L10: Determinación Espectrofotométrica de Hierro en una Muestra Problema

1. Objetivo

Determinar la concentración de hierro total en una muestra problema por espectrofotomatría

usando el método de curva de calibración.

2. Fundamento

La espectrofotometría se basa en que la absorción de luz por el analito a determinada

longitud de onda es dependiente de la concentración de dicho analito en una muestra
generando transiciones electrónicas a un estado mas exitado. La técnica en la región visible
utiliza la luz blanca emitida por una lámpara de tungsteno que se puede descomponer mediante
una red de difracción para obtener bandas angostas de radiación comprendidas entre 10 y 1000
nm (Skoog, Holler, & Crouch, 2001).

Las medidas de absorción en las regiones ultravioleta y visible se utilizan ampliamente para
identificar y determinar una enorme cantidad de especies inorgánicas y orgánicas. Es probable
que los métodos de absorción molecular en las regiones ultravioleta/visible sean los más
utilizados de todas las técnicas de análisis cuantitativo en los laboratorios químicos,
ambientales, forenses y clínicos en todo el mundo(Skoog et al., 2001)

La UV-visible presenta 3 regiones:

Región visible: comprendido desde 400 a 800nm
Región ultravioleta cercano: Llamado también de cuarzo 200 a 400nm. La atmósfera es
transparente a esta radiación.
Región ultravioleta lejano: Denominado Vacío, comprende longitudes minores a 200nm. En
este rango los gases de la atmósfera abserven la radiación. Se debe trabajar en vacío para
eliminar las señales del aire.
 Fig. N°1 Proceso de absorción de la radiación monocromática
Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija)
y concentración de un cromóforo en solución:
𝐼
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔 = − log 𝑇 = ℇ. 𝐶. 𝑙
𝐼𝑜
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor
número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante de
proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es específica de cada cromóforo.
Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud
(l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en
M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1cm-1. Este coeficiente así expresado, en
términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extinción molar (ε)(Díaz et al., 2010).

Fig. N°2 Curva de máxima absorvancia y curva de calibración

3. Materiales y reactivos

 5 fiolas de 25 mL
 1 fiola de 100 mL
 2 vasos de 50 mL
 2 vasos de 100 mL
 01 bageta de vidrio
 01 espatula
 01 pipeta volumétrica de 5mL
 01 micropipeta eppendorf 5000 µL
 01 propipeta
 1 muestra problema
 Hierro hemínico 0,0100g
4. Equipo
 Espectrofotómetro Shimadzu con celda de 1 cm
 Celdas de cuarzo (2)
5. Procedimiento

5.1 Determinación de la longitud de onda de máxima absorción

Medir con una micropipeta 2500 µL de la solución patrón de hierro, transferirlo a una fiola de 25
mL, enrasar a volumen con agua destilada. Realizar el barrido espectral de 190 a 800 nm, usando
celda de cuarzo y como blanco agua destilada. Determinar la máx adecuada para nuestras medidas
de absorbancia por adición estándar.

5.2 Curva de Calibración

Preparar la solución patrón de 100mL de concentración de 100ppm a partir de una muestra de

0,0100g hierro heminico y a continuación preparar una serie de diluciones en fiolas de 25mL con
concentraciones de 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 y 20,0 ppm. Seguidamente enrasar a volumen con agua
destilada. Finalmente leer las absorbancias a la máx haciendo una barrido espectral, con celdas de
cuarzo y de blanco agua destilada.

5.3Análisis de la muestra

En fiolas de 25 mL 3,5 mL de la solución diluida de la muestra, enrasar a volumen con agua destilada.
Leer las absorbancias a la máx obtenida, con celdas de cuarzo y blanco como agua.

6. Bibliografia

Díaz, N. A., Ruiz, J. A. B., Reyes, E. F., Cejudo, A. G., Novo, J. J., Peinado, J. P., … Fiñana, I. T. (2010).
Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. SAE Technical Papers,
1–8. https://doi.org/10.4271/841496
Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2001). Principios de análisis instrumental (sexta edic;
McGraw Hill, ed.). Madrid, España.
 7. ANEXO

Anotaciones relevantes para la lectura de absorbancia

1 Encender

2pc control-f4

3poner el método

4rango 800-190 todo el rango uv visible

5scan speed: medio

6intervalo

7conect, autozero sin celdas (autocero, recomendable usar para metodo fotometrico)

8colocar las celdas blanco

9baseline -> ok

10retirar el blanco y colocar la muestra

11star

12guardar archivo

13save as

14spectrum file_data print table(*.txt)

15colocar nombre de archivoajustar gráfica: clic derecho_customize_limits_ejeX y Yver picos: Peak

pick