INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

Programa Integrado de Pós-Graduação/INPA

Estrutura genética de populações e

filogeografia da acariquara (Minquartia
guianensis Aubl., Olacaceae)

Gabriela Souza Farias

Manaus, Amazonas
Março/2010
 II

Gabriela Souza Farias

Estrutura genética de populações e

filogeografia da acariquara (Minquartia
guianensis Aubl., Olacaceae)

Orientadora: Dra. Maristerra Rodrigues Lemes

Dissertação apresentada ao Programa

Integrado de Pós-Graduação do INPA,
como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas
área de concentração Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas
Março/2010
 III

FICHA CATALOGRÁFICA

F224 Farias, Gabriela Souza

Estrutura genética de populações e filogeografia da acariquara
(Minquartia guianensis Aubl., Olacaceae ) / Gabriela Souza Farias.---
Manaus : [s.n.], 2010.
xvi, 84 f. : il. color.

Dissertação (mestrado)-- INPA, Manaus, 2010

Orientador: Maristerra Rodrigues Lemes
Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Acariquara. 2. Variabilidade genética. 3. Sequência de bases (ácidos

nucléicos). 4. Microssatélites. 5. Biogeografia. 6. Espécie madeireira.
I. Título.
CDD 19. ed. 583.260415

Sinopse:

Estudou-se a estrutura genética de populações e os

padrões filogeográficos de M. guianensis, utilizando
marcadores microssatélites do genoma nuclear e do
cloroplasto e sequências não codificadoras do genoma
de cloroplasto. Os dados gerados corroboram a
hipótese de refúgios florestais como determinante na
estruturação genética atual das populações dessa
espécie.

Palavras-chave:
1. Acariquara. 2. Variabilidade genética. 3. Sequência
de bases (ácidos nucléicos). 4. Microssatélites. 5.
Biogeografia. 6. Espécie madeireira.
 IV

DEDICATÓRIA

À minha mãe

Maria Lúcia Souza Farias

e avó

Luiza de Souza Farias

 V

AGRADECIMENTOS

À Deus por ter me ajudado a seguir em frente com obstinação, esforço,

paciência e paixão pelo conhecimento, das quais, sem alguma delas, esta
caminhada teria sido muito mais árdua.

À FAPEAM, pela bolsa de estudos, ao INPA, ao GCBEv (Programa de Pós-

Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva) e, em especial, ao
Laboratório de Genética e Biologia Reprodutiva de Plantas – LABGEN/INPA que
com o apoio do Projeto SEEDSOURCE (financiado pela União Européia) permitiram
a realização deste trabalho.

À minha orientadora Dr.ª Maristerra Rodrigues Lemes e ao Dr. Rogério Gribel

pelos ensinamentos prestados, em especial, à disciplina que passei a ter e ao
interesse próprio que me ensinaram a desenvolver para superar as minhas
dificuldades. Foram mais de cinco anos de aprendizagem!

Ao Istituto di Genetica Vegetale (Plant Genetic Institute) no Consiglio

Nazionale delle Ricerche (National Research Council) em Sesto Fiorentino/Florença
- Itália, pela realização de parte importante do projeto. Ao Dr. Giovanni G.
Vendramin, il mio padre italiano, pois era assim que ele me fazia sentir no seu
laboratório, como uma filha. Aos amigos que trabalharam comigo na Itália, Sara
Torre, Marwan Lubis e Bouchra Douaihy, foi muito bom conhecer vocês, grazie mille!

À minha avó Luiza de Souza Farias e minha mãe Maria Lúcia Souza Farias
pelo apoio mais que sincero.

Aos meus amigos Jean Pimentel, Raquel Amazonas, Gustavo Nunes, Adam
Leão, Érika Portela, entre tantos outros que me apoiaram durante esses dois anos
com palavras de incentivo.

Aos meus amigos e colegas de turma (2007 e 2008) Alessandra, Suzana,

Rodrigo, Arlisson, Fabíola, Elizabete, Edvaldo, Daniela, Bárbara Alessandra,
Mariana, Mauro, Cabral, Mellina, Leila, Deyla, Graciela, Joel, Edson, Alexandre,
grandes companheiros nos momentos bons e ruins.
 VI

À equipe Labgen, Carla Sardelli, Érika Souza, Francimary Carneiro, Jaqueliny

Zocca, Joicy Falcão, Marcelo Queiroz, Marina Cortes, Milene Souza, Rafael
Angrizani, Rafael Arruda, Tatiana Menicucci e em especial à Carolina Medeiros
pelos conhecimentos técnicos, dicas valiosas, amizade e companheirismo, das quais
tornaram esses dois anos muito agradáveis.

Ai coniugi Carla e Maurizio Stanghellini di Firenze e specialmente a Vito

Scavo, la mia famiglia italiana che mi ha accolto e voluto bene. Sono molto contenta
di aver conosciuto queste persone meravigliose. Non mi dimenticherò mai di voi!!!

E por fim, aos professores do GCBEv que foram imprescindíveis para o meu
amadurecimento profissional.
 VII

Olha estas velhas árvores, mais belas

Do que as árvores moças, mais amigas,
Tanto mais belas quanto mais antigas,
Vencedoras da idade e das procelas...

Olavo Bilac
 VIII

RESUMO

A acariquara, Minquartia guianensis Aubl., é uma espécie florestal de grande

valor econômico na região Amazônica devido a alta durabilidade de sua madeira e
suas populações naturais têm sido intensamente exploradas. A fim de avaliar os
efeitos genéticos da exploração em espécies de árvores madeireiras, torna-se
prioritária a obtenção de informações sobre os padrões de distribuição da
variabilidade genética em populações naturais. Estes dados refletem as relações
históricas e atuais entre populações e devem ser avaliados à luz das diversas
hipóteses biogeográficas, a fim de se compreender a origem da diversidade das
populações de plantas. No presente estudo foram investigadas a estrutura genética
e a filogeografia de populações naturais da acariquara, por meio da análise de locos
microssatélites do genoma nuclear (ncSSR) e do cloroplasto (cpSSR), além de
sequências do genoma do cloroplasto (cpDNA), na Amazônia e América Central. No
total foram amostrados 187 indivíduos de M. guianensis em oito localidades. Foram
observados 128 alelos (oito a 23/loco) utilizando-se os locos ncSSR e 51 (3 a 6
alelos/loco) utilizando-se os locos cpSSR. No total foram encontrados 103 e cinco
haplótipos considerando os dados cpSSR e sequências do cpDNA, respectivamente.
As estimativas de diversidade genética (HE), utilizando-se os dados ncSSR e cpSSR
(0,64 e 0,29, respectivamente), são consideradas altas. O coeficiente de endogamia
FIS (0,26) também foi alto, indicando a ocorrência de endocruzamento ou
acasalamento entre indivíduos aparentados nas populações. A maior parte da
variação genética encontrada, utilizando-se os três marcadores (ncSSR, cpSSR e
sequências do cpDNA), ocorreu dentro das populações (68,79%, 63,98%; 71,67%,
respectivamente). No entanto foi observada uma forte estruturação genética das
populações de M. guianensis (FST= 0,36 (cpSSR), 0,31 (ncSSR); 0,28 (sequências
do cpDNA)). O grande número de haplótipos exclusivos observados pela análise
cpSSR sugere um fluxo gênico materno atual bastante restrito ou até ausente entre
as populações. Não houve correlação entre distância genética e distância geográfica
nas populações analisando-se os locos microssatélites. O padrão de estruturação
encontrado para as populações de M. guianensis pode estar relacionado aos efeitos
de isolamento causado por refúgios florestais ocorridos durante períodos glaciais no
Quaternário. As populações de M. guianensis também apresentaram uma alta
diversidade genética intrapopulacional. Infere-se que as populações dessa espécie
fragmentaram-se e mantiveram-se isoladas provavelmente devido às mudanças
climáticas ocorridas no Pleistoceno, no entanto as áreas de ocorrência parecem ter
sido amplas (os refúgios florestais teriam abrangido áreas maiores). Os efeitos de
estrangulamento populacional parecem ter tido pouco impacto nas populações de M.
guianensis, o que é evidenciado pela alta diversidade haplotípica encontrada
atualmente. Com base nos dados genéticos obtidos propõe-se que sejam
conservadas várias populações de M. guianensis ao longo de sua distribuição, a fim
de se preservar a diferenciação genética observada entre elas e a alta diversidade
genética detectada dentro das mesmas, de modo a possibilitar a manutenção da
variabilidade genética e a conservação efetiva dessas populações.
 IX

ABSTRACT

Minquartia guianensis Aubl. is a valuable Neotropical forest species due to the

high durability of its wood. The populations of this species are under very high
pressure due to the overexploitattion. In order to evaluate the genetic effects of
exploitation on this forest tree species, it is a priority to get information on patterns of
the distribution of genetic variability in natural populations. These data reflect the
historical and current relationships among populations and should be analised under
biogeographic hypotheses in order to understand the origin of the diversity in plant
populations. In the present study, the genetic structure and phylogeography of
natural populations of M. guianensis were investigated, using nuclear (ncSSR) and
chloroplast (cpSSR) microssatellite loci, as well as sequences of non-coding regions
of the cloroplast genome (cpDNA), in the Amazon and Central America. A total of
187 individuals of M. guianensis were sampled in eight populations. For the ncSSR
loci data set 128 alelles were found (eight to 23/locus) and 51 (3 to 6 alelles/locus) for
the cpSSR loci. A total of 103 different haplotypes were found based on cpSSR
analysis and five haplotypes were detected for the cpDNA sequence data set. The
genetic diversity measures (HE) were high for both nuclear and chloroplast
microssatelites (0.64 and 0.29, respectively). The inbreeding coefficient (FIS = 0.26)
was high in M. guianensis populations as well. The AMOVA showed that most of the
genetic variability is found within the acariquara populations (68,8%, 64%, 71,7%, ,
for ncSSR, cpSSR and cpDNA sequences, respectively). Despite the high genetic
variability found within populations, the populations of M. guianensis were
significantly differentiated, based on the three markers analysed. There was no
correlation between genetic and geographical distances among the populations for
any of the tested markers. The pattern of current genetic structuring found for the
populations of M. guianensis could be related to the isolation effects caused by forest
refuges during glacial periods in the Quaternary. In spite of the high population
genetic structuring, the populations present high intrapopulational genetic diversity.
The bottleneck effects seem not to have influenced the populations very much, as
observed by the high haplotypic diversity found within the populations. Based on the
data presented, in situ conservation strategies for M. guianensis should consider the
preservation of several populations of M. guianensis with many individuals each
along its geographical distribution in order to maintain the high genetic diversity
observed within populations and the highly structured pattern found for the
distribution of the genetic variability among populations.
 X

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - INDIVÍDUO ADULTO DE M. GUIANENSIS (A); INFLORESCÊNCIA MOSTRANDO O

ASPECTO DAS FLORES DE M. GUIANENSIS (B); FRUTO DA ESPÉCIE (C) E CORTES DE MADEIRA
EXPLORADA DE M. GUIANENSIS (D) ....................................................................................... 14

FIGURA 2 - LOCALIZAÇÃO DAS POPULAÇÕES AMOSTRADAS DE M. GUIANENSIS .................... 16

FIGURA 3 - QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRAÍDO A PARTIR DE FOLHAS E CÂMBIO DE 11
INDIVÍDUOS DE M. GUIANENSIS UTILIZANDO O MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE DNA CTAB, EM GEL

DE AGAROSE 1,5% CORADO COM BROMETO DE ETÍDIO. AS COLUNAS L1, L2 E L3 DO GEL

REFEREM-SE AOS MARCADORES DE MASSA MOLECULAR FAGO LAMBDA ( ) COM 50, 100 E

200 NG, RESPECTIVAMENTE. AS SUBSEQUENTES COLUNAS DO GEL REFEREM-SE AO DNA

EXTRAÍDO DE 11 AMOSTRAS DE FOLHAS (COLUNAS 1 A 8) E CÂMBIO (COLUNAS 9 A 11) DE M.
GUIANENSIS........................................................................................................................... 25

FIGURA 4 - QUANTIFICAÇÃO DO DNA EXTRAÍDO A PARTIR DA CASCA DE SEIS INDIVÍDUOS DE

M. GUIANENSIS UTILIZANDO O MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE DNA CTAB, EM GEL DE AGAROSE
1,5% CORADO COM BROMETO DE ETÍDIO. AS COLUNAS L1, L2 E L3 DO GEL REFEREM-SE AOS
MARCADORES DE MASSA MOLECULAR FAGO LAMBDA ( ) COM 50, 100 E 200 NG,

RESPECTIVAMENTE. AS SUBSEQUENTES COLUNAS DO GEL REFEREM-SE AO DNA EXTRAÍDO

DE SEIS AMOSTRAS DE M. GUIANENSIS.................................................................................. 26

FIGURA 5 - FRAGMENTOS AMPLIFICADOS REFERENTES A OITO LOCOS NCSSR DE M.

GUIANENSIS EM GEL DE AGAROSE 2%. A COLUNA L REFERE-SE AO MARCADOR LADDER 50
PB. AS COLUNAS SUBSEQUENTES REFEREM-SE AO DNA AMPLIFICADO DE TRÊS INDIVÍDUOS

PARA CADA UM DOS LOCOS MICROSSATÉLITES ...................................................................... 27

FIGURA 6 – ELETROFEROGRAMAS MOSTRANDO A DIVERSIDADE DE ALELOS OBSERVADA A

PARTIR DA AMPLIFICAÇÃO DE OITO LOCOS NCSSR DE M. GUIANENSIS. CADA PICO INDICA UM

ALELO. O TAMANHO DOS ALELOS ENCONTRAM-SE NA BARRA INFERIOR EM PARES DE BASE .. 28

FIGURA 7 - DISTRIBUIÇÃO DAS FREQUÊNCIAS ALÉLICAS OBSERVADAS PARA OITO LOCOS

NCSSR EM CINCO POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS. EIXO X: ALELOS ECONCONTRADOS PARA

CADA UM DOS LOCOS. EIXO Y: FREQUÊNCIA ALÉLICA ........................................................... 29

FIGURA 8 - CORRELAÇÃO ENTRE OS VALORES DE DELTA K E K PARA AS POPULAÇÕES DE M.
GUIANENSIS........................................................................................................................... 30

FIGURA 9 – ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS POR MEIO DA

ANÁLISE BAEYSIANA IMPLEMENTADA PELO PROGRAMA STRUCTURE UTILIZANDO OITO LOCOS

 XI

NCSSR. OS INDIVÍDUOS SÃO REPRESENTADOS POR LINHAS VERTICAIS. AS CORES E

NÚMEROS REPRESENTAM OS AGRUPAMENTOS BASEADOS EM SEMELHANÇAS GENOTÍPICAS 30

FIGURA 10 - ANÁLISE DE COMPONENTE PRINCIPAL (PCA) COM BASE NA ANÁLISE DA

VARIABILIDADE GENÉTICA CONTIDA EM OITO LOCOS DO NCSSR PARA CINCO POPULAÇÕES DE

M. GUIANENSIS ..................................................................................................................... 34
FIGURA 11 – INFERÊNCIAS SOBRE FLUXO GÊNICO ENTRE POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS,

POR MEIO DE ANÁLISE IMPLEMENTADA PELO PROGRAMA BARRIER. AS LINHAS VERMELHAS

REPRESENTAM AS BARREIRAS GENÉTICAS. QUANTO MAIS GROSSAS MAIS FORTES SÃO AS

BARREIRAS GENÉTICAS ENTRE AS POPULAÇÕES. AS SETAS INDICAM O SENTIDO DAS

INTERAÇÕES GENÉTICAS. OS NÚMEROS REPRESENTAM OS VALORES DE BOOTSTRAP........... 35

FIGURA 12 – RELAÇÃO ENTRE DISTÂNCIA GENÉTICA DE NEI E DISTÂNCIA GEOGRÁFICA (KM)

PARA CINCO POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS, ANALISADAS PAR A PAR, COM BASE NA

VARIAÇÃO OBSERVADA EM OITO LOCOS NCSSR ................................................................... 36

FIGURA 13 – PRODUTOS REFERENTES À AMPLIFICAÇÃO DE DEZ LOCOS CPSSR ANALISADOS

PARA QUATRO INDIVÍDUOS DE M. GUIANENSIS: (A) EMCRC67, (B) EMCRC74, (C) CCMP1, (D)
CCMP2, (E) CCMP3, (F) CCMP4, (G) CCMP5, (H) CCMP6, (I) CCMP7, (J) CCMP10, EM GEL DE
AGAROSE 3%. A COLUNA L REFERE-SE AO MARCADOR LADDER 1KB PLUS. AS COLUNAS

SUBSEQUENTES REFEREM-SE AO DNA AMPLIFICADO ........................................................... 39

FIGURA 14 - ELETROFEROGRAMAS MOSTRANDO OS ALELOS AMPLIFICADOS A PARTIR DA

ANÁLISE DE DEZ LOCOS CPSSR PARA DIFERENTES INDIVÍDUOS DE M. GUIANENSIS. CADA

PICO INDICA UM ALELO. OS TAMANHOS DOS ALELOS ENCONTRAM-SE INDICADOS NA BARRA

SUPERIOR, EM PARES DE BASES. A) EMCRC67; B) EMCRC74; C) CCMP1; D) CCMP2; E)

CCMP3; F) CCMP4; G) CCMP5; H) CCMP6; I) CCMP7; J) CCMP10 ......................................... 40

FIGURA 15 – RELAÇÃO ENTRE DISTÂNCIA GENÉTICA DE NEI E DISTÂNCIA GEOGRÁFICA (KM),

PARA SEIS POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS, ANALISADAS PAR A PAR, COM BASE NA

VARIAÇÃO OBSERVADA EM DEZ LOCOS CPSSR ..................................................................... 42

FIGURA 16 – OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DE QUATRO REGIÕES NÃO

CODIFICADORAS DO CPDNA DE M. GUIANENSIS UTILIZANDO OS PARES DE PRIMERS

TRNH/PSBA (A), TRNS/TRNG (B), TRNL/TRNF (C) E PSBB/PSBF (D) EM GEL DE AGAROSE

1,5% CORADO COM BROMETO DE ETÍDIO. A COLUNA L DO GEL REFERE-SE AO MARCADOR 1

KB PLUS. NAS COLUNAS SOBSEQUENTES SÃO REVELADAS SEIS AMOSTRAS DO DNA
AMPLIFICADO DE M. GUIANENSIS ........................................................................................... 44
 XII

FIGURA 17 – ELETROFEROGRAMAS MOSTRANDO PARTE DA SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA

REGIÃO TRNL/TRNF PARA DOIS INDIVÍDUOS DE M. GUIANENSIS. AS SETAS INDICAM UMA

SUBSTITUIÇÃO DO TIPO TRANSIÇÃO (A-G) ENTRE AS DUAS SEQUÊNCIAS .............................. 45

FIGURA 18 – POLIMORFISMOS DE SEQUÊNCIAS DE DNA DAS REGIÕES TRNL/TRNF (A) E

PSBB/PSBF (B) DO CPDNA DE M. GUIANENSIS. A) DUAS SUBSTITUIÇÕES NUCLEOTÍDICAS

(G-A E C-T); B) INSERÇÃO/DELEÇÃO DE NOVE PB ................................................................ 46

FIGURA 19 – FREQUÊNCIA DOS HAPLÓTIPOS OBSERVADOS NA ANÁLISE DE DEZ LOCOS

CPSSR DE M. GUIANENSIS ................................................................................................... 51

FIGURA 20 – RELAÇÃO ENTRE OS HAPLÓTIPOS DE M. GUIANENSIS, A PARTIR DE UMA ANÁLISE

DE REDE “NETWORK”, COM BASE NA ANÁLISE DE DEZ LOCOS CPSSR. CADA CÍRCULO SE

REFERE A UM HAPLÓTIPO. O TAMANHO DAS LINHAS SEPARANDO OS HAPLÓTIPOS

REPRESENTA O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO ENTRE OS MESMOS. NODOS PRETOS

REPRESENTAM MEDIAN VECTORS (HAPLÓTIPOS NÃO AMOSTRADOS OU HAPLÓTIPOS

ANCESTRAIS EXTINTOS)......................................................................................................... 52

FIGURA 21 – ANÁLISE DE REDE (NETWORK) MOSTRANDO AS RELAÇÕES ENTRE OS

HAPLÓTIPOS OBSERVADOS A PARTIR DA ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS DOS ESPAÇADORES

INTERGÊNICOS TRNL/TRNF E PSBB/PSBF DO CPDNA DE M. GUIANENSIS, CONSIDERANDO

APENAS SUSTITUIÇÕES DE NUCLEOTÍDEOS. CADA CÍRCULO REFERE-SE A UM HAPLÓTIPO E O

TAMANHO INDICA SUA FREQUÊNCIA DE OCORRÊNCIA. AS LINHAS REPRESENTAM AS

RELAÇÕES ENTRE OS HAPLÓTIPOS E SEU COMPRIMENTO ESTÁ RELACIONADO AO GRAU DE

RELAÇÃO ENTRE OS HAPLÓTIPOS ......................................................................................... 53

FIGURA 22 – MÉTODO DE COLETA DE CÂMBIO DE ÁRVORE PARA UTILIZAÇÃO EM ANÁLISE

GENÉTICA .............................................................................................................................. 54

FIGURA 23 – REGIÕES BIOGEOGRÁFICAS DA AMAZÔNIA. AS ÁREAS PONTILHADAS

REPRESENTAM AS POSSÍVEIS REGIÕES DE REFÚGIOS FLORESTAIS (HAFFER, 2008). FIGURA

ORIGINAL: BUSH & OLIVEIRA, 2006. MODIFICAÇÕES: GABRIELA FARIAS ............................. 64
FIGURA 24 – PLUVIOSIDADE ANUAL NA REGIÃO AMAZÔNICA. O CORREDOR SECO É A REGIÃO
BRANCA NO MAPA QUE ATRAVESSA A AMAZÔNIA TRANSVERSALMENTE NO SENTIDO

NOROESTE – SUDESTE. A PLUVIOSIDADE ANUAL NESSA ÁREA NÃO ULTRAPASSA 1500 MM DE

PRECIPITAÇÃO AO ANO. ........................................................................................................ 66
 XIII

LISTA DE TABELAS

T ABELA 1 – LOCALIDADES AMOSTRADAS DAS POPULAÇÕES ESTUDADAS DE M. GUIANENSIS 17

T ABELA 2 – PROTOCOLO DE REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO UTILIZANDO O KIT BIG DYE 3.1
(APPLIED BIOSYSTEMS INC.) ................................................................................................. 21
T ABELA 3 – CARACTERÍSTICAS DOS LOCOS NCSSR ISOLADOS DE M. GUIANENSIS. TA =
TEMPERATURA DE ANELAMENTO DOS PRIMERS. PB= PARES DE BASE .................................... 27

T ABELA 4 – DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE M. GUIANENSIS PELA ANÁLISE DE

VARIÂNCIA MOLECULAR (AMOVA), COM BASE NA ANÁLISE DE OITO LOCOS NCSSR ............ 31
T ABELA 5 – ÍNDICES DE DIVERSIDADE GENÉTICA, COEFICIENTE DE ENDOGAMIA E

DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA PARA OITO LOCOS NCSSR DE M. GUIANENSIS. A: NÚMERO DE

ALELOS; HO: HETEROZIGOSIDADE OBSERVADA; HE: HETEROZIGOSIDADE ESPERADA; FST:

ÍNDICE DE DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA BASEADA NA IDENTIDADE ALÉLICA; RST: ÍNDICE DE

DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA BASEADA NO TAMANHO DOS ALELOS; HT: DIVERSIDADE GÊNICA

TOTAL; FIS: COEFICIENTE DE ENDOGAMIA. EQUILÍBRIO DE HARDY-W EINBERG – HE

SIGNIFICANTEMENTE DIFERENTE DE HO: *= P < O,05; **= P < 0,01; ***= P < 0,001 .............. 32

T ABELA 6 – MATRIZ DE DIVERGÊNCIA CORRELACIONANDO FST (DIAGONAL ABAIXO) E FLUXO

GÊNICO (M= 2NM; DIAGONAL ACIMA) ENTRE AS POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS,

CONSIDERANDO OITO LOCOS NCSSR. .................................................................................. 33

T ABELA 7 – MATRIZ DE CORRELAÇÃO ENTRE DISTÂNCIAS GENÉTICAS DE NEI (ABAIXO DA

DIAGONAL) E DISTÂNCIAS GEOGRÁFICAS EM KM (ACIMA DA DIAGONAL) ENTRE AS

POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS, ANALISADAS PAR A PAR. ................................................... 36

T ABELA 8 – CARACTERÍSTICAS DOS DEZ LOCOS CPSSR ANALISADOS PARA M. GUIANENSIS.

TA = TEMPERATURA DE ANELAMENTO DOS PRIMERS. PB= PARES DE BASE. .......................... 38
T ABELA 9 – ÍNDICES DE DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS COM

BASE NA ANÁLISE DE DEZ LOCOS CPSSR. HE: DIVERSIDADE GENÉTICA (NEI, 1978) ............. 40

T ABELA 10 – DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DE M. GUIANENSIS PELA ANÁLISE

DE VARIÂNCIA MOLECULAR (AMOVA) PARA DEZ LOCOS CPSSR ......................................... 41

T ABELA 11 – MATRIZ DE CORRELAÇÃO ENTRE DISTÂNCIAS GENÉTICAS (ABAIXO DA

DIAGONAL) E DISTÂNCIAS GEOGRÁFICAS EM KM (ACIMA DA DIAGONAL) ENTRE AS

POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS, ANALISADAS PAR A PAR .................................................... 42

T ABELA 12 – CARACTERÍSTICAS DOS QUATRO PRIMERS DE SEQUÊNCIAS NÃO-

CODIFICADORAS DO CPDNA UTILIZADAS PARA AMPLIFICAÇÃO DESSAS REGIÕES EM M.

GUIANENSIS. TA = TEMPERATURA DE ANELAMENTO; PB= PARES DE BASE ............................. 43
 XIV

T ABELA 13 - DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE M.

GUIANENSIS PELA ANÁLISE DE VARIÂNCIA MOLECULAR (AMOVA), COM BASE NA ANÁLISE

DAS REGIÕES INTERGÊNICAS TRNL/TRNF E PSBB/PSBF DO CPDNA ..................................... 47

T ABELA 14 – HAPLÓTIPOS OBSERVADOS COM BASE NA ANÁLISE DE DEZ LOCOS CPSSR PARA
SEIS POPULAÇÕES DE M. GUIANENSIS ................................................................................... 48
 XV

SUMÁRIO

FICHA CATALOGRÁFICA .........................................................................................III

DEDICATÓRIA .......................................................................................................... IV
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. V
EPÍGRAFE ................................................................................................................ VII
RESUMO.................................................................................................................. VIII
ABSTRACT ................................................................................................................ IX
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... X
LISTA DE TABELAS ............................................................................................... XIII
SUMÁRIO ................................................................................................................. XV
I. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1
I.1. EXPLORAÇÃO MADEIREIRA E O STATUS DE CONSERVAÇÃO DE ACARIQUARA
(MINQUARTIA GUIANENSIS) ..................................................................................................... 1
I.2. CONSERVAÇÃO DE ÁRVORES TROPICAIS ......................................................................... 3
I.3. ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE PLANTAS .................................................... 4
I.4. FILOGEOGRAFIA DE PLANTAS NEOTROPICAIS .................................................................. 5
I.5. MARCADORES MOLECULARES PARA ESTUDOS DE ESTRUTURA GENÉTICA E

FILOGEOGRAFIA DE PLANTAS ................................................................................................. 7

I.6. A FAMÍLIA OLACACEAE E A ACARIQUARA (MINQUARTIA GUIANENSIS AUBL.)................ 11
II. OBJETIVOS ...........................................................................................................15
III. MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................................16
III.1. MATERIAL BIOLÓGICO E LOCAIS DE COLETA ............................................................... 16
III.2. EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E DILUIÇÃO DO DNA ..................................................17
III.3. AMPLIFICAÇÃO E ANÁLISE DOS LOCOS MICROSSATELITES DO GENOMA NUCLEAR
(NCSSR) E DO CLOROPLASTO (CPSSR) .............................................................................. 17
III.4. AMPLIFICAÇÃO DAS REGIÕES NÃO CODIFICADORAS DO CPDNA ................................ 19
III.5. SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS ................................... 20
III.5.1. PURIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DA PCR .................................................................... 20
III.5.2. REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO, PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO DE DNA ......... 21
III.6. ANÁLISE DOS DADOS ................................................................................................... 22
III.6.1. DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES ........................................ 22
III.6.2. ANÁLISES FILOGEOGRÁFICAS ................................................................................... 24
 XVI

IV. RESULTADOS .....................................................................................................25

IV.1. EXTRAÇÃO DO DNA .................................................................................................... 25
IV.2. DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DA ACARIQUARA................ 26
IV.2.1. MICROSSATÉLITES DO GENOMA NUCLEAR (NCSSR) ................................................ 26
IV.2.2. MICROSSATÉLITES DO GENOMA DO CLOROPLASTO (CPSSR) .................................. 36
IV.2.3. SEQUÊNCIAS DE REGIÕES NÃO CODIFICADORAS DO CPDNA .................................. 41
IV.3. ANÁLISES FILOGEOGRÁFICAS EM ACARIQUARA .......................................................... 45
V. DISCUSSÃO ..........................................................................................................52
V.1. EXTRAÇÃO DO DNA ..................................................................................................... 52
V.2. DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DA ACARIQUARA ................. 53
V.3. PADRÕES FILOGEOGRÁFICOS EM ACARIQUARA ........................................................... 58
V.4. IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA ACARIQUARA .............................................. 65

VI. CONCLUSÕES .....................................................................................................67

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................68
 1

I. INTRODUÇÃO

I. 1. Exploração Madeireira e o Status de Conservação da Acariquara

(Minquartia guianensis)

A extração de madeira na Amazônia é uma atividade econômica em

crescimento (Rizzini, 1971; Lemes, 2000) e, para atender os interesses do mercado
nacional e internacional, é restrita a poucas espécies de alto valor comercial, como o
mogno (Swietenia macrophyla), o cedro (Cedrela odorata) e a acariquara (Minquartia
guianensis; Newton et al., 1994; Lemes, 2000; Nebel, 2001; Barros & Veríssimo,
2002).

A contribuição da Amazônia na produção madeireira total do Brasil aumentou

de 14% para 85% nas últimas décadas (Cotton & Romine, 1999; Ferraz & Motta,
2002), tornando-se o maior produtor de madeira em tora do país (Nepstad et al.,
1999). Segundo Lentini et al. (2005), só em 2004, o setor madeireiro extraiu 24,5
milhões de metros cúbicos de madeira em tora, o equivalente a cerca de 6,2 milhões
de árvores. Esse impressionante aumento revela claramente a importância
crescente das espécies amazônicas na atividade madeireira.

De acordo com a Secretaria de Assuntos Estratégicos da Presidência da

República (SAE, 1997), 80% da madeira explorada na Amazônia têm origem ilegal
ou ligação com meios de exploração ilegal na região. No entanto, mesmo a extração
considerada “legal” é destrutiva por causa do uso de tecnologias ultrapassadas que
resultam em uma enorme perda de matéria-prima. Segundo Uhl et al. (1997),
apenas 1/3 da madeira extraída da Amazônia é transformada em produtos finais.

A destruição das florestas causadas pela exploração madeireira é prejudicial,

podendo levá-las à exaustão, uma vez que toda a produção madeireira na Amazônia
é proveniente da extração do estoque natural existente (Ferraz & Motta, 2002). Isto
causa uma instabilidade porque, mesmo que um recurso seja renovável, há a
incapacidade de regeneração da espécie por causa da velocidade de extração com
o intuito de atender ao crescimento da demanda de madeira no mercado para
diversos fins (Homma, 1993). Neste caso, a exploração de madeira pode ser tratada
equivalentemente aos recursos naturais não-renováveis (Ferraz & Motta, 2002).
 2

A intensa exploração madeireira de árvores tropicais causa a diminuição do

número de indivíduos reprodutivos, com graves consequências genéticas para as
populações naturais (Bawa, 1993; Murawski et al., 1994). A baixa densidade
populacional provoca perda da variabilidade genética, afeta os níveis de
endocruzamento e acaba por comprometer a viabilidade das populações, podendo
levar muitas delas à extinção (Simberloff, 1988; Alvarez-Buylla et al., 1996; Lemes et
al., 2003).

No caso da acariquara (Minquartia guianensis, Aubl., Olacaceae), o efeito

drástico da exploração se dá pelo grande valor econômico da madeira, que é
pesada (densidade 1,04 g/cm3) e apresenta uma alta durabilidade, com vida útil de
30 a 40 anos (Kvist & Nebel, 2001; Nebel, 2001; Lorenzi, 2002). Devido à sua alta
durabilidade e resistência, a madeira de M. guianensis (Figura 1-D) é muito utilizada
em exteriores na sua forma bruta, como postes para eletrificação, em colunas na
construção civil, bem como na fabricação de estacas, dormentes e mourões (Kvist &
Nebel, 2001; Nebel, 2001; Lorenzi, 2002; Camargo & Ferraz, 2004). Com o grande
uso na construção civil, como em casas de campo e esteios, ocorre, inclusive, o
comércio ilícito de madeira, onde há inclusive a substituição do tronco de acariquara
por outra semelhante pertencente à espécie Aspidosperma carapanauba, que não
possui a mesma durabilidade (Lorenzi, 2002). Minquartia guianensis também é
resistente a organismos que destroem a madeira, devido à substâncias antifúngicas,
e ao ataque por cupins, devido à alta densidade de sua madeira e à presença de
substâncias repelentes ou tóxicas (Bultman & Southwell, 1976; Nebel, 2001).

Estudos realizados no Peru (Kvist et al., 1995; Kvist et al., 2001) mostraram
que M. guianensis é uma das espécies de maior relevância econômica na área da
construção civil, sofrendo uma alta pressão de exploração e, em consequência, suas
populações naturais têm sido severamente depauperadas. Isso também é
demonstrado em um estudo de Nebel (2001) no Peru, o qual revelou que 80% da
madeira usada para construção civil é proveniente de áreas onde ocorrem
populações naturais de M. guianensis.
 3

I. 2. Conservação de Árvores Tropicais

A diversidade genética é importante para a sobrevivência de espécies, uma

vez que proporciona a elas a possibilidade de se adaptarem às mudanças
ambientais naturais. Essa diversidade pode ser comprometida quando, em
decorrência da ação antrópica (como no caso da exploração madeireira),
populações têm sua densidade diminuída e consequentemente o tamanho efetivo
populacional das espécies pode ser prejudicado (Bawa, 1993).

A diminuição da densidade de indivíduos de espécies tropicais em

populações naturais pode provocar o isolamento populacional, o qual restringe a
ação de polinizadores, que por sua vez é de fundamental importância para a
produção de sementes geradas por fecundação cruzada (Alvarez-Buylla et al.,
1996). Isso leva à perda de variabilidade genética, afetando os níveis de
endocruzamento, podendo levar consequentemente à fixação aleatória de mutações
deletérias e perda de alelos causados por deriva genética (Lacy, 1986; Simberloff,
1988; Alvarez-Buylla et al., 1996). A perda da variabilidade genética pode reduzir o
potencial evolutivo das populações de plantas (Frankhan et al., 1999). Dessa forma,
o distúrbio causado pela baixa densidade populacional em árvores tropicais
compromete a viabilidade de suas populações podendo levar à extinção local
(Lemes, 2000).

Embora se saiba que a fragmentação de habitats causada pela exploração de

madeira cause sérios danos às espécies de árvores tropicais, é difícil estimar os
efeitos sobre a diversidade genética atual de suas populações, em função da
escassez de informação (Bawa, 1993). Assim sendo, é imprescindível a obtenção de
dados sobre o tipo e a extensão da variação genética e como esta variação é
mantida e espacialmente organizada (Hamrick, 1993). Atualmente, a maioria dos
planos de conservação baseiam-se em dados de tamanho, estrutura e variabilidade
genética de populações (Fernández-Soltz, 2007). Dessa forma, a obtenção de dados
a cerca da distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações de
árvores tropicais é de suma importância no desenvolvimento de estratégias de
conservação cujo intuito seja preservar a diversidade genética de espécies (Hamrick
et al., 1991; Young et al., 1996). Mais do que isso, um conhecimento adequado
sobre a diversidade genética atual das espécies, sua biologia reprodutiva e as
 4

práticas apropriadas de corte seletivo são de fundamental importância para um

manejo sustentável de recursos madeireiros em florestas tropicais (Murawski et al.,
1994).

I. 3. Estrutura genética de populações de plantas

A estrutura genética está relacionada com a distribuição não aleatória dos

alelos e genótipos no espaço e no tempo, a qual é resultante da ação de forças
evolutivas, tais como: mutação, migração, seleção e deriva genética (Felsenstein,
2005). Dentre esses fatores, a migração e a mutação aumentam a variabilidade
genética, enquanto a seleção e a deriva podem causar a diminuição da variabilidade
genética dentro das populações (Felsenstein, 2005). O conhecimento sobre a
estrutura genética populacional de espécies de plantas é importante para se evitar
perdas adicionais de diversidade genética em populações que são ameaçadas por
atividades madeireiras, desmatamento e fragmentação de habitat (Collevatti et al.,
2003; Dutech et al., 2003; Lemes et al., 2003).

As populações de plantas estão estruturadas no espaço e no tempo. A

estrutura espacial refere-se à distribuição espacial dos indivíduos que é determinada
pelo sistema de reprodução e pelos padrões de dispersão de pólen e sementes. Já,
a estrutura genética temporal refere-se à subdivisão de gerações, por exemplo,
entre pais e filhos, plântulas e jovens e entre jovens e adultos (Loveless & Hamrick,
1984).

Fatores como a endogamia, deriva genética ou seleção podem alterar a

frequência de certos alelos, causando a formação de grupos divergentes dentro das
populações. No entanto, esta diferenciação pode ser contrabalanceada pela
presença de fluxo gênico, uma vez que espécies com intenso movimento de pólen e
sementes têm menor diferenciação genética entre populações do que espécies com
fluxo gênico restrito (Loveless & Hamrick, 1984). De acordo com Sork et al. (1999),
uma pequena quantidade de fluxo gênico a longas distâncias já é suficiente para
retardar a diferenciação entre populações quando se consideram os alelos neutros.
Dessa forma, fatores como o tamanho populacional, sistema de reprodução, fluxo
 5

gênico e habitat influenciam na distribuição da variação genética inter e

intrapopulacional.

Para a maioria das espécies arbóreas, observa-se uma alta diversidade

genética dentro das populações e baixa entre elas (Buckley et al., 1988; Powell et
al., 1995; Aldrich et al., 1998; Collevatti et al., 2001; Lemes et al., 2003; Novick et al.,
2003). Isso é o esperado para espécies de plantas com um alto N populacional, mais
de um sistema de reprodução e mecanismos eficientes de dispersão de sementes e
pólen. Por outro lado, para espécies com baixo N populacional, autofecundação e/ou
reprodução vegetativa e limitada dispersão de pólen e sementes se espera uma
baixa variabilidade dentro e alta entre as populações (Loveless & Hamrick, 1984).

I. 4. Filogeografia de Plantas Neotropicais

Nas últimas décadas, os estudos sobre os padrões intraespecíficos de

distribuição da variabilidade genética, com base na relação entre a genealogia de
genes e sua distribuição geográfica, a filogeografia, tem ganhado espaço em
pesquisas na área da biologia evolutiva (Avise et al., 1987; Avise, 2000; Avise,
2009). Métodos de análise filogeográficas possuem a capacidade de determinar as
relações históricas entre populações distinguindo-os dos processos atuais que
alteram os padrões de distribuição da variação genética (Caicedo & Schaal, 2004).

A filogeografia proporciona uma nova visão do papel do fluxo gênico na

estruturação genética de populações de plantas. Especificamente, ela promove um
caminho de detecção histórica de eventos de fluxo gênico, podendo discriminar
entre padrões causados por fluxo gênico atual e ancestral (Schaal et al., 1998).
Também fornece informações sobre processos do passado, permitindo entender as
consequências de eventos como a história de colonização de espécies de plantas,
além de permitir pesquisas que testem hipóteses adaptativas (Weiss & Ferrand,
2007).

Nas plantas em geral e nas espécies tropicais, em particular, estudos

envolvendo análises filogeográficas são recentes e considerados muito importantes
devido ao grande interesse em elucidar os fatores que determinam a estrutura
 6

genética atual das populações de plantas (Schaal et al., 1998; Hewitt, 2000, 2004;
Carvers et al., 2003; Dick et al., 2003, 2007; Dutech et al., 2003; Caicedo & Schaal,
2004). Tais estudos demonstraram que alterações climáticas ocorridas no passado,
ainda que de ocorrência mais branda na região tropical do que nas regiões
temperadas, teriam deixado grandes marcas na diversidade genética e na
distribuição geográfica de espécies neotropicais (Dynesius & Jansson, 2000).

O estudo de Caron et al. (2000) na Guiana, revelou um padrão de distribuição

em Dicorynia guianensis que está de acordo com eventos de regressão e expansão
das florestas tropicais durante o Quaternário.

Olsen (2002) observou que as populações de Manihot esculenta no norte e

centro-oeste do Brasil, que hoje se apresentam-se fragmentadas, estiveram
conectadas até um passado recente e que esta fragmentação deve-se a refúgios
florestais resultantes da última glaciação.

O desequilíbrio citonuclear observado em Vouacapoua americana nos

estudos de Dutech et al. (2003), na Guiana Francesa, pode ser interpretada como
um sinal histórico de divergência genética entre populações fragmentadas causadas
por eventos de extinção-recolonização durante as mudanças climáticas do passado.

Lira et al. (2003) revelaram que houve pouco fluxo gênico entre as
populações de Caesalpinia echinata no sudeste e nordeste do Brasil (na costa
brasileira) por um longo tempo, indo de acordo com a existência de refúgios glaciais
ao invés de ação antrópica.

Collevatti et al. (2003) mostraram que populações de Caryocar brasiliense,

nas regiões de cerrado do centro-oeste e sudeste do Brasil, teriam ficado isoladas
durante as glaciações e que, nos períodos interglaciais, as diferentes linhagens
puderam restabelecer suas rotas de fluxo gênico.

González-Rodriguez et al. (2004), em estudos realizados no México,

mostraram que populações das espécies Quercus affinis e Quercus laurina não
ficaram isoladas a poucas regiões na última glaciação, indicando que um número
considerável de populações permaneceram ao longo das mudanças climáticas onde
experimentaram migrações latitudinais e altitudinais.
 7

Farias (2006) observou que as populações de Salvertia convallariodora dos

cerrados amazônicos, que permanecem hoje ilhadas por ocasião das alterações
climáticas do passado, estiveram conectadas até um passado recente (Quaternário)
com as populações do Brasil central, por meio de um corredor climático mais seco
que ocorre na região centro-oriental do Brasil.

Ramos et al. (2007) observaram que durante as glaciações ocorridas durante

o Quaternário as populações de Hymenaea stigonocarpa do sul do cerrado brasileiro
tornaram-se extintas, havendo uma posterior recolonização a partir de linhagens do
norte durante o atual período interglacial.

Menicucci (2007) revelou que a colonização de Pseudobombax munguba na

Amazônia brasileira é recente e que variações no nível do mar ocorridas durante o
Plioceno ou Pleistoceno, em virtude de mudanças climáticas, teriam afetado o
padrão de distribuição da diversidade haplotípica dessa espécie, corroborando a
hipótese biogeográfica do Lago Amazônico (Klammer, 1984) como determinante na
estruturação genética das populações de árvores de várzea.

I. 5. Marcadores Moleculares para estudos de estrutura genética e filogeografia

de plantas

Ao longo dos anos, o acesso a dados sobre a variabilidade genética intra e

interpopulacional têm aumentado significativamente, principalmente através de
polimorfismos de proteínas (Solferini & Selivon, 2001) e de sequências de DNA
(Avise, 1994). A genética da conservação postula duas metas fundamentais:
prevenção de problemas associados ao endocruzamento e à deriva genética em
populações pequenas, e descrição da estrutura populacional com finalidade de
identificar unidades de conservação (Frankham et al., 2002). Para isso, marcadores
moleculares para estudos populacionais e filogeográficos que sejam altamente
polimórficos e com altas taxas de mutações estão cada vez mais sendo requeridos.
Entre os mais utilizados estão: sequências de regiões não codificadoras e
sequências simples repetitivas ou microssatélites. A busca por marcadores com
padrões de herança e taxas evolutivas diferentes ajuda na obtenção de informações
 8

mais completas para a elucidação de dados de estrutura genética e história evolutiva

dos organismos (Schaal, 1998; Provan et al., 1999b).

Em plantas, marcadores moleculares oriundos do genoma do cloroplasto têm

se mostrado como ideais para estudos de filogeografia (Olsen & Schaal, 1999;
Olsen, 2002; Collevatti et al., 2003; Caicedo & Schaal, 2004; Lorenz-Lemke et al.,
2005; Miller & Schaal, 2005; Dick et al., 2007). O DNA do cloroplasto é um genoma
extranuclear, circular, que pode variar de 120 a 217 kb (Arias & Malachias, 2001). O
DNA do cloroplasto tem como característica, em geral, ser herdado maternalmente,
mas pode possuir herança biparental e até mesmo paterna, como já foi registrado
em algumas espécies de angiospermas (Arias & Malachias, 2001; Nahum, 2001). O
DNA cloroplastidial possui também uma taxa de mutação menos frequente que a
observada para o genoma nuclear tanto de plantas quanto de animais (Provan et al.,
2001) e menos frequente ainda quando comparado com o DNA mitocondrial de
animais (Nahum, 2001).

Embora o genoma mitocondrial (mtDNA) de plantas tenha características

semelhantes ao do genoma do cloroplasto (cpDNA), como o fato de possuir uma
taxa de substituição lenta e herança uniparental, ele não é muito utilizado devido a
taxa de mutação ser bem menor do que o cpDNA, tanto de substituições quanto de
inserções e deleções (Wolfe et al., 1987; Dumolin-Lapègue et al., 1997). Dessa
forma, é muito mais difícil identificar polimorfismos nesse genoma. Além disso, o
mtDNA apresenta grande variação em tamanho do genoma, no rearranjo dos genes
e sofre frequentes recombinações (Provan, 1999a). Assim, o mtDNA de plantas é
muito menos estudado que o cpDNA (Dumolin-Lapègue et al., 1997).

Como resultado da herança materna na maioria das angiospermas, o fluxo

gênico do genoma do cloroplasto é restrito quando comparado com o genoma
nuclear, por ser transmitido apenas através de sementes, e não via pólen.
Consequentemente, quando se utiliza o genoma do cloroplasto em estudos
genéticos, espera-se encontrar uma maior estruturação geográfica da variação
genética. Mais do que isso, como a taxa de evolução de sequência do cpDNA é
mais baixa (Wolfe et al., 1987; Provan et al., 1999b), tal genoma é ideal para
detectar eventos demográficos antigos (Ennos et al., 1999). Dessa forma, o genoma
do cloroplasto é importante para estudos de padrões históricos de fluxo gênico,
 9

relações filogenéticas entre populações, reconstrução das rotas de dispersão e

colonização de espécies de plantas (Ennos et al., 1999; Li et al., 2002; Carvers et
al., 2003).

Iniciadores (primers) considerados universais são muito úteis para estudos

moleculares, pois normalmente são homólogos a regiões conservadas dos
genomas. Tais iniciadores são utilizados para amplificar regiões não-codificadoras
dos genomas, permitindo assim, a transferabilidade de um determinado marcador
para outras espécies, que podem ser do mesmo gênero, da mesma família e até de
grupos taxonômicos superiores (Dayanandan et al., 1997; Dumolin-Lapègue et al.,
1997; White & Powell, 1997; Collevatti et al., 1999; Weising & Gardner, 1999). Este é
um recurso muito utilizado em laboratórios, devido ao aumento significativo na
relação custo/benefício, na utilização desta técnica.

Em plantas, o desenvolvimento recente de primers universais, tendo como

alvo regiões não codificadoras do cpDNA (Tarbelet et al., 1991; Demesure et al.,
1995; Dumolin-Lapègue et al., 1997; Hamilton et al., 1999), tem fornecido
marcadores moleculares muito informativos no nível intraespecífico (Newton et al.,
1999). Marcadores do cpDNA têm sido utilizados com sucesso em vários estudos
sobre a filogeografia de plantas (Petit et al., 1993, 1997, 2002; Demesure et al.,
1996; Caron et al., 2000; Dutech et al., 2000; Raspe et al., 2000; Carvers et al.,
2003; Caicedo & Schaal, 2004; Miller & Schaal, 2005; Menicucci, 2007).

Em tais estudos têm sido empregadas técnicas, principalmente para se

verificar a variabilidade genética ao nível da sequência de DNA. A análise se dá por
meio da verificação de variação nas bases nucleotídicas em uma sequência
específica do DNA, permitindo assim detectar polimorfismos genéticos.
Conjuntamente com dados de substituições de bases, inserções e deleções são
também bastante informativas nas análises genéticas (Schaal et al., 1998). Dessa
forma, primers de sequência nucleotídica de regiões não codificadoras do genoma
de organelas apresentam características importantes para análises genéticas, pois
não ocorrem homoplasias devido à baixa taxa de substituições e à baixa frequência
de inserções e deleções proporcionando assim um bom alinhamento das sequências
(Ennos et al., 1999).
 10

Outro marcador molecular bastante utilizado para estudos genéticos em

plantas são os microssatélites, também conhecidos como SSR (Simple Sequence
Repeats). Este marcador permite superar as deficiências dos outros marcadores por
apresentar altos níveis de variabilidade em estado diplóide por ser altamente
polimórfico (Tautz, 1993). Uma outra vantagem desses marcadores é que eles são
seletivamente neutros possibilitando, dessa forma, a manutenção de sua alta
variabilidade, além de acumularem mutações a uma taxa relativamente constante
(Fernandéz-Stolz, 2007). Os SSRs são pequenas sequências repetidas de DNA
compostas de um a seis nucleotídeos, dispostas em tandem encontradas com
frequência e amplamente distribuídas nos genomas dos eucariotos (Tautz & Renz,
1984; Litt & Luty, 1989). Os mais utilizados para estudos genéticos são os SSRs
com repetições de dois, três e quatro nucleotídeos (Li et al., 2002). Os locos de DNA
microssatélites possuem expressão co-dominante (no caso de microssatélites do
genoma nuclear) e são bastante polimórficos devido às altas taxas de mutação
(Condit & Hubbell, 1991; Li et al., 2002; Morgante & Olivieri, 1993; Provan et al.,
1999a, 2001; Rafalski et al., 1996). Essas mutações ocorrem por meio de
escorregões (slippage) da polimerase que acontecem durante a replicação do DNA.
Dessa forma, há uma mudança no número de repetições alongando ou encurtando
essas regiões (Schlötterer, 2000; Selkoe & Toonen, 2006). Essas características
tornam os microssatélites uma ferramenta ideal em estudos de diversidade e
estrutura genética de populações (Ferreira & Grattapaglia, 1998; White et al., 1999;
Dayanandan et al, 1999; Collevatti et al., 2001; 2009; Gaiotto et al., 2003; Ashworth
& Clegg, 2003; Lemes et al., 2003; Novick et al., 2003; Heuertz et al., 2004; Dutech
et al., 2004; Jones & Hubbell, 2006).

Em plantas, também são encontrados sequências simples repetidas no

cpDNA e isso tem levado à novas abordagens de estudos em genética de
populações e sistemática de plantas (Powell et al., 1995, Provan et al., 1999a).
Esses marcadores têm se apresentado como uma ferramenta bastante informativa
na determinação das relações histórico-evolutivas no nível intraespecífico (Powell et
al., 1995; Bucci et al, 1998; Collevatti et al., 2003; Mengoni et al., 2000; Vendramin
et al., 2000; Gugerli et al., 2001; Provan et al., 2001; Ribeiro et al., 2002; Lira et al.,
2003; Gómez et al., 2005; Steane et al., 2005; Farias, 2006). Dessa forma,
marcadores de DNA microssatélites do cpDNA tem-se demonstrado como uma
 11

ferramenta alternativa importante para a estimativa de diversidade genética e

descrição da estrutura genética e fluxo gênico histórico em populações de plantas
(Morgante & Olivieri, 1993; Provan et al., 2001).

I. 6. A Família Olacaceae e a Acariquara (Minquartia guianensis Aubl.)

A família Olacaceae possui uma distribuição pantropical e pertence à Ordem

Santalales, na qual incluem-se também as famílias Dipentodontaceae, Opiliaceae,
Grubbiaceae, Santalaceae, Misodendraceae, Loranthaceae e Viscaceae (Joly, 1993;
Malécot & Nickrent, 2008). Na família Olacaceae há 27 gêneros e em torno de 200
espécies (Souza & Lorenzi, 2005). Seus representantes compõem-se de plantas
lenhosas, lianas e algumas hemiparasitas, que crescem sobre as raízes de outras
plantas (Joly, 1993).

Entre as famílias da Ordem Santalales, a família Olacaceae tem sido

considerada como a mais basal, justamente por possuir espécies parasitas e não-
parasitas e por isso tem sido alvo de estudos morfológicos e filogenéticos. Malécot
et al. (2004), utilizando caracteres morfológicos, encontraram quatro clados distintos
em Olacaceae, que se revelou parafilética, sendo o grupo de plantas parasitas o
mais basal. O mesmo aconteceu nos estudos moleculares de Malécot & Nickrent
(2008) que, por meio de dados de sequência de DNA nuclear e do cloroplasto,
revelaram sete clados bem suportados, apresentando uma família polifilética com o
grupo de espécies parasitas sendo o mais basal.

Dos 26 gêneros pertencentes à família, dez ocorrem no Brasil, sendo

Heisteria, Ximenia, Liriosmae e Schoepfia os que apresentam o maior número de
espécies. Minquartia guianensis, conhecida como acariquara, é a única
representante do gênero Minquartia e é considerada uma espécie importante devido
ao grande valor econômico de sua madeira (Joly, 1993; Kvist & Nebel, 2001; Nebel,
2001).

A acariquara, M. guianensis Aubl., apresenta distribuição Neotropical,

ocorrendo na América Central, da Nicarágua ao Panamá, e em vários países da
América do Sul, tais como: Brasil, Colômbia, Equador, Peru, Venezuela e nas
 12

Guianas (Flores, 2002). No Brasil, a espécie é encontrada nos estados do Acre,

Amazonas, Roraima, Pará e Amapá (Lorenzi, 2002). Ocorre em solos arenosos ou
argilosos, desde terras baixas até 1000 m de altitude, com precipitação média anual
variando de 2500 a 6500 mm e temperatura média anual de 22°C a 35°C. Ocorre
predominantemente em matas primárias e secundárias de terra-firme, podendo ser
encontrada em menor frequência em matas de galerias e matas de várzeas (Flores,
2002; Lorenzi, 2002).

Minquartia guianensis é uma das espécies florestais de grande valor

econômico da região Amazônica. No Brasil é conhecida popularmente como:
acariquara, acapú, acari, arariuba, aquariquara e acariquara-roxa; na Costa Rica:
manú negro; na Guiana Francesa: maka, minquar e pai-coussa rouge; na Guiana:
man wood e mincoa; no Panamá: man wood e níspero negro; no Peru: huacapú; no
Suriname: alata-udú, alata-weri e wananin; e na Venezuela: urana-u-yek (Nebel,
2001).

A acariquara é uma árvore emergente, podendo alcançar até 180 cm de DAP

(diâmetro à altura do peito) e 70 m de altura (Figura 1-A), com a copa em formato
cônico (Flores, 2002; Ankersen et al., 2005). O tronco geralmente é fenestrado e
acanalado, mas também há árvores com sapopemas e troncos não fenestrados. A
casca é marrom-acinzentada, com fissuras verticais retas e pequenas placas
oblongas (Flores, 2002).

As folhas de M. guianensis são simples, alternas com textura cartácea a

coriácea, medindo 10-16 cm de comprimento e 4-6 cm de largura; formato oblongo a
elíptico; base obtusa e arrendondada-truncada; ápice abrupto, curto e acuminado;
margem inteira; face adaxial verde-escura; face abaxial mais clara e algumas vezes
esbranquiçada (Flores, 2002).

As inflorescências, com cerca de 2 a 9 cm de comprimento, se formam nas

partes terminais dos galhos mais finos (Figura 1-B). São espigas axilares, solitárias e
simples, formadas por flores hermafroditas minúsculas de coloração creme,
distribuídas irregularmente ao longo da raque (Flores, 2002). A polinização é feita
basicamente por besouros e abelhas, sendo que há também registros de pássaros
visitando as flores de M. guianensis (Flores, 2002).
 13

O fruto é do tipo drupa monospérmica, pesando em torno de 3,5 g; com

formato elíptico ou ovalado, base e ápice arredondados (Figura 1-C). O exocarpo é
fino e membranoso, com superfície lisa, glabra, brilhosa e coloração variando
conforme a maturação (verde-escura, verde-clara, amarela até roxo-escura).
Apresenta látex abundante e gosto adstringente quando imaturo. Ao amadurecer, o
mesocarpo carnoso amolece e adquire coloração amarelada e gosto adocicado
(Flores, 2002).

O propágulo, botanicamente um pirênio, apresenta superfície marrom clara,

verrugosa e glabra, consistência lenhosa e peso médio de 1,5 g; formato elipsóide,
com base arredondada e ápice acuminado (Flores, 2002; Camargo & Ferraz, 2004).
A dispersão dos propágulos é zoocórica (Ferraz et al., 2004; Camargo & Ferraz,
2004), feita basicamente por pequenos mamíferos e mais amplamente por pássaros,
tais como os tucanos (Nebel, 2001). A predação dos frutos é alta e pode ocorrer
ainda na copa. Após a dispersão, os frutos e as sementes são predados por cutias,
cutiaras, veados, ratos (Nebel, 2001; Guariguata et al., 2002).

Além da madeira, M. guianensis também é utilizada e apreciada por

características não-madeireiras. Os cavacos, quando fervidos, produzem um corante
negro que serve para o tingimento de tecidos (Camargo & Ferraz, 2004). Algumas
populações indígenas do Equador usam a infusão da casca no tratamento de
infecções intestinais, causadas por parasitas, e contra dores musculares e irritações
cutâneas, além do uso como veneno para a pesca (Ribeiro et al., 1999). O ácido
minquartinóico mostrou ser eficiente no combate à doenças tropicais, tais como a
malária e a leishmaniose, embora ainda não se conheça estudos sobre o emprego
medicinal dessa espécie no Brasil ou sobre sua viabilidade comercial visando
utilização dos produtos não-madeireiros da espécie (Camargo & Ferraz, 2004). A
árvore também possui características ornamentais, devido ao formato do tronco e
copa, podendo ser utilizada na arborização urbana (Camargo & Ferraz, 2004).
 14

www.rain-tree.com

www.nybg.org
A B

www.rain-tree.com
maderasulamerica.galeon.com
D

Figura 1 – Indivíduo adulto de M. guianensis (A); inflorescência mostrando o

aspecto das flores de M. guianensis (B); fruto da espécie (C) e cortes de madeira
explorada de M. guianensis (D).
 15

II. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Determinar a estrutura genética e os padrões filogeográficos em populações

naturais da acariquara (M. guianensis) por meio da análise de locos microssatélites
do genoma nuclear e de polimorfismos de sequências de DNA e locos
microssatélites do genoma do cloroplasto.

Objetivos específicos

 Definir as populações de M. guianensis.

 Quantificar a diversidade genética e os níveis de diferenciação genética entre

as populações de M. guianensis

 Caracterizar e comparar os padrões de distribuição da variabilidade genética

em populações de M. guianensis.

 Determinar as relações filogeográficas entre as populações de M. guianensis.

 Gerar informações que subsidiem a implementação de estratégias de

conservação para a acariquara.
 16

III. MATERIAL E MÉTODOS

III. 1. Material Biológico e Locais de Coleta

Para as análises genéticas foram coletados indivíduos adultos de M.

guianensis provenientes de oito localidades (Figura 2 e Tabela 1) situadas na
América Central: Sarapiquí (Costa Rica) e América do Sul: Orellana (Equador);
Loreto (Peru); Urucu, AM; Tefé, AM, Manaus, AM, Porto Trombetas, PA, e Floresta
Nacional do Tapajós (Flona Tapajós), PA (Brasil).

Figura 2 – Localização das populações amostradas de M. guianensis.

As análises genéticas foram realizadas a partir de amostras de folhas, câmbio

e/ou casca coletados de 1 a 68 indivíduos adultos de M. guianensis por localidade
amostrada (Tabela 1). As amostras utilizadas foram coletadas no âmbito do projeto
SEEDSOURCE (Developing best practice for seed sourcing of planted and natural
regeneration in the Neotropics). As amostras coletadas foram acondicionadas em
recipientes contendo sílica gel e armazenadas a –20 ºC.
 17

Tabela 1 – Localidades amostradas das populações estudadas de M. guianensis.

Populações Coordenadas geográficas Nº de indivíduos

amostrados
Costa Rica (Sarapiquí) 10º 03’ 48” N - 83º 41’ 43” O 10
Equador (Orellana) 0º 40’ 30” S - 76º 22’ 52” O 36
Peru (Loreto) 4º 17’ 20” S - 72º 13’ 59” O 21
Brasil (Urucu - AM) 4º 52’ 55” S- 65º 21’ 03” O 1
Brasil (Tefé - AM) 3º 21’ 06” S - 64º 43’ 31” O 16
Brasil (Manaus - AM) 2º 57’ 37” S - 59º 57’ 32” O 68
Brasil (Porto Trombetas - PA) 1º 28’ 25” S - 53º 23’ 05” O 3
Brasil (Flona Tapajós - PA) 2º 31’ 23” S - 54º 57’ 32” O 32
Total - 187

III. 2. Extração, Quantificação e Diluição do DNA

A extração do DNA de M. guianensis foi feita utilizando-se o protocolo de

extração de tecidos vegetais CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio; Doyle & Doyle,
1987) otimizado por Ferreira & Grattapaglia (1998). O material vegetal foi macerado
utilizando-se um disruptor celular FAST PREP (Qbiogene, USA). A quantificação do
DNA extraído foi feita por comparação com padrões de massa molecular conhecida,
utilizando-se DNA do bacteriófago Lambda (50 ng, 100 ng e 200 ng de DNA) após
eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio (Ferreira &
Grattapaglia, 1998). Os géis foram analisados em transiluminador sob luz ultravioleta
e fotodocumentados. Após a quantificação, as amostras do DNA extraído foram
diluídas em água ultra-pura e padronizadas a uma concentração de 2,5 ng/ L.
 18

III. 3. Amplificação e Análise dos Locos Microssatélites do Genoma Nuclear

(ncSSR) e do Cloroplasto (cpSSR)

Para as análises genéticas foram utilizados oito locos microssatélites do

genoma nuclear previamente desenvolvidos para M. guianensis (Buonamici et al.,
2010, em preparação), bem como dez pares de oligonucleotídeos iniciadores
(primers) universais que amplificam locos microssatélites do genoma do cloroplasto
da maioria das angiospermas, os quais foram originalmente desenvolvidos para
Nicotiana tabacum (Weising & Gardner, 1999), mais quatro primers previamente
desenvolvidos para Eucalyptus globulus (Steane et al., 2005). A amplificação dos
locos ncSSR e cpSSR foi realizada via PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação
em Cadeia da Polimerase) utilizando-se um termociclador Veriti 96 Well (Applied
Biosystems Inc.) nas seguintes condições:

Desnaturação inicial a 94 ºC durante 5 minutos. Posteriormente, 30 ciclos de:

1) Desnaturação a 94 ºC durante 1 minuto;

2) Anelamento na temperatura específica de cada par de primer durante 1
minuto;
3) Extensão a 72 ºC durante 1 minuto;

No final de 30 ciclos ocorre uma extensão final a 72 ºC durante 7 minutos.

Para a amplificação dos locos ncSSR foi utilizado tampão 1X GoTaq PCR
contendo 1,5 mM MgCl2 (Promega), 200 M de cada DNTP, 3,25 g de BSA (Bovine
Serum Albumin), 0,2 M de cada primer, 20,0 ng de DNA e água purificada para um
total de 12,5 L de reação final. A amplificação dos locos cpSSR foi realizada
utilizando-se os seguintes reagentes: tampão de PCR 1X (10 mM Tris-HCl, pH 8,3,
50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2), 200 M de cada DNTP, 3,25 g de BSA (Bovine Serum
Albumin), 1 unidade de Taq polimerase , 0,4 M de cada primer, 5,0 ng de DNA e
água ultrapurificada para um total de 10 L de reação final.

Os produtos amplificados foram posteriormente analisados em gel de agarose

1,5% corado com brometo de etídio e fotodocumentados utilizando-se um
transiluminador (Vilber Loumart). Para a estimativa dos tamanhos dos produtos
 19

amplificados foi utilizado o marcador padrão Ladder 50 pb e Ladder 1 Kb plus para

os locos ncSSR e cpSSR, respectivamente.

Os produtos ncSSR e cpSSR amplificados foram quantificados e diluídos em

água ultra pura a uma concentração de 10 ng/ L e 7,5 ng/ L, respectivamente. Essa
padronização é necessária devido à presença de primers marcados com
fluorescência na reação. Os produtos ncSSR amplificados foram analisados sob
eletroforese capilar em um sequenciador automático de DNA MegaBACE 1000
(Amersham-Pharmacia). A análise foi feita por meio de sistemas multiplex de
genotipagem, que consiste na análise de vários locos SSR concomitantemente. A
marcação dos primers foi feita com os fluorocromos FAM, HEX e TAMRA para
detecção dos fragmentos amplificados, via laser, durante a realização da
eletroforese no sequenciador automático de DNA. As amostras foram preparadas da
seguinte forma: 0,6 L do PCR, 4,75 L de Tween 20 (0,1%) e 0,25 L de marcador
interno de peso molecular ET-ROX 400 (Applied Biosystems, Inc.). Os produtos
amplificados foram analisados por meio dos programas Genetic Profiler version 1.2 e
Fragment Profiler version 1.2 (GE Healthcare), para estimativa do tamanho dos
alelos.

Os locos cpSSR amplificados foram analisados sob eletroforese em gel de

poliacrilamida 5% em um sequenciador automático de DNA ABI Prism 377 (Applied
Biosystems, Inc.). A análise desses locos também foi feita por meio de sistemas
multiplex de genotipagem. Um dos primers de cada par utilizado foi previamente
marcado com um fluorocromo específico (FAM, TET, HEX). As amostras foram
preparadas da seguinte forma: 1 L do PCR previamente diluído, 1,5 L de tampão
de carregamento Loading Buffer (200 L de formamida + 40 L de tampão Blue
Dextran) e 0,5 L de marcador interno de peso molecular GeneScan N-500 TAMRA
(Applied Biosystems, Inc.). Os produtos amplificados foram analisados por meio do
programa GeneScan e Genotyper (Applied Biosystems, Inc., 1993; 1994), visando
estimar o tamanho dos alelos.
 20

III. 4. Amplificação das Regiões Não Codificadoras do cpDNA

Para as análises de polimorfismos de sequências de segmentos amplificados

de regiões não codificadoras do DNA do cloroplasto de M. guianensis, foram
inicialmente testados sete pares de iniciadores: os espaçadores intergênicos
trnL/trnF e tabE/tabF (Taberlet et al., 1991), trnH/psbA (Hamilton, 1999; Kress &
Erickson, 2007), psbB/psbF, trnS/trnG (Hamilton, 1999), atpB/rbcLl (Crayn & Quinn,
2000); e o íntron rps16 (Oxelman et al., 1997). A amplificação dessas regiões foi
realizada via PCR utilizando-se um termociclador Veriti 96 Well (Applied Biosystems
Inc.) nas seguintes condições:

Desnaturação inicial a 94 ºC durante 1 minuto. Posteriormente, 30 ciclos de:

1) Desnaturação a 94 ºC durante 1 minuto;

2) Anelamento na temperatura específica de cada par de primer durante 1
minuto;
3) Extensão a 72 ºC durante 3 minutos;

No final de 30 ciclos ocorre uma extensão final a 72 ºC durante 10 minutos.

A reação de PCR teve um volume total de 20 μL contendo tampão de PCR 1X

(10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2); 1,5 μM de cada primer; 2,5
unidades de Taq DNA polimerase; 200 μM de cada nucleotídeo (dNTP); BSA
(Bovine Serum Albumin - 2,5 mg/mL); 23,4 mM de MgCl 2; 7,5 ng de DNA e água
ultrapura.

Os produtos amplificados foram posteriormente analisados em gel de agarose

1,5% corado com brometo de etídio e fotodocumentados sob luz ultravioleta
utilizando-se um transiluminador (Vilber Loumart). Para a estimativa dos tamanhos
dos produtos amplificados foi utilizado o marcador padrão ladder 1 Kb plus.
 21

III.5. Sequenciamento e Análise dos Produtos Amplificados

III.5.1. Purificação dos Produtos da PCR

Os produtos amplificados, após a PCR contêm reagentes (em geral excesso

de primers e nucleotídeos) que não foram incorporados durante a amplificação, os
quais precisam ser retirados para que não haja interferência na reação de
sequenciamento do DNA. Assim, os produtos da PCR foram purificados utilizando-
se o kit ExoSAP IT (USB Corporation) composto das enzimas Exonuclease I
recombinante (Exo) e Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP). Para tal, foram
adicionados 2,0 μl das enzimas ExoSAP para 5 µl de produto amplificado. A
purificação foi realizada em uma temperatura de 37 ºC durante 15 minutos para ação
das enzimas e depois a 80 ºC durante 15 minutos para sua degradação utilizando-se
para tal um termociclador Veriti 96 Well (Applied Biosystems Inc.).

III. 5.2. Reação de Sequenciamento, Purificação e Sequenciamento do DNA

As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando-se o Kit Big Dye

3.1 (Applied Biosystems, Inc.) em volume total de 10 µl, seguindo as instruções do
fabricante. A Tabela 2 mostra o protocolo que foi utilizado para a realização das
reações de sequenciamento.

Tabela 2 – Protocolo de reação de sequenciamento utilizando o Kit Big

Dye 3.1 (Applied Biosystems Inc.).
Reagentes Volume (µl)
Água ultrapura 2,5
Primer (2,0 M) 1,5
Big Dye 3.1 (Applied Biosystems, Inc.) 4,0
PCR (7,5 ng/μl) 2,0
Total 10,0
 22

Após a reação de sequenciamento foi realizada a purificação dos produtos

para retirada de reagentes não incorporados. Para tal, fez-se a precipitação dos
reagentes não-incorporados utilizando-se uma solução de Acetato de Sódio/EDTA
(3M Acetato de Sódio com pH 5.2; 125 mM EDTA com pH 8.0) e Etanol 100%. Após
a purificação, os produtos da reação de sequenciamento foram re-suspensos em
tampão de carregamento composto por quatro partes de formamida para uma parte
de tampão de carregamento (Loading Buffer), desnaturados a 95ºC durante dois
minutos e analisados sob eletroforese em gel de poliacrilaminda 5% em
sequenciador de DNA ABI 377 (Applied Biosystems Inc.).

III. 6. Análise dos Dados

III. 6. 1. Diversidade e Estrutura Genética das Populações

A estruturação da variabilidade genética das populações de M. guianensis foi

analisada, para o conjunto de dados microssatélites do ncDNA, por meio de análise
Bayesiana implementada pelo programa Structure (Pritchard et al., 2000; disponível
em: http://www.pritch.bsd.uchicago.edu/software/structure2p1.html). Este programa
permite apenas a análise a partir de dados de genoma diplóide. Essa análise
considera a separação do número total de indivíduos em agrupamentos (clusters),
atribuindo-os um número K de populações e assumindo que há equilíbrio de Hardy -
Weinberg e ausência de desequilíbrio de ligação entre os locos analisados dentro de
cada população. Dessa forma, são definidas as populações às quais pertencem os
indivíduos, não sendo necessária uma informação anterior sobre sua localidade de
origem. O modelo utilizado para esta análise foi o admixture model, onde cada
amostra pode ter ancestrais de mais de uma população.

Os seguintes parâmetros de diversidade genética foram estimados para cada

população e loco microssatélite do genoma nuclear (ncSSR), e a média para todas
as populações e locos analisados em conjunto: número de alelos (A E),
heterozigosidade observada (HO) e heterozigosidade esperada (HE), utilizando-se o
programa GenAlEx 6.0 (Peakall & Smouse 2005). Também foram estimados os
coeficientes de endocruzamento FIS (Weir & Cockerham, 1984) para cada população
 23

e a média considerando todas as populações, utilizando o mesmo programa.

Valores positivos de FIS indicam endocruzamento (excesso de homozigotos) ou
alelos nulos indetectados, por outro lado, valores negativos indicam excesso de
heterozigotos. Valores próximos de zero são esperados em uma situação de
cruzamento aleatório (Hartl & Clark, 1997).

Para os dados de cpSSR, os parâmetros de diversidade genética estimados

foram: número efetivo de alelos (AE) e o coeficiente de diversidade genética de Nei
(HE; Nei 1987), utilizando-se o programa ARLEQUIN (Schneider et al., 2001).

Para determinar os padrões de distribuição da variabilidade e diferenciação

genética entre as populações de M. guianensis foram realizadas três análises de
variância molecular (AMOVA) utilizando-se o programa ARLEQUIN, sendo uma para
os dados de ncSSR, outra para os locos cpSSR, e a terceira para os dados de
sequência do cpDNA. Na AMOVA foi estimado o parâmetro de diferenciação
genética entre as populações (Weir and Cockerham, 1984). A significância de foi
testada por um teste de permutação não-paramétrico (Excoffier et al., 1992). Além
do índice FST de Wright foi também estimado o índice R ST (Slatkin, 1995) de
diferenciação genética entre as populações de M. guianensis, utilizando o programa
Spagedi (Hardy & Vekemans, 2002; disponível gratuitamente no site:
http://www.ulb.ac.be/sciences/lagev/spagedi.html). Para os dados de ncSSR
também estimou-se as taxas de fluxo gênico entre as populações de M. guianensis
por meio do cálculo do número de migrantes, utilizando a fórmula Nm =(1/FST -1)/4
(Whitlock & McCauley, 1999) e pelo número absoluto de migrantes assumindo que
M=2Nm, como implementado no programa ARLEQUIN.

Buscando inferir sobre a influência de possíveis barreiras geográficas no fluxo

gênico entre as populações, foi feita uma análise que utiliza métodos de regressão e
autocorrelação espacial implementada pelo programa Barrier version 2.2 (Manni et
al., 2004). Os testes possibilitam identificar onde há taxas abruptas de variação
genética entre indivíduos. Dessa forma, uma análise de geometria computacional é
empregada buscando evidenciar os locais e as direções das barreiras. A análise é
baseada em médias de análises de matrizes com bootstrap. Como resultado é
 24

possível visualizar o ruído associado a marcadores genéticos em um mapa e as

áreas onde as prováveis barreiras genéticas mais robustas são encontradas.

A hipótese de isolamento por distância foi avaliada por meio do teste de

Mantel (Mantel, 1967) no qual considerou-se a relação entre distância genética de
Nei e distância geográfica (em Km) entre os pares de populações de M. guianensis,
para os conjuntos de dados de microssatélites do núcleo e cloroplasto. Para tal foi
utilizado o programa GenAlEx 6.0 (Peakall & Smouse 2005).

III. 6. 2. Análises Filogeográficas

As análises filogeográficas foram realizadas considerando os conjuntos de

dados microssatélites e de sequências do cpDNA. Para ambos os conjuntos de
dados foram determinados os números de haplótipos observados.

As seqüências de DNA obtidas foram inicialmente analisadas no programa

Sequencing Analysis 3.4.1 (Applied Biosystems Inc.), editadas no programa
ChromasPro (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) e alinhadas por meio
do programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997) e do programa BioEdit (Hall,
1999).

As relações entre os haplótipos detectados foram determinadas por meio de

uma análise de rede “network” utilizando o algoritmo “Median-Joining” (Bandelt et al.,
1999) implementada pelo programa NETWORK (Fluxus Technology Ltd. At
www.Fluxus-engineering.com; Forster et al., 2000). Foram realizadas duas análises
de rede sendo uma para os dados dos locos cpSSR e outra para as sequências das
regiões não codificadoras do cpDNA. A árvore de haplótipos gerada utiliza um
critério de máxima parcimônia. Devido à persistência de haplótipos ancestrais dentro
de espécies e à possibilidade de ocorrência de variantes mutacionais para um dado
haplótipo em filogenias intraespecíficas, árvores não-enraizadas são mais confiáveis
como figuras representativas de relações de haplótipos no nível intraespecífico do
que árvores bifurcadas (Posada & Crandall, 2001).
 25

IV. RESULTADOS

IV. 1. Extração do DNA

A extração do DNA genômico total a partir de folhas e câmbio de indivíduos

adultos de M. guianensis foi realizada com sucesso, usando o método CTAB (Doyle
& Doyle, 1987) modificado por Ferreira & Grattapaglia (1998). Na Figura 3 observa-
se a qualidade e quantidade do DNA extraído a partir das folhas e câmbio de 11
indivíduos de M. guianensis.

L1 L2 L3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Figura 3 - Quantificação do DNA extraído a partir de folhas e câmbio de 11

indivíduos de M. guianensis utilizando o método de extração de DNA CTAB, em gel
de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. As colunas L1, L2 e L3 do gel
referem-se aos marcadores de massa molecular fago Lambda (λ) com 50, 100 e 200
ng, respectivamente. As subsequentes colunas do gel referem-se ao DNA extraído
de 11 amostras de folhas (colunas 1 a 8) e câmbio (colunas 9 a 11) de M.
guianensis.

Além disso, foi testada pela primeira vez a extração do DNA genômico total a
partir da casca de M. guianensis. Foi extraído o DNA da casca de um total de dez
indivíduos de M. guianensis. O resultado é apresentado na Figura 4, onde é possível
observar a qualidade da extração do DNA dessa nova fonte de material genético, o
qual apresentou 60% de sucesso (foi possível extrair DNA de qualidade de seis das
dez amostras testadas).
 26

L1 L2 L3 1 2 3 4 5 6

Figura 4 - Quantificação do DNA extraído a partir da casca de seis indivíduos de M.

guianensis utilizando o método de extração de DNA CTAB, em gel de agarose 1,5%
corado com brometo de etídio. As colunas L1, L2 e L3 do gel referem-se aos
marcadores de massa molecular fago Lambda (λ) com 50, 100 e 200 ng,
respectivamente. As subsequentes colunas do gel referem-se ao DNA extraído de
seis amostras de M. guianensis.

IV. 2. Diversidade e Estrutura Genética de Populações da Acariquara

IV.2.1. Microssatélites do genoma nuclear (ncSSR)

Para as análises genéticas dos locos ncSSR foram utilizadas cinco

populações de M. guianensis: Sarapiquí – Costa Rica (N= 11), Orellana – Equador
(N= 20), Loretto – Peru (N= 36), Tefé – AM (N= 16) e Manaus – AM (N= 68). Todos
os oito locos do ncDNA previamente desenvolvidos para M. guianensis (Buonamici
et al., 2010, em preparação) tiveram suas condições de amplificação otimizadas. Na
Tabela 3 são apresentadas as sequências nucleotídicas dos pares de primers SSR,
as unidades de repetição (motif) de cada microssatélite, o número de alelos, as
temperaturas de anelamento e as estimativas dos tamanhos dos alelos encontrados
por loco, considerando as cinco populações analisadas. Na Figura 5 são observados
os produtos da PCR otimizados para os oito locos microssatélites amplificados para
três indivíduos de M. guianensis em gel de agarose 1,5% corado com brometo de
etídio.

Na Figura 6 são apresentados eletroferogramas mostrando diferentes alelos

oriundos da amplificação de oito locos microssatélites do ncDNA de M. guianensis.
Nota-se a clara diferenciação entre indivíduos heterozigotos (dois alelos) e
homozigotos (um alelo) para os locos analisados.
 27

Tabela 3 – Características dos locos ncSSR isolados de M. guianensis. Ta =

temperatura de anelamento dos primers. pb= pares de base.
Estimativa do
Repetições Nº de Ta
Primer Sequência do primer 5’ → 3’ tamanho dos
(motif) Alelos* (ºC)*
alelos (pb)*
ATCGATATATCCGAGGGTTT 179-230
Min17 (CGG)8 11 50 ºC
GAGCTCGAACAATAGGTCTG 179-239
TATTGTTTTGAGGGGAAAAA 160-176
Min19 (GA)10 8 50 ºC
CATGGAAAAGGAGTGTGAAC 160-178
AACGTTCTATTTGGCAGCTA 213-281
Min26 (GA)15 23 50 ºC
TGTCAATGTATTGCTTGCTT 213-283
TAAATCAATGGCCTCATTTC 99-138
Min27 (GGT)9 16 50 ºC
CTATACCACCCCACCTACAA 99-177
GGTCAACAAAGGGGTGTTAG 179-211
Min56 (CATA)10 11 50 ºC
GGGTGAGGTTGTGTATGTGT 195-223
TGCAGCTGGTAACAGAAAAT 95-131
Min62 (GA)14 21 50 ºC
AATGGAAAGCTTGATTACCC 95-147
ATCTGCCAGCTCGTCATC 139-175
Min71 (GGC)7(GGT)7 15 50 ºC
ATGCGAGTCGATCATGTAAA 139-184
GCATGTGTGTGTTTTGACTG 157-171
Min91 (GA)6GGAA(GA)9 23 50 ºC
TAACACGCATCAAGGTGACT 171-207

* Resultados baseados nos dados gerados da dissertação.

250 pb
200 pb
150 pb
100 pb

Figura 5 - Fragmentos amplificados referentes a oito locos ncSSR de M. guianensis

em gel de agarose 2%. A coluna L refere-se ao marcador Ladder 50 pb. As colunas
subsequentes referem-se ao DNA amplificado de três indivíduos para cada um dos
locos microssatélites.
 28

Min17 Min19

Min26 Min27

Min56 Min62

Min71 Min91

Figura 6 - Eletroferogramas mostrando a diversidade de alelos observada a partir da

amplificação de oito locos ncSSR de M. guianensis. Cada pico indica um alelo. Os
tamanhos dos alelos encontram-se indicados na barra inferior em pares de bases.
 29

Para o conjunto dos oito locos ncSSR foram encontrados 128 alelos. O
número de alelos observados em cada loco variou de oito a 23 (média= 16 alelos por
loco). Os tamanhos dos alelos variaram entre 95 pb (loco Min62) e 283 pb (loco
Min26; Tabela 3; Figura 7). Os padrões de distribuição de frequências dos alelos são
apresentados na Figura 7. Nota-se que para a maioria dos locos há três ou quatro
alelos mais frequentes.

Figura 7 – Distribuição das frequências alélicas observadas para oito locos ncSSR,
em cinco populações de M. guianensis. Eixo X: alelos encontrados para cada um dos
locos. Eixo Y: frequência alélica.
 30

A análise bayesiana implementada pelo programa Structure evidenciou a

diferenciação genética dos indivíduos de M. guianensis em cinco grupos distintos
(Figura 9), a qual é corroborada pela análise de K (K representa o número de
populações identificadas; Figura 8). A análise implementada pelo programa
Structure revelou que os cinco agrupamentos encontrados correspondem às cinco
populações de M. guianensis amostradas nas cinco localidades.

Figura 8 – Correlação entre os valores de delta K

e K para as populações de M. guianensis.

Figura 9 – Estrutura genética de populações de M. guianensis por meio de análise

baeysiana implementada pelo programa Structure utilizando oito locos ncSSR. Os
indivíduos são representados por linhas verticais. As cores e números representam
os agrupamentos baseados em semelhanças genotípicas.
 31

A distribuição da variabilidade genética dentro e entre as populações, inferida

por meio da Análise de Variância Molecular (AMOVA) com base nos locos ncSSR é
apresentada na Tabela 4. A maior parte da variação genética encontrada é
explicada pela variação contida dentro das populações, representando 68,79% da
variação encontrada, enquanto que a diferenciação genética entre as populações foi
de 31,21%. Resultados similares também foram encontrados para os índices de
diferenciação genética RST (0,35; Tabela 5).

Tabela 4 – Distribuição da variabilidade genética de M. guianensis pela análise de

variância Molecular (AMOVA), com base na análise de oito locos ncSSR.
Soma dos Porcentagem de
Fonte de variação g. l.
quadrados variação
Entre populações 4 110.096 31.21
Dentro das
297 324.437 68.79
populações
Total 301 434.533 -
Índice de fixação (FST): 0.31213. P = 0.00001 Testes de significância: (1023
permutações).

As estimativas de diversidade genética total (H T) foram altas para todos os

locos analisados (Tabela 5), variando de 0,64 (Min19) a 0,91 (Min91). As
heterozigosidades observadas (HO) e esperadas (HE) foram altas para a maioria dos
locos sendo os menores valores encontrados para o loco Min19. Os valores de HO
foram menores que os valores de HE em todos os locos, com exceção dos locos
Min27 (população de Tefé – AM) e Min62 (Sarapiquí – Costa Rica e Orellana -
Equador). Os valores de HO foram significativamente diferentes dos de H E para dois
locos da população de Sarapiquí – Costa Rica e Tefé – AM, cinco locos para a
população de Orellana – Equador, seis para Loreto – Peru e para todos os oitos
locos de Manaus – AM (Tabela 5). Os valores de F IS variaram de 0,06 (Min62) a 0,48
(Min19), média de 0,25 (todos os locos). Os locos Min17, Min19, Min26, Min71e
Min91 foram os que apresentaram elevados valores de F IS, indicando endogamia
(Tabela5).
 32

Tabela 5 – Índices de diversidade genética, coeficiente de endogamia e diferenciação genética para oito locos ncSSR de
M. guianensis. A: número de alelos; HO: heterozigosidade observada; HE: heterozigosidade esperada; FST: índice de diferenciação
genética baseada na identidade alélica; RST: índice de diferenciação genética baseada no tamanho dos alelos; HT: diversidade
gênica total; FIS: coeficiente de endogamia. Equilíbrio de Hardy-Weinberg – HE significantemente diferente de HO: * = p < 0,05; ** =
p < 0,01; *** = p < 0,001
Medidas de
População f Min17 Min19 Min26 Min27 Min56 Min62 Min71 Min91 Todos os locos
diversidade
A 2 2 7 5 4 8 3 5 36
Sarapiquí – Costa
HO 0.00 0.11 0.75 0.27 0.44 0.89 0.22 0.67 0.42
Rica 0.26
HE 0.23** 0.11 0.84 0.41 0.78 0.83 0.39* 0.93 0.57
(N=11)
FST 0.17 0.42 0.12 0.37 0.37 0.15 0.30 0.16 0.32
A 6 2 16 8 6 17 10 16 81
Orellana - Equador HO 0.50 0.19 0.59 0.78 0.71 0.94 0.68 0.77 0.64
0.12
(N=20) HE 0.70*** 0.30* 0.69** 0.79 0.68 0.92 0.83** 0.90*** 0.73
FST 0.16 0.41 0.13 0.36 0.37 0.14 0.29 0.16 0.31
A 9 10 9 12 7 12 11 12 65
Loreto - Peru HO 0.47 0.30 0.33 0.30 0.65 0.74 0.82 0.47 0.51
0.31
(N=36) HE 0.84*** 0.59*** 0.88*** 0.40* 0.80 0.89** 0.88*** 0.79** 0.76
FST 0.16 0.40 0.12 0.37 0.37 0.14 0.29 0.16 0.31
A 4 3 14 5 3 5 5 6 45
Tefé - AM HO 0.33 0.13 0.77 0.73 0.13 0.50 0.40 0.43 0.43
0.16 HE 0.59 0.13 0.94 0.66* 0.13 0.70 0.74* 0.63 0.57
(N=16)
FST 0.16 0.42 0.12 0.36 0.38 0.15 0.29 0.16 0.32
A 8 6 9 9 6 13 7 17 75
Manaus - AM HO 0.49 0.12 0.15 0.31 0.40 0.60 0.33 0.62 0.38
0.36
(N=68) HE 0.79*** 0.56*** 0.74*** 0.44*** 0.43*** 0.67*** 0.48*** 0.78*** 0.61
FST 0.16 0.40 0.12 0.37 0.37 0.15 0.30 0.16 0.31
RST 0.21 0.23 0.29 0.27 0.47 0.24 0.59 0.39 0.35
Média
0.26 HT 0.82 0.64 0.85 0.76 0.75 0.86 0.82 0.91 0.80
FIS 0.41 0.48 0.36 0.09 0.14 0.06 0.24 0.23 0.25
P = 0.00001 Testes de significância: (1023 permutações).
 33

Os índices de diferenciação genética (F ST) estimado entre os pares de

populações de M. guianensis foram altos (Tabela 6). Os menores valores
encontrados ocorreram entre as populações Sarapiquí – Costa Rica e Loreto – Peru
(0,05) e entre as populações de Orellana – Equador e Loreto – Peru (0,18). Os
maiores valores de FST foram encontrados entre as populações de Sarapiquí – Costa
Rica e Tefé – AM (0,92) e entre Manaus – AM e Tefé AM (0,80). Os resultados
encontrados para diferenciação genética entre as populações foram corroborados
pelas taxas de fluxo gênico estimadas (valores de M; Tabela 6).

Tabela 6 – Matriz de divergência correlacionando F ST (diagonal abaixo) e fluxo

gênico (M= 2Nm; diagonal acima) entre as populações de M. guianensis,
considerando oito locos ncSSR.
Sarapiquí – Orellana- Loreto – Tefé - Manaus -
Costa Rica Equador Peru AM AM
Sarapiquí –
- 1.60 10.46 0.54 1.47
Costa Rica
Orellana -
0.31 - 2.78 2.37 0.96
Equador
Loreto – Peru 0.05 0.18 - 1.14 1.09

Tefé - AM 0.92 0.21 0.44 - 0.63

Manaus - AM 0.34 0.52 0.46 0.80 -

A Figura 10 mostra a análise de componentes principais (PCA) implementado

pelo programa GenAlEx. Esta análise permite encontrar e traçar padrões em um
conjunto de dados multivariados. A figura mostra uma clara separação dos
indivíduos da população de Manaus – AM em relação às demais populações.
Também é possível distinguir na população de Manaus, a existência de dois sub-
grupos. Para as demais populações, a análise PCA não evidenciou padrões claros
de separação das populações.
 34

Figura 10 – Análise de componentes principais (PCA) com base na análise da

variabilidade genética contida em oito locos do ncSSR para cinco populações de M.
guianensis.

A análise referente à relação entre fluxo gênico e barreiras genéticas entre

populações de M. guianensis utilizando o programa Barrier revelou que as
populações apresentam-se em um contínuo, em concordância com a distribuição
geográfica da espécie (Figura 11). A população de Sarapiquí – Costa Rica
apresenta-se mais isolada em relação às demais populações (presença de uma forte
barreira genética). Existem fortes “barreiras genéticas” separando as populações de
Loreto – Peru e Manaus – AM das populações de Orellana – Equador e Tefé – AM.
Com base nos resultados, a população de Loreto – Peru apresenta uma baixa
interação com as populações de Orellana – Equador e Tefé – AM. Estas duas, por
sua vez, apresentam uma “barreira” ao fluxo gênico considerada moderada entre
elas, embora geograficamente sejam mais distantes em relação à população de
Loreto - Peru. No entanto, não existe um forte suporte de bootstrap para apoiar tal
resultado. Por fim, a população de Manaus – AM apresenta uma baixa interação
com a população de Tefé – AM.
 35

Figura 11 – Inferências sobre fluxo gênico entre populações

de M. guianensis, por meio de análise implementada pelo
programa Barrier. As linhas vermelhas representam as
barreiras genéticas existentes. Quanto mais grossas mais
fortes são as barreiras genéticas entre as populações. As
setas indicam o sentido das interações genéticas. Os
números representam os valores de bootstrap.

A Tabela 7 apresenta a matriz que correlaciona as distâncias genéticas de

Nei e distâncias geográficas em Km, par a par, entre as populações de M.
guianensis. Enquanto que na Figura 12 apresentada o resultado desta correlação,
utilizando o teste de Mantel implementado pelo programa GenAlEx. O teste de
Mantel testa a significância da correlação entre estas duas variáveis. Apesar de o
resultado de p obtido ser significativo (p= 0,01), o coeficiente de correlação
encontrado é considerado muito baixo (r= 0,1927), indicando que apenas 19% dos
dados apresentam correlação direta entre distância genética e distância geográfica.
 36

Tabela 7 - Matriz de correlação entre distâncias genéticas de Nei (abaixo da

diagonal) e distâncias geográficas em Km (acima da diagonal) entre as populações
de M. guianensis, analisadas par a par.
Populações Costa Rica Equador Peru Tefé - AM Manaus - AM
Costa Rica – 1375,0 2400,0 2440,0 2425,0
Equador 20,7 – 468,4 1451,6 1941,2
Peru 19,0 18,1 – 910,0 1490,2
Tefé – AM 23,0 18,1 20,8 – 492,3
Manaus – AM 22,2 20,8 21,7 22,9 –

25
Distância genética de Nei

20

15

10

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Distância geográfica (Km)

Figura 12 - Relação entre distância genética de Nei e distância geográfica (Km)

para cinco populações M. guianensis, analisadas par a par, com base na variação
observada em oito locos ncSSR.
 37

IV.2.2. Microssatélites do genoma do cloroplasto (cpSSR)

A transferabilidade dos primers cpSSR, desenvolvidos para o tabaco (Weising

& Gardner, 1999), foi realizada com sucesso para M. guianensis. Foram otimizadas
as condições de amplificação de dez dos 14 pares de primers testados, sendo eles:
emcrc67, emcrc74, ccmp1, ccmp2, ccmp3, ccmp4, ccmp5, ccmp6, ccmp7 e ccmp10.
Na Tabela 8 são apresentadas as sequências nucleotídicas, regiões do genoma
amplificado, temperaturas de anelamento otimizadas, número de alelos e
estimativas do tamanho dos fragmentos para cada um dos pares de primers
utilizados. A Figura 13 mostra os produtos da amplificação de quatro indivíduos de
M. guianensis para os dez locos cpSSR otimizados, em gel de agarose 1,5% corado
com brometo de etídio.

Os dez locos cpSSR analisados apresentaram polimorfismos, considerando o

total de 139 indivíduos de M. guianensis analisados pertencentes às seis populações
amostradas: Sarapiquí – Costa Rica (N= 10), Orellana – Equador (N= 30), Loreto –
Peru (N= 21), Tefé – AM (N= 16), Manaus – AM (N= 30) e Flona Tapajós – PA (N=
32). No total foram observados 51 alelos para os dez locos cpSSR analisados nas
seis populações de M. guianensis. O número de alelos observados por loco variou
de 3 a 6 (Tabelas 8). O número médio de alelos encontrados por população foi de
5,1.

A Figura 14 mostra eletroferogramas ilustrando alelos observados para os dez

locos microssatélites do cpDNA nas populações analisadas de M. guianensis. Uma
vez que os locos microssatélites analisados encontram-se no genoma do
cloroplasto, que apresenta herança materna, apenas um alelo pode ser observado
por loco analisado. Dessa forma a análise combinada dos locos permitiu a definição
dos haplótipos encontrados com base na variação alélica. As cores dos picos nos
gráficos representam as fluorescências dos primers cpSSR marcados (Figura 14).
 38

Tabela 8 – Características dos dez locos cpSSR analisados para M. guianensis. Ta=
temperatura de anelamento dos primers. pb= pares de base.
Estimativa dos
Locus Região Nº de Ta
tamanhos dos
SSR Sequência 5’ → 3’ amplificada Alelos* (ºC)*
alelos (pb)*

CATCCTCAAATCCGTCCT atpF-atpH
emcrc67 5 56 ºC 236 - 241
TATTGCTTAGTCTGGCTTTTATG intergenic

GGCCGTGTACGAGAAGTCAA trnT-psbD
emcrc74 3 56 ºC 125 - 128
CCAAGGGCTATAGTCATAGTGATCC intergenic
GGCCGTGTACGAGAAGTCAA
ccmp1 trnK 5 56 ºC 125 - 131
CCAAGGGCTATAGTCATAGTGATCC

GATCCCGGACGTAATCCTG
ccmp2 5’ para trnS 6 56 ºC 220 - 228
ATCGTACCGAGGGTTCGAAT

CAGACCAAAAGCTGACATAG
ccmp3 trnG íntron 4 56 ºC 106 - 109
GTTTCATTCGGCTCCTTTAT
AATGCTGAATCGAYGACCTA
ccmp4 atpF íntron 6 56 ºC 116 - 121
CCAAAATATTBGGAGGACTCT
TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT
ccmp5 3’ para rps2 6 56 ºC 102 - 107
AGGTTCCATCGGAACAATTAT
CGATGCATATGTAGAAAGCC ORF 77-
ccmp6 5 58 ºC 99 - 103
CATTACGTGCGACTATCTCC ORF 82

CAACATATACCACTGTCAAG atpB-rbcL
ccmp7 6 56 ºC 132 - 140
ACATCATTATTGTATACTCTTTC intergênico

TTTTTTTTTAGTGAACGTGTCA
ccmp10 rpl2-rps19 5 56 ºC 102 - 108
TTCGTCGDCGTAGTAAATAG

* Resultados baseados nos dados gerados na dissertação.

 39

L 1 2 3 4 L 1 2 3 4
A B

300pb
200pb 200pb

100pb

C D

300pb
200pb
200pb

100pb

E F

200pb 200pb

100pb 100pb

G H

200pb 200pb

100pb
100pb

I J

200pb
200pb

100pb 100pb

Figura 13 – Produtos referentes à amplificação de dez locos cpSSR analisados

para quatro indivíduos de M. guianensis: (A) emcrc67, (B) emcrc74, (C) ccmp1,
(D) ccmp2, (E) ccmp3, (F) ccmp4 (G) ccmp5, (H) ccmp6, (I) ccmp7, (J) ccmp10,
em gel de agarose 3%. A coluna L refere-se ao marcador Ladder 1Kb plus. As
colunas subsequentes referem-se ao DNA amplificado.
 40

A F

B G

C H

D I

E J

Figura 14 – Eletroferogramas mostrando os alelos amplificados a partir da análise

de dez locos cpSSR para diferentes indivíduos de M. guianensis. Cada pico indica
um alelo. Os tamanhos dos alelos encontram-se indicados na barra superior, em
pares de bases. A) emcrc67; B) emcrc74; C) ccmp1; D) ccmp2; E) ccmp3; F)
ccmp4; G) ccmp5; H) ccmp6; I) ccmp7; J) ccmp10.

Os valores de diversidade genética de Nei (He, Nei, 1987) variaram entre

0,08 e 0,34. A diversidade genética média total foi de 0,29 para todas as populações
analisadas conjuntamente (Tabela 9).

Tabela 9 – Índices de diversidade genética em populações de M. guianensis com

base na análise de dez locos cpSSR. HE: diversidade genética (Nei, 1987).
Nº de locos Nº de Nº de
População HE
polimórficos Alelos Haplótipos
Sarapiquí – Costa Rica 2 12 4 0.082
Orellana – Equador 10 29 27 0.345
Loreto – Peru 7 23 16 0.296
Tefé – AM 10 21 12 0.290
Manaus – AM 9 27 31 0.327
Flona Tapajós - PA 10 27 27 0.323
Média - - - 0.295
Testes de significância: (1023 permutações). P = 0.00001.
 41

A Tabela 10 mostra a distribuição da variabilidade genética nos locos cpSSR,

dentro e entre as populações, inferidas por meio de uma análise de variância
molecular (AMOVA) considerando todas as populações. A maior parte da variação
genética encontrada pode ser explicada pela variação contida dentro das
populações, representando 63,98% da variação encontrada, enquanto que a
diferenciação genética entre as populações foi de 36,02%.

Tabela 10 – Distribuição da variabilidade genética de M. guianensis pela Análise de

Variância Molecular (AMOVA) para dez locos cpSSR.
Porcentagem de
Fonte de variação g. l. Soma dos quadrados
variação
Entre populações 5 104.472 36.02
Dentro das populações 133 202.788 63.98
Total 138 307.360
Índice de fixação - FST: 0.36018. P = 0.00001 Testes de significância: (1023
permutações)

Na Tabela 11 é apresentada a matriz que correlaciona as distâncias

genéticas de Nei e distâncias geográficas em Km, par a par, entre as populações de
M. guianensis. Na Figura 15 é apresentada a correlação entre estas distâncias
utilizando o teste de Mantel implementado pelo programa GenAlEx. O teste de
Mantel testa a significância da correlação entre estas duas variáveis. O coeficiente
de correlação r observado foi 0,1054 e a probabilidade p foi 0,01. Este resultado
indica que não há relação direta entre distância genética e distância geográfica,
rejeitando a hipótese de isolamento por distância entre as populações de M.
guianensis.
 42

Tabela 11 - Matriz de correlação entre distâncias genéticas de Nei (abaixo da

diagonal) e distâncias geográficas em Km (acima da diagonal) entre as populações
de M. guianensis, analisadas par a par.
Costa Tefé - Manaus - Flona
Populações Equador Peru
Rica AM AM Tapajós - PA
Costa Rica – 1375,0 2400,0 2440,0 2425,0 2975,9
Equador 8,3 – 468,4 1451,6 1941,2 2492,3
Peru 8,4 7,6 – 910,0 1490,2 2041,3
Tefé – AM 12,2 13,6 12,2 – 492,3 1043,2
Manaus – AM 9,1 10,4 11,4 13,1 – 550,9
Flona
47,3 46,3 46,4 41,4 44,5 –
Tapajós - PA

50
Distância genética de Nei

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
Distância geográfica (Km)

Figura 15 - Relação entre distância genética de Nei e distância geográfica (Km)

para seis populações M. guianensis, analisadas par a par, com base na variação
observada em dez locos cpSSR.
 43

IV.2.3. Sequências de Regiões Não Codificadoras do cpDNA

Foram otimizadas as condições de amplificação de quatro dos sete pares de

primers testados que amplificam regiões não codificadoras do cpDNA. As
temperaturas ótimas de anelamento, os tamanhos estimados dos fragmentos
amplificados para M. guianensis e as referências de literatura para cada um dos
pares de primers utilizados são apresentados na Tabela 12. A Figura 16 mostra os
fragmentos amplificados, após otimização das condições da PCR, para quatro
regiões não-codificadoras do cpDNA de M. guianensis, em gel de agorose 1,5%
corado com brometo de etídio.

Para a escolha dos marcadores mais informativos (polimórficos) foi feita uma
análise preliminar na qual foram sequenciadas regiões não codificadoras do cpDNA
para seis indivíduos de M. guianensis pertencentes a três populações (Sarapiquí –
Costa Rica, Orellana – Equador e Loreto – Peru) utilizando somente o primer
forward para os quatro pares de primers otimizados.

Tabela 12 – Características dos quatro marcadores de sequências não codificadoras

do cpDNA utilizadas para amplificação dessas regiões em M. guianensis. Ta =
temperatura de anelamento; pb= pares de bases.

Estimativa do
Região
Seqüência nucleotídica (5' 3') Ta (ºC)* tamanho dos Referência
cpDNA
fragmentos (pb)*

trnH ACTGCCTTGATCCACTTGGC Hamilton,

56 600
psbA CGAAGCTCCATCTACAAATGG 1999
trnS GCCGCTTTAGTCCACTCAGC Hamilton,
57 600
trnG GAACGAATCACACTTTTACCAC 1999
trnL CGAAATCGGTAGACGCTACG Taberlet et
56 800
trnF GGGGATAGAGGGACTTGAAC al., 1991
psbB GTTTACTTTTGGGCATGCTTCG Hamilton,
63 850
psbF CGCAGTTCGTCTTGGACCAG 1999
* Resultados baseados nos dados gerados da dissertação.
 44

L 1 2 3 4 5 6 L 1 2 3 4 5 6

650pb 650pb
500pb 500pb

A B
L 1 2 3 4 5 6 L 1 2 3 4 5 6

850pb

850pb

C D

Figura 16 – Otimização das condições de amplificação de quatro regiões não

codificadoras do cpDNA de M. guianensis utilizando os pares de primers trnH/psbA
(A), trnS/trnG (B), trnL/trnF (C) e psbB/psbF (D) em gel de agarose 1,5% corado
com brometo de etídio. A coluna L do gel refere-se ao marcador 1Kb plus. Nas
colunas subsequentes são reveladas seis amostras do DNA amplificado de M.
guianensis.

Apenas as regiões intergênicas trnL/trnF e psbB/psbF do cpDNA de M.

guianensis apresentaram polimorfismos. Observou-se a presença de polimosfimos
do tipo substituições bem como indels (inserções e deleções).

Na Figura 17 são apresentados eletroferogramas obtidos a partir do

sequenciamento da região trnL/trnF de dois indivíduos que apresentaram haplótipos
diferentes, um da população de Sarapiquí – Costa Rica e outro da população de
Orellana – Equador, nos quais observa-se uma substituição do tipo transição.
 45

Figura 17 – Eletroferogramas mostrando parte da sequência nucleotídica da região

trnL/trnF para dois indivíduos de M. guianensis. As setas indicam uma substituição
do tipo transição (A-G) nas duas sequências.

No total foram sequenciados dez indivíduos de M. guianensis de cada uma

das populações: Sarapiquí – Costa Rica, Orellana – Equador, Loreto – Peru, Tefé –
AM, Manaus – AM; oito indivíduos da Flona Tapajós – PA; dois indivíduos de Porto
Trombetas – PA; e um indivíduo de Urucu – AM, obtendo-se 61 sequências para
cada uma das regiões intergênicas trnL/trnF e psbB/psbF, analisadas em ambos os
sentidos (forward e reverse), totalizando 122 sequências. As localidades Porto
Trombetas – PA e Urucu – AM foram utilizadas apenas para análises utilizando-se
sequências do cpDNA devido ao baixo número amostral.

As sequências das regiões trnL/trnF e psbB/psbF apresentaram

comprimentos de 477 e 624pb, respectivamente, totalizando 1101pb. As proporções
de bases nucleotídicas encontradas para as sequências trnL/trnF foram: T: 26,5%,
C: 15,5%, A: 39,7% e G: 18,3%, e para as sequências da região psbB/psbF foram:
T: 33%; 18.1%; 30.7%; 18.3%. As sequências trnL/trnF apresentaram seis sítios
polimórficos, sendo quatro de substituições nucleotídicas e duas de indels. Enquanto
 46

que para as sequências psbB/psbF foram detectados quatro sítios polimórficos,

sendo dois deles relacionadas a substituições e os outros dois a indels. A Figura 18
mostra as substituições nucleotídicas observadas entre diferentes indivíduos de M.
guianensis para a região trnL/trnF (Figura 18 – A) e uma inserção de nove pb na
região psbB/psbF em três indivíduos analisados da população de Iquitos – Peru
(Figura 18 – B).

Figura 18 – Polimorfismos de sequências de DNA das regiões trnL/trnF (A) e

psbB/psbF (B) do cpDNA de M. guianensis. A) Duas substituições nucleotídicas (G-
A e C-T); B) inserção de nove pb.

A Tabela 13 mostra a distribuição da variabilidade genética observada, por

meio da AMOVA, dentro e entre populações de M. guianensis, para duas regiões
não codificadoras do cpDNA. A maior parte da variação genética encontrada pode
ser explicada pela variação contida dentro das populações (71,67%).
 47

Tabela 13 – Distribuição da variabilidade genética em populações de M. guianensis

pela Análise de Variância Molecular (AMOVA), com base na análise das regiões
intergênicas trnL/trnF e psbB/psbF do cpDNA.
Soma dos Porcentagem de
Fonte de variação g. l.
quadrados variação
Entre populações 7 14.698 28.33

Dentro das populações 53 28.400 71.67

Total 60 43.098
Índice de fixação - FST: 0.28335. P = 0.00000 Testes de significância: (1023
permutações).

IV.3. Análises filogeográficas em Acariquara

A análise conjunta dos dez locos microssatélites do cpDNA evidenciou a

presença de 103 haplótipos nas seis populações analisadas de M. guianensis,
perfazendo uma média de 17,2 haplótipos por população. A composição dos
haplótipos observados, com base na análise dos dez locos cpSSR, é apresentada
na Tabela 14.

As frequências dos haplótipos cpSSR e sua distribuição nas populações estão

apresentadas na Figura 19. Dentre os 103 haplótipos detectados, dois mostraram-se
mais frequentes em relação aos demais (1,94%), ocorrendo em duas populações
(Sarapiquí – Costa Rica e Manaus – AM) e 88 foram representados por apenas um
indivíduo (85,43%). A frequência dos outros 13 haplótipos variou de 0,97% a 6,79%
(Figura 19). Dos 103 haplótipos quatro foram compartilhados entre indivíduos de
diferentes populações e 83 haplótipos foram exclusivos a alguma das populações
analisadas.
 48

Tabela 14 – Haplótipos observados com base na análise de dez locos cpSSR para seis populações de M. guianensis.
Haplótipo Populações emcrc67 emcrc74 ccmp1 ccmp2 ccmp3 ccmp4 ccmp5 ccmp6 ccmp7 ccmp10 Nº de
Indivíduos
1 Costa Rica 236 126 126 227 109 120 104 102 138 107 6
2 Costa Rica 236 126 127 227 109 120 104 102 138 107 2
3 Costa Rica 236 126 127 227 109 119 104 102 138 107 1
4 Costa Rica 236 126 126 227 109 119 104 102 138 107 1
5 Equador 237 126 126 227 108 120 104 102 138 107 3
6 Equador 237 126 127 227 108 120 104 102 138 107 1
7 Equador 237 126 128 227 108 120 104 103 138 107 1
8 Equador 237 126 127 227 108 120 104 102 138 108 1
9 Equador 237 126 126 227 108 120 104 102 138 108 1
10 Equador 237 126 127 226 108 120 104 101 138 108 1
11 Equador 240 126 127 227 108 120 105 102 138 108 1
12 Equador 241 126 127 227 108 120 104 102 138 108 1
13 Equador 237 126 126 227 108 120 105 102 138 107 1
14 Equador 237 127 126 227 108 120 105 102 138 107 1
15 Equador 237 126 126 227 109 120 106 102 138 107 1
16 Equador 237 126 126 227 107 120 106 102 138 107 1
17 Equador 237 126 126 227 107 120 105 102 139 107 1
18 Equador 237 126 126 227 107 120 106 102 139 107 1
19 Equador 237 126 126 227 107 119 107 102 139 107 1
20 Equador 237 126 127 227 108 120 106 102 139 107 1
21 Equador 237 126 127 227 108 120 107 102 139 108 1
22 Equador 237 126 127 227 108 120 106 102 138 108 1
23 Equador 237 126 127 226 108 120 106 102 140 108 1
24 Equador 237 126 126 227 107 120 102 102 140 108 1
25 Equador 237 126 126 227 107 120 104 101 138 107 1
26 Equador 237 126 126 227 107 120 104 102 138 107 2
27 Equador 237 126 126 226 107 120 104 102 138 107 1
28 Equador 237 126 127 226 107 120 104 102 138 107 1
29 Equador 237 127 126 227 107 120 104 102 138 107 1
30 Equador 237 126 127 227 108 121 105 101 138 107 1
31 Equador e 237 126 126 227 107 120 105 102 138 107 5
Peru
 49

32 Peru 237 126 126 227 107 119 105 102 138 107 1
33 Peru 237 126 127 227 108 121 105 102 137 107 1
34 Peru 237 126 127 227 108 120 105 102 137 107 2
35 Peru 237 126 126 227 108 120 106 102 137 107 1
36 Peru 237 126 126 227 108 120 105 102 137 107 1
37 Peru 237 126 126 227 107 120 105 102 137 107 2
38 Peru 237 126 126 227 107 119 105 102 137 107 1
39 Peru 237 126 126 227 107 119 106 102 137 107 1
40 Peru 237 126 126 227 107 120 105 99 137 107 1
41 Peru 237 126 126 227 107 121 105 102 140 107 1
42 Peru 237 126 128 227 108 120 106 102 137 108 1
43 Peru 237 126 127 227 108 120 107 102 138 108 1
44 Peru 237 126 127 227 107 120 107 102 138 108 1
45 Peru 237 126 127 227 108 121 102 102 137 107 1
46 Peru e Manaus 237 126 126 227 108 119 104 102 137 107 2
47 Tefé 237 126 127 227 108 118 104 102 132 102 1
48 Tefé 237 126 126 227 107 119 102 102 138 107 1
49 Tefé 237 126 126 227 108 119 102 102 137 107 1
50 Tefé 237 126 127 227 108 118 102 102 137 107 1
51 Tefé 237 126 127 227 108 119 104 102 137 107 1
52 Tefé 238 126 126 227 107 119 104 102 137 107 1
53 Tefé 237 126 126 226 107 119 104 101 137 107 1
54 Tefé 237 126 127 226 107 118 104 102 137 107 1
55 Tefé 237 127 126 226 107 119 104 102 137 107 1
56 Tefé 237 126 126 226 107 118 104 101 137 107 1
57 Tefé e Manaus 237 126 126 227 107 119 104 102 137 107 4
58 Tefé e Manaus 237 126 127 227 107 119 104 102 137 107 4
59 Manaus 237 126 126 226 108 118 103 102 137 107 1
60 Manaus 237 125 126 227 107 120 103 103 137 107 1
61 Manaus 237 126 126 227 108 119 104 102 136 107 1
62 Manaus 237 126 125 226 107 119 104 102 137 107 1
63 Manaus 237 127 127 226 107 119 104 102 139 107 1
64 Manaus 237 126 126 227 108 119 104 102 138 107 1
65 Manaus 237 126 126 227 108 119 104 102 139 107 1
66 Manaus 237 126 126 226 108 118 104 102 139 107 1
 50

67 Manaus 237 126 126 227 108 118 104 102 139 107 2
68 Manaus 237 126 127 227 108 118 105 102 139 107 1
69 Manaus 237 126 126 227 107 118 104 102 139 107 1
70 Manaus 237 126 126 227 107 118 104 107 139 107 1
71 Manaus 237 126 126 227 108 118 105 102 139 107 6
72 Manaus 237 126 126 227 109 118 105 102 139 107 2
73 Manaus 237 126 126 227 108 118 105 102 140 107 1
74 Manaus 237 126 127 227 108 118 105 102 139 107 1
75 Manaus 237 127 126 228 108 118 105 102 139 107 1
76 Manaus 237 127 126 226 109 118 105 102 139 107 1
77 Manaus 237 126 126 226 109 118 105 102 139 107 1
78 Manaus 237 126 126 226 108 118 105 102 139 107 1
79 Flona Tapajós 237 126 126 221 106 118 104 102 137 107 1
80 Flona Tapajós 237 126 126 222 107 118 104 102 137 106 1
81 Flona Tapajós 237 126 126 220 107 118 103 102 137 107 1
82 Flona Tapajós 237 126 125 221 107 118 103 102 137 107 1
83 Flona Tapajós 237 126 131 221 107 118 103 102 138 107 1
84 Flona Tapajós 237 126 126 221 108 118 104 102 137 106 1
85 Flona Tapajós 237 126 126 221 107 117 104 102 137 106 1
86 Flona Tapajós 237 127 126 221 107 118 104 102 137 106 1
87 Flona Tapajós 237 127 126 221 107 117 104 102 137 107 1
88 Flona Tapajós 237 127 125 220 107 119 103 102 137 107 1
89 Flona Tapajós 237 127 125 220 107 118 104 102 137 107 1
90 Flona Tapajós 236 126 126 221 107 119 104 102 137 107 1
91 Flona Tapajós 237 126 126 221 107 119 104 102 137 107 5
92 Flona Tapajós 237 126 126 220 107 119 104 102 137 107 4
93 Flona Tapajós 237 126 126 220 106 119 104 101 137 107 1
94 Flona Tapajós 237 127 126 220 107 119 104 101 137 107 1
95 Flona Tapajós 237 127 126 221 107 119 104 102 137 107 1
96 Flona Tapajós 237 127 126 221 108 119 104 102 137 107 1
97 Flona Tapajós 237 125 126 221 107 119 104 102 136 107 1
98 Flona Tapajós 237 125 125 221 107 119 104 102 137 107 1
99 Flona Tapajós 237 126 126 221 107 119 104 101 137 107 1
100 Flona Tapajós 237 127 126 221 107 119 104 101 137 106 1
101 Flona Tapajós 237 128 126 222 107 119 104 102 137 106 1
 51

102 Flona Tapajós 237 126 125 221 107 118 104 101 136 107 1
103 Flona Tapajós 237 127 125 221 107 119 104 101 136 107 1

4,5

3,5
Frequência (%)

2,5

1,5

0,5

0
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 89 93 97 101
Haplótipo
Figura 19 – Frequência dos haplótipos observados na análise de dez locos cpSSR de M. guianensis.
 52

As relações entre os haplótipos de M. guianensis, com base na análise dos

locos cpSSR, foram inferidas por meio de uma análise de rede utilizando o método
Median-Joining (Figura 20). Nota-se uma separação clara de haplótipos exclusivos
caracterizando uma determinada população para a maioria das populações
analisadas.

Figura 20 – Relações entre os haplótipos de M. guianensis, a partir de uma análise

de rede “Network”, com base na análise de dez locos cpSSR. Cada círculo se refere
a um haplótipo. O tamanho do círculo é proporcional à frequência de ocorrência do
haplótipo. O tamanho das linhas separando os haplótipos representa o grau de
diferenciação entre os mesmos. Nodos pretos representam median vectors
(haplótipos não amostrados ou haplótipos ancestrais extintos).

A Figura 21 ilustra as relações entre os haplótipos a partir da análise das

substituições de nucleotídeos observadas nas sequências das regiões intergênicas
trnL/trnF e psbB/psbF do cpDNA de M. guianensis. No total foram encontrados cinco
 53

haplótipos. O haplótipo mais frequente está diretamente relacionado aos outros

quatro haplótipos e ocorre em seis das oito populações estudadas. O segundo
haplótipo mais frequente foi compartilhado entre as populações de Manaus – AM,
Tefé – AM e Urucu – AM. Três das oito populações analisadas apresentaram mais
de um haplótipo (Orellana - Equador (dois haplótipos), Loreto – Peru (três
haplótipos) e Manaus – AM (dois haplótipos). Para as demais populações analisadas
observou-se um único haplótipo por população.

Figura 21 – Análise de rede (Network) mostrando as relações entre haplótipos a

partir da análise das sequências dos espaçadores intergênicos trnL/trnF e
psbB/psbF do cpDNA de M. guianensis, considerando apenas substituições de
nucleotídeos. Cada círculo refere-se a um haplótipo e o tamanho indica sua
frequência de ocorrência. O tamanho das linhas separando os haplótipos
representa o grau de diferenciação entre os mesmos. Nodos pretos representam
median vectors (haplótipos não amostrados ou haplótipos ancestrais extintos).
 54

V. DISCUSSÃO

V. 1. Extração do DNA

A necessidade de se otimizar a extração de DNA a partir de uma outra fonte

de material genético que não folhas, como a casca de árvores (por exemplo), se dá
em virtude da dificuldade da coleta de material biológico em campo, para a
realização de análises genéticas. As árvores de M. guianensis podem atingir até 70
m de altura, o que dificulta a coleta de folhas, material biológico mais comumente
utilizado para a extração de DNA em plantas. Outra alternativa de obtenção de
material biológico para extração de DNA em árvores se dá por meio da coleta do
câmbio. No entanto, em virtude da alta densidade da madeira (1,04 g/cm3) da
acariquara, há dificuldade para se alcançar o câmbio atravessando a madeira
(Figura 22). A utilização desses dois métodos aliada à baixa densidade de indivíduos
em populações naturais de M. guianensis torna difícil a coleta de material genético
de um número adequado de indivíduos para as estimativas de parâmetros genéticos
de populações. Dessa forma, tentou-se extrair DNA a partir da casca como um
método alternativo para acessar o material genético. O DNA extraído da casca
apresentou boa qualidade e quantidade, semelhante ao DNA extraído a partir de
folhas e câmbio.
Rafael Angrizani

Figura 22 – Método de coleta de câmbio de árvore

para utilização em análise genética.
 55

V.2. Diversidade e Estrutura Genética de Populações da Acariquara

Os oito locos microssatélites do genoma nuclear de M. guianensis mostraram

alta variabilidade alélica (8 a 23 alelos, média de 16 alelos por loco), confirmando o
alto conteúdo informativo esperado para esses marcadores. Existem fatores que
estão relacionados ao número de repetições encontrado em locos microssatélites.
Geralmente, locos com um número maior de repetições apresentam maior número
de alelos (Van de Vem & McNicol, 1996; Dayanandan et al., 1999). Os locos Min26 e
Min91 confirmaram esta tendência. Cada um desses locos apresentou 23 alelos,
sendo os locos com o maior número de repetições (total= 15) dentre os
desenvolvidos para a espécie (Buonamici et al., 2010, em preparação). Por outro
lado, o loco Min19, com apenas 10 repetições, apresentou um número bem menor
de alelos (total= 8). Outro fator é o número de nucleotídeos que constitui o motif dos
microssatélites. Microssatélites compostos, que apresentam repetições de três ou
mais nucleotídeos geralmente apresentam maior polimorfismo do que
microssatélites com repetições de apenas dois nucleotídeos. Um bom exemplo é o
loco Min27 (um SSR com repetições de três nucleotídeos) que, com apenas nove
repetições, apresentou 16 alelos.

Em análises de genética de populações é necessário determinar como uma

população será definida, uma vez que quaisquer inferências realizadas em relação à
estrutura genética são baseadas na predição de que um grupo de indivíduos
pertence àquele mesmo pool gênico. Normalmente, considera-se uma população,
uma área onde ocorrem indivíduos com um mesmo fenótipo. Porém, este método de
delimitação é falho, já que, dessa forma, é difícil identificar se existem possíveis
barreiras ao fluxo gênico dentro ou entre áreas pré-determinadas. Erros na
identificação de possíveis populações podem resultar em erros na interpretação dos
resultados.

Atualmente, análises computacionais vêm sendo utilizadas para solucionar

esse problema. No presente estudo, foi realizada uma análise Bayesiana,
implementada pelo programa Structure (Pritchard et al., 2000), utilizando-se os locos
ncSSR, com o intuito de determinar a priori as prováveis populações existentes de
M. guianensis, a partir da análise genética dos indivíduos amostrados. Esta análise
agrupa os indivíduos com base em distinções genéticas, sem a necessidade de uma
 56

pré-identificação das populações. O resultado indicou que as cinco localidades de

amostragem analisadas para este programa são de fato reconhecidas como cinco
populações distintas.

O conhecimento da diversidade genética em plantas é importante, uma vez

que tal característica é informativa acerca da capacidade das populações se
adaptarem às mudanças ambientais. Em geral, a perda de diversidade genética
torna as populações naturais suscetíveis às mudanças ambientais, a qual é
resultado de efeitos de endocruzamento e perda de heterozigosidade afetando
assim o seu potencial evolutivo (Lacy, 1986; Frankhan et al., 1999).

A diversidade genética (número de alelos e HE) encontrada nas populações,

considerando os locos ncSSR de M. guianensis, foi alta sendo no entanto
ligeiramente menor (HE= 0,65) que as heterozigosidades esperadas determinadas
para outras espécies neotropicais (Collevatti et al., 2001; Gaiotto et al., 2003; Lemes
et al., 2003, 2007). Também o coeficiente de endogamia detectado nas populações
da acariquara foi maior (FIS= 0,26), quando comparado aos estudos citados. Para os
locos cpSSR as estimativas de diversidade genética observados para M. guianensis
foram altos comparados a outras espécies de plantas. O número médio de alelos
encontrado por loco cpSSR (5,1) foi ligeiramente maior do que a média observada
em populações naturais de outras espécies de plantas, tais como Salix reinii (3,2;
Lian et al., 2003) Silene paradoxa (2,8; Mengoni et al., 2001), Alyssum bertolonii
(4.8; Mengoni et al., 2003), Pinus pinaster (4,1; Ribeiro et al., 2002), Caesalpina
echinata (3,28; Lira et al., 2003), Caryocar brasiliense (3,2; Collevatti et al., 2003),
Magnolia stellata (3,33; Ueno et al., 2005), Dalbergia monticola (3,33; Andrianoelina
et al., 2006) e Helianthus annuus (6,0; Wills & Burke, 2006).

Alguns dos locos microssatélites nucleares analisados mostraram deficiência

em heterozigotos para algumas populações, indicando que estes locos não se
encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg e que há fatores influenciando a
aleatoriedade alélica (Futuyma, 2002). Sabe-se que, mesmo em espécies alógamas,
o equilíbrio de Hardy-Weinberg deixa de existir na presença de cruzamentos
preferenciais, o que pode resultar em uma estruturação dentro da população.
 57

Um dos fatores que pode estar influenciando a frequência alélica nos locos
ncSSR é a presença de alelos nulos não identificados na análise, que ocorrem
devido à falhas durante a amplificação na reação de PCR (Pemberton et al., 1995;
Selkoe & Toonen, 2006). Outro fator é a seleção natural, a qual restringe a
diversidade genética, podendo diminuir o número de alelos, aumentando a
proporção de homozigotos e favorecendo assim determinados genótipos (Hartl,
2008). No entanto, tal fator não deveria estar influenciando os locos microssatélites
já que estes são considerados neutros. A endogamia, que pode acontecer por
endocruzamento ou acasalamento entre indivíduos aparentados, também constitui
um fator importante a ser considerado. Lemes (2000) discute que, apesar do baixo
índice de endogamia detectado para o mogno (Swietenia macrophylla), isto pode
explicar o déficit de heterozigotos observado para a espécie, provavelmente devido
ao acasalamento entre indivíduos aparentados (biparental inbreeding). No entanto, é
difícil afirmar que a endogamia é o fator responsável pelos desvios de
heterozigosidade apresentados para M. guianensis, uma vez que não há estudos
detalhados sobre o sistema de reprodução da espécie. O que se sabe apenas, e de
um modo geral, é que a polinização da espécie é feita por besouros e abelhas,
havendo também registros de pássaros visitando suas flores (Flores, 2002). Por
outro lado, a dispersão de sementes de M. guianensis já é mais bem documentada,
sendo do tipo zoocórica (Ferraz et al., 2004; Camargo & Ferraz, 2004), feita
basicamente por pequenos mamíferos e por pássaros, tais como os tucanos (Nebel,
2001; Guariguata et al., 2002).

Cinco das seis populações de M. guianensis estudadas apresentam altos

índices de diversidade genética (HE médio= 0,29), considerando os dez locos cpSSR
analisados. A população com o maior índice de diversidade genética foi Orellana –
Equador enquanto que Sarapiquí – Costa Rica apresentou o menor índice. A
comparação entre a diversidade genética de Sarapiquí – Costa Rica (HE= 0,08) com
a média da diversidade genética das demais populações (H E= 0,32) foi contrastante.
Isso pode ser explicado pela localização geográfica dessa população, além da
cordilheira dos Andes, que pode ter atuado como barreira ao fluxo gênico com as
populações da América do Sul. O índice de diferenciação genética desta população
em relação às demais foi o mais alto (FST: 0,38). Outro dado importante e que
 58

justifica a baixa diversidade é que esta população apresenta apenas quatro

haplótipos dos 103 encontrados para M. guianensis.

Por outro lado, Orellana – Equador foi a população que apresentou a maior
diversidade genética, maior número de alelos e possui 27 haplótipos para os dados
de microssatélites e dois haplótipos para as sequências. Quando se consideram
marcadores microssatélites e sequências do genoma do cloroplasto, espera-se que
as populações que apresentem alta diversidade genética sejam populações mais
antigas. Como esses marcadores possuem uma taxa mutacional mais baixa (~2,9 x
10-9/2T; T= tempo de divergência) quando comparado com o genoma nuclear (~8,1 x
10-9/2T; T= tempo de divergência) em plantas (Wolfe, 1987), o padrão observado
para população de Orellana - Equador só poderia acontecer se ela existisse há mais
tempo que as demais populações. Dessa forma, poderia acumular mutações
suficientes que representam a sua atual diversidade alélica e haplotípica. Além de
antigas, essas populações deveriam sofrer pouco com efeitos de estrangulamento
populacional, mantendo a sua integridade alélica. Dessa forma, gargalos
populacionais, tais como bottleneck, ocorreriam com uma baixa frequência ou não
teriam um grande impacto nestas populações.

As populações de M. guianensis apresentaram um alto número de haplótipos

(total de 103) para os dados de cpSSR. O número médio encontrado para outras
espécies de plantas nos neotrópicos utilizando-se este mesmo tipo de marcador foi
de apenas 34,2 haplótipos (Mengoni et al., 2001; Lira et al., 2003; Farias, 2006;
Menicucci, 2007; Arruda, 2008).

As análises de variância molecular realizadas para os três tipos de

marcadores (cpSSR, ncSSR e sequências do cpDNA) mostraram o mesmo padrão
de distribuição da variabilidade genética, no qual a maior parte da variabilidade
detectada está contida dentro das populações, padrão também encontrado para a
maioria das espécies de árvores neotropicais. Este resultado é corroborado pela
grande quantidade de haplótipos exclusivos encontrados nas populações de M.
guianensis (99 haplótipos). Além disso, os resultados de sequência do cpDNA
revelam que dos cinco haplótipos encontrados, três são haplótipos únicos. No
entanto o nível de diferenciação genética entre as populações de M. guianensis é
considerado alto (FST= 0,36 (cpSSR), 0,31 (ncSSR); 0,28 (sequências do cpDNA)),
 59

revelando uma alta estruturação genética das populações. Os índices de

diferenciação apresentados para os locos cpSSR e sequências do cpDNA
apresentaram uma maior diferenciação em relação aos microssatélites do genoma
nuclear, como é esperado para locos cuja herança é uniparental (Ennos, 1994).

Wright (1965) estabelece valores de F ST para avaliar o nível de estruturação

genética nas populações de uma espécie. A análise é feita por comparação entre os
valores de Wright com o valor total de diferenciação genética populacional (F ST).
Valores entre 0 e 0,15 indicam fraca diferenciação genética; valores entre 0,15 e
0,25 indicam diferenciação moderada; e valores acima de 0,25 indicam grande
diferenciação. Assim, as populações de M. guianensis podem ser consideradas
como altamente estruturadas, considerado um nível elevado quando comparado a
outras espécies de árvores tropicais (Hamrick, 1994; Collevatti et al., 2001; Lemes et
al., 2003; Heuertz et al., 2004).

Segundo Hamrick & Loveless (1989), espécies cuja dispersão de sementes é

feita por animais que se movimentam a longas distâncias tendem a apresentar altos
valores de fluxo gênico e variação genética intrapopulacional, e um baixo índice de
diferenciação interpopulacional. Minquartia guianensis é dispersa por pássaros
ocasionando uma dispersão relativamente ampla. Embora seja observada uma alta
variação genética dentro das populações dessa espécie, os dados sobre F ST indicam
uma alta diferenciação genética entre as mesmas. No entanto, mesmo que
dispersão de sementes seja feita a longas distâncias, o modo como essa dispersão
acontece influencia a estrutura genética das populações. A alta diversidade
haplotípica encontrada para M. guianensis aliada à alta diferenciação genética indica
que há um fluxo gênico materno bastante restrito ou até possivelmente ausente
entre as populações. Além disso, pode-se inferir que essa restrição ao fluxo gênico
seja um evento recente, o qual ocasionou a estruração das populações, mas que
ainda não resultou em perda de diversidade genética. Os dados de correlação entre
fluxo gênico e FST apresentados na Tabela 6 corroboram com a hipótese de fluxo
gênico restrito. Foram encontrados elevados valores de F ST e baixos valores de fluxo
gênico entre as populações de M. guianensis. A única exceção é a baixa
diferenciação encontrada entre as populações de Sarapiquí – Costa Rica e Loreto –
Peru, na qual apresenta um valor de F ST de 0.05 e um valor de fluxo gênico de
 60

10.45. Considerando a geografia, o fluxo gênico deveria ser baixo, uma vez que a
população de Sarapiquí - Costa Rica possui baixos valores de fluxo gênico em
relação às demais populações. Embora esta análise tenha indicado um fluxo gênico
entre essas populações, os dados gerados pelo programa Structure (Figura 9)
revelam apenas um pequeno numero de indivíduos de Sarapiquí – Costa Rica
“presente” na população de Loreto – Peru e vice-versa. Os resultados da análise
implementada pelo programa Barrier, o qual estima possíveis barreiras genéticas ao
fluxo gênico entre populações, mostraram que existem fortes barreiras genéticas
entre essas duas populações. Quando se avalia os dados de sequência do cpDNA
(Figura 21) nota-se que as populações de M. guianensis eram panmíticas no
passado ocorrendo uma posterior fragmentação. As populações fragmentadas
divergiram e diferenciaram-se. Em virtude desta fragmentação, é provável que essas
duas populações (Sarapiquí – Costa Rica e Loretto - Peru) tenham divergido a
menos tempo das demais podendo indicar um sinal de fluxo gênico entre elas.

O teste de Mantel realizado para os dados ncSSR revelou que apenas 19%
da diferenciação genética observada nas populações de M. guianensis pode ser
explicada pela hipótese de isolamento por distância. Resultado semelhante foi
observado a partir dos dados dos locos cpSSR, indicando que a diversidade
genética nas populações de M. guianensis não parece ser afetada pela distância
geográfica.

Dessa forma, o padrão atual de estruturação genética das populações de M.

guianensis parece estar relacionado a fatores históricos. Eventos de extinção e
recolonização, bottleneck e efeito fundador podem deixar sinais genéticos nas
gerações posteriores (Hewitt, 1996; Schaal et al., 1998; Dutech et al., 2003). A
dificuldade em inferir sobre os possíveis fatores ambientais antigos que poderiam
influenciar na estruturação genética de populações está relacionada ao tipo de
marcador molecular utilizado. Marcadores do genoma nuclear sofrem recombinação,
fator que impede a detecção de eventos demográficos antigos. Além disso, os locos
microssatélites do genoma nuclear possuem uma alta taxa mutacional (10-2 a 10-6; Li
et al., 2002), os quais impedem a avaliação da variação genética histórica entre
populações. Em virtude disso, torna-se importante a avaliação específica de dados
gerados a partir do genoma cloroplastidial que permita verificar as influências de
 61

eventos antigos na estrutura genética atual de plantas. Métodos filogeográficos

proporcionam os meios de se examinar padrões de distribuição de variação
genética, com o potencial de distinguir aqueles causados por fluxo gênico atual entre
as populações, daqueles derivados de eventos históricos (Schaal et al., 1998).

V.III. Padrões filogeográficos em acariquara

Informações sobre eventos históricos afetando populações de espécies de

plantas são importantes para compreender os padrões de distribuição da
variabilidade genética e podem ser obtidas pela análise de genomas de herança
uniparental, tais como o genoma cloroplastidial. Uma das características importantes
é o fato de genomas haplóides serem mais sensíveis ao efeito de deriva genética
devido à ausência de recombinação (Petit et al., 1993; Ennos, 1994). Dessa forma,
observa-se uma maior estruturação da variação genética no genoma do cloroplasto
quando comparado ao genoma nuclear. A estrutura genética encontrada no genoma
do cloroplasto é mais influenciada pelas relações históricas e fluxo gênico antigo
entre populações, assim como eventos climáticos, tais como as glaciações (Avise et
al., 1987; Avise, 1994; Schaal et al., 1998).

Sabe-se que a evolução e distribuição atual de espécies estão diretamente

relacionadas à dinâmica dos ecossistemas ao longo do tempo (Haffer, 1969; Prance,
1982; Hewitt, 1996; Dynesius & Janson, 2000). Nesse contexto, estudos moleculares
que discutem a influência das mudanças climáticas em florestas tropicais,
especialmente na América do Sul, têm avançado nos últimos anos (Caron et al.,
2000; Olsen, 2000; Collevatti et al., 2003; Dutech et al., 2003; Lira et al., 2003;
González-Rodriguez et al., 2004; Ramos et al., 2007). Embora as mudanças
climáticas ocorridas no Pleistoceno (período que compreende um milhão e 806 mil e
11 mil e 500 anos atrás) tenham sido mais fracas nos trópicos do que nas latitudes
temperadas (Dynesius & Janson, 2000), a distribuição geográfica de espécies de
florestas tropicais pode ter sido seriamente afetada (Prance, 1982; Pennington et al.,
2000). Eras glaciais ocorreram em intervalos regulares de 100.000 anos com
períodos interglaciais de 15 a 20.000 anos como resultado da instabilidade do clima
da Terra causado pelos ciclos de Milankovitch (Bennett, 1990).
 62

Segundo a teoria dos refúgios (Haffer, 1969; Ab’Sáber, 1977; Brown &
Ab’Sáber, 1979; Haffer & Prance, 2002), florestas e biomas não-florestais mudaram
continuamente a sua distribuição geográfica durante o passado geológico. Baseado
em dados de biogeografia, geomorfologia e paleoecologia, muitos autores têm
proposto que o clima foi mais seco e mais frio nos trópicos durante parte do
Pleistoceno (períodos glaciais) e que as florestas foram de alguma forma
fragmentadas em muitas áreas geograficamente isoladas (Haffer, 1969; Prance,
1982; Bush, 1994; Hooghiemstra & van der Hammen, 1998). Dessa forma,
populações de plantas isoladas durante esta fase sofreram grandes reduções em
número populacional. Isso pode ter afetado a diversidade genética dentro de
espécies, podendo levar à diferenciação a níveis taxonômicos de subespécies ou
espécies antes de um novo contato com populações co-específicas de outros
refúgios durante os períodos favoráveis (Endler, 1982; Haffer, 1982; Hewitt, 1996;
Haffer, 2008). Além disso, algumas espécies eram capazes de “flutuar” em habitats
ótimos enquanto tais habitats mudavam de latitudes e altitudes; outras
permaneceram onde estavam e se adaptaram às alterações dos ambientes locais;
ou então sofreram redução de amplitude e eventual extinção (Brown, 2006). Ainda
segundo esta teoria, as florestas tropicais teriam se auto-sustentado onde as
condições ambientais (principalmente precipitação) foram favoráveis o suficiente.
Isso corresponderia às áreas de maior altitude e suas proximidades. Essas áreas
são chamadas de “Santuários Neotropicais Pleistocênicos” (Brown, 2006). Por outro
lado, regiões com condições menos favoráveis eram ocupadas por florestas mais
secas ou savanas (Hooghiemstra & van der Hammen, 1998; Pennington et al.,
2000). Variações climáticas deste tipo podem ter causado grande extinção-
recolonização de populações de árvores de florestas tropicais. Essa especiação
alopátrica, causada por influência de processos climáticos, pode ter contribuído para
a alta diversidade de espécies, atualmente encontrada em florestas tropicais (Haffer,
1969, 2008; Bush, 1994; Richardson et al., 2001).

A população de M. guianensis do Equador encontra-se localizada em uma

área considerada região de refúgio florestal durante os períodos glaciais, nomeada
como Refúgio Napo (Figura 23; Haffer, 2008). Essa pode ser a explicação para a
alta diversidade genética encontrada nesta população. A população do Peru,
também apresenta uma alta diversidade genética (dados de sequência mostram que
 63

esta é a população com mais haplótipos (total de três)). Sua alta diversidade pode
estar relacionada à proximidade desta população ao Refúgio Napo. Para os dados
microssatélites do cpDNA, observa-se que os haplótipos de Loreto – Peru estão
mais proximamente relacionados aos haplótipos da população de Orellana –
Equador além de terem um haplótipo em comum.

Em um primeiro momento, analisando apenas os dados microssatélites do

cpDNA, seria possível inferir que a população de Tefé – AM e parte da população de
Manaus – AM tenham tido seus haplótipos derivados a partir de haplótipos das
populações de Orellana – Equador e Loreto – Peru ou de outras populações
próximas da região de Refúgio Napo não amostradas no presente estudo. A
população de Tefé – AM possui haplótipos mais relacionados a Manaus – AM,
havendo inclusive dois haplótipos compartilhados. Um indício da relação dos
haplótipos entre essas quatro populações seria a presença de dois haplótipos, um
de Orellana – Equador e um de Loreto – Peru, que se relacionam com as
populações de Tefé – AM e Manaus – AM. Por outro lado, quando se analisam as
sequências do cpDNA percebemos uma discrepância. A população de Tefé - AM
revela-se isolada, apresentando um único haplótipo o qual é compartilhado com a
população de Manaus e Urucu - AM. Como dados de sequência do cpDNA reportam
a eventos históricos mais antigos que os marcadores cpSSR é possível sugerir que
os haplótipos da população de Tefé - AM derivaram a partir de haplótipos de uma
outra região não amostrada no presente estudo. Seu contato com as demais
populações deve ter acontecido posteriormente durante os períodos de expansão
populacional (períodos interglaciais), o qual é possível observar pela análise dos
dados microssatélites. Considerando a sua localização na margem direita do Rio
Amazonas e o compartilhamento de seu único haplótipo com a população de Urucu
– AM (sequências do cpDNA), que ocorre mais ao Sul, supõe-se que os haplótipos
da população de Tefé – AM tenham sido derivados a partir da região sul da
Amazônia (Figura 23).

Uma mesma população, ou um grupo de populações geograficamente

próximas, podem apresentar origens diversas. Collevatti et al. (2003) mostraram que
populações de Caryocar brasiliense, no centro-oeste e sudeste do país, teriam
ficado isoladas durante os períodos glaciais no hemisfério norte e que nos períodos
 64

interglaciais, diferentes linhagens entraram em contato e restabeleceram as rotas de

fluxo gênico. Ramos et al. (2007) observaram que durante as glaciações ocorridas
durante o Quaternário as populações de Hymenaea stigonocarpa do sul do cerrado
brasileiro tornaram-se extintas, havendo uma posterior recolonização a partir de
linhagens do norte durante os períodos interglaciais. A relação entre os haplótipos,
na análise dos locos microssatélites do cpDNA, para a população de Manaus - AM
sugere que seus haplótipos derivaram de duas linhagens distintas. Essa observação
se deve a essa população possuir dois grupos de haplótipos identificados para os
dados cpSSR (Figura 20). O primeiro grupo de haplótipos relaciona-se com os
haplótipos da população de Tefé – AM, enquanto o outro grupo de haplótipos parece
ter derivado a partir de uma outra região da Amazônia (não amostrada no presente
estudo).

Turrialba – Costa Rica

Yasuni – Equador
Iquitos – Peru
Urucu – AM
Tefé – AM
Manaus – AM
Porto Trombetas – PA
Flona Tapajós – PA

Figura 23 – Regiões biogeográficas da Amazônia. As áreas pontilhadas

representam as possíveis regiões de refúgios florestais (Haffer, 2008). Figura
original: Bush & Oliveira, 2006. Modificações: Gabriela Farias.
 65

A população de Flona Tapajós – PA apresenta características distintas, sendo

uma população com grande número de haplótipos (total de 27) e alta diversidade
genética (HE: 0,32), além de não compartilhar haplótipos com nenhuma outra
população. De acordo com a análise de rede (cpSSR), esta população parece ser a
mais diferenciada e distante geneticamente, havendo quatro mutações separando-a
das demais populações. É provável que esta população tenha sido mantida
separada das demais em uma região distinta durante os períodos glaciais. A
população de Flona Tapajós localiza-se entre os Rios Tapajós e Xingu. Por ela,
passa o “corredor seco”, área que apresenta baixa pluviosidade e que atravessa
transversalmente a região Amazônica no sentido Noroeste-Sudeste (Figura 24;
Haffer, 2008). Durante as glaciações, as áreas florestadas provavelmente
desapareceram dessa região. É provável que os haplótipos da população de Flona
Tapajós – PA tenham sido derivados a partir de uma região remanescente de
floresta localizada no lado leste deste corredor. O corredor seco foi uma área que
perdurou por mais tempo entre os refúgios florestais durante os períodos glaciais.
Esse período prolongado de separação pode ser a explicação para a diferenciação e
diversidade da população de Flona tapajós – PA.

Diferentemente das demais populações de M. guianensis, a população de

Sarapiquí – Costa Rica possui um baixo índice de diversidade genética e apresentou
baixo número de haplótipos, tanto para os dados de sequência do cpDNA (um
haplótipo), quanto para os dados cpSSR (quatro haplótipos). Essa baixa diversidade
encontrada pode ser explicada por efeito fundador. Considerando os dados de
sequência do cpDNA, a população de Sarapiquí – Costa Rica compartilha seu único
haplótipo com mais cinco populações de M. guianensis e é este o haplótipo mais
frequente. Haplótipos mais frequentes podem ser considerados haplótipos
ancestrais. Isso sugere que esta população fez parte de uma população antes
panmítica de M. guianensis na região amazônica e que, por efeito fundador,
colonizou posteriormente a região da América Central.
 66

Haffer, 2008
Figura 24 – Pluviosidade anual na região Amazônica. O corredor seco é a região
branca no mapa que atravessa a Amazônia transversalmente no sentido Noroeste
– Sudeste. A pluviosidade anual nessa área não ultrapassa de 1500 mm de
precipitação ao ano.

Por fim, o padrão atual de distribuição de haplótipos encontrado para M.

guianensis pode ter sido derivado a partir de haplótipos de populações restritas em
refúgios florestais durante períodos glaciais e que, durante os períodos interglaciais,
puderam expandir e se dispersar para áreas favoráveis convergindo para a
distribuição geográfica observada atualmente. A dispersão de sementes pode ter se
restringido a áreas menores, levando à estruturação genética observada hoje.

Embora a teoria dos refúgios seja uma forte hipótese biogeográfica (Haffer,
1969; Prance, 1982; Bush, 1994; Hooghiemstra & van der Hammen, 1998), ainda há
controvérsias ao se referir a ela, como possível causa para os padrões de
estruturação genética observados em populações de plantas na Amazônia. Muitos
possíveis refúgios florestais ainda são desconhecidos (Haffer, 2008). Além disso, os
 67

refúgios florestais citados por Haffer (2008) podem não ter acontecido em áreas tão
restritas como os observados no mapa (Figura 23). Essas áreas são regiões
consenso quando se avaliam diversos estudos. Mas é possível que as áreas de
refúgios florestais tenham abrangido regiões maiores considerando que os efeitos da
glaciação não foram tão fortes a ponto de alterar o clima de forma tão drástica nas
regiões tropicais (Bush, 1994). Dessa forma, as savanas não teriam sido
predominantes em grandes áreas na região Amazônica como prediz a hipótese.
Como as populações de M. guianensis, embora estruturadas, apresentam, de um
modo geral, alta diversidade genética, pode-se inferir que, de fato, as populações
dessa espécie sofreram um isolamento, mas suas áreas de abrangência ainda assim
foram amplas. Isto é, os efeitos de estrangulamento populacional não teriam
impactado tanto as populações, permitindo o desenvolvimento da alta diversidade
haplotípica hoje encontrada.

V.4. Implicações para a Conservação da Acariquara

Este estudo analisou a distribuição da variação genética em populações da

acariquara (M. guianensis), utilizando marcadores moleculares dos genomas do
núcleo e do cloroplasto e visando compreender os padrões de distribuição desta
variabilidade e a dinâmica dos eventos históricos que atuaram na determinação da
estruturação genética das populações desta espécie. Tais informações são de
fundamental importância para subsidiar propostas de conservação e manejo das
populações naturais da acariquara.

Minquartia guianensis é uma espécie que sofre superexploração devido à alta

qualidade de sua madeira. Em virtude disso, suas populações naturais vêm
diminuindo consideravelmente, o que pode reduzir sua viabilidade a longo prazo em
função da ação da deriva genética e eventual perda de variabilidade genética
(Frankhan et al., 1999).

Para muitas espécies de árvores tropicais, torna-se muito difícil criar

estratégias de conservação ex situ. Os bancos de germoplasmas são criados para
fins de coleção (preservação da variabilidade genética) ou para melhoramento
 68

genético (utilizado principalmente para espécie vegetais de consumo humano). Os

principais empecilhos são as dificuldades em coletar as quantidades de sementes
necessárias para preservar pelo menos parte da variação genética presente nas
populações, problemas com o armazenamento de sementes a longo prazo,
capacidades limitadas de cultivo para muitas espécies arbóreas grandes e possível
falha na manutenção de mecanismos de polinização em condições ex situ (Eguiarte
et al., 1992). Tais dificuldades aplicam-se às características da acariquara. Dessa
forma, estratégias de conservação in situ são as mais recomendadas para esta
espécie, pois é o melhor meio de se manter a integridade genética de suas
populações.

O presente estudo mostrou que M. guianensis apresenta alta variabilidade

genética intrapopulacional e suas populações apresentam-se altamente estruturadas
ao longo de sua distribuição. Uma boa estratégia para a conservação efetiva dessa
variabilidade seria a preservação de várias populações ao longo da distribuição
geográfica da espécie. Isso garantiria que a alta diversidade genética encontrada
fosse mantida nas diferentes populações.

A estruturação genética observada atualmente nas populações de M.

guianensis parece ter sido causada por eventos históricos. A reconstrução de rotas
de fluxo gênico poderia ser melhor elaborada aliando-se os dados gerados no
presente estudo (incluindo amostragem de um maior número de localidades) com
dados de sistema de cruzamento e fluxo de pólen (fluxo gênico contemporâneo)
visando contribuir para uma melhor compreensão dos padrões de distribuição da
variabilidade genética dentro e entre as populações da acariquara.
 69

VI. CONCLUSÕES

A diversidade genética encontrada nas populações de M. guianensis foi alta e

similar às estimativas observadas para outras espécies florestais neotropicais.

As populações apresentaram altos índices de diferenciação e baixo fluxo

gênico indicando uma alta estruturação genética.

As análises de variância molecular para os três tipos de marcadores

mostraram o mesmo padrão de distribuição da variabilidade genética, no qual
a maioria da variabilidade detectada está contida dentro das populações,
padrão este também observado para a maioria das espécies de árvores
neotropicais.

O grande número de haplótipos exclusivos (dados cpSSR) observados em

comparação ao baixo número de haplótipos compartilhados por mais de uma
população sugere um fluxo gênico materno atual bastante restrito ou até
ausente entre as populações.

O padrão de estruturação atual observado para as populações de M.

guianensis parece ser explicado pelos efeitos de isolamento causado por
refúgios florestais ocorridos durante períodos glaciais no Quaternário, no
entanto outras hipóteses biogeográficas devem ser também consideradas.

Os efeitos de estrangulamento populacional parecem ter pouco impactado as

populações de M. guianensis, o que é evidenciado pela alta diversidade
haplotípica encontrada atualmente.

Com base nos dados genéticos obtidos propõe-se que sejam conservadas
diferentes populações naturais de M. guianesis com vários indivíduos por
população, ao longo de sua distribuição, a fim de se preservar a alta
diferenciação genética observada entre elas, bem como a alta diversidade
genética detectada dentro das mesmas, de modo a possibilitar a manutenção
da variabilidade genética e a conservação efetiva dessas populações.
 70

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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