UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE

MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CÉLULA 1

GRUPO: 5588

-MINI PREPARACIÓN DE PLÁSMIDOS

-TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON pGLO

PROFESOR:
Felipe Alcántara Sánchez

ALUMNAS:

Rosales Ortega Xóchitl G.

Jiménez Bautista Araceli P.
Gómez Jiménez Martín.
Pantiga Fabiola.

INTRODUCCIÓN:
Muchas bacterias poseen información genética contenida en moléculas de ADN distintas
a las del cromosoma bacteriano, denominadas plásmidos.

Las células y los plásmidos se incuban juntos a 0°C en soluciones de cloruro de calcio,
posteriormente se da un incremento de temperatura al medio de entre 37 y 43°C,
alternativamente se puede utilizar un choque de corriente eléctrica en una técnico
denominada electroporación.

Los plásmidos pueden clasificarse según distintos criterios, por ejemplo por su tamaño
en pb, su número de copias en la bacteria o por el tipo de genes que porta (plásmidos
de virulencia, plásmidos de resistencia a antibióticos, etc.) También pueden clasificarse
en grupos de incompatibilidad. Se dice que dos plásmidos pertenecen al mismo grupo
de incompatibilidad si son incapaces de coexistir en la misma célula bacteriana. Muchos
plásmidos, en general los de mayor tamaño (que pueden portar hasta 50 o 100 genes),
suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a otra mediante un proceso llamado
conjugación Estos plásmidos de conjugación codifican todos los factores necesarios para
su transferencia.

La adquisición de ADN plasmídico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios
distintos a la conjugación, como transformación, transducción mediada por fagos o
incorporación en el cromosoma.

Los plásmidos son moléculas circulares de DNA que se replican de manera

independiente al cromosoma de la célula hospedera. De manera natural se encuentran
en las bacterias en tamaños que van desde 5000 hasta 400000 pb. Estos pueden ser
introducidos en las células bacterianas por un proceso denominado transformación
artificial.

La transformación genética literalmente significa un cambio causado por genes e

involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las
características del organismo. Es un proceso por el cual las células captan DNA libre
presente en el medio. Para que la transformación tenga lugar, la bacteria tiene que
encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas
condiciones fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y
membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleícos en la célula.

La transformación genética se usa en muchas áreas de la biotecnología. En agricultura,

se pueden introducir en las plantas, por transformación, los genes que codifican
características como la resistencia al frío, a los pesticidas o a la sequía. En
biodegradación, las bacterias se pueden transformar con genes que las hagan capaces
de digerir los vertidos accidentales de petróleo. En medicina, las enfermedades
originadas por genes defectuosos se están empezando a tratar con terapia génica,
mediante la transformación de las células del paciente con copias del gen que carecen
de la anomalía que produce la enfermedad. Los genes se pueden obtener de ADN de
humanos, animales o de plantas, e introducirse en las bacterias. En las condiciones
adecuadas, esas bacterias pueden producir auténtica insulina humana, la cual se puede
usar para tratar a los pacientes con diabetes, una enfermedad genética en la que los
genes responsables de producir insulina no funcionan correctamente.

El sistema pGLO Con el método de transformación pGLO, se transforman bacterias con

un gen que codifica la síntesis de una proteína denominada GFP (Green Fluorescent
Protein). La fuente natural de este gen es una medusa fosforescente llamada Aequorea
victoria, en la que la GFP es la responsable de que la medusa brille o emita fluorescencia
en la oscuridad. Después de la transformación, las bacterias expresan el gen de la
medusa y sintetizan la proteína, lo que les permite emitir un color verde brillante cuando
son expuestas a luz ultravioleta.
La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional a la talla del plásmido.
Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección
proporcionados por plásmidos.
Los marcadores de selección más utilizados son los genes de resistencia a antibióticos,
como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las
bacterias transformadas se cultivan siempre en presencia del antibiótico para evitar que
la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido.
Plásmidos
Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico, superenrollado, que
se replica de forma independiente del genoma y que puede ser propagado en una
población. Los plásmidos han sido descritos en varios organismos como bacterias y
hongos. Aunque la función de la mayoría de los plásmidos descritos hasta ahora se
desconoce, existen algunos que pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo
posee, como por ejemplo la resistencia a agentes antimicrobianos. La presión selectiva
que se induce al aplicar un antibiótico no específico para el tratamiento de una infección
en particular genera en algunos casos un resultado contraproducente: al aplicar por
ejemplo un antibiótico para el cual las bacterias poseen un plásmido que les confiere
resistencia al mismo, se está seleccionando precisamente por una población bacteriana
que sobrevive al tratamiento y que eventualmente puede contraatacar causando una
infección más difícil de controlar. A su vez, al ser los plásmidos transmisibles entre
poblaciones, las bacterias resistentes pueden transmitir esta información genética a su
progenie o a bacterias vecinas las cuales también se tornan resistentes. El fenómeno de
resistencia a los antibióticos es un problema causado por el mal uso de los mismos tanto
en el campo de la salud humana y la veterinaria. Esto a su vez se traduce en un reto más
 exigente para la industria farmacológica, la cual debe generar antibióticos con
formulaciones novedosas en períodos de tiempo cada vez más cortos.

Debido a algunas características como lo son bajo peso molecular (en comparación con
un genoma) replicación independiente y rastreabilidad, los plásmidos han sido
modificados en el laboratorio para su uso como herramientas de ingeniería genética.
Estos plásmidos son conocidos como vectores. Los vectores se utilizan como portadores
de información genética exógena que puede ser fácilmente aislada y amplificada en las
bacterias en un procedimiento denominado clonación de genes.

Algunas propiedades de los vectores de clonación son:

· Presentan un alto número de copias por célula
· La replicación es independiente del ADN del huésped
· Sus secuencias de nucleótidos completa es conocida para muchos vectores, lo cual
permite digerir con enzimas llamadas enzimas de restricción estas secuencias para la
posterior inserción del ADN en estudio.

La bacteria de uso más común para contener los plásmidos o vectores a utilizar en el
laboratorio con fines de clonaje es conocida como Escherichia coli. Esta bacteria es
un huésped común del tracto digestivo de mamíferos, por lo tanto el riesgo de infección
por manipulación es bajo si es manipulada adecuadamente.
 Las técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos han tenido gran desarrollo hoy
en día lo que permite obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son
la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular.

Objetivos:
· Repasar la preparación y esterilización de medios de cultivo bacteriano
· Reconocer la importancia de los vectores de clonación por medio de la extracción de
DNA plasmídico y así comprobar la presencia del inserto clonado en dicho vector.

MÉTODO:
En un medio líquido se obtuvieron colonias de E. coli y se inocularon en un matraz agregando 25
uL de ampicilina 2000x en un medio de LB que contiene pGLO, apartir de los cultivos de E.coli
saturado se obtuvieron 1.5 mililitros que se colocaron en un microtubo, se deben centrifugar para
precipitar y quitar el sobrenadante.
-Una vez teniendo los microtubos con E.coli concentrada en el punto mas bajo de los microtubos
se procede a colocar una serie de disoluciones que se prepararon en prácticas anteriores.
-La primera disolución utilizada va a precipitar el DNA al fondo del microtubo y va a formar un
botón que se debe incubar a temperatura ambiente.
-La segunda disolución interaccionó con las células para que se isaránl, se dejo incubando en
hielo durante 5 minutos.
-La tercer y última disolución aplicada a E.coli era un amortiguador de fosfatos que permitio la
completa desnaturalización de la membrana de la bacteria y generaba una mezcla de DNA y
proteinas.

Se centrifugó nuevamente y se empleo etanol para trabajar con el botón que se generó después
del proceso de la aplicación de las disoluciones, el volumen del botón dependió de la
concentración de copias del plásmido que se generaron a partir de E.coli.

Segunda sesión

Se etiquetaron 4 microtubos estériles con las letras.

D = DNA sin enzima
B = DNA digerido con BamHl
E = DNA diferido con EcoRl
H = DNA digerido con HindIII

Se le agregó a cada uno 11 uL de DNA con pGLO, 1.4 uL del amortiguador de digestión, 2 uL de
enzima, y 1.5 uL de agua destilada a excepción del tubo D que fue de 3.5 uL. Todo esto se
mezcló bien dando pequeños golpes con el dedo índice para luego centrifugar.
Para la realización del gel se hizo una disolución al 1 %, se pesó la agarosa y se le agregó el
amortiguador TAE 1x. Una vez disuelta la agarosa se depositó en la bandeja de la cámara ya
armada previamente.
Se agregó a cada tubo 3uL de amortiguador de carga con GelRed para observar el DNA después
de la electroforesis usando siempre diferente punta de micropipeta para cada uno.
Posteriormente ya mezclados bien se centrifugaron.
Se retiraron los peines y se colocó la bandeja dentro de la cámara.
Se tomó 10 uL de cada una de las muestras, 6uL de marcador de peso molecular con GelRed y
se colocaron en los pozos dejando un espacio entre cada uno para finalmente colocar la tapa
con los electrodos y conectar a la corriente y visualizar el DNA bajo la lámpara de luz UV.

RESULTADOS:
Se obtuvieron dos geles con preparaciones de plásmido.

ANÁLISIS Y CONCLUSIONES:
El objetivo inicial de la práctica era aislar el plásmido aislado de pGOL y cortarlo mediante
enzimas de restricción para medir mediante electroforesis el peso de las cadenas de nucleotidos
aisladas, para este procedimiento se necesitaba conocer que cadenas de nucleotidos que
aislaban las enzimas de restricción en sitios especificos del material genético, en este caso el
plásmido y que se generaran cadenas que corrieran diferente en el gel de agarosa por su tamaño
en relación a las pares de bases que aún conservan, después del corte de las enzimas de
restricción.
Debido a la falta de enzimas en el laboratorio, lo que se corrió en los geles de agarosa fueron
los plásmidos enteros que se obtuvieron de E.coli, por lo que se observan formas circulares en
los geles, sabemos que los plásmidos se colocaron bien en los posos y que corrieron de acuerdo
al peso y a sus características fisico-químicas como se observa en la fotografía el segundo gel
fue más evidente que logró correr el plásmido pero se encuentra muy proximo a la altura de los
otros.

Se sabe que mediante el proceso conocido como transformación bacteriana, es posible introducir
moléculas de ADN (plásmido) a bacterias (en este caso E. coli) - sólo cuando la bacteria se
presente en estado de competancia-. Por tal, dicha introducción de material genético conlleva a
que el plásmido introducido pase a formar parte del resto del ADN de la bacteria, pudiendo ser
heredado y aportando diferentes expresiones en el organismo.
Dado que las bacterias E. coli no se presentan en un estado natural de competencias, se requirió
de manipularla para hacerla competente, por ello se les expuso a choques térmicos (transiciones
súbitas entre calor y frío).

Debido a que en el proceso de transformación fue introducido el plásmido pFluoroGreen, este le

confirió un gen con información para la sínteis de proteína verde fluoresente (GFP), el cual otorga
a la bacteria resistencia a la ampicilina y la propiendad de fluorescer cuando ésta es expuesta a
la luz UV. Se puede concluir que el proceso de transformación se llevó a cabo de forma
satisfactoria puesto que se obtuvieron preparaciones fluorescentes a la luz UV .

FUENTES DE CONSULTA:

● Rodríguez E. et al. Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio.

2010.

● Biología Molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006.

Disponible en: http://genemol.org/biomolespa/plasmidos/plasmidos-01.html

● Biología Molecular, Cochabamba, Bolivia, abril 2006.

Disponible en: http://genemol.org/biomolespa/plasmidos/plasmidos-01.html