfocitos T y B.

2.- Qué es la Activación o estimulación de los linfocitos?