Practica 3

Determinación de proteínas por el método del Lowry

Antecedentes

El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de

técnicas analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así
como su caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más
sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la
espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y
cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de
reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un
producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.

La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas es una de las

pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio de
bioquímica. Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la
cantidad total de nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento
representa aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un
método largo y laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos
calorimétricos ha permitido solventar estos dos inconvenientes.
Entre los métodos calorimétricos destacan tres: el método de Biuret, el método de
Lowry y el método de Azul de Coomasie. Estos métodos tienen la ventaja de ser
extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10
microgramos de proteína.

Investigación previa
1. Fundamento de la cuantificación de proteína por el método de Lowrry
2. Expresa las reacciones que suceden en la cuantificación de proteína por el
método de Lowrry
3. Fundamento de la espectroscoía UV-VIS
4. Diagrama de niveles de energía en una molécula
5. Espectro electromagnético
6. Define la región UV en el espectro electromagnético
7. Define la región VIS en el espectro electromagnético
8. Define transmitancia
9. Define absorbancia
10. Explica la ley de Lambert-Beer
11. Dibuja el espectrofotómetro que utilizaras en la práctica, describe cada
 una de sus partes y su función.
12. ¿Qué es una curva patrón?
13. ¿Cómo se calcula la concentración de proteína en una muestra
biológica?

Objetivos
Conocer los componentes básicos de un espectrofotómetro
Familiarizarse con el uso y ajuste del espectrofotómetro.
Conocer los cuidados del instrumento
Elaboración de una curva patrón y cuantificar la concentración de proteína

Curva patrón
1. Rotular 6 tubos
2. Adicionar los siguientes volúmenes de Albúmina: 0 L, 20 L, 40 L, 80 L,
150L, 300 L,
3. Adicionar los siguientes volúmenes de H2O: 300 L, 280 L, 260 L, 220 L,
150L, 0 L, agitar unos segundos en vortex.
4. Adicionar 2 mL de solución E, agitar unos segundos en vortex.
5. Adicionar 100 L de Folin-Ciocalteau (1:9), agitar unos segundos en vortex.
6. Adicionar 1 mL de H2O a cada tubo, agitar unos segundos en vortex.
7. Incubar a temperatura ambiente, durante 30 min.
8. Leer la absorbancia a 660 nm.

Muestras
1. Rotular los tubos necesarios.
2. Adicionar 30 L H2O.
3. Adicionar 4 L de proteína, agitar unos segundos en vortex.
4. Adicionar 2 mL de solución E, agitar unos segundos en vortex.
5. Adicionar 100 L de Folin-Ciocalteau (1:9), agitar unos segundos en vortex.
6. Adicionar 1 mL de H2O a cada tubo, agitar unos segundos en vortex.
7. Incubar a temperatura ambiente, durante 30 min.
8. Leer la absorbancia a 660 nm.

Soluciones para cuantificación de proteína

1. Reactivo A: 100 mL de Na2CO3 al 2 % en NaOH 0.1 N.

2. Reactivo B: 5 ml de Cu SO4 .5H2O al 1%.

3. Reactivo C: 5 mL de tartrato dipotásico, C4H4K2O6 al 2%.

4. Reactivo D: Se mezclan 1:1 el reactivo B y el C.

5. Reactivo E: Se mezclan 50 mL de reactivo A más 1 mL del reactivo D, (se

desecha después de 24 h de preparado).

6. Reactivo F: 5 mL del reactivo de Folin Ciocalteu 2 N (SIGMA) más 5 mL

de agua tridestilada. También se usa sólo durante las primeras 24 h.

7. Solución concentrada de albúmina bovina, 1mg/mL, y se tomaron los

volúmenes necesarios para que las concentraciones de la curva
estándar estuvieran en la zona de 0 a 300g (con intervalos de 20 g).