Sesion 4 CultivosPrimariosSubcultivos RFD

Cultivos Primarios, subcultivos y líneas
celulares
Ricardo Felm er D .
Bioquím ico, Ph.D .
Cultivos primarios
Cultivos celulares obtenidos a partir de tejidos normales o patológicos mediante
disgregación (mecánica o enzimática) o explantes de tejidos u órganos. Corresponde a
la etapa de un cultivo después del aislamiento de las células pero antes del primer sub-
cultivo.
Existen 4 etapas a considerar:
1. Adquisición de la muestra
2. Aislamiento del tejido
3. Disección y/o desagregación
4. Cultivo (incubación) después del

sembrado en un recipiente de cultivo
apropiado.
Cultivos primarios
Aislamiento del tejido.
Disección de tejido embrionario de ratón.
•Los embriones de ratón son una fuente conveniente de células para cultivos de
fibroblastos indiferenciados (a menudo son utilizados como células alimentadoras).
PROTOCOLO AISLAMIENTO DE CÉLULAS ALIMENTADORAS:
Procedimiento :
•Inducción del estro de la hembra por
apareamiento.
•Detección del tapón vaginal (día 0).
•Matar a la hembra al día 13 de gestación
por dislocación cervical (U.K. Schedule I
Procedure).
•Desinfectar el vientre con alcohol (a).
•Tirar la parte ventral de la piel en forma
transversal (b-c).
•Cortar longitudinalmente a lo largo de la
línea media del abdomen expuesto (d).
Cultivos primarios
Procedimiento:
•Remover el útero (e-f).
•Disponer el útero junto a los

embriones en una placa Petri (g).
•Liberar los embriones de las

membranas y placenta con la ayuda
de 2 pinzas (h).
Cultivos primarios
Procedimiento:
•Remover las membranas (i).
•Remover la cabeza (j).
•Cortar los embriones (k).
•Transferir los fragmentos a un

frasco de tripsinización, para
tripsinización en caliente (l).
• o a un matraz Erlenmeyer para

tripsinización en frío (m-n).
Cultivos primarios
Disección de tejido embrionario de pollo.
•Más fáciles de disectar por su mayor tamaño al embrión de ratón (en etapa equivalente de
desarrollo). Utilizados como fuente de células para cultivos primarios, células alimentadoras y
como sustrato para propagación viral.
•Debido al > tamaño de sus órganos es más fácil generar tipos celulares específicos por ej. de
hepatocitos, células cardíacas y epitelio pulmonar.
Procedimiento:
•Limpiar con alcohol el huevo (a).
•Pararlo sobre un vaso pp y romper la

cáscara (b).
•Sacar la cáscara (c) y membrana (d).
•Se observan el sistema vascular y

membrana corioalantoidea (e).
•Tomar esta estructura con una pinza.

Cultivos primarios
Disección de tejido embrionario de pollo.
Procedimiento:
•Tomar el embrión con la pinza alrededor del cuello (g).
•Retirarlo del huevo (h).
•Colocarlo en una placa de disección (i).

Cultivos primarios
Disección de tejido humano. Algunas consideraciones importantes:
•Biopsias de tejido humano presenta varios problemas.
1. Necesidad de obtener consentimiento:
Del comité de ética del hospital.
Del Doctor que atiende al paciente.
Del paciente o familiares (donante).
2. Recolección del tejido:

Requiere sistemas de almacenamiento y recolección adecuados.
Requiere de un sistema de registro de información apropiado (recepción, tipo
de muestra, paciente, análisis etc).
3. Riesgo de bioseguridad:
Manipulación bajo nivel de contención 2, en Cámaras
de flujo laminar tipo II.
Tejido debe ser examinados por patógenos
oportunistas.
HIV
Hepatitis B
Mycobacterium
Cultivos primarios
Disección y/o desagregación del tejido.
Aunque cada tejido puede requerir diferentes condiciones, algunos requerimientos son
compartidos por la mayoría.
En tejido adulto:
El tejido necrótico y graso es mejor removerlo de cualquier tejido.
Cortar el tejido finamente con un instrumento afilado (bisturí).
Si se utilizan enzimas para la desagregación, se deben remover
posteriormente.
La conc. de células en el cultivo primario debe ser mayor a la
utilizada normalmente para el subcultivo.
Usar de preferencia un medio enriquecido ¿ ? p. ej. RPMI1640 o Ham´s F12.
• FBS es preferible al FC (células sobreviven mejor ).
En tejido embrionario:
La desagregación es más fácil.
Rendimiento celular es mayor y las células proliferan
más rápidamente que a partir del tejido adulto.
Cultivos primarios
Explante primario.
La técnica del explante primario fue el método original desarrollado por Harrison en
1907 y varios otros, para iniciar un cultivo celular.
Técnica original:
•Un fragmento de tejido era embebido en plasma o linfa,
mezclado con suero y extracto embrionario.
•Esto se colocaba en un cubre-objeto que estaba invertido

sobre un portaobjeto con una concavidad.
Harrison, 1907
•El plasma coagulado mantenía el tejido en su lugar y junto
al suero y el extracto embrionario, suministraban los
nutrientes que estimulaban la migración celular desde el
explante.
•Aunque aún se utiliza, ha sido reemplazada por un método más

sencillo.
Cultivos primarios
Cultivo de explante primario.
•Técnica especialmente útil para tejidos pequeños como biopsias de piel donde hay un alto
riesgo de perder células durante la disgregación mecánica o enzimática.
•Su desventaja está en la pobre adhesión a la placa de algunos tejidos y la selección por
migración.
Involucra la disección del tejido.

Funciona bien con tejido suave.
También se puede con tejidos duros pero el
rendimiento celular es bajo.
Primary explant culture from Outgrowth after removal of explant,

mouse squamous skin carcinoma; about 7 days after explantation. 10×
explant and early stage of objective. Adhesión de los explantes:
outgrowth about 3 days after Se puede facilitar tratando el plástico con polilisina,
explantation. fibronectina, matriz extracelular, o feeder cells.
Cultivos primarios
Disgregación mecánica.
Desagregación del tejido para el cultivo primario.
Técnica simple y efectiva en
tejidos suaves:
•Cerebro
•Bazo
•Hígado fetal
Cultivos primarios
Disgregación enzimática.
Da mejores resultados cuando hay más tejido disponible.
-Adhesión célula-célula es mediada por una variedad de
Glicoproteínas:
•Moléculas de adhesión celular o CAMs.
Algunas son dependientes de Ca2+ (Cadherinas), por lo tanto para romper estas
uniones se usa EDTA o EGTA (ambos quelantes de calcio).
•Integrinas.
Se unen a la matriz mediante dominios de arginina, glicina y acido aspártico
(RGD).
También tienen dominios Ca2+ por lo tanto se ve afectado por su depleción.
•Proteoglicanos
También se unen a la matriz. Son sensibles a proteasas. Pueden ser degradados
parcialmente por glicanasas tales como hialuronidasa o heparinasa.
•Fibronectina y laminina
Componentes de la membrana basal y de la matriz.
Sensibles a proteasas.
Cultivos primarios
Evita problemas de selección por migración (que ocurre en los
explantes).
Rinde un mayor nº de células que son más representativas del tejido de
origen.
Así como las técnicas de explante primario seleccionan por migración, las técnicas
de disgregación seleccionan células resistentes al stress mecánico y a las proteasas.
Tejido embrionario.
Se dispersa fácilmente.
Rinde un mayor nº de células que proliferan fácilmente.
Tejido de recién nacido o adulto.

Menor rendimiento celular, a medida que envejece el tejido.
• Debido al inicio de la diferenciación.
• Aumento del tejido conectivo fibroso y matriz extracelular.
• Disminución del pool de células indiferenciadas (células madre).
Cultivos primarios
Tipos de enzimas.
• Tripsina. Corta enlaces peptídicos en que estén implicados los AA básicos
arginina y lisina. En laboratorios de cultivo se emplea tripsina purificada.
• Elastasa. Corta enlaces peptídicos adyacentes a AA neutros. Empleada en la
disociación de tejidos conectivos, usualmente junto con tripsina o colagenasa.
• Colagenasa. Hidroliza los enlaces peptídicos del colágeno (Tipo I, II, III y IV)
liberando fragmentos cortos. Recomendada en aislamiento de islotes donde es
crítico el mantenimiento de la integridad de los receptores (también en tumores).
• Pronasa. Alternativa a tripsina en la disociación celular en cultivo. Habitualmente
se utiliza junto a colagenasa.
• DNAsa I. Se utiliza para la degradación de ADN que se libera como consecuencia

de la lisis celular, el que incrementa la viscosidad, dificultando la manipulación.
• EDTA. Ácido Etilendiaminotetraacético. Se utiliza en tampón fosfato salino sin
Ca2+ ni Mg2+ junto con la tripsina para aumentar la disociación celular.
Cultivos primarios
Escala de intensidad digestiva de las enzimas utilizadas en
Cultivo Celular.
Grados de tripsina:
•Más pura
•Menos tóxica.
•Efecto más predecible.
•Extracto crudo
•Más efectiva.
•Puede tener presente
otras proteasas.
•En la práctica
•Se recomienda evaluar la
viabilidad celular luego de cada
tratamiento con estos
preparados.
Cultivos primarios
Disgregación enzimática de tejido para la obtención de cultivos
primarios: 1) Tripsina en caliente.
Se realiza a 37°C
Células disociadas desde el baño de
tripsina.
Colectar cada media hora.
Remover tripsina por centrifugación y
neutralización con medio conteniendo
suero.
Util para obtener grandes cantidades de

tejido:
•Tejido de embriones de ratón
•Tejido de embriones de pollo etc.
Cultivos primarios
primarios: 2) Tripsina en frío.
4°C por 6-18 horas

•Mayor rendimiento de células.
•Preserva más tipos celulares que el método

en caliente.
•No hay agitación.
•No hay centrifugación

Cultivos primarios
primarios: 3) Disgregación con Colagenasa.
•Técnica simple y efectiva en muchos

tejidos:
•Adulto
•Embrionario
•Normal
•Maligno (tumor)
•Bueno para tejidos muy fibrosos o

demasiado sensibles a la tripsina.
•Particularmente útil para el cultivo de

tumores.
Cultivos primarios
Resumen.
•Crecimiento desde explantes primarios es lento y altamente selectivo.
•Digestión enzimática da más trabajo, pero se obtiene mayor rendimiento y el cultivo es más
representativo del tejido de origen. Eso si, hay potencial riesgo proteolítico de las enzimas utilizadas.
•Desagregación mecánica es rápido pero puede producir daños a las células en particular el método
del pipeteo y el de la jeringa.
Subcultivos y Líneas celulares
Cultivos Primarios: Cultivo de células, tejidos u órganos tomados
directamente del organismo y puestos a crecer en un medio artificial.
Línea celular: Una vez que un cultivo primario es subcultivado
(pasajeado) se conoce como línea celular.
Este término implica la presencia de diferentes linajes celulares ya sea de
fenotipo similar o distinto.
La necesidad de subcultivar implica que el cultivo

primario ha ocupado todo el espacio disponible en
la placa de cultivo (confluencia).
Cultivos Primario Línea celular

Subcultivo
(Heterogéneo) (Homogéneo)
1º subcultivo Cultivo secundario Cultivo terciario

Resumen.
Tejido
Cultivo primario
Sub-cultivo
Cultivo secundario
Sub-cultivo
Línea celular
Aislamiento de células Sub-cultivos sucesivos
Inmortalización
Pérdida de control Senescencia
Línea celular clonal del crecimiento celular
Línea celular transformada
Línea celular inmortalizada
Terminología.
Cepa celular: es el nombre que recibe una línea celular que ha sido identificada
por tener ciertas características especificas que la hacen propia. Estas cepas celulares
se pueden separar por:
Clonación.
Separación celular física.
O por cualquier otro método de selección.
Línea celular contínua: Si una línea celular se transforma in vitro, da lugar a una
línea celular contínua.
Cepa celular contínua: Si es seleccionada o clonada y caracterizada, se conoce

como cepa celular continua.
Número de pasaje: Es el número de veces que el cultivo ha sido sub-cultivado.
Número de generación: Es el número de doblaje a que ha sido objeto la población

celular.
Edad del cultivo
•Líneas celulares con vida media limitada se les conoce como “líneas
celulares finitas” y se comportan de una manera bastante
reproducible.
•Crecen un número limitado de generaciones celulares (entre 20 y 80
poblaciones de doblaje celular) antes de la extinción.
Número de doblaje depende de:

De la especie de origen del tejido.
Una línea celular continua ha
Diferencias en el linaje celular. escapado de la senescencia por lo
Variación clonal. que el nº de generaciones deja de
ser relevante en términos prácticos.
Condiciones de cultivo.
Designación de las líneas celulares
•A las nuevas líneas celulares se les da un código o designación.
P. Ej. “normal human brain” (NHB).
•Se les puede asignar un Nº de la línea celular, si

varias líneas celulares se derivaron de la misma
fuente.
P. Ej. NHB1, NHB2 etc
NHB1 NHB2
•Y si es clonada, un nº de clon.
P. Ej. NHB2-1, NHB2-2 etc.
NHB2-1 NHB2-2
Se debe tener un libro de registro o base de datos donde se mantenga

la información de cada cultivo.
Designación de las líneas celulares
• Para líneas celulares contínuas: se suele agregar un número “p” al
final para indicar el nº de pasajes desde la última vez que se
descongeló.
P. Ej. HeLa-S3/p4
También se suele agregar el prefijo del laboratotrio. Pej. NCI (National Cancer
Institute; SK(Sloan Kattering) etc.
Algunas líneas celulares utilizadas comúnmente.
Elección de la línea celular
•Finita v/s contínua: una línea celular continua es más fácil de
mantener, crece más rápido, rinde más y se adapta más fácilmente a
medios libres de suero.
•Normal o transformada: es importante si es que la línea está
transformada malignamente o no.
•Especie: líneas celulares “no-humanas” tienes menos restricciones
de bioseguridad.
•Características de crecimiento:
Tiempo de doblaje de la población.
Densidad de saturación (rendimiento por frasco).
Habilidad para crecer en suspensión.
Elección de la línea celular
•Validación: cuan bien caracterizada está la línea celular. Se puede
caracterizar?, hay posibilidad de contaminación cruzada con otras
líneas?.
•Caracterización fenotípica: expresa la línea celular las

características deseadas?
Mantenimiento de rutina
Iniciado el cultivo un cultivo primario o un subcultivo de una línea celular, este necesitará
un cambio de medio o alimentación (feeding).
En células no-proliferantes el medio también debe ser cambiado ya que hay acumulación
de metabolitos y/o degradación de otros constituyentes esenciales.
El intervalo entre cambio de medio depende del metabolismo de cada línea celular (cada 4
días para células de gran crecimiento p.ej: Hela o 1 vez cada 1, 2 o 3 semanas p.ej. células
no-transformadas).
Significancia de la morfología celular.

Las células deben ser observadas regularmente para confirmar la ausencia de
contaminación.
También se deben observar por cualquier signo

de deterioro.
•Granulación alrededor del núcleo.
•Vacuolación citoplasmática.
• Redondeo de las células con separación del
sustrato.
Reemplazo del medio.
4 factores indican la necesidad de reemplazar el medio de cultivo.
•Una caída en el pH: la mayoría de las células dejan de crecer cuando el pH cae de
7,0 a 6,5 y pierden viabilidad entre pH 6,5-6,0. Importante chequear el color del
medio.
•Concentración celular: mientras mayor la concentración celular más rápido se
consume el medio. Generalmente se correlaciona con un cambio en el pH pero no
siempre.
•Deterioro morfológico: células normales (fibroblastos diploides), usualmente
detienen su crecimiento a alta densidad y quedan arrestadas en G1 con poco
deterioro. Sin embargo, células transformadas, líneas celulares continuas y
algunas células embrionarias se deterioran rápidamente a altas concentraciones.
Este factor se puede anticipar examinando regularmente los cultivos.
•Tiempo desde el último subcultivo: El subcultivo de rutina es mejor realizarlo de

acuerdo a un estricto calendario.
Volumen de medio y superficie .
•La proporción usual de medio que se utiliza para los cultivos en
monocapa es de:
0,2–0,5 mL/cm2
•Si se utiliza un mayor volumen de medio, esto puede afectar la

adecuada difusión de gases.
Subcultivo o pasaje celular.
Cuando una línea celular es subcultivada, la regeneración de las células hasta el punto de la
próxima generación sigue usualmente un perfil estándar.
Fases del crecimiento celular.

• Periodo de latencia (Lag phase). Fijación al
sustrato e inicio del ciclo celular.
• Fase de crecimiento exponencial (log phase).

Periodo de gran crecimiento celular, el número de
células se duplica aproximadamente cada 24 horas.
• Fase de confluencia: Cuando la densidad celular

(células/cm2 de sustrato) alcanza un nivel que
ocupa toda la superficie o cuando la concentración
celular excede la capacidad del medio, el Se subcultiva
crecimiento se detiene (monocapa: inhibición por En este punto
contacto; suspensión: consumo del medio). o se cambia el medio
• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en una fase
de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.
Subcultivo o pasaje celular.
Lag Phase Entrando a
Log Phase
Mitad de Terminado la
Log Phase Log Phase
Subcultivo.
Distintas líneas celulares en confluencia.
• En células adherentes involucra:

Remoción del medio de cultivo.
Disociación de las células en medio conteniendo
tripsina (o de forma mecánica).
Algunas líneas celulares no se disocian en tripsina por
lo que es necesario el tratamiento con otras proteasas
como p. ej. Pronasa, dispasa, colagenasa etc.
Subcultivo en la práctica.
Observar confluencia celular
Remover el medio gastado

70-80% confluence 100% confluence
Lavar con PBS

¿Por qué subcultivar?
Incubar con Para mantener las células en cultivo
(evitar sobre-crecimiento).
tripsina/EDTA
Para incrementar el número celular
Resuspender en medio para experimentos o para congelar.
conteniendo suero
Transferir a un frasco de cultivo

Subcultivo en la práctica.
Ciclo de crecimiento celular.
El subcultivo de rutina conduce a la repetición de un protocolo de ciclo de crecimiento lo que
permite controlar la concentración de sembrado y la duración del crecimiento antes del
subcultivo, y por ende la duración de los experimentos, y el tiempo aproximado para
muestreo para tener la mayor consistencia.
En las distintas fases del ciclo de

crecimiento las células se comportan
distinto respecto a proliferación,
actividad enzimática, glicólisis,
respiración, síntesis de productos
especializados etc.
Si las células están creciendo apropiadamente deberían alcanzar la misma

concentración (peak) después del mismo tiempo (si se mantiene constante la
concentración de siembra y el intervalo de subcultivo).
Subcultivo de células en suspensión.
Para células no adherentes (P. ej. células tumorales).
No se remplaza el medio, simplemente se diluye y expande.

Este sistema de cultivo tiene varias ventajas:
•No se requiere tripsina por lo que el subcultivo es
más rápido.
•Es menos traumático para las células.
•Escalamiento es más fácil.
Criterios para el subcultivo son similares al de las
células en monocapa:
•pH
•Concentración celular (no debe exceder 1x106 cels/ml).
•Tiempo desde el último subcultivo.
Subcultivo.

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Cultivos Primarios, subcultivos y líneas

2. Aislamiento del tejido

3. Disección y/o desagregación

4. Cultivo (incubación) después del

PROTOCOLO AISLAMIENTO DE CÉLULAS ALIMENTADORAS:

PROTOCOLO AISLAMIENTO DE CÉLULAS ALIMENTADORAS:

•Disponer el útero junto a los

•Liberar los embriones de las

•Remover la cabeza (j).

•Cortar los embriones (k).

•Transferir los fragmentos a un

• o a un matraz Erlenmeyer para

•Pararlo sobre un vaso pp y romper la

•Sacar la cáscara (c) y membrana (d).

•Se observan el sistema vascular y

•Tomar esta estructura con una pinza.

•Retirarlo del huevo (h).

•Colocarlo en una placa de disección (i).

2. Recolección del tejido:

•Esto se colocaba en un cubre-objeto que estaba invertido

•Aunque aún se utiliza, ha sido reemplazada por un método más

Involucra la disección del tejido.

Primary explant culture from Outgrowth after removal of explant,

Tejido de recién nacido o adulto.

• DNAsa I. Se utiliza para la degradación de ADN que se libera como consecuencia

Util para obtener grandes cantidades de

4°C por 6-18 horas

•Preserva más tipos celulares que el método

•No hay agitación.

•No hay centrifugación

•Técnica simple y efectiva en muchos

•Bueno para tejidos muy fibrosos o

•Particularmente útil para el cultivo de

•Crecimiento desde explantes primarios es lento y altamente selectivo.

La necesidad de subcultivar implica que el cultivo

Cultivos Primario Línea celular

1º subcultivo Cultivo secundario Cultivo terciario

Cepa celular contínua: Si es seleccionada o clonada y caracterizada, se conoce

Número de pasaje: Es el número de veces que el cultivo ha sido sub-cultivado.

Número de generación: Es el número de doblaje a que ha sido objeto la población

Número de doblaje depende de:

•Se les puede asignar un Nº de la línea celular, si

Se debe tener un libro de registro o base de datos donde se mantenga

•Caracterización fenotípica: expresa la línea celular las

Significancia de la morfología celular.

También se deben observar por cualquier signo

Este factor se puede anticipar examinando regularmente los cultivos.

•Tiempo desde el último subcultivo: El subcultivo de rutina es mejor realizarlo de

•Si se utiliza un mayor volumen de medio, esto puede afectar la

Fases del crecimiento celular.

• Fase de crecimiento exponencial (log phase).

• Fase de confluencia: Cuando la densidad celular

• En células adherentes involucra:

Remover el medio gastado

Lavar con PBS

Transferir a un frasco de cultivo

En las distintas fases del ciclo de

Si las células están creciendo apropiadamente deberían alcanzar la misma

No se remplaza el medio, simplemente se diluye y expande.

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