Caracterización de Microorganismos en

Aire Interior de la Universidad Autónoma

de Madrid.

Sánchez Muñoz, Marta(1); Díaz Portuondo, Emiliano

Enrique(2); Cobas Pupo, Guillermo(1); Amils Pibernat
Ricardo (2); Sánchez Cabrero, Benigno(1).

(1)
Lab. de Aplicaciones Ambientales de la Radiación
Solar en Aire. CIEMAT-DER. Avda. Complutense, 22,
Edif.42.

28040 Madrid, España.

Tel. +34913466417. Fax 913466037. *E-mail:

benigno.sanchez@ciemat.es

(2)
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Facultad
de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid.
Cantoblanco

28049-Madrid

Tel. +34914978080.

Resumen:

Se ha realizado un muestreo de microorganismos suspendidos en el aire

interior de varios edificios de la Universidad Autónoma de Madrid. El análisis de las
muestras se ha llevado a cabo por dos vías paralelas: por un lado se utilizaron
técnicas de Microbiología Clásica (crecimiento y aislamiento de microorganismos) y
por el otro se emplearon técnicas de Biología Molecular (PCR, DGGE y
secuenciación), siendo ambas vías complementarias. Los resultados muestran la
existencia de una amplia diversidad microbiana en la que se destacan especies
bacterianas de los géneros Sphingomonas, Acinetobacter, Pantoea, Micrococcus y
Staphylococcus entre otras.

Palabras clave:
Microbiología, Ecología Molecular, Bioaerosoles.
1. INTRODUCCIÓN:

El hombre permanece alrededor de un 90% de su tiempo en el interior de

edificios, en muchos de los cuales la calidad del aire interior se encuentra
disminuida por la acumulación de compuestos orgánicos volátiles (COVs), bacterias,
hongos, etc., que han propiciado la aparición de una sintomatología específica
denominada Síndrome Del Edificio Enfermo (SEE), así como alergias, asma y otras
enfermedades.

La calidad del aire interior en los edificios modernos precisa de una mejor
caracterización del contenido en los bioaerosoles allí existentes. Cualquier foco de
crecimiento de microorganismos puede conducir a la diseminación e incremento de
estos organismos por toda la estructura edificada y al contrario de lo que sucede
con los contaminantes químicos, los biológicos son capaces de reproducirse, por lo
que es necesario el mantenimiento de sus niveles lo mas bajos posibles.

Durante mucho tiempo, la identificación de microorganismos ha dependido

de la obtención de cultivos puros mediante la utilización de técnicas de aislamiento
y purificación. Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos de
laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del ecosistema microbiano
[1]. Amann y colaboradores han estimado que en la mayoría de los casos solo se
cultiva un 1% del total de los organismos unicelulares de un sistema [2]. Por otra
parte, a la hora de identificar microorganismos la morfología no suele ayudar
mucho y las características fisiológicas pueden, a menudo, ser ambiguas. En
cambio, la identificación utilizando secuencias de ADN o ARN resulta sencilla y
sobre todo fiable. En la actualidad la filogenia microbiana se basa en la información
que nos proporcionan los ácidos nucleicos, particularmente el ARN de la subunidad
ribosomal menor (ARNr 16S en procariotas). De este modo, las técnicas de biología
molecular nos permiten estudiar la biodiversidad de un sistema, así como hacer
estudios filogenéticos de los organismos que forman la comunidad. Sin embargo, la
información fisiológica que nos dan estas metodologías es mucho menor que la que
nos proporciona las tecnologías clásicas, por lo que para el estudio completo de un
sistema conviene, en la medida de lo posible, combinar ambas metodologías [3].
 En el presente trabajo se ha llevado a cabo una caracterización de
microorganismos del aire interior de varios edificios de la Universidad Autónoma de
Madrid. El análisis de las muestras se realizó por dos vías paralelas basadas en
técnicas de microbiología clásica combinadas con técnicas de biología molecular.

2. MATERIALES Y MÉTODOS:

Se realizó un muestreo en La Universidad Autónoma de Madrid,

escogiéndose varios puntos similares frecuentados por alumnos, en facultades
distintas.

Punto 1: Pasillo en el Edificio de la Facultad de Filosofía y Letras.

Punto 2: Pasillo en el Edificio de la Facultad de Ciencias del Profesorado.
Punto 3: Despacho en un Edificio de la Facultad de Ciencias.
Punto 4: Biblioteca en el Edificio de la Facultad de Psicología.

El método escogido para la toma de muestras fue la decantación

gravitatoria, la cual se llevó a cabo por dos vías paralelas, en una de ellas se
utilizaron placas Petri con los medios Agar Nutritivo (AN) (3g de Extracto de Carne,
10g de Peptona Bacteriológica, 5g de Cloruro Sódico y 15g de Agar, pH: 7,2-7,4) y
el medio de Luria-Bertani (LB) (10g de Bactotriptona, 5g de Extracto de Levadura,
5g de Cloruro Sódico y 16g de Agar, pH:7); como segunda vía se escogió una
solución isotónica basada en el Buffer Sodio Fosfato (PBS) (130mM NaCl, 10mM
Na2PO4 / NaH2PO4, pH: 7,2-7,4). Se colocaron un total de 9 placas por punto de
muestreo (3 por cada medio), que contenían AN, LB Y PBS, y se dejaron expuestas
durante 24 horas (se quiso evitar así la pérdida de información por las posibles
fluctuaciones en la carga microbiana que pueda haber a lo largo del día). El
experimento se realizó por triplicado.

2.1. Procesamiento de las muestras:

Las muestras se procesaron de dos formas distintas:

A) Medios de cultivos.
Se incubaron las placas de LB y AN a 30ºC durante 2 días, tras lo cual se amplificó
un fragmento del gen 16S (gen de ARN ribosómico) de las bacterias crecidas
mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando los cebadores
8F(5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´) y 1492R(5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-
3´) (MWG Biotech AG) (Y= C:T; M=C:A), universales de bacterias, y se analizaron
todas las colonias distintas desarrolladas en las placas. Se añadieron 0,025 u/µl de
Taq polimerasa (Roche Diagnostics) en cada reacción. Se utilizó el siguiente
programa:

94ºC (10 min) 94ºC (1min) 56ºC (1min) 72ºC (3min) 72ºC (10min)

30 ciclos

El tamaño del fragmento amplificado fue de 1484 pares de bases. Tras la

amplificación del gen 16S, las muestras se purificaron siguiendo el protocolo del kit
JeTquick, PCR purification Spin Kit 50 (GENOMED GmbH). Las muestras se
secuenciaron utilizando el cebador 1492R.

B) Solución isotónica, PBS:

Se utilizó la solución isotónica PBS para evitar la lisis celular en la toma de

muestra. Transcurrido el tiempo de muestreo, el contenido de las placas se
centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos, descartando el sobrenadante y
resuspendiendo el pellet en 50µl de PBS.
Con el fin de extraer el DNA genómico, se aplicó a las muestras un ciclo de
ruptura térmica de las células con las siguientes temperaturas:

94ºC-5 min 4ºC-1 min 94ºC-1 min 4ºC - 1min 94ºC-

3min 4ºC-5 min

Posteriormente, se amplificó el DNA siguiendo el protocolo del kit de

GenomiPhi (Amersham biosciences).
Tras la amplificación, se realizó una PCR utilizando los cebadores 341FGC
(5´- CCTACGGGAGGCAGCAG-3´) y 907R (5´-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3)´
(MWG Biotech AG) del gen 16S de bacterias (Y= C:T; M= C:A). Se añadieron 0,025
u/µl de Taq polimerasa (Roche Diagnostics) en cada reacción. Se utilizó el siguiente
programa:
 94ºC (10 min) 94ºC (1min) 52ºC (1min) 72ºC (2min) 72ºC (10min)

35 ciclos

El tamaño del fragmento amplificado fue de 566 pares de bases. Tras la

amplificación del fragmento del gen 16S las muestras se secuenciaron utilizando el
cebador 1492R.

Con el fin de identificar los distintos microorganismos presentes en la

muestra se llevó a cabo una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (DGGE)
que permite separar en un gel con gradiente desnaturalizante de urea- formamida
(20%-70%) secuencias de ADN correspondientes a unidades taxonómicas distintas,
basándose en las diferencias entre sus temperaturas de fusión. De esta forma los
fragmentos de los genes de ARNr 16S amplificados en cada muestra puede
separarse en un gel de acrilamida-bisacrilamida (Bio-rad). Tras su separación, se
procedió a cortar las bandas y a la reamplificación del fragmento del gen 16S con
los cebadores 341F y 907R (MWG Biotech AG). Las bandas se purificaron siguiendo
el protocolo del kit JeTquick, PCR purification Spin Kit 50 (GENOMED GmbH). Los
resultados de la amplificación se secuenciaron como en el caso anterior.

Las secuencias se compararon mediante BLAST con la base de datos del NCBI.
(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

En las placas con los medios de cultivo AN y LB que se mantuvieron abiertas

durante 24 horas y se incubaron a 30ºC durante 4 días, se produjo un crecimiento
significativo tanto de hongos como de bacterias (Figura 1). En esta parte del
trabajo nos hemos centrado preferentemente en la identificación de las bacterias,
considerándose importante el proceder a una oportuna identificación de los hongos
debido a su cantidad (las placas corresponden a medios diseñados para crecer
fundamentalmente procariotas) y a su capacidad de esporular, y por lo tanto de
evadir con facilidad los protocolos de eliminación de microorganismos presentes en
el aire.
 A) Agar Nutritivo B) LB

Fig.1. Detalle de las colonias de microorganismos desarrollados en distintos

puntos de muestreo y con distintos medios de cultivo.
 En la figura 2 se muestran algunos de los resultados de la amplificación del
gen 16S de ARNr de bacterias de distintas colonias aisladas de estas placas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Fig.2. Gel de agarosa (1%) mostrando los resultados de la amplificación

del gen 16S de ARNr de bacterias. M: Marcador de Peso Molecular Φ29.

La figura 3 muestra un gel con gradiente desnaturalizante de urea-

formamida 20% - 70% (DGGE) que se realizó a partir de las muestras recogidas
mediante la solución isotónica PBS. Cada carril del gel muestra distintas bandas
pertenecientes a secuencias distintas del gen 16S de ARNr. Las bandas se cortaron,
reamplificaron y purificaron para su posterior secuenciación.
 4 3 2 1 Fig 3 .Separación por DGGE de los genes de 16S ARNr
amplificados a partir de distintas muestras recogidas en PBS.
Se referencian las bandas extraídas y secuenciadas.

B1
B2

B3
B4

B7 B6 B5

El material microbiano recogido en los distintos puntos de muestreo y la

concentración de DNA genómico variaron dependiendo del lugar y la metodología
del muestreo. La secuenciación de los genes de ARNr 16S y la comparación de los
resultados con las bases de datos del NCBI muestran la presencia de un 65% de
bacterias Gram positivas, entre las que se encuentran representantes de los Fila
Actinobacteria y Firmicutes y un 35% de bacterias Gram negativas entre las que se
encuentran representantes de las clases Alfaproteobacterias,
Gammaproteobacterias y el Filum Bacteroidete.

Los resultados de la afiliación filogenética muestran la existencia de los

siguientes géneros y especies:

BLAST % de
Secuencias relacionadas similitud
Sphingomonas aerolata 100%
Sphingomonas aurantiaca 100%

Staphylococcus croceolyticus 100%

Curtobacterium flaccumfaciens 100%

Rhodococcus corynebacterioides 100%

Nocardia corynebacterioides 100%
 Arthrobacter sp 100%
Bacterium btn 15-2 99%
Arthrobacter nicotianae 99%

Dermacoccus sp. 100%

Micrococcus sp. 100%

Pantoea ananatis 99%

Pantoea agglomerans 99%

Acinetobacter lwoffii 100%

Acinetobacter lwoffii 98%

Pedobacter cryoconitis 100%

Sphingobacterium sp. 100%

Kocuria rhizophila 100%

Bacterium K87 100%

Acinetobacter sp. 100%
Acinetobacter calcoaceticus 99%

Clavibacter michiganensis 100%

Arthrobacter agilis 99%

Glacial ice bacterium G200-C1 99%
Actinobacterium RG-54 99%
M.agilis 99%

Micrococcus luteus 100%

Arthrobacter sp. 100%

Kocuria carniphila 100%

Kocuria marina 100%

Bacillus megaterium 99%

Brevibacterium sanguinis 99%

Brevibacterium aureum 99%
Brevibacterium linens 99%

Acinetobacter lwoffii 100%

Rothia sp 99%
Rothia amarae 98%
Arthrobacter crystallopoietes 98%
Arthorbacter luteolus 98%

Arthrobacter agilis 99%

Staphylococcus croceolyticus 100%

Human oral bacterium C20 100%

Acinetobacter johnsonii 100%

 Rhizobium sp. 100%
Uncultured bacterium clone CD151 100%
Uncultured sheep mite bacterium Llangefni 28 100%
Phyllobacterium myrsinacearum 100%

Uncultured alpha proteobacterium clone 07-04-39 99%

Paracoccus denitrificans 98%
Rhodobacter sp. 98%

Tabla 1: Resultados de la afiliación filogenética de las secuencias obtenidas

a partir de las placas de cultivo..

Los resultados muestran la diversidad de microorganismos en las diferentes

áreas muestreadas de la Universidad Autónoma, algunas de las cuales son
bacterias relacionadas con el entorno de los edificios, o que han sido transportadas
por los ocupantes de los mismos. Se destaca la existencia de poblaciones
bacterianas descritas anteriormente en aire y polvo, como son algunas especies del
género Sphingomonas [4]. Se han encontrado varios representantes aislados
anteriormente de piel de individuos sanos como Acinetobacter lwoffii y
Acinetobacter johnsonii [5]. Aparecen algunas especies aisladas de suelo, frutas y
vegetales, algunas fitopatógenas, como es el caso del género Pantoea, descrita
clínicamente [6,7]. Otras especies de interés son Micrococcus luteus y
Staphylococcus croceolyticus. Por lo general, las bacterias dominantes deberían ser
las correspondientes a la microbiota normal humana, es decir, bacterias Gram
positivas pertenecientes a los géneros Micrococcus y Staphylococcus.
Concentraciones ambientales altas de estas bacterias, que se encuentran en la piel
y las secreciones respiratorias, indican que los niveles de ocupación son altos y/o la
renovación del aire es insuficiente [8].

CONCLUSIONES

1- Las técnicas de Biología Molecular empleadas, permiten identificar especies de

organismos existentes en aire interior y no cultivables por técnicas convencionales.
2- Las metodologías utilizadas en este trabajo han resultado complementarias para
la realización de estudios en aire interior.
3- En los aislamientos en placas se ha observado un desarrollo importante de
hongos. Esta abundancia será objeto de estudio en los próximos meses.
AGRADECIMIENTOS:

Esta investigación se ha realizado como parte de los trabajos iniciales

para la puesta a punto de la metodología necesaria en el proyecto ARFRISOL,
financiado por el MEC(PSE-120000-205-1), en relación con la calidad del aire
interior de los edificios: Subproyecto 7.

4. BIBLIOGRAFÍA

[1] Michael.T. Madigan, John M. Martinko, Jack Parker. Brock. Biología de los
Microorganismos. Ed. Pearson Prentice Hall. Cap.18, p. 606-623 (2003).
[2] R.I. Amann, W. Ludwig, and K.H. Schleifer. Phylogenetic Identification and in
situ Detection of Individual Microbial Cells Without Cultivation. Microbiological
Reviews. 59(1), p. 143-169 (1995).
[3] Elena González, Irma Marín, José Luis Sanz, Ricardo Amils. Biotecnología y
Medio Ambiente. Ecología Molecular Microbiana. Ed.Ephemera. Cap. 2, p. 39-59
(2005).
[4] Hans-Jürgen Busse, Ewald B. M. Denner, Sandra Buczolits, Mirja Salkinoja-
Salonen, Antonio Bennasar and Peter Kämpfer. Sphingomonas aurantiaca sp. nov.,
Sphingomonas aerolata sp. nov. and Sphingomonas faeni sp. nov., air- and
dustborne and Antartic, orange-pigmented, psychrotolerant bacteria, and emended
description of the genus Sphingomonas. Journal Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53
(PT 5), p.1253-1260 (2003).
[5] Philippe J. M. Bouvet,l Sylvie Jeanjean,' Jean-Francois Vieu,' and Lenie
Dijkshoorn. Species, Biotype, and Bacteriophage Type Determinations Compared
with Cell Envelope Protein Profiles for Typing Acinetobacter Strains. Journal of
Clinical Microbiology, p. 170-176 (1990).
[6] Thierry De Baere, Rita Verhelst, Caroline Labit, Gerda Verschraegen,Georges
Wauters, Geert Claeys, and Mario Vaneechoutte. Bacteremic Infection with Pantoea
ananatis. Journal of Clinical Microbiology, p. 4393–4395 Vol. 42, No. 9 (2004).
[7] C. de Champs, S. Le Seaux, J. J. Dubost, S. Boisgard, B. Sauvezie, and J. Sirot.
Isolation of Pantoea agglomerans in Two Cases of Septic Monoarthritis after Plant
Thorn and Wood Sliver Injuries. Journal of Clinical Microbiology, p. 460–461 Vol.
38, No. 1 (2000).
[8] Ana Hernández Calleja. NTP 409: Contaminantes Biológicos: Criterios de
Valoración. Centro Nacional de Condiciones de Trabajo.