Вы находитесь на странице: 1из 154

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ, МОЛОДЕЖИ И СПОРТА

УКРАИНЫ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ


«Харьковский политехнический институт»

Ю. М. Краснопольский, Н. Ф. Клещев

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ:
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ

Учебное пособие

для студентов (в т.ч. иностранных)


биотехнологического направления

В двух частях

ЧАСТЬ І

Утверждено
редакционно-издательским
советом университета,
протокол № 2 от 07.12. 2011 г.

Харьков
НТУ «ХПИ»
2012

1
УДК 615.012 (075) СОДЕРЖАНИЕ
ББК 35.66я73
К 78 Введение………………………………………………………………………..5
Глава 1. Биотехнология рекомбинантных ДНК…………………………8
1.1. Продуценты для генно-инженерной биотехнологии……………8
Рецензенты: С. М. Дроговоз, д-р фарм. наук, проф., Национальный
фармацевтический университет; 1.2. Технологические принципы получения рекомбинантных
Е. М. Бабич, д-р мед. наук, проф., ГП «Институт продуктов………………………………………………………….14
микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова 1.2.1. Векторы для введения рекомбинантных ДНК……………16
АМН Украины» Глава 2. Получение антибиотиков………………………………………...24
2.1. Этапы развития производства антибиотиков……………………24
2.2. Классификация и структура антибиотиков……………………...25
2.3. Пути биотехнологического получения антибиотиков…………..35
2.3.1. Получение антибиотиков с использованием
биосинтеза…………………………………………………..38
Посібник включає необхідні при вивченні фармацевтичної біотехнології відо- 2.3.2. Получение антибиотиков с использованием генной
мості про принципи дослідження, розробки, виробництва і використання инженерии…………………………………………………..42
біологічно активних субстанцій у фармації та медицині. .
Призначено для студентів і аспірантів біотехнологічного напрямку підготовки. 2.3.3. Получение антибиотиков с использованием
иммобилизованных ферментов……………………………45
Краснопольский Ю. М. 2.4. Условия культивирования продуцентов антибиотиков………...48
К 78: Фармацевтическая биотехнология: Производство биологически 2.5. Выделение и очистка антибиотиков……………………………...51
активных веществ : учеб. пособие : в 2 ч. – Ч. 1 / Ю. М. Красно- 2.6. Условия производства антибиотиков ……………………………52
польский, Н. Ф. Клещев. – Харьков : НТУ «ХПИ», 2013. – 304 с.–
2.6.1. Получение пенициллина…………………………………...59
На рус. яз.
2.6.2. Получение стрептомицина………………………………...66
ISBN 978-966-593-969-6 (полное изд.) 2.6.3. Получение гентамицина…………………………………...68
ISBN 978-966-593-970-2(Ч. 1)
2.7. Контроль антибиотиков…………………………………………...74
Пособие включает необходимые при изучении фармацевтической биотехноло- Глава 3. Технология получения гепаринов……….……………………...81
гии сведения о принципах исследования, разработки, производства и использова-
ния биологически активных субстанций в фармации и медицине. 3.1. Нефракционированные гепарины:
Предназначено для студентов и аспирантов биотехнологического направления выделение и характеристика……………………………………..81
подготовки.
3.2. Биотехнологическое получение низкомолекулярных
Ил. 19. Табл. 15. Библиогр.: 77 назв. гепаринов…………………………………………………………..85
3.3. Сравнительная характеристика гепаринов………..……………..96
УДК 615.012 (075)
ББК 35.66я73 3.4. Контроль и стандартизация гепаринов…………………………111
Глава 4. Биотехнологическое получение витаминов………………….116
ISBN 978-966-593-969-6 © Ю. М. Краснопольский, Н. Ф. Клещев, 2012 4.1. Производство витамина В2 (рибофлавин)……………………...123
ISBN 978-966-593-970-2(Ч. 1) © НТУ «ХПИ», 2012
4.2. Получение витамина В12 (цианокобаламин)…………...………128
2 3
4.3. Получение витамина D2………………………………………….134
4.4. Получение β-каротина.…………………………………………..137
4.5. Производство L-аскорбиновой кислоты (витамин С)…………144
4.6. Получение никотиновой кислоты (витамин РР)……………….147
4.7. Витамины в составе лекарственных препаратов………………148
Глава 5. Биотехнология получения гормональных препаратов…….155
5.1. Производство препаратов инсулина……………………………155
5.2. Производство гормона роста человека ВВЕДЕНИЕ
(соматотропный гормон)...............................................................171
5.3. Производство эритропоэтина человека………………………...180 Уважаемый читатель! Представленная Вам книга является первой
Глава 6. Новые технологии в изготовлении иммунобиологических попыткой создания обзора по биотехнологии фармацевтических активных
препаратов………………………………………………………...186
субстанций, входящих в состав профилактических, диагностических и ле-
6.1. Биотехнология вакцин…………………………………………...186
карственных препаратов: антибиотиков, гормонов, вакцин, факторов свер-
6.1.1. Живые вакцины…………………………………………...190
тываемости крови, витаминов и ряда других.
6.1.2. Рекомбинантные векторы………………………………...196
6.1.3.Субъединичные / инактивированные вакцины………….198 Невозможно сегодня представить нашу жизнь без рекомбинантных
6.1.4. Цельные патогенные организмы…………………………200 белковых субстанций, таких как, инсулин, факторы некроза опухолей, мо-
6.1.5. Белковые вакцины………………………………………...201 ноклональных антител и вакцин. Вакцинация сегодня является наиболее
6.1.6. Индивидуальные полисахаридные вакцины………….…211 эффективным методом профилактики ряда инфекционных заболеваний.
6.1.7. ДНК вакцины. Вирусная и бактериальная доставка……214 Препараты иммуноглобулинов последнего поколения и использование мо-
6.1.8. Разработка состава вакцин……………………………….220
ноклональных антител подняли терапию на качественно новый уровень.
6.2. Биотехнология цитокинов……………………………………….224
Существенно изменилось лечение человека с созданием низкомолекуляр-
6.2.1. Технология получения интерферонов…………………...229
ных гепаринов, факторов свертываемости крови и антитромбиновых пре-
6.2.2. Технология получения интерлейкинов………………….248
6.3. Биологически активные факторы……………………………….254 паратов. Активно используется в клинике группа цитокинов, представлен-
6.3.1. Колониестимулирующие факторы………………………254 ная интерферонами и интерлейкинами.
6.3.2. Факторы свертывания крови……………………………..260 Фармацевтическая биотехнология имеет большие перспективы на
6.3.3. Факторы некроза опухоли………………………………..266 мировом фармацевтическом рынке в связи с постоянным ростом потреб-
6.4. Антитромботические препараты………………………………..274 ностей здравоохранения. Среди биотехнологических препаратов присут-
6.5. Рекомбинантные белки плазмы крови………………………….278
ствуют продукты для направленного воздействия на патологические ми-
6.6. Биотехнология препаратов фагов……………………………….280
шени, в основном, парентеральные. Среди них белки и нуклеиновые кис-
6.6.1. Технологические принципы получения бактериофагов..285
лоты: вакцины, гормоны, моноклональные антитела, цитокины, факторы
Заключение………………………………………………………………….291
Список литературы………………………………………………………...297 крови, ДНК, РНК и др. Традиционные лекарственные препараты уступают
препаратам, полученным биотехнологическим путем: они чаще всего пе-
4 5
рорального применения, обладают небольшой молекулярной массой, про- и не являются технологией конкретного производителя. Попытка их вос-
изводятся с помощью химического или органического синтеза. производства не может закончиться успешно, так как приведены только
Интенсивное развитие биотехнологии, биохимии, иммунологии общие характеристики процессов, позволяющие представить и оценить со-
определило прогресс в развитии мировой фармации и создания высокоэф- временное состояние проблемы.
фективных вакцин, как традиционных, так и вакцин нового поколения; В этой публикации суммированы основные технологии, ключевые
препаратов крови, интерферонов, цитокинов и рекомбинантных продуктов проблемы и иммунологические цели создания различных видов противо-
различной направленности. С развитием технологии рекомбинантных ДНК вирусных и антибактериальных вакцин, цитокинов, биологических факто-
стало возможным создание вакцин следующего поколения, лишенных не- ров, а также производства фармацевтических активных ингредиентов для
достатков традиционных вакцин. получения антибиотиков, гормонов, витаминов и ряда других биологиче-
Вакцины являются первыми фармацевтическими препаратами, со- ски активных компонентов. Необходимо отметить, что данное учебное по-
зданными на основе биотехнологии. Все, по-видимому, началось с древних собие не имеет аналогов в Украине.
китайцев и арабов, которые много веков назад заметили, что человек, пе- Данная публикация является продолжением серии учебных пособий
ренесший оспу, редко заболевает ею вновь. В Х веке н.э. впервые в Китае НТУ «ХПИ» по специальности « Фармацевтическая биотехнология»:
была разработана вакцина против оспы. Ни одной медицинской науке че-  Фармацевтическая биотехнология: Технология производства им-
ловечество не обязано спасением стольких жизней, как вакцинологии. Со- мунобиологических препаратов (2009 г.);
зданы вакцины против 34-х социально значимых инфекций, что привело к  Фармацевтическая биотехнология: Бионанотехнология в фарма-
значительному снижению заболеваемости дифтерией, столбняком, корью, ции и медицине (2011 г.);
туляремией, полиомиелитом и исчезновению оспы.  Фармацевтическая биотехнология: Производство биологически
Широкий спектр биотехнологических препаратов, применяемый се- активных веществ, Часть І (2012 г.). Планируется выпуск Части ІІ пособия,
годня в мировой практике требует дальнейшего исследования и является посвященного технологии ряда субстанций: аминокислот, ферментов, ли-
предметом обсуждения данной публикации. Нами будут рассмотрены во- пидов и липаз, фармацевтических субстанций на основе биотехнологии
просы получения и использования ряда генно-инженерных продуктов: ин- растений и др.
терлейкины, интерфероны, цитокины, различные факторы, гормоны и дру- Можно надеяться, что представленный на суд читателей материал
гие препараты. В данной публикации подробно обсуждены современные будет способствовать развитию знаний студентов и аспирантов о произ-
технологии выделения и очистки биотехнологических продуктов, исполь- водстве, контроле и применении биологически активных веществ, полу-
зуемых для производства лекарственных препаратов: антибиотики, вита- ченных биотехнологическими методами.
мины, гепарины и другие. Отдельный раздел посвящен перспективному
направлению фармацевтической биотехнологии – созданию лекарствен-
ных и диагностических препаратов на основе фагов.
Технологии, приведенные в данной публикации, являются принци-
пиально возможными схемами получения биотехнологических препаратов
6 7
ГЛАВА 1. БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Acremonium chrysogenum, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus
thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Erwinia herbicola, Pseudomonas
spp., Rhizobium spp., Streptomyces spp., Trichoderma reesei, Xanthomonas
Наиболее активно развивающейся областью биотехнологии является campestris, Zymomonas mobilis и др. Их можно разделить на две группы:
фармацевтическая биотехнология. Мировой рынок фармацевтической микроорганизмы как источники специфических генов;
продукции, полученной с помощью биотехнологических методов, состав- микроорганизмы, созданные генно-инженерными методами для
ляет половину всего фармацевтического рынка. Существенным сегментом решения определенных задач.
фармацевтической биотехнологии являются генно-инженерные препара- К специфическим генам относится, например, ген, кодирующий
ты, полученные с использованием рекомбинантной ДНК. Причем, приме- термостабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широко при-
нение генной технологии используется для получения не только монокло- меняемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот ген был выделен из
нальных антител, вакцин, цитокинов, различных биологических факторов, термофильных бактерий и клонирован в E. Coli.
но и антибиотиков, витаминов и других лекарственных субстанций. В дан- Ко второй группе микроорганизмов относятся, например, различные
ной главе мы остановимся на биотехнологии рекомбинантных ДНК, ис- штаммы Corynebacterium glutamicum, которые были генетически модифи-
пользуемых для этого продуцентах и основных технологических принци- цированы с целью повышения продукции промышленно важных амино-
пах получения рекомбинантных продуктов. кислот.
Дрожжевые клетки. Синтезированный бактериальной клеткой эу-
1.1. Продуценты для генно-инженерной биотехнологии кариотический белок часто приходится подвергать ферментативной моди-
фикации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соедине-
В качестве продуцентов, используемых в биотехнологии рекомби- ния (во многих случаях это необходимо для правильного функционирова-
нантных ДНК, применяются прокариотические и эукариотические клетки. ния белка). К сожалению, E. Coli и другие прокариоты не способны осу-
Бактериальные клетки. Бактерия E. Coli – грамотрицательная не- ществлять эти модификации, поэтому для получения полноценных эука-
патогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Её средой обитания риотических белков используют Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи
является кишечник человека, но она также может высеваться из воды и Saccharomyces cerevisiae – это непатогенные одноклеточные микроорга-
почвы. Благодаря способности размножаться простым делением на средах, низмы с диаметром клетки примерно 5 мкм, которые во многих отношени-
содержащих только ионы Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+, Cl-, HPO42-, SO42-, мик- ях представляют собой эукариотический аналог E. Coli. Их генетика, моле-
роэлементы и источник углерода (например, глюкозу), E. Coli стала из- кулярная биология и метаболизм детально изучены. S. cerevisiae размно-
любленным объектом для научных исследований. При культивировании E. жаются почкованием и хорошо растут на такой же простой среде, как и E.
Coli на обогащенных жидких питательных средах, содержащих аминокис- Coli. Их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ из-
лоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода, время генера- давна использовались для изготовления алкогольных напитков и хлеба.
ции (т.е. время между образованием бактерии и её делением) в логарифми- Ежегодно в мире расходуется 1 млн. тонн S. cerevisiae. В 1996 году была
ческой фазе роста при температуре 37 °С, составляет примерно 22 мин. E. определена полная нуклеотидная последовательность всего набора хромо-
Coli можно культивировать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. сом S. cerevisiae, что еще более повысило ценность этого микроорганизма
Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков E. Coli (и для научных исследований. В настоящее время, кроме S. cerevisiae исполь-
другие микроорганизмы), обычно, выращивают в аэробных условиях. По- зуются и другие виды дрожжей: Klueveromyces lactis, Saccharomyces
мимо E. Coli в биотехнологии используют ряд других микроорганизмов:
8 9
diastaticus, Schizisaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Таблица 1 – Характеристика штаммов-продуцентов рекомбинантных
Hansenula polymorpha. Наиболее эффективными продуцентами рекомби- белков
нантных белков являются P. pastoris и H. polymorpha. Сегодня, с использо-
Продуценты Преимущества Недостатки
ванием дрожжевых клеток получены интерфероны, компоненты вакцин. 1. Быстрый рост культу- 1. Затруднен биосинтез
Эукариотические клетки. При всех различиях между типами эука- ры (6–12 часов от начала крупных полипептидов
риот, методические подходы к культивированию клеток насекомых, расте- посева до окончания ин- (более 50 кDa).
ний и млекопитающих имеют много общего. Первоначально берут не- дукции). 2. Отсутствует система
большой кусочек ткани данного организма и обрабатывают его протеоли- 2. Относительно высокий гликозилирования.
выход целевого продукта 3. Ограниченные воз-
тическими ферментами, расщепляющими белки межклеточного материала
(100–2000 мг/л). можности секреции бел-
(при работе с растительными клетками добавляют специальные ферменты, Бактерии: 3. Низкая цена ростовой ков.
разрушающие клеточную стенку). Высвободившиеся клетки помещают в E. Coli, B. subtillis среды. 4. Ряд геторологичных
сложную питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, 4. Низкая стоимость белков токсичны для
витамины, соли, глюкозы и факторы роста. В этих условиях клетки делятся ферментации. клеток.
до тех пор, пока на стенках емкости с культурой не образуется клеточный 5. Возможность получе- 5. Многие геторологич-
ния микрокристаллов це- ные белки образуют
монослой. Если после этого не перенести клетки в емкости со свежей пи-
левого белка (тельца только тела включения.
тательной средой, то рост прекращается. Обычно удается переносить (пе- включения). 6. Затруднено образова-
ревивать, субкультивировать) и поддерживать до 50–100 генераций исход- ние дисульфид. связей.
ной (первичной) культуры, затем клетки начинают терять способность к 1. Относительно быстрый 1. N-гликозилирование
делению и гибнут. Часто некоторые клетки перевиваемых первичных кле- рост культуры (3–5 суток дает иммуногенные
точных культур претерпевают генетические изменения, в результате кото- от начала посева до олигосахариды.
окончания индукции). 2. Не все белки эффек-
рых ускоряется их рост. Культуры клеток, которые при этом приобретают
2. Высокий выход целе- тивно секретируются.
селективные преимущества, оказываются способными к неограниченному вого продукта (до 40 г/л).
росту in vitro и называются устойчивыми клеточными линиями. У боль- 3. Очень низкая цена ро-
шинства клеток, способных к неограниченному росту, имеются значитель- стовой среды (глицерин,
ные хромосомные изменения, в частности отмечается увеличение числа Дрожжи: метанол, аммиак).
хромосом и потеря других. В биотехнологии устойчивые клеточные линии 4. Умеренная стоимость
Saccharomyces cerevisiae,
ферментации.
иногда используют для размножения вирусов и для выявления белков, ко- Pichia pastoris 5. Возможна экспрессия
торые кодируются клонированными последовательностями ДНК. Кроме крупных полипептидов
того, они применяются для крупномасштабного производства вакцин и ре- (более 50 кDa).
комбинантных белков. 6. Возможно гликозили-
Преимущества и недостатки различных штаммов-продуцентов ре- рование.
комбинантных продуктов приведены в табл. 1. 7. Секреция белка осу-
ществляется в ростовую
среду и низкий уровень
секреции протеаз.

10 11
Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии у про-  модификации аминокислот в составе белка: фосфолирование,
кариот наиболее важны следующие: ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирова-
 тип промотора и терминатора транскрипции; ние, миристилирование и пальмитоилирование.
 прочность связывания мРНК с рибосомой; Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо
 число копий клонированного гена и его локализация; наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед дан-
 конечная локализация синтезируемого продукта; ным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе,
 эффективность трансляции в организме хозяина; поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно транскри-
 стабильность продукта в клетке-хозяине. бируются. Регулируемость промотора позволяет клетке осуществлять
Для получения гетерологичных рекомбинантных белков с клониро- строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов
ванной эукариотической комплементарной ДНК (кДНК) обычно исполь- широко используется промотор хорошо изученного лактозного оперона
зуются прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случа- E. Coli. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезным для кон-
ях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются не- троля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называе-
стабильными или биологически неактивными. Кроме того, как бы тща- мым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но
тельно не проводилась очистка, конечный продукт может быть загрязнен лишенным промотора, встраивают случайные фрагменты ДНК. Если в ре-
токсичными веществами или пирогенами. Чтобы решить эти проблемы, зультате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то де-
для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использова- лают вывод, что клонированный фрагмент содержит функциональный
ния в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии. промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продукты, обу-
Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимиче- славливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который
ским, физическим и функциональным свойствам. Неспособность прокари- идентифицируется с помощью достаточно простого колориметрического
от синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном теста. Использование генов-репортеров позволяет проводить мониторинг
отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических рекомбинантных векторов, анализировать активность, например, вирусных
посттрансляционных модификаций. Белки в клетках эукариот претерпева- промоторов, намечать пути регуляции и переключения генов, осущест-
ют следующие посттрансляционные изменения: влять количественную оценку продуктов экспрессии. В качестве генов-
 образование дисульфидных связей (эту реакцию катализирует репортеров используют: хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, стрептоми-
фермент дисульфидизомераза). Неправильно уложенный белок оказывает- цинфосфотрансферазу, люциферазу светлячка, бактериальную люцифера-
ся нестабильным и неактивным; зу, гентамицин-ацетилтрансферазу и ряд других.
 протеолитическое расщепление предшественника, удаление опре- Таким образом, для получения белка с полным набором специфиче-
деленного участка полипептидной цепи с образованием функционально ских модификаций необходимо провести тестирование различных эукари-
активного белка; отических систем экспрессии и найти систему, которая воспроизводила бы
 гликолизирование (основная модификация, благодаря которой биологически аутентичный продукт.
белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях – особые свой- Эукариотические экспрессирующие векторы имеют такую же струк-
ства). Наиболее распространенная реакция гликозилирования (присоеди- туру, что и их прокариотические аналоги и должны содержать:
нение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину  эукариотический селективный маркер;
(О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликозилирование));  эукариотический промотор;

12 13
 соответствующие эукариотические сайты терминации транскрип- ные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и
ции и трансляции; расщепляет обе цепи.
 сигнал полиаденилирования мРНК. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз.
Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для
1.2. Технологические принципы получения рекомбинантных их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, со-
продуктов став и рН среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью повышения про-
дуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клони-
Технология рекомбинантных ДНК – это совокупность эксперимен- руют гены рестрицирующих эндонуклеаз в E. Coli.
тальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического ма- При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донор-
териала (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно ной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сай-
вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК синтеза- тах). Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена
торах практически в неограниченных количествах, определять последова- из бактерии E. Coli, получивших название Eco RI. Этот фермент узнает
тельность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изме- участок ДНК, содержащий специфическую последовательность из шести
нять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток пар оснований, и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в
или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функциони- каждой цепи, расщепляя связь между атомом кислорода при
ровать. 3'-углеродном атоме сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной
Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помо- группой, присоединенной к 5'-углеродному атому сахарного остатка со-
щью ряда ферментов – обязательного и незаменимого инструмента прак- седнего нуклеотида. Разрывы цепи в ДНК располагаются наискось друг от
тически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов ре- друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные
стрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз). Рестриктазы явля- концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом («липкие концы»).
ются составной частью системы рестрикции – модификации прокариоти- Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а
ческих клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Каждый
чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую
собственной ДНК в сайтах её узнавания немедленно после репликации. последовательность из 4–6 нуклеотидов. Кроме рестриктаз, расщепляю-
Чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с по- щих нуклеотидную цепь с образованием «липких концов», существуют ре-
мощью рестриктаз. стриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образова-
Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I нием ДНК с «тупыми концами».
разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III Однако ферментов рестрикции при молекулярном клонировании не-
классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Фермен- достаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями,
ты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух которые образуют «липкие концы», не столь прочны, чтобы удержать два
отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей ме- объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофос-
тилазы. Именно использование рестриктазы класса II позволило прово- фатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий
дить молекулярное клонирование, так как этот фермент узнает определен- образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных

14 15
цепей, которые удерживаются вместе при спаривании «липких концов».  наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть
ДНК-лигаза сшивает и «тупые концы». осуществлена вставка;
Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет  наличие одного или более селективных генетических маркеров
нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит ин- для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.
формацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Плазмидные векторы создаются при помощи генной инженерии. Од-
Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и ним из первых векторов был создан плазмидный вектор pBR 322 (см.
после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной Глоссарий – «Фармацевтическая биотехнология: Технология производства
ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, напри- иммунобиологических препаратов»). Для отличия трансформированных
мер, объединяются между собой фрагменты донорной ДНК и векторные клеток используют специальные маркеры. В качестве маркеров плазмида
ДНК. Для уменьшения количества последних, рестрицированную вектор-
может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибио-
ную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.
тикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к
инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные
1.2.1. Векторы для введения рекомбинантных ДНК
клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к ан-
Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных векто- тибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранив-
ра: плазмиды и бактериофаги. ших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому анти-
Плазмиды – внехромосомный генетический элемент, способный к биотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки. Для от-
длительному автономному существованию и репликации. Обычно это бора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК
двухцепочечная кольцевая ДНК. Плазмиды есть практически у всех бакте- (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к опре-
рий. Размеры плазмид достигают до 500 т.п.н. Плазмиды содержат сайты деленным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазми-
начала репликации (ori), определяющие репликацию в клетке-хозяине, без ду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в мар-
этих сайтов репликация была бы невозможна. Плазмиды могут быть пред- керный ген которого и внедрена донорная ДНК).
ставлены в клетке 10–100 копиями (высококопийные плазмиды) или 1–4 Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и вве-
копиями (низкокопийные плазмиды). На долю плазмидной ДНК обычно дения этих элементов в клетки-хозяина называется созданием геномной
приходится 0,1–5,0 % суммарной клеточной ДНК. Одни плазмиды содер- библиотеки (банка клонов, банка генов).
жат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной Следующим этапом является процесс трансформации – введение ре-
клетки в другую (F–плазмиды), другие несут гены устойчивости к анти- комбинантной ДНК в клетку-хозяина.
биотикам (R–плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических ре-
за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). агентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности,
Свойства высокоэффективного плазмидного вектора определяются чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабаты-
следующими параметрами: вают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 °С в
 небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзоген- течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению кле-
ной ДНК в E. Coli значительно снижается при длине плазмиды более точной стенки. Максимальная частота трансформации – 10-3, т.е. на каж-
15 т.н.п.; дую тысячу клеток приходится одна трансформация. Частота трансформа-

16 17
ций не бывает 100 %-ой. Для отбора используют схемы, позволяющие емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования ге-
идентифицировать трансформированные клетки. нов из фаговых в плазмидные векторы.
Эффективным методом трансформации E. Coli плазмидами являет-
ся электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим Заключение
током для увеличения их проницаемости). Необходимо отметить, что
Таким образом, для получения любого белкового продукта необхо-
электропорация в настоящее время самый эффективный и удобный, но до-
димо обеспечить транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соот-
вольно дорогой метод, используемый для генетической трансформации
ветствующей мРНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нуж-
бактерий. Для введения клонированных генов в соматические клетки
ном сайте необходим промотор, для её остановки – терминирующий ко-
также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с
дон.
клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).
Методика по клонированию включают следующие биотехнологичес-
Бактериофаги – используются в качестве носителей генетической
кие этапы:
информации. Рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в после-
1. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов
дующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфициро-
нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чу-
ванной клетке-хозяине. С этой целью применяют бактериофаг лямбда-
жеродная ДНК);
вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смы-
кается в кольцо. Бактериофаг М-13 – вирус нитевидной формы с кольце- 2. Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте
вой замкнутой ДНК, которая в клетке превращается в двухцепочечную и ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную
реплицируется в клетках-потомках. В поисках эукариотических систем последовательность, кодируемую геном;
экспрессии, для получения биологически активных белков, созданы бак- 3. Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клони-
миды – экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов для E. Coli и рования, который может реплицироваться в клетке-хозяине;
клеток насекомых. Выход рекомбинантных бакуловирусов в такой системе 4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием но-
повысился до 99 %. Клетки насекомого, инфицированные бакуловирусами, вой рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор –
синтезировали гетерологичный белок. Векторы на основе фага удобны для встроенная ДНК»;
создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций с фраг- 5. Введение этой конструкции в клетку-хозяина (реципиента), где
ментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется
переклонируют в плазмиды. трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроиз-
Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют водит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток;
космиды – плазмиды, несущие cos-участок (комплементарные липкие кон- 6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК
цы) ДНК фага лямбда. Наличие cos-участка позволяет проводить упаковку (трансформированные клетки);
ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в 7. Получение специфического белкового продукта, синтезированного
клетку путем инфекции, а не трансформации. клетками-хозяевами.
Фазмиды – это гибриды между фагами и плазмидами. Они способны Таким образом, технология рекомбинантных ДНК включает целый
развиваться как фаг и как плазмида. Уступая космидам по клонирующей
набор процедур, благодаря которым удается клонировать фрагменты ДНК,
18 19
содержащие специфические гены. Для отбора клеток, содержащих реком- сии. Предложен препарат, который помимо высокой антагонистической
бинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить ко- активности по отношению к патогенным и условно патогенным бактериям
личество кольцевых плазмидных молекул, образующихся при сшивании проявлял антивирусную активность благодаря введению генетической ин-
фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обра- формации, которая кодирует продукцию антивирусной субстанции – α-2-
батывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5′–концевые фосфатные интерферона. Для этой цели были отобраны несколько штаммов B. subtilis.
группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные Трансформацию отобранных бактериальных культур проводили плазми-
плазмиды, проводят: 1) тестирование на резистентность к определенным дами рВМВ, которые кодируют синтез секреторного (рВМВ 105) и внут-
антибиотикам или колориметрическую реакцию; 2) иммунологические те- риклеточного (рВМВ 104) интерферона. Указанные плазмиды содержат
сты или выявление специфического белка – продукта клонированного ге- ген интерферона в виде химически-синтезированного аналога гена челове-
на; 3) гибридизацию с зондом, комплементарным какому-либо участку ис- ческого лейкоцитарного α-2-интерферона. В структуре плазмиды
комого гена. Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорскую рВМВ 105 ген интерферона связан с геном сигнального пептида, гомоло-
ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной гической последовательности гена α-амилазы, который обеспечивает эф-
длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирова- фективную секрецию из клеток гетерологичного белка. Плазмида
ния крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе рВМВ 104 не имеет в своей структуре такой последовательности нуклео-
бактериофагов лямбда и З1-го, а также плазмиды F. Для получения фраг- тидов перед геном интерферона в связи с чем продуцируемый белок оста-
ментов ДНК, кодирующих эукариотические белки, на очищенной мРНК ется внутри клетки. При изучении стабильности плазмид в разных штам-
как на матрице синтезируют комплементарную цепь ДНК с помощью об- мах бацилл установлено, что максимальной стабильностью обладает плаз-
ратной транскриптазы; эта цепь в свою очередь используется в качестве мида рВМВ 105 в штаммме B .subtilis. Даже через 10 пассажей обнаружи-
матрицы для синтеза второй цепи. После ферментативной обработки эту валась 100 %-ая сохранность плазмиды. На разных экспериментальных
двухцепочечную комплементарную ДНК встраивают в вектор. Независимо инфекциях на животных изучена и подтверждена эффективность и без-
от того, какая именно стратегия клонирования используется, после иден- опасность препарата «Субалин» при пероральном введении. Интерферон
тификации клонированной последовательности необходимо показать, что α-2 человека был обнаружен во всех тестируемых органах лабораторных
она представляет собой нативный структурный ген. животных. Максимальное количество интерферона зарегистрировано в пе-
Весьма перспективным направлением генно-инженерных исследова- чени, легких и кишечнике.
ний является создание рекомбинантных препаратов на основе пробиоти- Применение плазмидных векторов используют для создания реком-
ков. После того как было установлено, что ряд бактерий способны прояв- бинантных штаммов бифидобактерий. Так, например, в Японии в настоя-
лять пробиотические свойства и благотворно влиять на здоровье человека, щее время осуществляются интенсивные исследования по использованию
началось использование технологии рекомбинантных ДНК с целью полу- модифицированных генно-инженерными методами штаммов бифидобак-
чения генетически измененных штаммов и создание пробиотических или терий для терапии онкологических заболеваний. Основанием для этого яв-
производственных культур с заданными уникальными свойствами. ляется тот факт, что штаммы бифидобактерий после системного введения
Несомненный интерес представляет один из первых рекомбинантных способны селективно локализоваться и быстро пролиферировать в грани-
пробиотиков («Субалин»), разработанный специалистами Украины и Рос- цах солидных опухолей. Используя анаэробные и непатогенные бактерии
20 21
B. Longum, в экспериментах удалось доставить в опухоль определенные Контрольные вопросы
терапевтические гетерологичные гены, в том числе компоненты системы
пролекарство – фермент – лекарство. Для этой цели была сконструирована 1. Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важ-
плазмида рBLES 100S-eCD, включающая ген цитозиндезаминазы. Транс- ны для технологии рекомбинантных ДНК?
формированные этой плазмидой B. longum были способны продуцировать 2. Опишите применение плазмиды hBR322 в качестве вектора. Ка-
кими особенностями они обладают?
цитозиндезаминазу в гипоксических опухолях, что приводило к локальной
3. Опишите основные преимущества и недостатки использования в
конверсии системно вводимого нетоксичного 5-фторцитозина в токсичное
качестве штаммов продуцентов рекомбинантных белков дрожжей и бакте-
для тканей соединение 5-фторурацил. Противоопухолевый эффект от при-
рий.
менения этого продукта был продемонстрирован на модели крыс с опухо- 4. Что означает процесс «электропорация» и для чего её применяют?
лями молочных желез при введении трансформированных B. longum непо- 5. Опишите структуру плазмид и охарактеризуйте плазмидные век-
средственно в область опухоли или внутривенно. При этом анаэробная B. торы.
longum накапливается в гипоксических солидных опухолях (анаэробная 6. Опишите способы введения рекомбинантных плазмид в грамотри-
среда опухоли). В настоящее время проходит испытания противоопухоле- цательную бактерию, например, E. Coli.
вый препарат рекомбинантных бифидобактерий (продуцирует цитозиндез- 7. Какова структура бактериофагов?
аминазу) под кодовым названием «APS001» селективно накапливающийся 8. Привести примеры фармацевтических субстанций на основе ре-
в гипоксической среде опухоли. Созданы рекомбинантные штаммы бифи- комбинантных белков.
добактерий, являющиеся продуцентами ферментов: α-амилазы и глутамат- 9. Что представляет собой банк клонов и каким образом создаются
банки клонов?
дегидрогеназы.
10. Почему часто прибегают к частичному гидролизу для создания
Таким образом, сегодня генно-инженерная технология позволяет по-
банков клонов?
лучать штаммы-продуценты многих белковых субстанций: ферментов,
11. Каковы отличительные особенности прокариотической клетки?
различных факторов, гормонов, вакцин, цитокинов и других компонентов 12. Каковы отличительные особенности эукариотической клетки?
фармацевтических препаратов. Кроме того, несомненный интерес пред- 13. Указать основные биотехнологические этапы методики клониро-
ставляют рекомбинантные штаммы пробиотиков, например, бифидобакте- вания.
рий или бацилл, которые, попадая в организм человека или животных спо- 14. Каковы основные методы анализа генетически модифицирован-
собны продуцировать запрограммированные биологически активные ве- ных организмов?
щества. 15. Что представляют собой трансгенные животные? Охарактеризуй-
те технологию их получения.
16. Классификация векторов, применяемых в генной инженерии.
17. Привести данные об областях применения рекомбинантных
микроорганизмов.
18. Какие преимущества у рекомбинантных штаммов пробиотиче-
ских микроорганизмов?

22 23
ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ  1942 г. – М. Г. Бражникова и Г. Ф. Гаузе выделили грамицидин С.
 1944 г. – С. А. Ваксман открыл стрептомицин, образуемый лучи-
стыми грибами рода Actinomyces (Streptomyces griseus).
2.1. Этапы развития производства антибиотиков Применение пенициллина в борьбе с различными инфекционными за-
болеваниями (пневмонии, сепсиса, гнойных инфекций кожи, дифтерии, сифи-
Широкое применение антибиотиков для лечения инфекционных за- лисе, гонореи, скарлатине и др.) и воспалительными процессами явилось
болеваний помогло сохранить миллионы жизней. Большинство основных мощным стимулом для поиска новых, еще более эффективных антибиотиче-
антибиотиков получено из грамположительной почвенной бактерии ских веществ, образуемых различными группами микроорганизмов (бакте-
Streptomyces. В тоже время существует ряд антибиотиков, выделенных и из риями, актиномицетами), низшими растениями (дрожжами, водорослями,
других грамположительных и грамотрицательных бактерий. плесневыми грибами, высшими грибами), высшими растениями и живот-
Историю развития науки об антибиотиках можно представить ными организмами.
следующим образом:
 1870 г. – Д. Сандерсон обнаружил отсутствие роста бактерий в 2.2. Классификация и структура антибиотиков
среде, содержащей плесень;
 1872 г. – Д. Листер доказал способность Penicillium glaucum по- Ядро молекулы пенициллина – 6-аминопенициллановая кислота
давлять рост бактерий; (6-АПК) – состоит из 4-членного -лактамного (А) и 5-членного тиазоли-
 1871–1872 г.г. – А. Г. Полотебневым показано, что молодая куль- динового (В) колец (см. рис. 1). Пенициллины отличаются характером ра-
тура зеленой плесени – грибы рода Penicillium способны задерживать раз- дикала в боковой цепи. Наиболее ценным оказался бензилпенициллин (ра-
витие возбудителей кожных заболеваний человека; дикал = СН2–С6Н5) поэтому при выращивании гриба продуцента, напри-
 1877 г. – Пастер Л., Джеберт С., Лебединский И. опубликовали мер, Penicillium crustosum процесс биосинтеза направляют в сторону обра-
сообщение о росте Bacillus anthracis анаэробными бактериями; зования преимущественно бензилпенициллина. После выделения в 1959
 1889 г. – А. Вюимен предложил термин «антибиотик», обознача- году из Penicillium chrysogenum 6-АПК появилась возможность химическо-
ющий действующий агент процесса «антибиоза», т.е. сопротивления, ока- го синтеза новых пенициллинов путем присоединения к ним различных
зываемого одним живым организмом другому; радикалов к свободной аминогруппе. Известно более 15000 полусинтети-
 1894 г. – И. И. Мечников обратил внимание на возможность ис- ческих пенициллинов, однако лишь немногие превосходят пенициллин по
пользования некоторых сапрофитных бактерий в борьбе с патогенными антибактериальной активности (ампициллин, оксациллин и др.). Пеницил-
микроорганизмами; лины выпускаются в виде хорошо растворимых в воде натриевых и калие-
 1929 г. – А. Флеминг впервые выделил комплекс пенициллинов из вых солей.
Penicillium notanum;
 1939 г. – Р. Дюбо впервые выделил тиротрицин из почвенной
споровой аэробной палочки Bacillus brevis;
 1940 г. – Х. Флори, Дж. Чейн выделена субстанция пенициллина;
 1941 г. – начато клиническое применение очищенного пеницил-
лина;

24 25
S цеводстве, пчеловодстве и растениеводстве, а отдельные антибиотические
CH3
вещества – и как стимуляторы роста животных.
H2N C C C 3. При широком применении антибиотиков в качестве лечебных пре-
A B CH3
паратов происходит быстрое накопление резистентных к этим соединениям
O C N CH COOH
форм микроорганизмов. Проблема резистентности микроорганизмов ставит
задачу замены одних антибиотиков другими, то есть поиска все новых и
Рисунок 1 – Структура молекулы пенициллина – новых антибиотических веществ.
6-аминопенициллановая кислота 4. Антибиотические вещества – новые, ранее неизвестные по химиче-
скому строению соединения, представляют огромный интерес для специали-
Стрептомицин – антибиотик широкого спектра действия. Активен в
стов в области химии природных соединений. Изучение структуры этих ве-
отношении туберкулезных бактерий, возбудителей чумы, туляремии,
ществ, а также синтез некоторых из них способствовали бурному развитию
стрептококков, стафилококков, пневмококков, гонококка и др. По химиче-
ской природе стрептомицин относится к аминогликозидным антибиоти- химии, а следовательно, и самой науки об антибиотиках. Достаточно указать,
кам. что к настоящему времени синтезированы такие антибиотики, как пеницил-
Эритромицин – антибиотик из группы макролидов, продуцентом ко- лины, хлорамфеникол, тетрациклины и др.
торого является почвенный гриб Streptomyces erythreus. Активен в отноше- 5. Антибиотики нашли широкое применение в научных исследованиях
нии грамположительных (стафилококки, стрептококки, пневмококки и др.) в качестве веществ, используемых при изучении отдельных сторон метабо-
и грамотрицательных бактерий, например, бруцелл. Эффективен в отно- лизма организмов, расшифровки тонких молекулярных механизмов биосин-
шении стафилококков устойчивых к пенициллину, тетрациклинам, стреп- теза белка, механизма функционирования мембран и других биохимических
томицину. превращений как специфические ингибиторы определенных реакций.
Со времен открытия пенициллина в конце 20-х годов из различных Например, одни антибиотики специфически ингибируют отдельные этапы
микроорганизмов было выделено более 6000 антибиотиков. Каждый год
синтеза белка на рибосомах (хлорамфеникол, пуромицин, тетрациклин),
ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков. До клиники до-
другие – синтез на разных уровнях нуклеиновых кислот (саркомицин подав-
ходит 1–2 % всех обнаруживаемых антибиотиков.
ляет активность полимераз; актиномицин, блеомицин, рубомицин и другие
Возникает вопрос: каковы причины постоянного роста числа анти-
биотиков за последние 40–50 лет? Среди них можно назвать следующие: нарушают функцию ДНК), третьи – образование клеточных стенок (пени-
1. Многие антибиотические вещества – незаменимые лечебные препа- циллины) и т.д.
раты. Они широко применяются при лечении большого числа инфекцион- 6. Изучение путей образования антибиотиков способствует глубокому
ных заболеваний, которые ранее, до открытия антибиотиков, считались не- проникновению в механизмы синтетической деятельности продуцентов
излечимыми или сопровождались высоким легальным исходом. К их числу этих биологически активных соединений, раскрытию основных этапов их
следует отнести некоторые формы туберкулеза, чуму, азиатскую холеру, метаболизма.
брюшной тиф, бруцеллез, пневмонию, различные септические процессы. По своему спектру действия, химической структуре и молекулярно-
2. Антибиотики – необходимые вещества для сельского хозяйства, му механизму действия известные антибиотики классифицируются следу-
прежде всего как лечебные препараты, применяемые в животноводстве, пти- ющим образом.

26 27
По спектру действия: Таблица 2 – Химическая структура антибиотиков
 антибактериальные, губительно действующие на грамположитель-
ные (бензилпенициллин, ристомицин, новобиоцин), грамотрицательные Антибиотик Химическая структура
(полимиксин) бактерии, а также антибиотики широкого спектра действия 1 2
(левомицетин, канамицин, мономицин, гентамицин);
 противогрибковые (амфотерицин В, нистатин, леворин, гризеофу-
львин);
 противоопухолевые, включающие в себя: актиномицины, антрак-
Стрептомицин
циклины (доксорубицин, эпирубицин, идарубицин), оливомицины, брунео-
мицины, блеомицины.
В зависимости от химической структуры и ряда других свойств ан-
тибиотики делят на ряд классов:
1. -лактамные – пенициллины, цефалоспорины, причем составляют
более 40 % рынка антибиотиков.
2. Макролиды – макроциклические (эритромицин, джозамицин, оле-
андомицин).
3. Аминогликозиды – (стрептомицин, канамицин, гентамицин, ами- Рифампицин
кацин, тобрамицин).
4. Тетрациклины – тетрациклин, метациклин.
5. Гликопептиды – ванкомицин, ристомицин, блеомицин.
6. Антрациклины – доксорубицин, эпирубицин, идарубицин.
7. Амфениколы – левомицетин.
8. Линкосамиды – линкомицин.
9. Полиеновые – ациклические (нистатин, леворин).
10. Полипептиды – полимиксин, грамицидин.
Мы считаем целесообразным привести химическую структуру ши-
роко используемых антибиотиков (табл. 2). Амикацин

28 29
Продолжение таблицы 2 Продолжение таблицы 2

1 2 1 2

Ципрофлоксацин

Гентамицин

Тобрамицин Ванкомицин

Бензилпенициллин

Анализируя влияние антибиотиков на бактерии и клетки (молекуляр-


ный механизм) можно определить их действие как:
1. Подавление активности микробных ферментов, ответственных за
синтез клеточной мембраны (амоксициллин, цефалоспорины, пеницилли-
Бензатина- ны, ампициллин), например, путем конкурентного блокирования транс-
бензилпенициллин пептидаз, участвующих в синтезе мукопептида, входящего в состав кле-
точной мембраны.
2. Подавление в микробной клетке синтеза белка путем взаимодей-
ствия с 50S рибосомальной субъединицей бактерий (кларитромицин,
клиндамицин).
3. Непосредственное взаимодействие с ДНК, что препятствует синте-
Цефазолин зу нуклеиновых кислот (противоопухолевое действие: антрациклиновые
антибиотики – доксорубуцин, эпирубцин, идарубицин и др.; блеомицин,
митомицин).

30 31
4. Нарушение движения рибосомы по нити информационной РНК Продолжение таблицы 3
(эритромицин, линкомицин).
5. Нарушение целостности цитоплазматической мембраны (противо- 1 2 3 4
грибковые антибиотики – нистатин, амфотерицин В, полимиксины и др.). Ванкомицин Amycolatopsis С66Н75N9O24 Грамположитель-
6. Нарушение прикрепления РНК к рибосомам (тетрациклины, мак- orientalis Трициклический ные бактерии. Ин-
гликопептид гибирует биосин-
ролиды, левомицитин).
тез клеточных
7. Селективное ингибирование ДНК-зависимой РНК полимеразы в
мембран, изменяет
микробной клетке (рифампицин).
их проницаемость,
8. Нарушение энергетического обмена (олигомицин). нарушает синтез
В табл. 3 представлены продуценты и характеристика антибиотиков. РНК
Гентамицин Micromonospora С21Н43N5O7, 418,54 Dа Грамположитель-
Таблица 3 – Продуценты и характеристика антибиотиков purpurea Аминогликозид ные и грамотрица-
Спектр тельные бактерии
Химическая и Джозамицин Streptomyces С42Н69NO15, 828,02 Dа Грамположитель-
Антибиотик Продуцент
природа механизм narbonensis var. Макролид ные и грамотрица-
действия Josamyceticus var. nova тельные бактерии
Доксорубицин Streptomyces peucetius С27Н29NO11, 543,53 Dа Противоопухоле-
1 2 3 4
var. Caesius Антрациклиновый ан- вое средство. Вза-
Амикацин Получают полу- С22Н43N5O13, 585,61 Да Грамотрицательные
тибиотик имодействует с
синтетическим Аминогликозид и грамположитель-
ДНК и препят-
путем из ные бактерии
ствует синтезу
канамицина А
нуклеиновых кис-
Амфотерицин В Streptomyces С47Н73NO17, 926,12 Да Дрожжи, дрожже-
лот
nodosus Полиеновый подобные грибы,
Канамицин А Streptomyces С18Н36N4O11, 484,51 Dа Грамположитель-
антибиотик включая
kanamyceticus Аминогликозид ные и грамотрица-
Candida albicans
тельные бактерии
Бацитрацин Bacillus subtilis Полипептид Грамположительные
Линкомицин Streptomyces С18Н34N2O6S, 406,55 Dа Грамположитель-
бактерии
lincolnensis var. Линкозамиды ные бактерии
Бензилпенициллин Penicillium С16Н18N2O4S, 334,4 Да Грамотрицательные
Lincolnensis
notatum Гетероциклическое и грамположитель-
Митомицин С Streptomyces С15Н18N4O5, 334,33 Dа Противоопухоле-
соединение, постро- ные бактерии
caespitosus вое средство. Вза-
енное из сконденсиро-
имодействует с
ванных тиазолидино-
ДНК и препят-
вого и беталактмного
ствует синтезу
кольца
нуклеиновых кис-
Блеомицин Streptomyces С55Н84N20O21 S2 Противоопухолевое
лот
verticillus С55Н84N17O21S3 средство. Вызывает
Мономицин Streptomyces circulatus С23Н45N5O14, 615,6 Dа Лейшманиоз, ток-
Гликопептид фрагментацию мо-
var. Аминогликозид соплазмоз, саль-
лекул ДНК
Monomycini монеллез

32 33
Продолжение таблицы 3 2.3. Пути биотехнологического получения антибиотиков

1 2 3 4
Необходимость поисков новых антибиотиков обусловлена многими
Нистатин Streptomyces noursei С47Н75NO17, 276,42 Dа Дрожжеподобные
причинами. Постоянно ведутся поиски эффективных антибиотиков для борь-
Антибиотик грибы рода Candida
полиеновой группы бы с теми заболеваниями, на возбудители которых не действуют существу-
Полимиксин Bacillus polymyxa Полипептид Грамотрицательные ющие препараты. Потребность в антибиотиках обусловлена также тем, что
и грамположитель- при их использовании в лечебных целях происходит накопление резистент-
ные бактерии ных к этим соединениям форм организмов. Длительное и не всегда оправдан-
Рифампицин Streptomyces С42Н58N4O12, 822,96 Dа Грамположительные ное применение антибиотиков приводит зачастую к ускорению эволюции
mediterranei и грамотрицательные
патогенных организмов в сторону закрепления их устойчивости к этим пре-
бактерии, включая
микобактерии тубер- паратам. Поэтому необходимо постоянно заменять одни виды антибиотиков
кулеза и лепры на другие. Для этого нужно находить наиболее активные микроорганизмы –
Рубомицина Streptomyces С27Н29NO10HCI, Противоопухолевое продуценты антибиотиков.
гидрохлорид coeruleorubidis 563,98 Dа Основные этапы поисков антибиотиков:
Стрептомицин Streptomyces griseus С21Н39N7O12, 581,58 Dа Грамотрицательные  выделение микробов-антагонистов из почвы;
Аминогликозид бактерии и микобак-
 определение антагонистического спектра и активности антибиоти-
терии туберкулеза
ков;
Тетрациклин Streptomyces С22Н24N2O8, 444,45 Dа Грамположительные
aureofaciens и грамотрицательные  подбор условий культивирования продуцентов антибиотиков;
бактерии. Нарушает  выделение и химическая очистка антибиотиков;
образование ком-  изучение физико-химических и фармакологических свойств анти-
плекса между транс- биотиков;
портной РНК и ри-
 испытание химико-терапевтической эффективности;
босомой, приводя к
 идентификация антибиотиков.
нарушению синтеза
белка Биосинтез антибиотиков – наследственная особенность организмов,
Тобрамицин Streptomyces С18Н37N5O9, 467,52 Dа Грамотрицательные проявляющаяся в том, что каждый вид (штамм) способен образовывать один
tenebrarius Аминогликозид бактерии или несколько вполне определенных, строго специфичных для него анти-
биотических веществ. Вместе с тем известно, что одинаковые антибиотики
Цефалоспорин С Cephalospororium sp. С16Н21N3O8S Грамположительные могут образовываться несколькими видами организмов.
и грамотрицательные
Выявление потенциальной возможности образовывать в процессе
бактерии
Эритромицин Streptomyces erythreus С37Н67NO13, 733,95 Dа Грамположительные жизнедеятельности антибиотики связано с условиями культивирования ор-
Макролид бактерии ганизмов. В одних условиях организм образует антибиотик, в других усло-
виях тот же организм не будет обладать способностью синтезировать анти-
биотическое вещество.

34 35
В связи с резистентностью микроорганизмов к антибиотикам посто- высокопродуктивных штаммов продуцентов антибиотиков получено тра-
янно проводится их совершенствование, что приводит к появлению новых диционными методами мутагенеза и селекции.
поколений. Например, цефалоспориновые антибиотики, приводящие к Выделенные культуры микроорганизмов-антагонистов изучают по со-
нарушению синтеза компонентов клеточной мембраны, присутствуют в держанию в них антибиотических веществ, необходимых для практических
виде 4-х поколений полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков: целей. При этом методом хроматографии определяют наличие известных ан-
Цефадроксил, Цефазолин, Цефалексин – 1 поколение; Цефамандол, Цефу- тибиотиков. Если обнаруживают новый антибиотик, то вначале осуществ-
роксим – 2 поколение; Цефиксим, Цефоперазон, Цефотаксим, Цефтазидим, ляют первичное выделение и химическую очистку антибиотика, определяют
Цефтриаксон – 3 поколение; Цефпиром, Цефепим – 4 поколение. его токсичность и химико-терапевтические свойства на животных, заражен-
Основными продуцентами антибиотиков являются актиномицеты, ных возбудителями различных заболеваний.
плесневые грибы, бактерии. Главным местом их обитания является почва. Биосинтез молекулы любого антибиотика происходит с участием ряда
Для выделения микроорганизмов, образующих антибиотики, берут пробы ферментов – от нескольких единиц до нескольких десятков. Координация
почвы, высушивают ее до воздушно-сухого состояния и делают высевы на действия ферментов, т.е. обеспечение правильной последовательности фер-
специальные питательные среды. ментативных реакций, обеспечивается разными, не всегда еще ясными пу-
Выделенные штаммы-продуценты антибиотиков часто вариабельны и тями.
нестабильны. Поэтому методом селекции отбирают наиболее перспективные Процесс развития микроорганизмов (продуцентов антибиотиков)
штаммы, а затем проводят отбор индуцированных мутантов. Мутантное дей- имеет, как правило, двухфазный характер:
ствие на микроорганизмы достигается применением различных источников В первой фазе развития культуры, носящей название трофофазы
лучистой энергии (УФ-лучи, рентгеновские лучи, нейтроны и др.). (тропофазы) (фаза сбалансированного роста микроорганизма), идет ин-
Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актиномицета- тенсивное накопление биомассы продуцента. Продуцент синтезирует бел-
ми, эубактериями и рядом других микроорганизмов. Некоторые из этих ки, нуклеиновые кислоты, углеводы, ферменты и другие биологически ак-
организмов способны продуцировать большое количество антибиотиков. тивные вещества (БАВ), необходимые для роста микроорганизма; наблю-
Так, шесть родов филаментозных грибов производят 1000 различных ан- дается быстрое потребление основных компонентов субстрата (источников
тибиотиков, в том числе пенициллин и цефалоспорин, а три рода актино- углерода, азота, фосфора и др.), интенсивное поглощение кислорода. В
мицетов – 3000 антибиотиков. Среди актиномицетов наибольший вклад
культуральной среде может снижаться рН, как результат накопления орга-
вносит род Streptomyces, один из видов которого S. griseus синтезирует бо-
нических кислот. В трофофазе антибиотик, как правило, не образуется или
лее 50 антибиотиков. В процессе образования антибиотиков задействовано
его количество незначительное. Возможно, в этой фазе синтез ферментов,
значительное число генов. Массовая расшифровка первичной структуры
принимающих участие в образовании антибиотика, подавлен.
геномов микроорганизмов показала, что эта величина равна 1–2 %. Так, у
Вторая фаза развития культуры, носящая название идиофазы (фаза
Bacillus subtilis число таких генов достигает 2 %, что обеспечивает микро-
несбалансированного роста) характеризуется снижением общего количе-
организму большие возможности для защиты и адаптации. С другой сто-
ства биомассы. В период второй фазы происходит развитие микроорганиз-
роны, это обстоятельство затрудняет анализ путей биосинтеза антибиоти-
ков и идентификацию отдельных мутаций, способных увеличить выход ма и образование новых клеток, но в культуре начинают преобладать авто-
продукта. Тем не менее, большинство известных в настоящее время литические процессы, что приводит к снижению общего числа биомассы.
Продукты метаболизма микроорганизмов частично используются на по-
строение клеток мицелия, частично – на синтез антибиотика. Среда обога-
36 37
щается продуктами обмена и продуктами автолиза клеток, возрастает зна- тез макролидов через метилмалонил КоА; L-фенилаланин – предшествен-
чение рН, происходит интенсивный процесс биосинтеза и максимальное ник фенилаланина – ускоряет синтез грамицидина-S. Аналогичный эффект
накопление антибиотика. вызывает использование ингибиторов метаболизма. Так, при подавлении
Биосинтез антибиотиков возрастает в фазе замедленного роста кле- процесса введения хлора микроорганизм S. aureofaciens образует тетра-
точной популяции (конец трофофазы) и достигает максимума в стационар- циклин, а не хлортетрациклин, а при ингибировании реакции метилирова-
ной фазе (идиофазе). Считают, что в конце трофофазы изменяется энзима- ния им синтезируются деметилированное производное хлортетрациклина.
тический статус клеток, появляются индукторы вторичного метаболизма, Другой способ получения антибиотиков состоит в использовании
освобождающие гены вторичного метаболизма из-под влияния катаболит- для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсутствует (бло-
ной репрессии. Поэтому любые механизмы, тормозящие клеточную про- кировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу анти-
лиферацию и активный рост, стрессовые ситуации, активируют процесс биотика. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный ан-
образования антибиотиков. тибиотик, используя низкую субстратную специфичность ферментов вто-
Процесс культивирования идиолитов происходит в две фазы (двух- ричного метаболизма и вводя аналоги предшественника антибиотика, по-
ступенчатое культивирование). На первой фазе происходит накопление следние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, извест-
достаточного количества биомассы, которая выращивается на среде для ного как мутационный биосинтез, или мутасинтез. Схема мутационного
роста микроорганизма. Эта фаза должна быть быстрой, а питательная сре- биосинтеза антибиотика показана на рис. 2.
да дешевой. На второй фазе осуществляется запуск и активный синтез ан-
тибиотика. На этой фазе ферментацию ведут на продуктивной среде.
Предполагаемая
2.3.1. Получение антибиотиков с использованием биосинтеза последовательность реакций, А В Фермент С D E Антибиотик
Методы получения антибиотиков путем химического синтеза доста- ведущая к синтезу антибиотика
точно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методом био-
технологии. Существует несколько способов получения как природных,
так и полусинтетических антибиотиков. Направленный биосинтез анти- Отсутствие синтеза
биотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма – антибиотика у А В С D Блокированное звено метаболизма
продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез «блокированного» мутанта
ферментов вторичного метаболизма в идиофазе. Точный механизм инду-
цирования первичными метаболитами генов, кодирующих синтез фермен-
тов вторичного метаболизма, окончательно не расшифрован, однако выяс- Синтез модифицированного
нено, что молекулы предшественника необходимо добавлять в среду в пе- антибиотика после введения А В ...D* Е* Модифицированный антибиотик
риод фазы роста микроорганизмов. Установлено, что вводимый предше- аналога предшественника (D*)
ственник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Напри-
мер, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулиру-
ется добавками его метаболического предшественника – фенилуксусной
Рисунок 2 – Схема мутационного биосинтеза антибиотика
кислоты; пропионовая кислота и пропиловый спирт индуцируют биосин-
38 39
Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способ- Бензилпенициллин гидролизуют ацилазой мутанта Kluyvera
ность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицина В – citrophila при рН 7,8–8,0 и температуре 40–50 °С. Затем в ферментер вно-
рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения мно- сят мутант Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия фермента-
гих синтетических рифамицинов. ции изменяют таким образом (рН 5,0–5,5), чтобы ацилаза второго мутант-
Особенно успешны разработки в области биосинтеза полусинтетиче- ного организма осуществляла синтез ампициллина (рис. 4).
ских пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых более эффектив-
ных аналогов пенициллина основано на изменении его ацильной группи- NH2
ровки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина – S CH3
6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК по- СН СООH H2N Ацилаза
+ CH3
лучают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфиче- -H2О
O C N
ского фермента пенициллинацилазы, образующейся с высоким выходом в Фенилглицин 6-АПК COOH
процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Ацилазы разли- NH2
S CH3
чают по их субстратной специфичности. Некоторые из них способны ката-
СН СО NH
лизировать и обратные реакции – процессы ацилирования аминогруппы CH3
6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем O C N
COOH
было получено более 40000 полусинтетических пенициллинов. Суще- Ампициллин
ственным является то, что во многих случаях 6-АПК не выделяют из куль-
туральной жидкости, например, при превращении бензилпенициллина в
ампициллин (рис. 3).
Рисунок 4 – Схема получения ампициллина
S CH3
СН2 СО NH +
H2O, пенициллинацилаза Замена ацильного остатка приводит к синтезу других полусинтети-
CH3 ческих антибиотиков. Так, например, если в структурной формуле анти-
СН2 СООH
O C N
COOH биотика ацильный остаток представлен в виде (см. рис. 5), а радикал в мо-
Бензилпенициллин
лекуле пенициллина представлен в виде (см. рис. 6) – образуется метицил-
S CH3
лин, а в случае представления радикала в виде (см. рис. 7) – оксациллин.
H 2N
CH3
O C N COOH RC
6-АПК
O

Рисунок 3 – Схема превращения бензилпенициллина в 6-АПК Рисунок 5 – Вид ацильного остатка

40 41
OCH3 ток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облег-
O
чается в присутствии полиэтиленгликоля. После трансформации протопла-
C сты сначала высевают на твердую среду, чтобы образовалась клеточная
стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на се-
лективную среду, обычно содержащую неомицин, либо тиострептон. Ак-
тиномицеты являются продуцентами большинства промышленно важных
OCH3
антибиотиков. Известно, что один из эффективных путей воздействия на
Рисунок 6 – Вид радикала в молекуле пенициллина (метициллин) геном актиномицетов – это протопластирование их клеток. Показано, что
протопластирование может влиять на уровень антибиотической активно-
O сти. Метод слияния протопластов различных штаммов может служить
C для получения рекомбинантов, способных синтезировать новый антибио-
тик, или обладающих более высоким уровнем образования антибиотика.
Биотехнология данного процесса следующая: мицелий отмывают от пита-
тельной среды, промывают специальными средами путем центрифугиро-
N
O CH3 вания; проводят лизис в питательной среде, содержащей 20 % сахарозу и
Рисунок 7 – Вид радикала в молекуле пенициллина (оксациллин) лизоцим в концентрации 1–2 мг/мл; нелизированный материал отделяют
центрифугированием при 1000 об/мин; протопласты осаждают путем цен-
2.3.2. Получение антибиотиков с использованием генной трифугирования при 3000 об/мин; протопласты высевают на питательные
инженерии среды и инкубируют при (27 ± 1) °С в течение 15 суток.
Кроме того, с помощью генной инженерии можно не только созда-
Весьма перспективным является получение новых антибиотиков пу- вать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже
тем создания генно-инженерных продуктов, в частности рекомбинантных известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве ан-
штаммов продуцентов. Большой эффект может дать технология рекомби- тибиотиков с помощью Streptomyces часто является количество доступного
нантных ДНК. При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces (ос- клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и
новного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков) высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недоста-
важно понять, что трансформация и отбор трансформированных клеток не точно, рост клеток замедляется, и выход антибиотика снижается. Решить
должны быть слишком сложными. Однако, в отличие от E. Coli, эту задачу можно двумя способами: во-первых, изменить конструкцию
Streptomyces существует не в виде изолированных клеток, а в виде протя- ферментера, в котором выращивается культура Streptomyces, а во-вторых,
женных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо разрушить используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более
клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты. Без этого будет эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не ис-
невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформиро- ключают друг друга. Одна из стратегий, которая используется некоторыми
ванных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовы- аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кис-
ваться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки. Соответственно лорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного ак-
колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут пред- кумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная
ставлять собой смесь трансформированных и не трансформированных кле-
42 43
бактерия Vitreoscilla синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, только 5 % цефалоспорина С напрямую гидролизуется до 7АСА. Исходя
функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген гемоглоби- из полученных данных установлено, что для образования 7АСА с высоким
на Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и выходом необходимы оба фермента.
введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю ге-
моглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1 % всех клеточных белков 2.3.3. Получение антибиотиков с использованием
Streptomyces coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществля- иммобилизованных ферментов
лась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla,
Хорошо известно, что 6-АПК является исходным соединением для
а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки Streptomyces
получения эффективных полусинтетических аналогов природных пени-
coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода
циллинов. Получение 6-АПК в промышленности путем химического гид-
(примерно 5 % от насыщающей концентрации) синтезировали в 10 раз
ролиза бензилпенициллина сопряжено с большими трудностями в связи с
больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую
крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при ще-
скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно исполь-
лочном гидролизе бензилпенициллина выход 6-АПК составляет всего 1 %.
зовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих
Продуктивность этого метода удалось значительно повысить благодаря
в условиях недостатка кислорода.
применению гидролиза иммобилизованных бактериальных клеток, содер-
Исходным материалом при химическом синтезе ряда цефалоспори-
жащих пенициллинамидазу. Со второй половины 70-х годов ХХ века вся
нов – антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом и
6-АПК, выпускаемая в России и значительная часть 6-АПК, выпускаемой в
обладающий высокой антибактериальной активностью, – является
Италии производится с помощью иммобилизованных ферментов. Приме-
7-аминоцефалоспорановая кислота (7АСА), которая в свою очередь синте-
няют фермент, иммобилизованный путем включения клеток E. Coli в во-
зируется из антибиотика цефалоспорина С. К сожалению, природных мик-
локна триацетата целлюлозы, а на российских предприятиях используют
роорганизмов, способных синтезировать 7АСА, до сих пор не выявлено.
бактериальные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле. Пе-
Предложен путь биосинтеза 7АСА за счет включения специфических ге-
реход к технологии, применяющей иммобилизованные бактериальные
нов в плазмиду гриба Acremonium chrysogenum, который в обычных усло-
клетки обеспечивают высокий выход 6-АПК, составляющий 80–85 %. По
виях синтезирует только цефалоспорин С. Один из этих генов был пред-
данным японских исследователей, время полуинактивации пенициллина-
ставлен кДНК гриба Fusarium solani, кодирующий оксидазу
мидазы в полиакриламидном геле бактериальных клеток равно 42 суткам
D-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Pseudomonas
при 30 °С или 17 суткам при 40 °С.
diminuta и кодировал фермент – цефалоспоринацилазу. В плазмиде гены
Одним из перспективных методов получения антибиотиков являет-
находились под контролем промотора Acremonium chrysogenum. На первом
ся использование ферментов в качестве катализаторов. Ферментативный
этапе нового биосинтетического пути цефалоспорин С превращается в
синтез полусинтетических β-лактамных антибиотиков является объектом
7--(5-карбокси-5-оксопентанамид) цефалоспорановую кислоту (кето-AD-
пристального внимания исследователей в течение нескольких десятилетий,
7АСА) при помощи оксидазы D-аминокислот. Часть этого продукта, всту-
а в последние годы он находит все большее практическое применение,
пая в реакцию с пероксидом водорода, одним из побочных продуктов, пре-
благодаря преимуществам биокатализа, перед традиционными химически-
вращается в 7--(4-карбосибутанамид) цефалоспорановую кислоту
ми технологиями. Прежде всего, это связано с возможностью достижения
(GL-7ACA). И цефалоспорин С, и кето-AD-7АСА, и GL-7ACA могут под-
высокой чистоты конечного продукта, так как уникальная специфичность
вергаться гидролизу цефалоспоринацилазой с образованием 7АСА, однако
и высокая реакционная способность ферментов позволяет проводить
44 45
направленные реакции, избегая побочных процессов и риска рацемизации. карбоновая кислота, а активированное производное карбоновой кислоты
Неоспоримы преимущества биокаталитических технологий с точки зрения или аминокислоты.
охраны окружающей среды: ферментативные реакции протекают в мягких Выделение продуктов биокаталитического синтеза. Биокатали-
условиях (рН, температура); исключается использование токсических реа- тические технологии отличаются от традиционных химических техноло-
гентов на стадии активации карбоксильной группы ацилирующего агента и гий не только стадией собственно синтеза, но и схемой выделения целевых
особо вредных галогенсодержащих растворителей; значительно уменьша- продуктов. Реакционные смеси при ферментативном синтезе, как правило,
ется общее количество используемых органических растворителей и реа- содержат соединения близкой физико-химической природы, поэтому раз-
гентов. На сегодняшний день известны единичные случаи применения эн- работка процессов разделения компонентов реакционных масс и выделе-
зиматического синтеза для промышленного производства β-лактамных ан- ния целевых продуктов, представляет собой, пожалуй, наиболее сложную
тибиотиков (например, выпуск цефалексина компанией DSM, Нидерлан- проблему при создании биокаталитической технологии получения
ды). β-лактамов. Особенно сложной является проблема разделения компонен-
Исходными соединениями для получения беталактамных антибиоти- тов реакционной смеси синтеза амино-β-лактамов, содержащей три амино-
ков являются пенициллины, такие как цефалоспорин С и цефамицин С или кислоты (целевой продукт, ядро β-лактама и побочный продукт синтеза),
получаемые путем их химической или энзиматической трансформации изоэлектрические точки и растворимость которых достаточно близки.
производные (например, 7-фенилацетамидодезацетксицефалоспорановая Кроме того, из-за низкой растворимости побочных продуктов синтеза су-
кислота, называемая цефалоспорином G). ществует опасность осаждения их еще в процессе ферментативного пре-
Для ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков чаще всего вращения даже при работе с низкоконцентрированными растворами реа-
используют широко специфичную пенициллинацилазу из различных мик- гентов, поскольку ацильный донор практически всегда берется в избытке.
роорганизмов, а также другие ферменты, принадлежащие к тому же классу Разработаны оригинальные методы отделения иммобилизованных
гидролаз, но более специфичные к синтезу определенных групп антибио- ферментов от реакционной массы, содержащей кристаллические компо-
тиков (например, синтетазу цефалоспоринов – из E. Coli). Пенициллина- ненты. Один из методов основан на использовании иммобилизованного
цилаза проявляет специфичность предпочтительно к фенилуксусной и фе- фермента с плотностью меньше единицы, частицы которого флотируют
ноксиуксусной кислотам, а также к их производным, содержащим неболь- на поверхности жидкости после прекращения перемешивания реакционной
шие заместители в положении (амин, гидроксил, метил) или в ароматиче- массы, в то время как кристаллические продукты удаляются через днище
ском ядре. реактора. Другой подход к этой проблеме базируется на инженерном ре-
Известно два направления синтеза β-лактамов: шении. Сконструированы специальные сита с порами такого размера, ко-
1. Термодинамически контролируемый синтез – прямое образование торый позволяет мелким кристаллическим компонентам реакционной сме-
ациламидной связи из свободной карбоновой кислоты и ключевой амино- си проходить вместе с фильтратом через отверстия в сите, задерживая при
кислоты (ядра антибиотика), являющееся наиболее простым энзиматиче- этом в реакторе крупные частицы иммобилизованного фермента с диамет-
ским способом синтеза β-лактамных антибиотиков; ром более 150 мкм. Реакторы с такими фильтрующими ситовыми днищами
2. Кинетически контролируемый синтез является альтернативой используют, например, для отделения биокатализатора от смеси амокси-
прямому синтезу, который предусматривает синтез с переносом ацильной циллина с парагидрокси-D-фенилглицина при получении амоксициллина.
части ацилирующего агента на первичную аминогруппу ключевой амино-
кислоты. Ацилирующим агентом в данном случае служит не свободная

46 47
2.4. Условия культивирования продуцентов антибиотиков Streptomyces antibioticus оказалась смесь 0,1 % глюкозы и 1 % галактозы.
При таком соотношении моносахаридов глюкоза быстро утилизируется и
Синтез антибиотиков определяется условиями культивирования микроорганизм переключается на усвоение галактозы, что и инициирует
микроорганизмов. Поэтому оптимизация питательной среды является идиофазу. Для производства ряда антибиотиков необходимы липидные
одним из главных факторов, приводящих к увеличению выхода целевого компоненты, в частности, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты.
продукта – антибиотика. Так, например, для образования цефалоспорина С (штамм Cephalosporium
При проведении первой стадии технологического процесса получе- acremonium) необходимо потребление в составе питательной среды жир-
ния антибиотиков применяют натуральные среды неопределенного соста- ных кислот: миристиновой С14:0, пальмитиновой С16:0, олеиновой С18:1, ли-
ва, к числу которых относят продукты крахмалопаточного производства, нолевой С18:2. Обнаружено, что при культивировании штамма обнаружива-
агар, желатин, отруби, зерно. Композиция натуральных сред неопределен- ется максимальное потребление олеиновой и линолевой кислот.
ного состава не является постоянной. Например, агар, получаемый из раз- Для выращивания актиномицетов предложено множество сред раз-
ных видов морских водорослей, по химическому составу является слож- личного состава, например: соево-глицериновая среда, содержащая соевую
ным эфирным комплексом полисахарида с серной кислотой и разнообраз- муку – 1,5 %, глицерина – 3 %, натрия хлористого – 0,3 %, кальция карбо-
ными микроэлементами. Агар содержит также жирные кислоты, биотин, ната – 0,3 % или соево-глюкозная среда, содержащая соевую муку – 1,5 %,
тиамин или его компоненты. В картофельной среде с глюкозой и пепто- глюкозы – 4 %, натрия хлористого – 0,25 %, кальция карбоната – 0,2 %,
ном, при одной и той же партии пептона и химически чистой глюкозы, со- кальция хлорида – 0,2 %, сульфата натрия – 0,05 %. На этих средах культу-
став картофельного экстракта зависит от сорта картофеля, места его выра- ры выращивают при 28 ° С в течение 6–7 суток.
щивания, время уборки, срока и режима хранения и других причин. По- На примере Streptomyces hygroscopicus (продуцент комплекса анти-
этому для получения сопоставимых результатов, особенно при изучении биотика азоломицина, полиеновых и неполиеновых макролидов) было по-
физиологических и биохимических особенностей микроорганизма, приме- казано, что использование хлористого аммония как единственного источ-
няют синтетические среды, в состав которых входят определенные хими- ника азота в высоких концентрациях или его добавление в питательные
чески чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Для среды, содержащие аминокислоты (валин, треонин, серин) снижает синтез
антибиотика. Добавление хлористого аммония в питательную среду, со-
выделения актиномицетов, являющихся основными продуцентами антибио-
держащую аланин и лизин, приводит к повышению синтеза антибиотика.
тиков, используют синтетические питательные среды, в которые в качестве
Наличие в среде индивидуальных аминокислот валина и треонина также
источника углерода добавляют крахмал или глицерин. В качестве источника
усиливает синтез антибиотика. Данный эффект может быть связан с тем,
азота в среды добавляют нитратные соли. На этих средах рост бактерий по- что у многих видов микроорганизмов ионы аммония ассимилируются по
давляется, а грибы развиваются в малом количестве. Чтобы они росли лучше, одному или двум метаболитным путям. При высоких концентрациях ам-
нужно подкислить среду до значений рН = 4,0–4,5. Например, мутантные мония глутаматдегидрогеназа катализирует восстановительное аминиро-
штаммы культивируют на обогащенной питательными компонентами среде. вание -кетоглутарата до глутамата, а при недостаточном снабжении
Процесс контролируют либо по концентрации биомассы, либо по концен- ионом аммония глутаматсинтетаза катализирует АТФ-зависимое образо-
трации питательных веществ в среде. Исследования показали, что выход вание глутамина. Глутамин может быть образован в результате трансами-
цефалоспорина С уменьшается при переходе от использования в качестве нирования -кетоглутарата катализируемого глутаматсинтетазой.
источника углерода сахарозы к быстро усваиваемому углеводу глюкозе. Для увеличения выхода антибиотика и возможности направлять био-
Наиболее оптимальной средой для образования антибиотика культурой синтез в необходимом направлении в питательные среды добавляют ряд
веществ – предшественников антибиотиков. Так как многие антибиотики
48 49
берут свое начало от промежуточных соединений обмена первичных мета- В процессе культивирования возникает необходимость изучения
болитов, то их биосинтез возможно регулировать путем ретроингибирова- ферментов, катализирующих ключевые для вторичного метаболизма реак-
ния. Например, биосинтез пенициллина культурой гриба Penicillium ции, обусловленная практической задачей повышения продуктивности
chrysogenum контролируется по принципу обратной связи L-лизином. Этот промышленных штаммов. Важное значение одного из этих ферментов –
эффект объясняется тем, что биосинтез как пенициллина, так и лизина пропионил-КоА-карбоксилазы – определяется участием её в синтезе пер-
осуществляется через общего предшественника – -аминоадипиновую вичного безазотистого предшественника – метил-малонил-КоА, включаю-
кислоту. Торможение лизином первого фермента биосинтеза (гомо- щегося в макроциклические лактонные кольца макролидных антибиотиков
цитратсинтазы) приводит к недостатку -аминоадипиновой кислоты, что (эритромицин, олеандомицин и др.), полиэфирных антибиотиков (салино-
снижает выход антибиотика. Добавление в питательную среду мицин, монензин и др.) анзамицинов и др.
α-аминоадипиновой кислоты предотвращает ингибирующий эффект лизи-
на и активирует биосинтез пенициллина в отсутствие лизина. Кроме ре- 2.5. Выделение и очистка антибиотиков
троингибирования биосинтез многих антибиотиков тормозится высокими
концентрациями своих же антибиотиков. С накоплением определенной Экстракцию антибиотиков из культуральной жидкости проводят
концентрации антибиотика рост микроорганизмов прекращается (напри- ацетоном, бутанолом и другими органическими растворителями. Необхо-
мер, Streptomyces griseus прекращает свой рост при концентрации в среде димо отметить, что при экстракции антибиотиков используют различные
стрептомицина сульфата 0,5 %). Следует отметить, что в процессе эволю- значения рН: для A. Rubra – нейтральное значение рН, для A. Madurae A и
ции многие микроорганизмы выработали механизмы защиты от действия Carminata (карминомицин) – щелочное значение рН.
собственных антибиотиков. Эта проблема успешно решается в результате Технология выделения антибиотиков включает: экстракцию анти-
использования иммобилизованных ферментов. биотиков подходящими растворителями, осаждение и перекристаллизация
Большинство антибиотиков получают при глубинной аэробной фер- их из разных сред, фракционирование на ионообменных смолах, лиофиль-
ментации периодического действия в асептических условиях. Период фер- ную и распылительную сушку готовых препаратов. На экстракцию анти-
ментации длится 7–10 суток. биотика в значительной степени влияет значение рН. Так, например, при
Стадия выращивания вегетативного инокулюма в значительной ме- выделении антрациклиновых антибиотиков установлено, что антрацикли-
ре определяет конечный результат ферментации. Установлено, что спо- новые антибиотики (рубомицин, канамицин, доксорубицин) взаимодей-
собность продуцента к интенсивному биосинтезу зависит от многих фак- ствуют с полимерными сорбентами по ион-ионному и гидрофобному ме-
торов, в том числе, от гидродинамических условий выращивания посевно- ханизмам. Наиболее селективная сорбция происходит на сегрегированном
го материала, возраста и количества посевного мицелия. Культуры иноку- карбоксильном катионите БДМ-12 (метакрилсодержащий катионит). Пока-
люма используют от 10 % до 40 % при различных значениях интенсивно- зано, что максимальное поглощение антрациклинового антибиотика нахо-
сти дыхания. Кроме того, направленность вторичного синтеза на образова- дится в области нейтральных значений рН, когда в системе сорбент – сор-
ние того или иного метаболита определяется интенсивностью углеводного бат реализуются как ион-ионные, так и гидрофобные взаимодействия.
обмена, а именно, соотношением активности ферментов гликолиза и пен- Из культуральной среды антибиотики выделяют экстракцией орга-
тозофосфатного пути, которое в свою очередь зависит от характеристики ническими растворителями, осаждением, адсорбцией. Очистку антибиоти-
посевного материала. На этом этапе при производстве антибиотиков необ- ков проводят повторной заменой растворителя, адсорбционно-
ходимо проводить определение интенсивности дыхания посевной культу- хроматографическими методами, высокоэффективной жидкостной хрома-
ры, например, с помощью газоанализатора. Желательно использовать тографией (ВЭЖХ). От степени чистоты препарата, влажности, темпе-
культуру с максимальной интенсивностью роста. ратуры, рН растворителя зависит стабильность антибиотика.
Общая схема получения антибиотиков представлена на рис. 8.

50 51
Выделение штамма-продуцента
2.6. Условия производства антибиотиков
антибиотика из природных условий
Поскольку основным этапом микробиологического производства
Селекция наиболее активного штамма
антибиотиков является процесс ферментации продуцента, осуществля-
І Получение наиболее активного штамма методами: ющего синтез целевого продукта, особое внимание необходимо уделять
СТАДИЯ конструкции ферментеров их автоматизации и обеспечению надежности
Индуцированного Слияния Генно-инженерной производственного процесса. Ферментеры должны быть оснащены элек-
мутагенеза протопластов манипуляцией
тронными стойками автоматического управлениями процессом фермента-
ции в автоматическом режиме и контролировать такие технологические
Высокопродуктивный и технологичный штамм продуцента параметры, как значения рН, уровень растворенного кислорода (рО2), тем-
пературу, давление, число оборотов мешалки, уровень пены в аппарате,
расход подаваемого на аэрацию воздуха. Также необходимо учитывать
Продуцент Посевной материал Питательная среда
возможность последовательной передачи биологического материала из ап-
ІІ
СТАДИЯ Подготовка инокулята паратов меньшего объема в аппараты большего объема. Для обеспечения
стерильных условий ферментации и защиты окружающей среды в составе
Смешанная Культивирование
Монокультура обвязки ферментера должны присутствовать стерилизующие фильтры тон-
культура (процесс биосинтеза)

кой очистки, например, фирмы PALL или MILLIPORE (DURAPORE,


Разделение MILIDISK), обеспечивающие подачу в ферментер стерильного воздуха и
Культуральная жидкость Биомасса очистку отработанного воздуха, выбрасываемого в атмосферу.
ІІІ
СТАДИЯ Аэрация культуральной жидкости в стерильных условиях. Сте-
Выделение антибиотика
пень бактериальной очистки воздуха, подаваемого на аэрацию культураль-
Очистка ной жидкости, во многих случаях должна быть выше, чем для воздуха, по-
даваемого в «чистые» помещения наиболее ответственных стадий фарма-
Концентрирование цевтического производства инъекционных препаратов.
В полном объеме схема получения стерильного сжатого воздуха
Стабилизация
многостадийна и включает в себя фильтр на входе в компрессор, компрес-
ІV
СТАДИЯ Обезвоживание сор, теплообменники для охлаждения и нагрева воздуха, предфильтр,
фильтр тонкой очистки. Наиболее ответственным узлом в этом перечне
Измельчение
является фильтр тонкой очистки, который должен удовлетворять следую-
Сухой препарат Жидкий экстракт
щим требованиям:
 обеспечить гарантию 100 % удаления бактерий из сухого и влаж-
Фасовка
ного воздуха;
 иметь достаточно длительный срок службы (не менее 1 года);
Рисунок 8 – Схема получения антибиотиков в процессе микробного
биосинтеза (по Н.Е. Егорову, 1994)
52 53
 работать при низком исходном перепаде давления в продолжении Наиболее широко применяют следующие контуры управления:
длительного периода времени;  регулирование температуры культуральной жидкости путем из-
 обладать свойствами, позволяющими периодически осуществлять менения параметров теплоносителя;
стерилизацию паром;  контроль и регулирование концентрации растворенного кислоро-
 быть простым в обслуживании; да (рО2) путем изменения расхода воздуха, подаваемого на аэрацию или
 иметь надежное уплотнение фильтрующего элемента. числа оборотов мешалки;
По механизму фильтрации фильтры тонкой очистки подразделяются  поддержание давления в ферментере путем открытия или закры-
на поверхностные и глубинные. тия клапана на линии выходящего воздуха;
Глубинные фильтры удерживают отделяемые частицы во всем объе-  стабилизация рН путем добавления кислоты или щелочи;
ме фильтрующего материала. Для их изготовления в настоящее время ис-  поддержание уровня пены в заданных пределах путем внесения
пользуют волокнистые, порошковые и прессованные материалы, а также пеногасителя, снижения расхода воздуха или уменьшения числа оборотов
пластик на бумажной или асбестовой основе. Вероятность задержки мешалки;
микроорганизмов в таких фильтрах связана с толщиной фильтрующего  поддержание на заданном уровне концентрации ингредиентов
слоя, вследствие чего степень эффективности находится в диапазоне субстрата в культуральной жидкости путем их добавления в ферментер.
90–99,999 %. Теоретически нельзя удалить из воздушного потока 100 % Регулирование температуры суспензии в ферментере. Процесс
находящихся в нем микроорганизмов. Поэтому применение глубинных обеспечивается за счет подачи в «рубашку» аппарата теплоносителя – сме-
фильтров возможно только на стадии предварительной фильтрации. си воды и пара, транспортируемой циркуляционным насосом. Регулировка
Поверхностным фильтрам свойственна абсолютная эффективность температуры теплоносителя в диапазоне от 0 до 150 °С с точностью
(100 %). Механизм их действия подобен работе сита. Частицы и микроор- ± 0,5 °С обеспечивается за счет установления требуемой температуры на
ганизмы не могут преодолеть мембрану, так как она имеет поры, размер стойке управления. Паровоздушная смесь, пройдя через обратный клапан и
которых меньше, чем размер этих частиц и микроорганизмов. Как правило, инжектор, в котором происходит смешение воды и пара, поступает в ру-
мембраны изготавливают в виде простых листов из эфира целлюлозы, чи- башку ферментера. После выхода из рубашки, теплоноситель поступает на
стой целлюлозы, неорганических микроволокон, покрытых смолами, по- вход циркуляционного насоса. Избыток теплоносителя, образующийся за
липропилена, нейлона, капрона, фторопласта и других материалов, изго- счет конденсации пара, отводится в канализацию через отрегулированный
товленных как одно целое. Размеры пор мембран в этих материалах лежат на определенное давление клапан.
в широком диапазоне от 0,1 мкм до 5 мкм. Для стерилизующих фильтров Контроль уровня растворенного кислорода. Растворенный кисло-
воздуха, подаваемого в ферментеры, как правило, используют мембраны с род имеет исключительно большое значение в процессах биосинтеза, ха-
размерами пор 0,22 мкм. Большинство фильтров выдерживают в течение рактеризующихся интенсивными скоростями роста биомассы и повышен-
1 года многократную стерилизацию при режиме 121 °С в течение 30 мин, ными вязкостями культуральной жидкости, что характерно для процессов
либо 141 °С в течение 10 мин. получения антибиотиков. При анаэробном метаболизме кислород играет
Регулирование параметров процесса биосинтеза. Управление тех- роль акцептора электронов или водорода при участии фермента оксидазы.
нологическим процессом микробиологического синтеза заключается в Кроме того, с помощью оксигеназ кислород может встраиваться в молеку-
поддержании на заданных уровнях значений основных технологических лу углеродных субстратов при их катаболизме. Причем, требующееся на
параметров. единицу биомассы количество кислорода зависит от свойств субстрата

54 55
(углеводы требуют меньшего количества кислорода, а углеводороды – зна- стабилизирующих пузырьки пены. В стойких пенах длительность суще-
чительно большего). Экспериментально установлено, что в случае фермен- ствования пузырька 1–15 мин.
тации бактерий и грибов, использующих в качестве источника энергии уг- Интенсивное пенообразование затрудняет максимальное использо-
леводы, на 1 г сухой биомассы требуется 1 г кислорода (теоретически для вание емкости биореактора, так как способствует выбросу пены и потери
биосинтеза 3,39 г сухой биомассы – 1 г кислорода). целевого продукта. Кроме того выброс пены зачастую приводит к несте-
Кислород является трудно растворимым газом (8 мг/л при 25 °С; рильности продукта. Для пеногашения в настоящее время использую раз-
7 мг/л при 35 °С), причем наличие солей в жидкости существенно снижает личные методы: механические (разрушение пены за счет ударного воздей-
растворимость в ней кислорода. При высоком содержании биомассы в ствия твердых поверхностей, воздействия струями жидкости или газа, рез-
культуральной жидкости (потребление кислорода может достигать 50 г/л) кое изменение давления и др.); химические (добавление поверхностно-
необходимо интенсивно пополнять среду растворенным кислородом. Дат- активных веществ, уменьшающих прочность пленок, добавление веществ,
чики, регистрирующие концентрацию растворенного кислорода, выдержи- связывающих пенообразователи в поверхностно-неактивные комплексы);
вающие многократную стерилизацию, основаны на методе полярографи- физические методы (электрическое пеногашение, воздействие колебаний
ческого определения диффузионного потока кислорода через полупрони- звуковой или ультразвуковой частоты и др.); стабилизация уровня пены
цаемую мембрану, под которой располагается анод (материал – свинец или путем временного уменьшения подачи воздуха или временного прекраще-
серебро) и катод (материал – платина) в растворе электролита. Датчики ния механического перемешивания, вывода избыточной пены из биореак-
имеют температурную компенсацию в диапазоне 0–50 °С. тора. Наиболее эффективными по нашему мнению являются химические и
Рабочее давление в ферментере может изменяться от 0 до 2,5 атм. механические способы пеногашения или их комбинации. Проблему вспе-
Результирующий сигнал от датчика давления преобразуется в электриче- нивания можно решить, если оставить в верхней части реактора достаточ-
ский сигнал и по команде от блока управлению с помощью клапана обрат- ный объем пустого пространства, в котором бы лопались пузырьки возду-
ного давления поддерживает его в заданных пределах. Контур давления ха, но это уменьшает рабочий объем реактора на 25–30 %.
дополнительно оснащен контрольным манометром. Таким образом, регулирование уровня пены осуществляется не-
Концентрация водородных ионов (рН) – важный параметр, влияю- сколькими способами:
щий на рост микроорганизмов и образование конечного продукта. Бакте-  воздействие на пену химическими и физико-химическими сред-
рии обычно растут в диапазоне значений рН 4–8, дрожжи при рН 3–6, мик- ствами;
роскопические грибы при рН 3–7. По разным причинам рН в ходе фермен-  разрушение пены механическими, гидро- и аэродинамическими
тации имеют тенденцию к изменению, поэтому необходима схема управ- способами;
ления и поддержания рН на оптимальном уровне. Регулирование рН осу-  разрушение пены колебаниями звуковой и ультразвуковой часто-
ществляется автоматически добавлением кислоты или щелочи при помощи ты;
перистальтических насосов (температурная компенсация 0–100 °С).  стабилизация уровня пены уменьшением расхода аэрирующего
Регулирование уровня пены. Процесс культивирования аэробных воздуха и снижением числа оборотов мешалки.
микроорганизмов сопровождается образованием пены. Это связано, во- Для химического пеногашения наибольшее распространение полу-
первых, с введением в жидкость воздуха, во-вторых, с наличием в составе чили полиэфирные препараты пропинол Б-400 и адеканоль, полиметилси-
культуральной жидкости белков и других поверхностно активных веществ, локсаны АС-60 и др. В ходе культивирования химические поногасители

56 57
могут подаваться либо по заранее заданной программе, либо по мере необ- лении 0,5–1 атм при температуре 110–120 °С в течение 1–1,5 часов с мо-
ходимости при повышении уровня пены. мента достижения заданной температуры.
Стерилизация питательных сред и аппаратуры. В биотехнологии Особое внимание следует уделять стерилизации аппаратуры и ком-
наибольшее распространение получила термическая стерилизация. В тех- муникаций, предназначенных для подачи пеногасителя (125–135 °С в тече-
нических системах, работающих в асептических условиях, должна обеспе- ние 1,5–2 часов). Стерилизацию осуществляют в следующей последова-
чиваться стерилизуемость всех точек внутренних объемов аппаратов, ком- тельности:
муникаций, арматуры, контрольно-измерительных приборов, непосред-  входной и выходной фильтры тонкой очистки, трубопроводы, ар-
ственно соприкасающихся с чистыми культурами целевых микроорганиз- матура;
мов или со стерильными материальными потоками. Для этого в каждой  ферментеры;
точке необходимо создать требуемую температуру и поддерживать её в те-  питательная среда при следующих режимах: температура –
чение заданного промежутка времени. 120–124 °С, время выдержки после достижения заданной температуры –
Наибольшим бактерицидным эффектом обладает насыщенный водя- 40–60 мин.
ной пар под давлением. При стерилизации насыщенным водяным паром
споры наиболее устойчивых термофилов гибнут при температуре 121 °С и 2.6.1. Получение пенициллина
времени экспозиции 25 мин, при 132 °С – за 4 мин. При использовании су-
Для производства пенициллина используют специально отобранные
хого пара время гибели спор составляет при 160 °С – 60 мин., а при 180 °С
расы плесневых грибов (суперпродуцентов), принадлежащие к роду
– 10 мин. Инактивация спор в кипящей воде при 100 °С происходит мед-
Penicillium. Для промышленного производства пенициллина применяют
ленно, они гибнут через 8–9 часов. Большое значение имеет содержание
биореакторы-ферментеры с механическим перемешиванием, объемом свы-
воды в клетке микроорганизма – чем больше воды, тем ниже температура
ше 10000 дм3. Питательная среда, используемая для производства пеницил-
коагуляции белков. Именно этим объясняется высокий стерилизующий
лина, обычно содержит кукурузный экстракт, лактозу, глюкозу и др.
эффект насыщенного водяного пара – он не только нагревает, но и увлаж-
После стерилизации и охлаждения среда засевается проросшими спо-
няет клетки, что повышает термочувствительность.
рами гриба, аэрируется путем пропускания через нее воздуха и перемешива-
Стерилизацию жидких питательных сред при работе с небольшими
ется с помощью мешалки. Температуру культивирования поддерживают в
объемами целесообразно вести в периодическом режиме в несколько эта-
пределах 24–25 °С. Для предотвращения чрезмерного образования пены
пов:
применяются химические пеногасители. После окончания ферментации ми-
 стерилизация всех коммуникаций и ферментера острым или глу-
целий гриба отделяется вакуумной фильтрацией или центрифугированием.
хим паром;
Технологическая схема производства пенициллина приведена на
 наполнение аппарата прогретой гомогенизированной средой;
рис. 9.
 нагревание питательной среды до температуры стерилизации;
 выдерживание при температуре стерилизации в течение времени,
необходимого для гибели всех микроорганизмов;
 охлаждение стерильной питательной среды в этой же емкости.
Этот способ стерилизации длителен, и поэтому во избежание суще-
ственных изменений в составе среды, процесс ведут при избыточном дав-

58 59
Для концентрирования пенициллина применяется экстракция органи-
ческими растворителями и адсорбция на активированном угле. Возможно
также применение упаривания и осаждения.
Для промышленного производства антибиотика используют культу-
ру Penicillium chrysogenum и среду, содержащую кукурузный экстракт,
гидрол, лактозу и минеральные соли.
Вместо кукурузного экстракта может быть применена арахисовая
мука, жмыхи, мука из хлопковых семян и другие источники. Возможность
широкого использования продуктов растительного происхождения обу-
словлена тем, что у P. сhrysogenum имеются сильные протеолитические
ферменты. В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь
лактозы с глюкозой в соотношении 1 : 1. Глюкоза может снижать биосин-
тез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу (в условиях
депрессии), биосинтез антибиотика идет активнее. Важную роль в процес-
се биосинтеза пенициллина играет сера, которая содержится в структуре
антибиотика. В качестве источника серы используются натрия сульфат и
натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но по-
давляет биосинтез пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимает-
ся добавлением в среду ионов железа. P. Сhrysogenum в качестве источни-
ка фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты (соли
инозитфосфорных кислот). Этот продуцент содержит фермент, разруша-
ющий фитин с освобождением неорганического фосфора.
Температура в период первой фазы должны быть 30 °С, во вторую
фазу – 20 °С; рН в период роста гриба ниже 7,0; потребление углеводов
должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо
дробным введением глюкозы.
Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфиче-
ского вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который микроор-
ганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепле-
ния. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина
(фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при
Рисунок 9 – Технологическая схема производства пенициллина
определенных концентрациях и рН среды оказывают токсическое влияние
60 61
на продуцент. Фенилуксусная кислота (С6Н5СН2СООН) наименее токсич- В настоящее время описано шесть условно выраженных возрастных
на. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост фаз продуцента пенициллина. Заметное количество пенициллина начинает
мицелия, особенно в первые 24 часа его развития. При таких условиях образовываться с IV возрастной фазы гриба, максимум накопления прихо-
обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 дится на VI фазу – в период автолиза.
часа развития может достигать 500–1000 мкг/мл. Определение возрастных фаз путем микроскопического контроля
При развитии гриба без внесения предшественника образуется около позволяет установить: 1) ход общего темпа развития гриба, его состояние,
45 % бензилпенициллина (пенициллин G) и около 53 % пенициллина К пригодное для использования посевного материала, контроль за ходом об-
(радикал – n-гептилпенициллин). При добавлении к среде фенилуксусной разования антибиотика; 2) дефекты развития и возможные причины этих
кислоты меняется соотношение образующихся компонентов в сторону дефектов; 3) момент окончания развития гриба в реакторе.
резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимо- По мере развития гриба меняется и химический состав мицелия. Ко-
сти от возраста достигает 75–99 % от смеси пенициллинов. В процессе личество общего азота и белка в мицелии уменьшается, содержание моно-
культивирования P. Сhrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной сахаридов в период максимального биосинтеза пенициллина (96 часов)
кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не увеличивается почти в 6 раз по сравнению с начальным периодом, количе-
-лактамного характера, близкие к цистеину и метионину. Добавление в ство дисахаридов уменьшается. Изменяется количество отдельных амино-
среду фенилуксусной кислоты способствует более интенсивному метабо- кислот.
лизму серосодержащих компонентов в соединения -лактамного характе- Процесс биосинтеза пенициллина ведется при самом тщательном со-
ра. блюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур посто-
При развитии продуцента пенициллина (гриба P. Сhrysogenum) на ронней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связано
кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы. с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пенициллина-
Первая фаза – рост мицелллия, выход антибиотика низок. Всегда зу. Особенно активно продуцируют этот фермент B. subtilis и B. cereus.
присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулезная
продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно. палочка (Mycob. tuberculosis). Предположительно именно с этим свойством
Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину.
в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН. Механизм биосинтеза молекулы пенициллина представлен на
Вторая фаза – максимальное образование пенициллина. Это связано рис. 10.
с быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. Увеличение массы
мицелия незначительное, потребление кислорода снижается, рН среды
остается почти без изменений.
Третья фаза – снижение концентрации антибиотика в среде в связи
с начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого про-
цесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.

62 63
Кетоглутарат + Ацетил-КоА Современная биотехнологическая промышленность получает куль-
туральные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл пенициллина. Вы-
Гомоцитрат деление пенициллина начинается с фильтрации или центрифугирования
(отделения мицелия гриба).
α-кетоадипиновая кислота Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде
кислоты, выделяют путем экстракции неполярными органическими рас-
α-кетоадипиновая кислота творителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутанолом и
др.). Очистку антибиотика проводят путем замены растворителей, по-
скольку соли пенициллина плохо растворимы в органических растворите-
L--аминоадипиновая кислота (L--ААК)
лях. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный
раствор в виде соли, добавляя щелочь. Повторяя эти операции, пеницил-
L-цистеин
лин кон-центрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в
виде натриевых или калиевых солей. Новокаиновые и бензатиновые соли
L--ААК-L-цистеин (LL –дипептид) являются основой пролонгированных препаратов пенициллина для внут-
римышечного введения.
L-валин В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли достаточно
стабильны в течение длительного времени при температуре 4 °С. Растворы
L--ААК-L-цистеин-D-валин (LLD-трипептид) быстро теряют активность (в течение 24 часов при температуре 20 °С), их
готовят непосредственно перед введением.
Моноциклический -лактам В настоящее время большое практическое значение имеет
полусинтетический (биологический + химический) способ получения ана-
логов природного пенициллина. Исходным продуктом служит
L--ААК-L-цистеин-D-валин (LLD-трипептид)
6-аминопенициллановая кислота (6-АПК). Эту кислоту получают в резуль-
тате биосинтеза при развитии P. Сhrysogenum при отсутствии предше-
Изопенициллин N (L--АКК-6-АПК)
ственника в среде или путем ферментативного дезацилирования бензилпе-
нициллина или феноксиметилпенициллина при участии фермента пени-
С6Н5СН2СООН
циллинацилазы (пенициллинамидазы). Второй способ наиболее перспек-
тивен. Используется иммобилизованная пенициллинацилаза, которая гид-
Бензилпенициллин (С6Н5СН2СО-6-АПК) ролизует бензилпенициллин с образованием 6-АПК и фенилуксусной кис-
лоты. Пенициллинацилаза образуется различными группами микроорга-
Рисунок 10 – Механизм биосинтез молекулы пенициллина
низмов, в том числе она образуется всеми продуцирующими пенициллин
грибами. В настоящее время предложен способ получения иммобилизо-
64 65
ванных клеток E. Coli с высокой пенициллинацилазной активностью, при-
Сырье
годных для многократного применения. Посевной материал из качалок
Сама по себе 6-АПК не активна. Её подвергают химическому ацили- 1 4
рованию и получают аналоги пенициллина (оксациллин, ампициллин, ме- 3
тициллин, амоксициллин и др.) с улучшенными или новыми свойствами. 2 17
Всего в настоящее время используется порядка четырех десятков таких Каолин
препаратов.
Из всего общего количества природных пенициллинов примерно
Готовая Биомасса Каолин
35 % используется как медицинские препараты, а 65 % – для получения 5 6 8
продукция
6-АПК.

Биомасса
7
9
2.6.2. Получение стрептомицина 16 Центрифугат в
канализацию
Для производства стрептомицина используют штаммы актиномицета 10
12 11
Streptomyces griseus, образующего воздушный мицелий и споры. Продуцент
образует максимальное количество стрептомицина в жидкой питательной
среде, содержащей мясной экстракт.
В качестве основы питательных сред используют продукты гидроли- 14
15
за растительных или животных белков. Среду стерилизуют при 120 °С, охла- 13
ждают и засевают посевным материалом. Культивирование проводится при
25–30 °С и сопровождается аэрацией и перемешиванием.
На рис. 11 представлена аппаратурная схема производства стрепто-
мицина.

Рисунок 11 – Аппаратурная схема производства стрептомицина:


1,2 – весы для сырья; 3 – емкость для приготовления питательной среды;
4 – аппарат для посева; 5 – биореактор; 6 – центрифуга; 7 – емкость для биомассы;
8 – весы для биомассы и каолина; 9 – электросушильный шкаф для стерилизации
каолина; 10 – смеситель; 11 – гранулятор; 12 – электросушильный шкаф для
сушки гранулированной биомассы с каолином; 13 – мельница; 14 – вибрационное
сито; 15 – емкость для стандартизации продукта; 16 – агрегат для упаковки и
маркировки готового продукта; 17 – емкость для дезинфицирующего раствора

66 67
Затем культуральная жидкость фильтруется для удаления мицелия. С В соответствии с требованиями фармакопеи проводят нормирование
этой целью пользуются фильтр-прессами, обеспечивающими высокую ско- каждого компонента: С1 – от 20 % до 40 %; С1а – от 10 % до 30 %;
рость фильтрации. До подачи жидкости в фильтр к ней для улучшения филь- С2, С2а, С2b – от 40 % до 60 %.
трации примешивают наполнитель, не поглощающий стрептомицин. После Гентамицин подавляет развитие грамположительных и грамотрица-
такой первичной фильтрации рН фильтрата доводят до определенной вели- тельных бактерий, в том числе Proteus, Pseudomonas, не оказывает дей-
чины, а затем окончательно отфильтровывают его с помощью второго филь- ствия на грибы. Применяют гентамицин сульфат при различных инфекци-
тра. Осадок, оставшийся после фильтрации, утилизируется. онных заболеваниях, вызванных чувствительными к нему микроорганиз-
Стрептомицин и некоторые примеси извлекают из фильтрата путем ад- мами. Препарат особенно эффективен при инфекциях мочевыводящих пу-
сорбции на активированном угле, который затем автоматически подается в тей, респираторных и желудочно-кишечных болезнях. В связи с широким
фильтр-пресс, где остатки неактивной жидкости отделяются. Стрептомицин
спектром действия гентамицин назначают часто при смешанной инфекции,
смывается с активированного угля разбавленным спиртовым раствором соля-
а также когда возбудитель не установлен (в том числе, при общей экстрен-
ной кислоты, нейтрализуется и затем концентрируется путем упаривания.
ной профилактике).
Полученный концентрат обрабатывается ацетоном, который осаждает соля-
Субстанция гентамицина сульфата представляет собой пористую
нокислый стрептомицин. Смесь фильтруется через пресс, причем фильтрат
массу или порошок белого или почти белого цвета. Гигроскопичен, легко
поступает на регенерацию растворителя. К безводному спиртовому раство-
растворим в воде, практически не растворим в 95 %-ном спирте, хлоро-
ру соли стрептомицина добавляют спиртовой раствор хлористого кальция,
форме, эфире.
чтобы получить кристаллическую соль стрептомицина. В асептических
Современное промышленное получение гентамицина сульфата – это
условиях соль стрептомицина растворяют в воде, пропускают через фильтр
сложная многоступенчатая система, состоящая из ряда последовательных
(0,22 мкм) для стерилизующей фильтрации с целью удаления микроорга-
низмов, затем подвергают лиофилизации, измельчают в порошок и фасуют. технологических стадий. На рис. 12 представлена технологическая схема
получения гентамицина сульфата.
2.6.3. Получение гентамицина

Гентамицина сульфат – антибиотик, относящийся к группе амино-


гликозидов; представляет собой смесь гентамицинов сульфатов, которые
образуются культурой Micromonospora purpurea. Основные компоненты
гентамицина сульфата представлены как:
С1 (С21Н43N5O7), где R1 – СН3, R2 – СН3, R3 – Н;
С1а (С19Н39N5O7), где R1 – Н, R2 – Н, R3 – Н;
С2 (С20Н41N5O7), где R1 – Н, R2 – СН3, R3 – Н;
С2а (С20Н41N5O7), где R1 – Н, R2 – Н, R3 – СН3;
С2b (С20Н41N5O7), где R1 – СН3, R2 – Н, R3 – Н.

68 69
Приготовление посевного материала. Исходной в производстве
Приготовление посевного материала на агаризированной гентамицина является культура Micromonospora purpurea var. Violacca
питательной среде
штамм ВНИИ-7R, выращенная в пробирках на скошенной агаризирован-
ной среде Гаузе-1.
Выращивание вегетативного посевного материала
в колбах Подготовка посевного материала – одна из ответственных опера-
ций в цикле биотехнологических процессов получения гентамицина. От ко-
Выращивание посевного мицелия личества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в
в биореакторах ферментере, так и биосинтез гентамицина в целом.
При получении вегетативного посевного материала второй генерации
Биосинтез гентамицина (культивирование) используют вегетативный посевной материал первой генерации, если он от-
вечает следующим требованиям:
Предварительная обработка и ультрафильтрация  биомасса средней густоты от бежевого до розово-сиреневого цве-
культуральной жидкости гентамицина та, при взбалтывании мицелий обволакивает стенки флакона, не оседает на
дно и не расслаивается;
 при микроскопии окрашенного препарата наблюдаются микроколо-
Сорбция гентамицина на катионите КБ-2
нии, гифы длинные или средней длины, волнистые, протоплазма базофиль-
в аммонийной форме и десорбция
ная, иногда в виде пунктира;
Получение концентрата гентамицина  посторонняя микрофлора отсутствует.
Выращивание вегетативного посевного материала второй генерации
осуществляют в посевном биореакторе для глубинного культивирования,
Получение осветленного концентрата гентамицина и снабженного мешалкой, барбатером для подачи воздуха, рубашкой для
перевод его в сульфатную форму
нагрева и охлаждения среды. Приготовление посевной среды проводят в
биореакторе БИОР-0,1.
Распылительная сушка водных растворов гентамицина Биосинтез гентамицина (культивирование). Процесс биосинтеза
гентамицина в аппаратах БИОР-0,25 осуществляется методом периодического
Фасовка, упаковка и маркировка глубинного культивирования. Посевной материал вносят в среду для культи-
вирования в количестве 5–10 % от её объема. Культивирование длится 6–7
суток. В табл. 4 показаны режимы культивирования продуцента гентамицина в
Контроль
биореакторе БИОР-0,25.

Рисунок 12 – Технологическая схема получения гентамицина сульфата

70 71
Таблица 4 – Режимы культивирования продуцента гентамицина Для сорбции гентамицина его нативный раствор из сборной емкости
в биореакторе БИОР-0,25 подают насосом снизу вверх на ионно-обменную колонку, заполненную ка-
тионитом КБ-2 в аммонийной форме.
Продолжительность культивирования, ч В колонне десорбции проводят стадию химической очистки (удаление
Регулируемые показатели
0–24 24–96 96 – до слива гентамициноподобных и окрашивающих примесей) и десорбцию гентами-
Температура, ºС 37 ± 1 33 ± 1 33 ± 1 цина.
Расход воздуха на аэрацию, Элюирование минорных компонентов примесей проводят 0,043Н рас-
75 105 75
дм3 /мин твором аммиака, пропуская его через слой катионита в ионообменной ко-
Частота вращения мешалки, лонне сверху вниз:
3,5 4,16 3,5
об/мин [R(СОО)5 – гентамицин-комплекс с минорными примесями] +
5NН4ОН => [R(СОО)5 – гентамицин-комплекс без минорных примесей] +
Изменение режимов аэрации в ферментере проводят с учетом массо- [гентамициноподобные минорные примеси]5.
обменных характеристик аппаратов по сульфитному числу. Давление в про- Десорбцию гентамицина проводят 5 %-ным раствором аммиака, про-
цессе биосинтеза поддерживается в пределе 0,05–0,2 кгс/см2. При вспенива- пуская его через колонну с катионитом сверху вниз.
нии культуральной жидкости вводят порционно 50 см3 стерильного пенно- Получение концентрата гентамицина. Полученный элюат гентами-
гасителя. цина упаривают на роторном испарителе (Т = 50–55 °С, Р = 0,085 МПа)
Предварительная обработка и ультрафильтрация культуральной для удаления аммиака и концентрирования гентамицина до
жидкости. Культуральную жидкость из ферментера загружают в приемную 60000–70000 мкг/см3.
емкость, включают насос на перемешивание и проводят предварительную Осветление концентрата гентамицина основания углем и перевод
обработку последовательным добавлением реагентов (растворы щавелевой его в сульфат форму. Очищенный и сконцентрированный раствор гента-
кислоты, цетилперидиний бромида) для коагуляции белков и удаления мицина основания помещают в колбу и подкисляют раствор 20 %-ной сер-
поливалентных металлов. ной кислоты до рН 6,0–6,5; добавляют активированный уголь (7 % от объема
Процесс ультрафильтрации осуществляют на установке типа УСФ-1. концентрата) и нагревают до 40–45 °С при перемешивании 30 мин, затем
При ультрафильтрации культуральной жидкости происходит процесс кон- уголь отфильтровывают.
центрации растворов высокомолекулярных соединений (в том числе и анти- Распылительная сушка водных растворов гентамицина сульфата.
биотиков) с одновременной очисткой их от низкомолекулярных примесей Распылительную сушку осветленного концентрата гентамицина сульфата
путем пропускания раствора через мембрану. производят на лабораторной сушилке типа УРС-0,5, предназначенной для
Сорбция гентамицина на катионите КБ-2 в аммонийной форме и распылительного обезвоживания растворов в асептических условиях. Осу-
десорбция. Процесс выделения и химической очистки гентамицина на кати- шителем является очищенный воздух.
оните КБ-2 включает следующие операции: сорбция гентамицина из натив- Перед началом работы все детали сушильной камеры моют, протирают
ного раствора, элюирование минорных компонентов, десорбция гентамици- спиртом, собирают и высушивают горячим воздухом при 108 °С.
на. Далее устанавливают значения температур воздуха-теплоносителя: на
входе в сушильную камеру – 175–185 °С; на выходе из сушильной
камеры – 103–105 °С.

72 73
Раствор антибиотика, подаваемый в сушильную камеру, распыляется в Метод диффузии. Питательную среду, рекомендованную для коли-
токе нагретого воздуха до мелких капель. чественного определения, расплавляют и вносят в нее при температуре,
Фасовка, упаковка и маркировка препарата гентамицина сульфа- например, от 48 °С до 50 °С определенное количество суспензии микроор-
та. Загрузку и выгрузку препарата из сушилок, а также фасовку проводят в ганизмов, чувствительных к исследуемому антибиотику. После внесения
помещениях, где поддерживаются асептические условия. тест-микроорганизма, питательную среду разливают в чашки Петри (слой
Фасовка осуществляется в ламинарном боксе. Порошок гентамицина от 2 мм до 5 мм). Затем готовят растворы стандартного образца с извест-
сульфата переносят из приемной тары распылительной сушки в банки из ными концентрациями и растворы исследуемого антибиотика в концен-
оранжевого стекла с винтовой горловиной и навинчиваемой крышкой. трациях аналогичных концентрациям стандартного образца. Растворы вно-
сят в лунки на твердой среде, содержащей тест-микроорганизмы. Чашки
2.7. Контроль антибиотиков инкубируют при подходящей температуре около 18 часов. Затем измеряют
диаметры круглых зон угнетения роста с точностью не менее 0,1 мм (или
Требования к качеству антибиотиков изложены в Государственной их площадь) и рассчитывают активность, используя подходящие статисти-
Фармакопее Украины и Европейской фармакопеи. Методов определения ческие методы.
активности антибиотиков много, но главным из них является микробио- Турбометрический метод. В питательную среду вносят суспензию
логический. микроорганизмов, чувствительность которых к испытуемому антибиотику
Способность убивать или тормозить рост и развитие микроорганиз- обеспечивает достаточно сильное угнетение роста в условиях проведения
мов называют биологической активностью препарата. В связи с этим раз- эксперимента. Затем готовят растворы стандартного образца с известными
личают цидное и статическое действия веществ. Например, антибиотики концентрациями и растворы исследуемого антибиотика в концентрациях
обладают фунгицидным, бактерицидным действием или фунгистатиче- аналогичных концентрациям стандартного образца. Равные объемы каждо-
ским и бактериостатическим действием. го из растворов вносят в одинаковые пробирки и добавляют в каждую про-
Для количественного определения активности антибиотика введено бирку равные объемы инокулированной питательной среды. Пробирки вы-
понятие единицы действия (ЕД). При определении активности выделенно- держивают при указанной температуре от 3 до 4 часов. После окончания
го антибиотика обычно в качестве эталона используют химически чистый периода инкубации останавливают рост микроорганизмов путем добавле-
препарат с заранее известной величиной активности. ЕД – это активность ния в каждую из пробирок 0,5 мл формальдегида. Проводят измерение
определенного весового количества антибиотика, принятого за эталон. мутности и проводят расчет активности, используя подходящие статисти-
Активность антибиотиков определяют путем сравнения степени ческие методы.
угнетения роста чувствительных микроорганизмов в результате действия Кроме микробиологического метода контроля применяют химиче-
испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентра- ские и физико-химические методы: колориметрию, жидкостную и тонко-
циях. Стандартные образцы, используемые для количественного определе- слойную хроматографию, спектрофотометрию в ультрафиолетовой и ин-
ния, представляют собой вещества, активность которых точно установлена фракрасной областях и др.
в соответствие с международным стандартом препарата. При количествен- В табл. 5 приведена характеристика субстанций антибиотиков в со-
ном определении активности доверительные интервалы (Р = 0,05) должны ответствии с требованиями фармакопеи Украины. Субстанция антибиоти-
составлять не менее 95 % и не более 105 % от установленной активности. ков также проходит контроль по следующим тестам: стерильность, бакте-
Количественное определение проводят, используя один из двух ме-
тодов: метод диффузии или турбометрический метод.
74 75
риальные эндотоксины или пирогенность, тяжелые металлы, аномальная Продолжение таблицы 5
токсичность, оптическая плотность, компонентный состав и др.
1 2 3 4 5 6
Порошок бело- ИКС, ТСХ 5,5–7,5; ВЭЖХ
Таблица 5 – Характеристика субстанций антибиотиков в го или почти кач. реак- Каждая
соответствии с требованиями фармакопеи Украины Бензилпенициллина
белого цвета; ции; примесь
калиевая соль 96,0–101,0
растворим в от +270º не более
C16H17KN2O4S
Иденти- воде до +300º 1,0 %;
Количест- Приме-
фикация;
Наименование венное Описание; рН; си;
оптиче- Порошок жел- УФС, ИКС -; Каждая
антибиотика определе- растворимость вода сульфат-
ское вра- Не менее того или слегка кач. реак- не более примесь
ние ная зола
щение 4400 коричневого ции; 5,0 % не более
1 2 3 4 5 6 Нистатин МЕ/мг, цвета; не рас- 4,0 %;
Порошок белого ИКС кач. 9,0–11,0; ВЭЖХ C47H75NO 17 нистатина творим в воде, не более
или почти бело- реакции; от 1,8 % не более не менее растворим в 3,5 %
го цвета; от -45º до 6,5 % 6,2 %; 85,0 % диметилсуль-
Азитромицин
96–102 практически не до -49º не более фоксиде
С38Н72N2О12
растворим в во- 0,2 %
де, легко в эта-
ноле
Заключение
Порошок желто- ТСХ кач. 1,8–2,8; ВЭЖХ
го цвета; реакции; не более не более Необходимость поисков новых антибиотиков обусловлена многими
Тетрациклина
растворим в во- от -240º 2,0 % 5,5 %;
гидрохлорид 95–102 причинами. Так, ежегодно на нашей планете умирают от инфекционной па-
де, мало в спир- до -49º не более
C22H25CIN2O8
те, не растворим 0,5 % тологии более 50 млн. человек. С инфекционными и паразитарными болез-
в ацетоне нями связаны 25 % смертности в мире, а с учетом роли инфекции в «неин-
Порошок белого УФС, ТСХ 3,5–5,5; ВЭЖХ
Гентамицина или почти бело- кач. реак- не более не более
фекционных» заболеваниях – почти 35 %. Кроме того, наблюдаются «воз-
сульфат го цвета; ции; 15,0 % 10 %; вращающиеся инфекции», т.е. инфекции, которые достались нам в наслед-
Не менее
C21H43N5O7 растворим в во- от +107º не более ство от предыдущих веков. Среди них туберкулез, малярия, лейшманиоз, ин-
590 МЕ/мг
C19H39N5O7 де, практически до +121º 1,0 %
C20H41N5O7 не растворим в фекции, передающиеся половым путем (например, сифилис). В то же время,
спирте наблюдается появление новых инфекций.
Порошок белого ИКС, ТСХ 3,5–5,5; ГЖХ
Наряду с этим выявлены и недостатки, связанные с высокой резистент-
или почти бело- кач. реак- от 3,1 % не более
Линкомицина го цвета; ции; до 4,6 % 5,0 %; ностью микроорганизмов к антибиотикам и появлению штаммов не только
гидрохлорид 82,5–93,0 растворим в во- от +135º не более антибиотикоустойчивых, но и антибиотикозависимых.
C18H35CIN2O6S,H2O де, мало раство- до +150º 0,5 %
Кроме того, установлено, что широкое и бесконтрольное применение
рим в спирте и
ацетоне антибиотиков быстро привело к появлению резистентных и атипичных форм

76 77
большинства актуальных возбудителей инфекционных болезней. Началась  липосомы, содержащие антибиотики приводят к снижению про-
гонка по созданию все новых и новых антибактериальных препаратов, боль- явления побочных эффектов по сравнению со свободными формами анти-
шинство из которых быстро становились малоэффективными. В настоящее биотиков;
время описано более 6000 антибиотиков. Однако только 2–3 % известных ан-  антибиотики, инкапсулированные в липосомы проявляют боль-
тибиотиков применяется на практике. Остальные из-за их токсичности, инак- шую антимикробную активность по сравнению со свободными формами
тивации в организме и других причин не используются. Большую часть вы- антибиотиков.
пускаемых антибиотиков составляют пенициллины, цефалоспорины, тетра- За прошедший период изучения липосомальных форм антибиотиков
циклины, эритрин, стрептомицин. были изучены липосомы, содержащие: адриамицин, амикацин, амфотери-
С учетом этих данных стали появляться высказывания об отказе от цин, ампицилин, азаитромицин, блеомицин, доксициклин, доксорубицин,
производства и применения антибиотиков. Но в настоящее время пока нет вакомицин, стрептомицин, изониазид, гентамицин, канамицин, тобрами-
других надежных лекарственных препаратов, которыми можно заменить ан- цин, рифампицин, цефалин и многие другие. Созданы липосомальные
тибиотики. Поэтому их продолжают выпускать и применять во врачебной коммерческие препараты содержащие антибиотики: доксорубицин, дауно-
практике. Наряду с выпуском известных антибиотиков ведутся поиски но- рубицин, амфотерицин В, тобрамицин, амикацин и ряд других. Для боль-
вых, более эффективных препаратов. шинства антибиотиков установлена возможность преодоления резистент-
Необходимо остановиться еще на одном вопросе. Весьма перспек- ности при их использовании в липосомальной форме. По нашему мнению,
тивной является липосомальная форма антибиотика, открывающая значи- в ряде случаев, липосомальная форма антибиотиков позволит расширить
тельные возможности для воздействия на внутриклеточных возбудителей. их применение в клинике.
При лечении инфекционных заболеваний липосомы применяют в ка- Таким образом, развитие исследований в биотехнологии, создание
честве носителей антимикробных агентов – антибиотиков различной новых штаммов-продуцентов антибиотиков, включая рекомбинантные,
структуры. Преимуществом липосомальной формы антибиотиков для ле- производство высокоэффективного оборудования даст возможность по-
чения бактериальной контаминации является: полнить номенклатуру антибиотиков и их лекарственных форм.
 антибиотики, инкапсулированные в липосомы не подвергаются
действию экзогенных гидролаз, что является одним из путей борьбы с ре-
зистентностью к антибиотикам;
 при попадании в организм липосомальные лекарственные формы
антибиотиков обладают выраженным пролонгированным действием по
сравнению со свободными формами антибиотиков;
 липосомы, содержащие антибиотики сливаются с наружной мем-
браной клеточной стенки бактерий, проникая во внутрь бактериальной
клетки, что приводит к её гибели.
78 79
Контрольные вопросы ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНОВ

1. Описать историю открытия антибиотиков.


2. Классификация антибиотиков по спектру действия и химической 3.1. Нефракционированные гепарины:
структуре. выделение и характеристика
3. Классификация антибиотиков по молекулярному механизму дей-
ствия. Препараты на основе гепаринов хорошо известны сегодня, и трудно
представить профилактику и лечение патологических поражений сосудов
4. Назовите бактерии продуценты антибиотиков на примере пени-
и тканей без этой группы биологически активных соединений. Известно,
циллина.
что гепарины применяют для лечения большого числа заболеваний: тром-
5. Как определяют антагонистический спектр и активность антибио-
бозы и тромбоэмболии, ишемическая болезнь сердца и инфаркт миокарда,
тиков? гломерулонефрит и другие. Препараты гепарина вводят человеку в виде
6. Какие требования предъявляют к ферментерам для производства инъекций, гелей в форме липосомальных препаратов и перорально.
антибиотиков? Гепарин – протеогликан, в котором несколько полисахаридных це-
7. Охарактеризуйте основные технологические этапы получения ан- почек связаны с общим белковым ядром. Дисахаридный компонент поли-
тибиотиков и методы их очистки. сахаридных цепочек гепарина содержит глюкозамин и уроновую кислоту.
8. Условия культивирования продуцентов антибиотиков (состав пи- Большинство аминогрупп остатков глюкозамина существуют в
тательных сред, температура, аэрация и др.). N-сульфатированной форме, но есть и небольшое количество ацетили-
9. Схема производства гентамицина. рованных аминогрупп. Более 90 % уроновой кислоты представлено идуро-
10. Как получают и для чего используют 6-АПК? новой кислотой и только 10 % – глюкуроновой. Белковая составляющая
протеогликана уникальна тем, что состоит только из сериновых и глици-
11. Почему существует необходимость в создании нескольких поко-
новых остатков.
лений антибиотиков?
Нефракционированные гепарины (НФГ) представляют собой гетеро-
12. Схема производства пенициллина. Какие формы пенициллина се-
генную смесь мукополисахаридов. Они связываются с поверхностью эндо-
годня используются в медицине?
телиальных клеток и различными белками плазмы. Биологическая актив-
13. Схема производства стрептомицина.
ность НФГ зависит от плазменного протеазного ингибитора – антитром-
14. Физико-химические и фармакологические свойства антибиотика.
бина III. Антитромбин III ингибирует факторы свертывания – протеазы,
15. Какие основные лекарственные формы антибиотиков?
особенно тромбин (фактор IIа), факторы IХ и Ха, при помощи формирова-
16. Какие методы применяют для очистки антибиотиков?
ния эквимолярных стабильных комплексов с ними. При отсутствии гепа-
17. Влияние состава питательных сред и предшественника на эффек-
рина эти реакции протекают медленно, присутствие гепарина ускоряет их
тивность синтеза антибиотика штаммами продуцентами. в 1000 раз. Только три молекулы в коммерческих препаратах НФГ имеют
18. Чем объясняется необходимость создания новых антибиотиков? этот ускоряющий эффект ввиду наличия уникального пентасахаридного
19. Что означает резистентность бактерий? участка, необходимого для высокоаффинной связи с антитромбином. Ак-
тивная молекула гепарина связывается с антитромбином и вызывает кон-
80 81
формационные изменения этого ингибитора. Конформационные измене-
ния антитромбина предоставляют его активный участок для более интен-
А
сивного взаимодействия с протеазами. С тканевыми фактором (ТФ) фактор
VII формирует активированный комплекс (VII-ТФ), который катализирует
активацию ферментного каскада от фактора IX до фактора IХa. Активиро-
ванный фактор XIa также катализирует эту реакцию. Ингибитор тканевого
фактора ингибирует каталитическое действие VIIa-ТФ комплекса. Резуль-
татом этого каскада является превращение фибриногена в фибрин, эссен-
циальный компонент функционального сгустка. Гепарин, действующий в В
крови, прямо активирует противосвертывающие факторы, особенно антит-
ромбин, который в свою очередь инактивирует ряд факторов.
Препараты гепарина представляют собой гетерогенную смесь суль-
фатированных мукополисахаридов (гликозаминогликанов) с различными
молекулярными массами. В полимере гепарина главная повторяющаяся
Рисунок 13 – Структурные компоненты гепарина:
дисахаридная единица имеет следующую формулу: 4)-2-дезокси-2-
А – наиболее частый тип дисахаридной единицы;
сульфамино-α-D-глюкопираноза-6-сульфат-(14)-α-L-идопиранозилуро-
В – схематическое изображение уникальной пентасахаридной
новая кислота-2-сульфат (1. Повторяющаяся единица составляет в гепа- последовательности (места связывания для антитромбина III (АТ III)),
рине из легких крупного рогатого скота свыше 90 %, а в слизистой обо- являющейся основным структурным центром, определяющим
лочке (мукозе) тонкого кишечника свиней около 75 %. В макромолекуле антикоагулянтную способность гепарина
мукозного гепарина, кроме указанных дисахаридных фрагментов, присут-
ствуют остатки 2-ацета-мидо-2-дезокси-α-D-глюкопиранозы и β-D- НФГ неоднородны по своему составу. Их молекулярная масса ко-
глюкуроновой кислоты. На pис. 13 представлены структурные компоненты леблется от 2 кDа до 80 кDа. Фракции НФГ с низкой молекулярной массой
(менее 5 кDа) обладают более мощной анти-Ха активностью, но меньшей
гепарина. Высокое содержание сульфатных и карбоксильных групп обу-
антитромбиновой активностью. Фракции гепарина с высокой молекуляр-
славливает высокий отрицательный заряд гепарина; изоэлектрическая точ-
ной массой (более 20 кDа) имеют противоположные свойства, т. е. в ос-
ка составляет pI – 3,2–4,2.
новном, обладают антитромбиновой активностью. Обнаружено, что анти-
коагулянтная активность гепарина связана с особенностями строения его
молекулы. Так, антикоагулянтная активность зависит от содержания серы,
степени сульфатирования, количества и расположения О-сульфатных
групп, а также от размера скелета молекулы. Более высокая активность в
препаратах с большим содержанием эфирсвязанной серы. Показано, что
активность фракции, в которой на дисахаридную структурную единицу

82 83
приходится четыре остатка серной кислоты, в 1,4 раза превышает актив- 20–25 °С, прибавляют хлорид натрия, выдерживают 12 часов и раствор ге-
ность фракции гепарина с тремя остатками. парина отделяют мембранной фильтрацией).
В качестве примера технологии получения субстанции гепарина 9. Выделение гепарина (к раствору гепарина прибавляют трилон Б из
натрия мы приводим методику получения гепарина из легких сельскохозяй- расчета 0,7 грамма на 1 литр раствора, доводят рН раствора 18 %-ным рас-
ственных животных: твором кислоты хлористоводородной до значения 6,0–6,2; охлаждают до
1. Подготовка сырья (дефростация легких, отмывка от крови, взве- 5–10 °С и прибавляют этанол, выдерживают 24 часа; осадок отделяют на
шивание ткани, измельчение (4,5–5,0 мм)). нутч-фильтре, промывают охлажденным этанолом; сушка осадка при ком-
2. Экстракция гепарина (суспензию легких помещают в 20-й % рас- натной температуре, а затем при 50–60 °С);
твор хлорида натрия, добавляют натрия карбонат, доводят 20 %-ным рас- Однако НФГ имеют ряд существенных недостатков: они не способ-
твором натрия гидроокиси до значения рН 8,5–8,7; кипятят 5 мин, охла- ны ингибировать тромбин, связанный с тромбом, который продолжает ак-
ждают до 50–60 °С). тивировать свертывание крови и ингибировать фибринолиз (процесс рас-
3. Отделение экстракта гепарина от ткани легких и проведение творения тромбов и сгустков крови). Известным осложнением применения
осветляющей фильтрации раствора. НФГ является гепарин-индуцированная тромбоцитопения. Кроме того,
4. Сорбция гепарина (проводят последовательную сорбцию при действие тромбина зависит от наличия кофактора – антитромбина III.
60–65 °С на нескольких ионообменных колонках с анионитом; после сорб- Также гепарин может быть инактивирован тромбоцитарным фактором IV,
ции последовательно промывают анионит 1 М раствором хлорида натрия, белками плазмы крови или путем связывания его макрофагами. В след-
очищенной водой, раствором для удаления липидов и снова очищенной ствии этого, для повышения эффективности антикоагулянтного действия
водой). НФГ необходимо прибегать к непрерывной внутривенной инфузии с си-
5. Десорбция гепарина (проводят 20 %-ным раствором хлорида стематическим контролем активированного частично тромбопластиново-
натрия, содержащим трилон Б с рН 7,5–8,0). го времени (АЧТВ) для корректировки дозы препарата. Тем не менее, даже
6. Выделение гепарина сырца (раствор гепарина охлаждают до такой подход может не обеспечить получение адекватного эффекта из-за
10–15 °С прибавляют охлажденный до 0–2 °С этанол, перемешивают и вы- несовершенства АЧТВ как показателя антикоагулянтной активности гепа-
держивают для формирования осадка, который отделяют на нутч-фильтре, рина и отсутствия других, более эффективных, лабораторных тестов.
промывают охлажденным этанолом).
7. Сушка осадка при комнатной температуре, а затем при 3.2. Биотехнологическое получение низкомолекулярных
50–60 °С. гепаринов
8. Очистка гепарина сырца (сухой гепарин помещают в очищенную
воду, доводят рН до 8,3–8,5 при помощи 18 %-ого раствора кислоты хло- Наличие побочного действия у НФГ привело во второй половине
ристоводородной, нагревают до 68–72 °С, прибавляют 5–10 %-ный раствор 80-х годов к созданию низкомолекулярных гепаринов (НМГ). НМГ получа-
калия марганцовокислого, нагревают до 90–95 °С; осадок отделяют на ют различными химическими и ферментативными способами деполимери-
мембранных фильтрах; доводят рН раствора 18 % -ным раствором кислоты зации гепарина из НФГ, полученного из слизистой кишечника свиньи. Об-
хлористоводородной до значения 6,9–7,1; добавляют безводный натрий разуются фрагменты от 4,0 до 6,5 кDа. НМГ обладают большей активно-
сернокислый, нагревают при 40–50 °С в течение 10 мин, охлаждают до стью в ингибировании фактора Ха и меньше влияют на тромбин

84 85
(фактор II). Отношение анти-Ха к анти-IIа (антитромбин) у различных нией, которая в свою очередь обусловлена взаимодействием НМГ с тром-
НМГ варьирует от 2 : 1 до 4 : 1. В отличие от НФГ, у которого соотноше- боцитами. Кроме того, на лабораторных животных продемонстрирована
ние анти-Ха к активности АЧТВ составляет 1 : 1 ингибирование Ха факто- возможность проникновения гепарина с молекулярной массой 1,9–4,6 кDа
ра свертывания НМГ значительно более выражено, чем его влияние на через гематоэнцефалический барьер.
АЧТВ. Это оказывает более благоприятное влияние на эффективность и Одним из первых способов получения НМГ явилась работа по
переносимость НМГ и, соответственно, на ожидаемую противотромбиче- ферментативной деполимеризации НФГ при помощи гепариназы, вы-
скую активность и риск развития кровотечения. С химической и фармако- деленной из Flavobacterium heparinum. Для этой цели использовали гепа-
логической точки зрения НМГ являются гетерогенной смесью полисаха- рин натрия с молекулярной массой 17,3 кDа. НФГ растворяли в 0,1 М
ридов, которые содержат также биологически неактивные компоненты. По натрия ацетата и 0,01 М кальция ацетата. К раствору прибавляли гепарина-
мнению ряда исследователей, способы получения НМГ: ферментативная зу с активностью 1050 МЕ/мг, растворенную в 0,1 М натрия ацетата. Смесь
деполимеризация, химическая деградация или фракционирование не влия- термостатировали при 30 °С при постоянном перемешивании. Были полу-
ют на их активность. Относительное содержание высоко- (более 7,5 кDа) чены НМГ со средней молекулярной массой около 5 кDа. С целью повы-
и низко- (менее 2,5 кDа) молекулярных фрагментов полисахаридных цепо- шения эффективности технологии предложено использовать биотехноло-
гический процесс деполимеризации НФГ на иммобилизованном комплексе
чек определяет фармакодинамический и фармакокинетический профиль
ферментов.
отдельных препаратов в клинических исследованиях. НМГ получают из
Предложен способ получения НМГ путем ферментативной депо-
слизистой оболочки кишок свиней, при этом НФГ был получен из слизи-
лимеризации с помощью комплекса ферментов (гепариназы), выделен-
стой оболочки кишок крупного рогатого скота с помощью ферментативной
ных из Streptomyces kurssanovii, иммобилизованных на силохроме, при ве-
деполимеризации или прямой экстракции серной кислотой. При этом обра-
совом соотношении – гепарин (выделенный из слизистой оболочки свиньи
зуются фрагменты разной длины: а) молекулы, которые содержат около
с молекулярной массой 7,5–15 кDа) : иммобилизованный фермент (1 : 1).
16 моносахаридов и могут ингибировать не только фактор Ха, но и тром-
Суспензию перемешивают при 37 °С в течение 3 часов. Иммобилизован-
бин (IIа); б) молекулы из 8–18 моносахаридов (молекулярная масса меньше ный фермент отделяют центрифугированием, промывают 0,5 М раствором
5,4 кDа), которые ингибируют только фактор Ха; в) молекулы, которые натрия хлорида и водой для инъекций. Имеются данные о целесообразно-
имеют меньше, чем 8 моносахаридов и не проявляют ингибирующего эф- сти проведения гидролиза гепариназами Streptomyces kurssanovii при тем-
фекта; г) по меньшей мере, 24 сахаридных остатка должны быть в молеку- пературе 40–45 °С. Промывную жидкость объединяют с супернатантом и
ле гепарина (что соответствует молекулярной массе около 7,2 кDа), чтобы обессоливают на колонке с сефадексом G-10. Элюирование проводится во-
он мог ускорять инактивацию тромбина антитромбином III. дой со скоростью 80 мл/ч. Полученный продукт НМГ подвергают лиофи-
Сегодня существует около 20 препаратов НМГ с молекулярной лизации. Получают НМГ с выходом около 70 % и молекулярной массой на
средней массой около 5 кDа. Главное преимущество НМГ следует из их 50–75 % ниже, чем у исходного гепарина. Анти-Ха активность составляет
фармакокинетических свойств: в 2–4 раза большее время полувыведения 130–170 МЕ/мг, что соответствует удельной активности таких препаратов
из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и как Фраксипарин и Дельтапарин. Молекулярная масса полученного НМГ
более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только ис- составляла 4,5 кDа (при использовании исходного гепарина с молекуляр-
ходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). ной массой 15 кDа) и 2,7 кDа (при использовании исходного гепарина с
Меньший токсический эффект связан с вызываемой НФГ тромбоцитопе- молекулярной массой 7,5 кDа).

86 87
Интересен способ получения НМГ на основе предварительной щения при 20 °С равной 28 °–55 °; анти-Ха – 163 МЕ/мг и анти-IIа –
ультрафильтрации НФГ с целью их освобождения от фракций с молеку- 53 МЕ/мг.
лярной массой менее 3 кDа и проведения деполимеризации и фракциони- Достаточно часто используют метод деполимеризации с применени-
рования за счет различного растворения продуктов в водной и органиче- ем азотной кислоты. НФГ, полученный из слизистой кишечника свиньи
ской фазах. Несмотря на то, что гепарин не растворим в органических рас- растворяю в очищенной воде до конечной концентрации 5,0 %. К раствору
творителях, его комплексы с катионами четвертичного аммония при опре- НФГ прибавляют натрия нитрат до конечной концентрации 0,01М. Смесь
деленных условиях растворимы в дихлорметане. Для деполимеризации ис- доводят до температуры 18–24 °С и в течение двух минут прибавляют
пользовались коммерческие препараты НФГ с молекулярной массой 37 %-ый раствор хлористоводородной кислоты до значения рН = 3,2. Рас-
17 кDа, выделенные из слизистой оболочки свиньи. Гепарин натрия рас- твор перемешивают в течение двух часов при указанной температуре. По-
творяют в воде и проводят ультрафильтрацию на полых волокнах до пол- сле двух часовой инкубации при помощи 50 % раствора натрия гидроокиси
ного удаления фракций с молекулярными массами менее 3 кDа. К концен- устанавливают значение рН = 6,75. Затем проводят процесс ультрафиль-
трированному раствору до половины исходного объема прибавляют трации через мембраны с порогом отсечения 10 кDa и диализ против воды
натрия хлорида и 7,5 % раствор бензетония хлорида в дихлорметане. Рас- очищенной. Получены НМГ с выходом 42,0 %.
твор смешивают с водным 0,17 М раствором натрия хлорида. Затем к сме- Описан метод деполимеризации НФГ путем термической обработ-
си при температуре 20–25 °С прибавляют хлористый бензил. Смесь пере- ки. НФГ натрия растворяют в воде в соотношении 1 : 5, охлаждают до
мешивают при указанной температуре в течение 6 часов. Затем к смеси 5–10 °С. Добавляют катионит до снижения значения рН до 3,5 для получе-
прибавляют бензилтриметиламмония гидроксид и продолжают перемеши- ния гепариновой кислоты. Смола удаляется центрифугированием. К рас-
вание в течение 3-х часов. После окончания перемешивания к раствору твору прибавляют перекись водорода до конечной концентрации около
бензилгепаринат прибавляют 2 N раствор натрия гидроксида и выдержи- 3,5 %. После чего незамедлительно подвергают автоклавированию при
вают в течение 2-х часов при 4 °С. Реакция деполимеризации прекращает- 125 °С в течение 10 минут. Раствор охлаждают, доводят рН до значения 6,8
ся добавлением 1 N хлористоводородной кислоты. Полученный продукт при помощи гидроокиси натрия. НМГ осаждают добавлением этилового
подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом отсечения 1 кDа спирта до конечной концентрации 50,0 %. Осадок отделяют центрифуги-
для удаления хлорид-ионов, а затем продукт лиофилизируют. На этом эта- рованием и сушат в вакууме. Средняя молекулярная масса НМГ около
пе, возможно, олигосахариды можно выделить из водного раствора оса- 5 кDа.
ждением НМГ метанолом, ацетоном, этанолом в виде натриевой соли. Авторы предлагают ознакомиться с технологией получения НМГ
Необходимо отметить, что ультрафильтрация является методом очистки Эноксапарина, который сегодня широко применяется в Украине.
гепаринов от различных низкомолекулярных примесей, включая целена- 1. Предварительная стадия. Субстанцию гепарина натрия раство-
правленное концентрирование активных фракций вещества. Комбинации ряют в очищенной воде, охлаждают до температуры 4–8 °С и добавляют
ультра- и диафильтрации дают возможность с выходом 90 % проводить охлажденный этанол. Смесь выдерживают при температуре 4–8 °С в тече-
десятикратное концентрирование растворов гепарина. Этот метод исполь- ние 10–12 часов для формирования осадка. Осадок отделяют центрифуги-
зуется большинством авторов, работающих в области выделения гетеропо- рованием или фильтрацией и высушивают. Аликвоту осадка (3 % граммов)
лисахаридов из экстрактов животных тканей, в том числе и очистки НМГ. обработанного таким образом гепарина используют в качестве образца для
Полученный продукт характеризовался молекулярной массой 3,0–7,0 кDа; определения деполимеризации путем добавления к растворенному в воде
средней молекулярной массой – 3,8 кDа; содержанием: уроновой кислоты очищенному образцу азотной кислоты. Степень деполимеризации опреде-
(25–40 %), серы (10–13 %), азота (1,8–2,5 %); величиной оптического вра- ляют исследованием материала методом высокоэффективной жидкост-
ной хроматографии (эксклюзионной хроматографии). Полученное таким
88 89
образом вещество должно содержать менее 1 % дерматансульфата и хон- Таблица 6 – Характеристика примесей в субстанции Эноксапарина
дроитинсульфата (т.е. небольшой пик должен составлять менее 1 % от об-
щего). В случае соответствия продукта указанным требованиям обрабо- Метод
танный гепарин натрия передают на стадию «Солеобразование». В случае Наименования устранения в Метод
несоответствия – проводят дополнительную обработку. Спецификация
примесей процессе испытаний
2. Солеобразование. Обработанный гепарин натрия растворяют в производства
воде очищенной. К раствору добавляют бензэтония хлорид и оставляют на Дерматансульфат Осаждение гепа- <1% Эксклюзионная
10–12 часов при температуре 4–8 °С для формирования осадка. Осадок от- и хондроитин- рина с помощью хроматография
деляют фильтрацией, промывают водой очищенной и высушивают. Оса- сульфат этанола (ВЭЖХ)
док, представляющий собой бензэтониевую соль гепарина (бензэтония ге- Тяжелые металлы Активированный ≤ 30 частей на Фармакопейный
паринат) передают на стадию «Этерификация». уголь миллион метод
3. Этерификация. Осадок бензэтония гепарината растворяют в хло- Нерастворимые Активированный В соответствии с Фармакопейный
ристом метилене и добавляют хлористый бензил. Смесь выдерживают частицы уголь ДФУ метод
определенное время, которое необходимо для осуществления реакции эте- Вода и другие Лиофилизация ≤ 10 % Потеря массы
рификации. После чего к смеси добавляют метанол, собирают осадок пу- растворители при высушива-
тем фильтрования, промывают метанолом и высушивают. В результате ре- нии
акций получают бензиловый эфир гепарина в виде натриевой соли, кото- Бензиловый спирт Осаждение мета- ≤ 0,1 % (м/м) Газовая
рую передают на стадию «Деполимеризация». нолом несколько хроматография
4. Деполимеризация. Натриевую соль бензилового эфира гепарина раз в конце этапа
растворяют в воде очищенной и добавляют гидроксид натрия до получе- «Деполимериза-
ния среды со щелочным уровнем рH ≈ 9,0. Смесь выдерживают опреде- ции»
ленное время для осуществления реакции деполимеризации. Добавляют Бактериальные Активированный ≤ 0,01 МЕ/МЕ Пирогенность
хлористоводородную кислоту, чтобы нейтрализовать реакционную смесь. эндотоксины уголь анти-Xa или LAL-тест
Для выделения осадка НМГ добавляют натрия хлорид и метанол. Выпав- Хлорид Промывка мета- 14,0 до 20,0 Абсорбция
ший осадок отделяют центрифугированием или фильтрацией и растворяют бензетония нолом в конце
в воде очищенной. Раствор передают на стадию «Обработка активирован- стадии «Этери-
ным углем». фикации»
5. Обработка активированным углем. Добавляют в раствор гепари- Метанол Лиофилизация ≤ 0,3 % Газовая
на активированный уголь до концентрации 1–2 %. Смесь выдерживают хроматография
8–10 часов. Затем активированный уголь отделяют фильтрацией. На этом Этанол Лиофилизация ≤ 0,5 % Газовая
этапе проводят обесцвечивание раствора гепарина. Очищенный бесцвет- хроматография
ный раствор передают на стадию «Лиофилизации». Хлористый Лиофилизация ≤ 0,06 % Газовая
6. Лиофилизация. Раствор НМГ замораживают и лиофилизируют. метилен хроматография
Молекулярная масса полученного НМГ (Эноксапарин) – 4500 Dа.
Контроль продукта осуществляется методами, приведенными в
табл. 6.
90 91
Технология получения НМГ сводится к трем стадиям: Деполимеризации можно добиться также использованием высоких
1. Деполимеризация НФГ и фракционирование этанолом. Гепарин энергий излучения, например, γ-излучением в присутствии органических
натрия, полученный из мукозы свиньи, растворяют в очищенной воде до растворителей. В качестве растворителей использовали спирты (изопропи-
конечной концентрации около 10 %. С помощью концентрированной хло- ловый, этиловый, метиловый и др.); эфиры (диоксан, тетрагидрофуран и
ристоводородной кислоты устанавливают рН раствора до значения 2,5. др.); альдегиды (формальдегид, ацетальальдегид и др.). Использовали
Деполимеризацию проводят под постоянным контролем. При помощи γ-излучение 60Сo. НФГ с молекулярной массой 14,8 кDа растворяли в ди-
натрия гидроксида устанавливают значение рН = 10,0 и к раствору прибав- стиллированной воде, содержащей, например, 0,5 % изопропилового спир-
ляют натрия боргидрида (NaBH4). Смесь перемешивают в течение 15 ча- та. Раствор помещали в сосуд из стекла Pyrex, используя энергию в
сов, а затем с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты 150 KGy. Получен раствор темно-желтого цвета. Для обесцвечивания рас-
величину рН устанавливают на уровне 3,5–4,0 для разрушения избытка твора значение рН при помощи 32 % раствора натрия гидроксида доводили
боргидрата натрия. Затем с помощью натрия гидроксида доводят значение до 8,0–8,5 и перемешивали в течение 7 часов. Затем при помощи раствора
рН до 7,0. К раствору прибавляют два объема этилового спирта для оса- 10 % хлористоводородной кислоты значение рН доводили до 6,5, обраба-
ждения целевого продукта. Осадок отделяют и растворяют в воде очищен- тывали ацетоном, и полученный порошок высушивали в вакууме при тем-
ной и прибавляют натрия хлорид до определенной величины ионной силы, пературе не выше 60 °С. Получен НМГ со следующими характеристиками:
определяемой кондуктометрически. В растворе с помощью хлористоводо- средняя молекулярная масса – 4,89 кDа; уроновых кислот – 28,2 %; рН 4,8–
родной кислоты устанавливают рН = 4,0 и добавляют для осаждения гепа- 5,5; органических сульфатов – 12,2 %; активность анти-Ха – 104 МЕ/мг.
рина один объем этилового спирта. Для формирования осадка гепаринов Также установлено, что облучение необходимо проводить ступенчато т.к.
смесь выдерживают около 60 часов и спиртово-водный слой удаляют. По- при однократном облучении не полностью деполимеризуется НФГ. По
лученный осадок НМГ (надропарин) находится в натриевой форме. Осадок мнению авторов необходимо, по крайней мере, два этапа облучения, при
растворяют в воде очищенной до концентрации приблизительно 18 % и этом на последующих этапах при облучении γ-лучами происходит полная
устанавливают значение рН = 7,0 при помощи раствора натрия гидрооки- деполимеризация гепарина. Предложено несколько источников получения
си. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через картридж с раз- γ-излучения – 137Cs, 226Ra, 60Co. Обработку материала излучением предла-
мером пор 0,2 мкм. гают проводить в атмосфере азота при 100–200 KGy.
2. Обработка полученных продуктов в ультрафиолете. Исследова- 3. Хроматографическая очистка и перевод в кальциевую соль. Рас-
ния физико-химических и биологических свойств полученных препаратов твор надропарина натрия подвергают анионообменной хроматографии. В
убедительно показало, что обработка ультрафиолетом не приводит к изме- собранные фракции очищенного НМГ прибавляют натрия хлорид и оса-
нению свойств надропарина и к его деградации. Средняя молекуляр- ждают 1,5 объемами этилового спирта. Смесь выдерживают около 41 часа
ная масса препарата около 5 кDа. Активность против факторов: и супернатант отделяют. Осадок гепарина растворяют в воде очищенной
Ха – 124 МЕ/мг и IIа – 30 МЕ/мг. до концентрации приблизительно 18 % и прибавляют гексагидрат кальция
На этой стадии проводят обработку ультрафиолетом при длине вол- хлористого и перемешивают. К смеси прибавляют 1,5 объема этилового
ны 254 нм в течение 9–10 минут со скоростью 4,8 литра в час при комнат- спирта и выпавший осадок отделяют и сушат при температуре не более
ной температуре и рН раствора около 7,0. Раствор вводится в специальную 60 °С.
систему облучения и с помощью перистальтического насоса циркулирует Интерес представляют данные, полученные при выделении гепари-
со скоростью 19 л/час в течение 16 часов при температуре 30 °С. нов при помощи аффинной хроматографии. В качестве сорбента исполь-

92 93
зована сефароза 4В, связанная с протамином. НФГ наносили на колонку с буют деполимеризации, хроматографических методов очистки и дополни-
аффинным сорбентом в 0,6 М растворе натрия хлорида с рН = 7,35. Затем тельных этапов фильтрации, что позволяет снизить стоимость препаратов
связавшийся с носителем гепарин элюировали при помощи раствора НМГ и сделать эти препараты более доступными. Для выделения препара-
натрия хлорида с возрастающей концентрацией от 1,3 М до 2,0 М, содер- та используют около двух десятков рыб, предпочтительно сайра, кефаль,
жащие 0,02 М имидазола с рН = 7,35. Полученные фракции контролирова- лосось, скумбрия. Для выделения используют жабры и головы рыб. Ткань
ли по специфической активности (антифактор Ха). Наиболее активные измельчают в буферном растворе: 5 мМ карбонат аммония в 0,1 М натрия
фракции объединяли и подвергали гельфильтрации на сефадексе G-25. По- хлорида, рН = 9,0. Гомогенат инкубируют при 80 °С в течение одного часа
лучен препарат с активностью 270 МЕ/мг, который может быть использо- и центрифугируют при 13000 об/мин. Супернатант подвергают ионно-
ван для производства НМГ. обменной хроматографии, элюирование проводят 4 М раствором натрия
хлорида в указанном буферном растворе. Проводят концентрацию раство-
Учитывая, что в НМГ обладают относительно невысокой анти-IIа ак-
ра с последующей лиофилизацией.
тивностью появляются работы, авторы которых ставят задачу создания
Таким образом, существующие сегодня способы выделения и очист-
препаратов с большей биодоступностью, сокращения гепарин индуциро-
ки НМГ основаны на:
ванной тромбоцитопении и повышения активности анти-IIа. Предложен
1. Окислительной деполимеризации с пероксидом водорода напри-
препарат НМГ с молекулярной массой от 5,5 до 8,3 кDа, содержащий це-
мер, ардепарин («Normiflarin»).
почку дисахаридов с 8–18 единицами. В препарате по сравнению с ком-
2. Расщеплении, например, цертопарин («Sandoparin»).
мерческими препаратами увеличено содержание 3-О сульфатов. Соотно-
3. Щелочном гидролизе бензиловых эфиров гепарина, например,
шение антифактор Ха к антифактору IIа от 0,5 до 3,5.
эноксипарин («Clexan»).
В последние годы проявляется большой интерес к получению и ис-
4. Окислительной деполимеризации с Сu+2 и пероксидом водорода,
следованию биологических свойств химически модифицированных анало-
например, парнапарин («Fluxum»).
гов гепарина или других антикоагулянтов. Функционализация гепарина
5. Деполимеризации ферментом гепариназой, например, тинзапарин
позволяет изменить физико-химические и биологические свойства гепари-
(«Innohep»).
на. Конъюгаты гепарина с лекарственными субстанциями могут обладать
6. Деполимеризации гидролизом серной кислотой, например, даль-
большей растворимостью и продолжительностью действия по сравнению с
тепарин («Fragmin»), ревипарин («Clivarin»).
НФГ и НМГ, могут использоваться как препараты комбинированного дей-
7. Деполимеризации гидролизом азотной кислотой, например,
ствия. Так, были предложены конъюгаты гепарина с новокаином, тауфо-
надропарин («Fraxiparine»).
ном, изониазидом и другими лекарственными препаратами. Предложены
По данным ряда авторов метод производства НМГ может суще-
способы получения нитропроизводных НМГ. Препарат представлял фрак-
ственно влиять на их фармакокинетические свойства и антикоагуляцион-
цию НМГ с молекулярными массами от 3,0 до 6,5 кDа. Средняя молеку-
ную активность. Так, например, Фрагмин, в отличие от Логипарина и
лярная масса 5,0 ± 0,4 кDа. Препарат содержит нитрогруппы – ONO2 кова-
Эноксапарина не имеет отрицательно заряженных сульфоаминогрупп.
лентно связанные с сахарами.
Кроме того, нам хотелось бы отметить, что НМГ посвящен большой объем
Несомненный интерес представляет работа посвященная получению
литературных материалов, в том числе и по методам получения продукта.
НМГ из морских животных, в частности из рыб. Установлено, что рыбы
В то же время, вопрос о механизме процесса деполимеризации и сегодня
содержат НМГ с молекулярными массами не более 3,0 кDа. Авторами
установлено, что выделенный препарат НМГ, по крайней мере, на 20 % ак- является не полностью изученным.
тивней, чем НМГ с массой 8000 дальтон. Полученные препараты не тре-
94 95
Суммируя изложенное, можно заключить, что в настоящее время Таблица 7 – Характеристика низкомолекулярных гепаринов
большинство исследователей считают НМГ по силе действия не уступа-
ющим НФГ. В то же время, препараты НМГ имеют ряд преимуществ, в Период
том числе, они приводят к значительно меньшему количеству осложнений. Наимено- Молеку- полу-
Соотношение Наименова-
вание лярная жизни
анти-Ха/анти- ние
3.3. Сравнительная характеристика гепаринов НМГ, масса, (Т1/2)
ІІа препарата
INN кDа в плаз-
Преимущества НМГ (надропарина кальция) над НФГ были впервые ме, мин
продемонстрированы в 1995 году на 219 больных нестабильной стенокар- Дальтепарин
Фрагмин,
дией. В рандомизированном, открытом исследовании комбинация надро- натрия, 5,0–6,0 2,0–4,0 119–139
Pfizer Inc.
парина с аспирином по сравнению только с аспирином или аспирином в Kabi, Швеция
комплексе с НФГ была признана более эффективной, что сопровождалось Надропарин
кальция,
уменьшением летальности. Фраксипарин,
Sanofi-
Международным эталоном для НМГ является стандартный препа- 4,3–4,5 3,2–3,6 132–162 Glaxo Smith
Synthelabo,
рат, 1 мг которого имеет специфическую активность 168 анти-Ха единиц и Kline
Франция
68 анти-IIа антитромбиновых единиц (в соотношении 2,5 : 1).
Показаниями к применению НМГ являются: Эноксапарин
 профилактика тромбоэмболических осложнений, в особенности натрия, Клексан,
4,2–4,5 3,7–3,8 129–180
тех, которые связаны с общей хирургией или ортопедией; Rhone-Poylenc, Sanofi Aventis
 у нехирургических больных с высоким тромбоэмболическим Франция
риском (острая дыхательная недостаточность и/или респираторная инфек-
ция, и/или острая сердечная недостаточность); Рассмотрим ряд НМГ хорошо зарекомендовавших себя в клиниче-
 лечение тромбоэмболических осложнений; ской практике.
 профилактика свертывания крови в ходе гемодиализа; ФРАКСИПАРИН (Надропарин кальция) – синтетический гликоза-
миногликан – первый из НМГ, изученный в клинике. Его получают из сли-
 острый инфаркт миокарда, острые коронарные нарушения.
зистой оболочки кишок свиней путем расщепления азотной кислотой, ре-
Метаболизм НМГ происходит путем десульфатации и/или деполи-
дукцией концевых групп боргидридом натрия, очисткой и замещением на-
меризации с образованием разновидностей гепарина низкой молекулярной
трия на кальций. Фраксипарин имеет 70 % регулярных и 30 % нерегуляр-
массы с существенно более низкой биологической активностью.
ных дисахаридов. В основном, смеси семи дисахаридов 80 % цепочек этого
В табл. 7 приведена характеристика наиболее часто используемых НМГ имеют молекулярную массу в пределах 2,0–7,0 кDа, которые состоят
низкомолекулярных гепаринов. из 4–12 дисахаридных единиц, а около 50 % имеют молекулярную массу
4,0–5,0 кDа и состоят из 12–16 дисахаридных единиц. Около 25 % молекул
Фраксипарина имеют специфический участок связывания с антитромби-

96 97
ном III. Полисахаридные цепочки Фраксипарина разделяются на высоко- и Дальтепарин связывается с антитромбином III и усиливает его инги-
низкоаффинные фракции. Высокоаффинные фракции отвечают за анти-Ха бирующее влияние на активность преимущественно фактора свертывания
и анти-IIа активность, а низкоаффинные компоненты препарата активно- Ха. В меньшей степени уменьшает активность фактора IIа (тромбин) т.к.
стью не обладают. Биодоступность Фраксипарина при подкожном введе- полисахаридные цепочки необходимой для ингибирования тромбина дли-
нии достигает по данным ряда авторов от 80 % до 98 %, в то время как у ны (содержащие не менее 18 олигосахаридов) обнаруживаются лишь в
НФГ биодоступность лишь 24 %. Уже после одноразового внутривенного 25–30 % молекул НМГ.
введения Фраксипарина наступает длительный анти-Ха эффект; активиро- КЛЕКСАН (Эноксапарин натрия) – представляет собой НМГ со
ванное частичное тромбопластиновое и тромбиновое время увеличивается средней молекулярной массой 4,5 кDа. Препарат с высокой активностью
уже на 5-ой минуте, а после 24 часов нормализуется. После подкожных анти-Ха (100 МЕ/мл) и низкой ингибирующей активностью в отношении
инъекций анти-Ха эффект обнаруживается только через 3–4 часа и про- фактора IIа (тромбина) (28 МЕ/мл), соотношение 3 : 1. Фракционный со-
должается в течение 18 часов. Преимущества Фраксипарина по сравнению став эноксапарина натрия: фрагменты менее 2,0 кDа – менее 20 %; от 2,0
с НФГ и выгодные отличия от других НМГ сегодня признаны многими до 8,0 кDа – более 68 %; более 8,0 кDа – менее 18 %. Эноксапарин натрия
специалистами. Установлено, что кальциевые соли вызывают достоверно получают щелочным гидролизом бензилового эфира гепарина, выделенно-
меньше местных осложнений, чем натриевые соли НМГ. го из слизистой оболочки тонкого кишечника свиньи. Его структура харак-
ФРАГМИН (Дальтепарин натрия) – представляет собой НМГ, выде- теризуется невосстанавливающимися фрагментами 2-О-сульфо-4-
ленный в процессе контролируемой деполимеризации (с помощью серной енпиразиносуроновой кислоты и восстанавливающимся фрагментом 2-N,6-
кислоты) гепарина натрия из слизистой оболочки тонкой кишки свиньи и О-дисульфо-О-глюкопиранозида. Структура эноксапарина содержит 20 %
подвергнутый дополнительной очистке при помощи ионно-обменной хро- (в пределах от 15 до 25 %) 1,6-ангидропроизводного в восстанавливаю-
матографии. Лекарственный препарат состоит из сульфатированных поли- щемся фрагменте полисахаридной цепи. Эноксапарин содержит много ко-
сахаридных цепочек, имеющих среднюю молекулярную массу 5,0 кDа (от ротких цепей (31 %) с молекулярной массой 2,5 кDа, которые обладают
3,0 до 6,0 кDа). Низкая молекулярная масса молекул Фрагмина способ- высокой анти-Ха активностью, но практически не могут инактивировать
ствует селективному ингибированию факторов Ха, ХIIа и калликреина и тромбин, в отличие от гепарина, который в одинаковой степени инактиви-
более низкую активность к ингибированию факторов IIа, IХа и ХIа. Соот- рует тромбин и фактор Ха. Необходимо отметить, что препараты энокса-
ношение анти-Ха к анти-IIа Фрагмина достигает по данным ряда авторов парина, произведенные различными производителями отличаются по сво-
от 2,2 до 4,0. Биодоступность препарата достаточно высока – 87 ± 6 % и по им характеристикам.
данным она в 9 раз превышает активность НФГ. Фрагмин метаболизирует- После подкожного введения препарат полностью адсорбируется, до-
ся преимущественно в ретикуло-эндотелиальной системе печени, селезен- стигая максимального уровня в плазме крови уже в течение первого часа, а
ки и почек путем N- и O-десульфатирования и в незначительной степени максимальная активность наблюдается на 3-й час после введения. Анти-Ха
выделяется с мочой в неизменном состоянии. АЧТВ после подкожного активность продолжается в течение 24 часов. Период полувыведения
введения 2500 МЕ анти-Ха Фрагмина удлиняется на 3 секунды (при Клексана продолжается в среднем 4 часа. Эноксапарин не влияет на АЧТВ
5000 МЕ анти-Ха – на 6 секунд) и возвращается к первоначальному уров- и протромбиновое время, что позволяет не проводить мониторинг этих по-
ню, соответственно, через 12 и 24 часа. Период полувыведения препарата казателей лабораторными методами.
после подкожного введения, колеблется от 160 ± 50 до 228 ± 40 минут. ИННОГЕП (Тинзапарин натрия) – НМГ, получаемый ферментолизом
стандартного НФГ при помощи гепариназы, выделенной из Flavobacterium

98 99
heparinum. Средняя молекулярная масса препарата 4,5 ± 1,5 кDа. При срав- массе известных НМГ – 4,5–6,0 кDа; самое значительное преимущество
нении активности с первым международным стандартом анти-Ха актив- Цибора это соотношение Ха / IIа (антитромботическая активность / анти-
ность тинзапарина составляет 75 МЕ/мг, а активность анти-IIа значительно коагуляционная активность), составляющее у данного препарата 8 : 1, что
меньше и составляет 50 МЕ/мг. Соотношение этих активностей 1,5–2,5 : 1. значительно отличает Цибор от других НМГ (см. табл. 7). Кроме того, пе-
Пик анти-Ха и анти-IIа активности после подкожного введения Инногепа риод полужизни препарата в плазме крови составляет около 300 минут, что
обнаруживается на 4–6 часу и, несомненно, зависит от дозы введенного делает его применение 1 раз в день более предпочтительным по сравнению
препарата. Общая биодоступность, определяемая этой активностью дости- с другими НМГ.
гает, соответственно, 90 % и 67 %. При введении препарата в течение не- Необходимо остановиться еще на одной группе гепаринов. За по-
скольких дней, пиковые значения этих активностей прогрессивно нарас- следнее время предложены гепарины со средней молекулярной массой
тают, но аккумулирования не наблюдается. Период полувыведения анти- (СМГ), около 10,5 кDа с узким диапазоном молекулярной массы
Ха активности тинзапарина после подкожного введения составляет 82 ми- (9,5–11,5 кDа). Препарат СМГ обладает практически одинаковой анти-Ха
нуты, а для анти-IIа – 71 минуту. Эффект анти-Ха активности тинзапарина (174,9 МЕ/мг) и анти-IIа (170 МЕ/мг) активностью и объединяет высокую
в три раза (в дозе 2500 МЕ анти-Ха), в шесть раз (в дозе 5000 МЕ анти-Ха) антитромбиновую активность, характерную для НФГ и высокую биодо-
и в 11 раз (в дозе 10000 МЕ анти-Ха) выше, чем при использовании ступность, свойственную для НМГ. Предложен гепарин со средней моле-
5000 МЕ НФГ. При гемодиализе Инногеп вводится болюсно в артериаль- кулярной массой, полученный путем контролируемой деполимеризации
ную линию диализатора перед сеансом в дозе 4250 МЕ, что позволяет эф- НФГ и последующего выделения методами молекулярной фильтрации.
фективно предупредить образование сгустков во время процедуры. Препарат предназначен для получения лекарственного средства для про-
ЦИБОР (Бемипарин натрия) – один из последних препаратов НМГ филактики и терапии тромбоэмболических процессов, в частности, для
попавший на фармацевтический рынок, относится к НМГ второго поколе- торможения свертывания крови при экстракорпоральном кровообращении.
ния. Препарат используется для профилактики и лечения венозных тром- Предложенный препарат отличает отсутствие по сравнению с известными
боэмболических осложнений (ВТЭО) у пациентов. Цибор® 2500 МЕ пред- гепаринами кровоточивости при наибольшей активности против фактора
назначен для профилактики ВТЭО у пациентов с умеренным и средним IIа, что достоверно повышает его терапевтический индекс. Сравнение пре-
риском, а Цибор® 3500 – для профилактики ВТЭО у больных высокого парата проводили с НФГ (Liquemin) и НМГ (Эноксапарин). Гельпроника-
риска. С этим препаратом проведено несколько мультицентровых, рандо- ющей хроматографией (ГПХ) изучены их молекулярные массы и молеку-
мизированных, двойных слепых клинических исследований в 2000– лярно-массовое распределение. Было установлено, что кривые элюирова-
2004 г.г. в Испании, США, Франции. Изучено количество случаев тромбо- ния, полученные при ГПХ для НФГ имеют среднюю молекулярную массу,
за глубоких вен и тромбоэмболии легочной артерии, а также количество равную 13,0 кDа, и одновременно с этим характеризуются исключительно
геморрагических осложнений у хирургических, онкологических, ортопе- широким молекулярно-массовым распределением. НМГ имеют среднюю
дических больных на фоне тромбопрофилактики. Цибор сравнивали с молекулярную массу, равную 4,5 кDа, и значительно более узкое молеку-
эноксапарином и НФГ. Проведенные исследования подтвердили эффек- лярно-массовое распределение. Предложенный СМГ имеет среднюю мо-
тивность Цибора: количество случаев тромбоза глубоких вен и тромбоэм- лекулярную массу, равную 10,5 кDа, и наиболее узкое среди всех трех раз-
болии легочной артерии снизилось с 5,4 % (Эноксапарин) до 1,8 % (Ци- личных гепаринов молекулярно-массовое распределение. При этом, авто-
бор). По-видимому, это связано с рядом факторов: Бемипарин имеет самую ры придают особое значение узкому молекулярно-массовому распределе-
низкую молекулярную массу из всех НМГ – 3,6 кDа, при молекулярной нию, поскольку именно подобным молекулярно-массовым распределением

100 101
обусловлено наличие у СМГ уникального и неожиданного спектра фарма- Таблица 8 – Сравнительная характеристика гепаринов с разной
кологического действия – СМГ при его сопоставлении с обоими сравнива- молекулярной массой
емыми действующими веществами (НФГ и НМГ) обладает более высокой
активностью как против фактора Ха, так и против фактора IIа. При Характеристика НФГ СМГ НМГ
изучении СМГ в клинике обнаружено, что СМГ проявляет наибольшую Молекулярная масса, кDа 3,0–30,0 10,0–11,5 2,0–8,0
активность в опыте по определению АЧТВ и в опыте по определению ак- Средняя молекулярная масса, кDа 13,0 10,5 5,0
тивности против фактора IIа, причем предлагаемый гепарин именно по по- Активность против
1,0 1,03 3,8
казателям его активности против фактора IIа значительно отличается от фактора Ха / фактора ІІа
двух других гепаринов, что, по мнению авторов, является неожиданным. Активность против фактора Ха 219 439 1028
Ожидаемый результат был получен только при анализе активности против Активность против фактора ІІа 308 544 358
фактора Ха. В этом случае СМГ занимает примерно среднее положение Активность в опыте по
между Эноксапарином и Liquemin. Хотя активность эноксапарина против 104 154 126
определению АЧТВ
фактора Ха более чем в два раза превышает активность СМГ, тем не менее Биологическая доступность, %
антитромбиновая активность эноксапарина составляет лишь приблизи- 10–25 70 90
(подкожно)
тельно 66 % от активности СМГ (см. табл. 8). Авторы пришли к выводу,
что эноксапарин действительно обладает более высокой по сравнению с Одним из основных преимуществ НМГ по сравнению с обычным ге-
СМГ бидоступностью, однако его ингибирующее тромбин действие, кото- парином является низкая частота развития тромбоцитопении. Так как
рым в первую очередь определяется противосвертывающая эффектив- способность вызывать агрегацию тромбоцитов более выражена у высоко-
ность, проявляется существенно в меньшей степени, чем у предлагаемого молекулярных фракций гепарина, включая НФГ, у больных с исходной
СМГ. Результаты эксперимента на кроликах однозначно свидетельствова- тромбоцитопенией в качестве прямых антикоагулянтов лучше использо-
ли о наличии у СМГ более высокого терапевтического действия касатель- вать НМГ. В то же время не следует назначать НМГ больным с индуциро-
но предупреждения и лечения тромбоэмболических процессов по сравне- ванной обычным гепарином тромбоцитопенией из-за высокой частоты пе-
нию с НМГ. Помимо этого было установлено, что введение СМГ сопро- рекрестных реакций с гепаринзависимыми антителами. Для лечения боль-
вождается меньшим по сравнению с эноксапарином риском кровотечений. ных с индуцированной гепарином тромбоцитопенией рекомендуется ис-
С учетом экспериментально полученных результатов СМГ предпочтитель- пользовать гепариноиды, например, Данапароид натрия. Этот препарат
но применять и для терапии острого инфаркта миокарда и нестабильной содержит смесь гликозамингликанов: 84,0 % гепарина сульфата, 120 %
стенокардии, а также для ингибирования свертывания крови при экстра- дерматана сульфата, 4,0 % хондроитин сульфата, обладает анти-Ха актив-
корпоральном кровообращении. ностью. Средняя молекулярная масса Данапароида 6,5 кDа. Препарат не
В табл. 8 дана сравнительная характеристика НФГ, НМГ и СМГ. обладает антитромбиновой активностью. Отношение активности против
фактора Ха к активности против фактора IIа для Данапароида составляет
20 : 1.
В последние годы проявляется большой интерес к получению и ис-
следованию биологических свойств химически модифицированных анало-
гов гепарина или других антикоагулянтов. Функционализация гепарина

102 103
позволяет изменить физико-химические и биологические свойства гепари- ный гепарин. Между двумя сравниваемыми препаратами не было значи-
на. Коньюгаты гепарина с лекарственными субстанциями могут обладать мой разницы по количеству инфаркта миокарда и летальных исходов.
большей растворимостью и продолжительностью действия по сравнению с Геморрагические осложнения были довольно редкими, но тем не ме-
НФГ и НМГ, могут использоваться как препараты комбинированного дей- нее, они достоверно чаще возникали у больных, получавших Эноксапарин
ствия. Так, были предложены конъюгаты гепарина с новокаином, тауфо- 15,2 % и 12,5 % при использовании НФГ. Предположение продемонстри-
ном, изониазидом и другими лекарственными препаратами. Предложены ровать явное превосходство Эноксапарина над НФГ в отношении эффек-
способы получения нитропроизводных НМГ. Такой препарат представляет тивности при равном риске кровотечений не подтвердилось. В действи-
фракцию НМГ с молекулярными массами от 3,0 до 6,5 кDа. Средняя моле- тельности эффективность оказалась одинаковой, а риск кровотечений при
кулярная масса 5,0 ± 0,4 кDа. Препарат содержит нитрогруппы (ONO2) ко- использовании Эноксапарина достоверно более высокий. Тем не менее,
валентно связанные с сахарами. основной результат вполне благоприятен для Эноксапарина, если учесть
По данным ряда авторов метод производства НМГ может суще- удобство его применения.
ственно влиять на их фармакокинетические свойства и антикоагуляцион- В исследованиях ESSENCE установлено, что антитромбическая те-
ную активность. Так, например, Дальтепарин, в отличие от Логипарина и рапия с использованием Эноксапарина и ацетилсалициловой кислоты
Эноксапарина не имеет отрицательно заряженных сульфоаминогрупп. снижает риск развития ишемических осложнений у пациентов с неста-
Кроме того, нам хотелось бы отметить, что НМГ посвящен большой объем бильной стенокардией или острым инфарктом миокарда без зубца Q. В
литературных данных, в том числе и по методам получения продукта. В то исследовании ТIMI 11B установлено, что Эноксапарин снижает смерт-
же время, вопрос о механизме процесса деполимеризации и сегодня явля- ность и необходимость проведения неотложной реваскуляризации у боль-
ется не полностью изученным. ных нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокарда без подъ-
Исследования, проведенные в 1993–1995 гг. на 1482 больных неста- ема сегмента ST более эффективно, чем НФГ. Исследование ТIMI 11B бы-
бильной стенокардией или с инфарктом миокарда без зубца Q, показало, ло начато в 1984 году в клинике Гарвардской медицинской школы (США).
что применение Дальтепарина, назначаемого подкожно дважды в сутки в В рамках научного проекта ТIMI 11B изучали клиническую эффективность
дозе 120 ЕД/кг массы тела больного, является безопасной и эффективной применения тромболитических, антитромботических и антитромбоцитар-
альтернативой НФГ у пациентов с данной патологией. ных средств у пациентов с нестабильной стенокардией и острым инфарк-
На 65 больных панкреонекрозом проведено сравнительное изучение том миокарда без/с элевацией сегмента ST. Установлено, что указанные
эффективности Эноксапарина и нефракционированного гепарина. Полу- лекарственные средства играют важную роль в лечении больных с острым
ченные данные свидетельствуют о более высоком уровне тканевой перфу- коронарным синдромом. Кроме того, была разработана специальная кли-
зии у больных, получавших Клексан (Эноксапарин), что способствовало ническая шкала для оценки степени риска возможного развития осложне-
более эффективному дренированию очага поражения в зоне деструкции. ний нестабильной стенокардии / острого инфаркта миокарда без подъема
Усиление тканевой перфузии вне зоны деструкции предотвращает распро- сегмента ST.
странение некроза и прогрессированию заболевания. Эноксапарин оказывает более сбалансированное сберегающее дей-
При исследовании эффективности гепаринов для лечения больных ствие на систему гемостаза. Исследования проводили на 536 больных. Дву-
острым коронарным синдромом без подъемов сегмента ST на ЭКГ обна- кратное введение Эноксапарина в дозе 40 мг в сутки после транскатетер-
ружено, что Эноксапарин не более эффективен, чем нефракционирован- ной деструкции обеспечивает более стабильное снижение активности си-
стемы коагуляции, чем гепарин введенный подкожно по 5000 ЕД с интер-

104 105
валом 6 часов. Применение Эноксапарина для профилактики тромботиче- Таблица 9 – Фармакокинетические характеристики
ских осложнений после транскатетерной деструкции также удобно в смыс- низкомолекулярных гепаринов
ле частоты введения и длительности применения. Сегодня ведущие специ-
алисты в области кардиологии считают что, следует отказаться от исполь- Время Среднее
Период
зования НФГ и применять Эноксапарин в целях снижения смертности и достижения время
Наименование полуэлиминации
заболеваемости инфарктом миокарда. максимальной нахождения
препарата (Т½),
Исследования по оценке влияния НМГ (Фраксипарина) на частоту активности, в организме,
час
фатальной тромбоэмболии проводили на 4498 пациентах с умеренным час час
риском тромбоэмболических осложнений после общехирургических опера- Эноксапарин-2000 МЕ 3,95 ± 0,65 2,35 6,68 ± 0,94
ций (абдоминальной, торакальной и др.). Авторы выявили существенное Эноксапарин-4000 МЕ 4,37 ± 0,47 2,91 7,38 ± 0,74
снижение частоты фатальной тромбоэмболии легочной артерии (с 0,18 до Надропарин-3075 МЕ 3,75 ± 0,68 3,62 7,10 ± 0,99
0,09 %), тромбоэмболической смертности (с 0,36 % до 0,05 %). Дальтепарин-2500 МЕ 2,81 ± 0,84 2,82 5,26 ± 1,15
При использовании Фраксипарина для экстракорпорального метода
детоксикации кардиологических больных было установлено, что доза пре- Сравнение фармакологической эффективности НМГ и обычного
парата в эквивалентных международных единицах действия приблизи- НФГ затруднено, поскольку определение АЧТВ, которое обычно приме-
тельно на 70 % ниже, чем при использовании НФГ. Фраксипарин вводили няется для оценки антикоагулянтного действия НФГ, непригодно для
один раз непосредственно перед процедурой, и не было необходимости в оценки биологической активности НМГ. Сравнивать эффективность НМГ
повторных введениях и инфузиях препарата в период всей процедуры. Ко- и НФГ можно лишь путем измерения его активности против фактора Ха.
личество геморрагических осложнений при использовании Фраксипарина Анализ литературных данных позволяет нам сделать вывод о том, что
было значительно меньше, чем в контрольной группе. В связи с малым НМГ обладают более продолжительной биологической активностью по
влиянием на время образования сгустка не требуется постоянного коагу- сравнению с НФГ. Период полужизни (Т½) НМГ после внутривенного
ляционного контроля – АЧТВ. При лечении коротким курсом в течение введения колеблется от 1,5 до 4,5 часов, в то время как Т½ для НФГ со-
4 дней не успевает закончиться запас антитромбина III в организме. Одна- ставляет 50–60 минут. Биодоступность большинства НМГ после подкож-
ко бесконтрольное применение этого препарата снижает эффективность ной инъекции составляет более 90 %, в то время как для НФГ – лишь
его использования и вызывает опасные для жизни осложнения. 15–25 %. Различны механизмы и пути клиренса НМГ и НФГ. Как известно
Интерес представляют данные, полученные авторами при сравни- после внутривенного введения НФГ наблюдается две фазы элиминации –
тельном изучении фармакокинетических характеристик НМГ при исполь- быстрая и медленная. Предполагают, что быстрая элиминация НФГ обу-
зовании в целях предотвращения тромбоэмболических осложнений. Полу- словлена его связыванием с рецепторами эндотелиальных клеток и макро-
ченные данные, как показывает табл. 9, подтверждают, что используемые фагов. В клетках происходит частичная деполимеризация и десульфатиро-
НМГ: Дальтепарин, Эноксапарин и Надропарин существенно отличаются вание гепаринов, после чего его небольшие фрагменты, по-видимому, вы-
по основным фармакокинетическим характеристикам (при подкожном свобождаются в кровоток, а затем выводятся почками. Фаза медленного
введении). клиренса, очевидно, начинается тогда, когда насыщены все клеточные ре-
цепторы гепарина. Этими особенностями клиренса НФГ объясняется тот
факт, что Т½ НФГ зависит от вводимой дозы. Клиренс НМГ более медлен-

106 107
ный и более равномерный, чем у НФГ. Это объясняется тем, что НМГ зна- тельное применение НМГ в сравнении с использованием НФГ значительно
чительно хуже связываются с эндотелиальными клетками и белками плаз- реже приводит к осложнениям, в том числе остеопорозу, тромбоцитопе-
мы крови. Выведение почками является основным путем элиминации нии, кровоточивости. В целом на основании проведенного анализа авторы
НМГ. При почечной недостаточности Т½ НМГ значительно увеличивает- утверждают, что применение НМГ во время беременности безопасно как
ся. НМГ в значительно меньшей степени, чем НФГ, связываются с белка- для плода, так и матери и позволяет предупредить ряд осложнений.
ми плазмы (например, гликопротеидом, богатым гистидином, фактором 4 Тромбоз глубоких вен и тромбоэмболия легочной артерии являются
тромбоцитов и т.д.), которые способны нейтрализовать их антикоагулян- главной причиной осложнений и смертности у пациентов с травмами.
тную активность. НМГ более резистентны к тромбоцитарному фактору 4, Крупномасштабные исследования в элективной ортопедической хирургии
освобождаемому из тромбоцитов при их активации. Именно низким срод- показали эффективность и безопасность применения НМГ для профилак-
тики тромбоза глубоких вен. Было проведено рандомизированное, откры-
ством НМГ к гепарин-нейтрализующим белкам плазмы можно объяснить
тое многоцентровое исследование. В исследование были включены паци-
высокую биодоступность при их применении в низких дозах. Все указан-
енты с переломами позвоночника, костей таза и нижних конечностей. По-
ные особенности фармакокинетики и фармакодинамики НМГ обуславли-
казано, что профилактика тромбоза глубоких вен и тромбоэмболии легоч-
вают их несомненное преимущество. Другое преимущество НМГ перед
ной артерии НМГ (надропарином кальция) у больных с ортопедической
НФГ низкая частота развития тромбоцитопении. Частота тромбоцито-
травмой один раз в день в фиксированной дозе так же эффективна, как и в
пении при лечении НФГ колеблется от 1 до 3 %. Тромбоцитопения чаще
дозе, рассчитанной в соответствии с массой тела пациента. Частота воз-
встречается при лечении препаратами гепаринов, полученных из легких никновения массивных кровотечений и низкая тромбоцитопения, индуци-
крупного рогатого скота (15,6 %), чем при лечении гепаринами, выделен- рованная НМГ, свидетельствует о безопасности применения НМГ у паци-
ными из слизистой оболочки кишечника (5,8 %). Использование эноксапа- ентов с ортопедической травмой.
рина натрия (Клексана) – эффективный способ предупреждения тромбоэм- Продемонстрирована высокая клиническая эффективность при ис-
болических осложнений у больных онкоторакального профиля при прове- пользовании НМГ в нефрологии при хронических заболеваниях почек. Та-
дении комплексного лечения. Применение этого препарата не увеличивает ким образом, НМГ так же как НФГ являются катализаторами антитромби-
объем интра- и послеоперационной кровопотери при онкоторакальных на III. Однако благодаря уменьшению количества мукополисахаридных
вмешательствах, включая расширенные операции и медиастинальную цепей и соответственно уменьшению молекулярной массы их антитромби-
лимфодиссекцию, способствует сокращению продолжительности лимфо- ческое действие более селективно и поэтому более предсказуемо, чем у
реи и сопровождается уменьшением количества пневмоний, развивающих- НФГ, и главным образом, заключается в инактивации фактора Ха. В
ся на фоне индукционной полихимиотерапии и в послеоперационный пе- меньшей степени НМГ влияют на фактор IIа, что уменьшает риск выра-
риод. женных кровотечений, которые, в принципе, могут возникать на фоне лю-
Антитромботические средства применяют при беременности для ле- бой антитромботической терапии. НМГ не связываются с эндотелием и
чения и профилактики венозной тромбоэмболической болезни, эмболий, обладают меньшей способностью связываться с белками плазмы. Это обу-
связанных с клапанными пороками сердца или возникающих после проте- славливает большую биодоступность, значительное увеличение времени
зирования клапанов, для предотвращения задержки развития плода и его полувыведения и стабильный дозозависимый эффект при подкожном вве-
потери у женщин с антифосфолипидным синдромом, а также при тромбо- дении.
филических состояниях. Применяли следующие НМГ: надропарин (Фрак- Основными нежелательными эффектами НМГ являются кровоте-
сипарин) – 208 случаев, эноксапарин (Клексан) – 137, дальтепарин (Фраг- чения, тромбоцитопения и остеопороз. К редким нежелательным реакциям
мин) – 59, ревипарин (Кливарин) – 43, тинзапарин (Инногеп) – 19. Дли- относят гипоальдостеронизм, преходящее повышение сывороточной ак-
108 109
тивности аминотрансфераз и уровня свободных жирных кислот, аллерги-  описаны редкие случаи гематомы спинного мозга при использо-
ческие кожные реакции и некроз кожи при подкожном применении. В кон- вании эноксапарина натрия на фоне спинальной анестезии с развитием
тролируемых клинических исследованиях частота геморрагических стойкого или необратимого паралича. Риск этого осложнения выше при
осложнений при применении НМГ была в целом сопоставимой с таковой использовании катетеров после операции.
при лечении НФГ или ниже. Для купирования кровотечений, вызванных Суммируя изложенное, можно заключить, что в настоящее время
НМГ, может быть использован протамин, хотя он нейтрализует их актив- большинство исследователей считают, что НМГ по силе действия не усту-
ность менее эффективно, чем активность НФГ. Серьезным нежелатель- пают НФГ. В то же время, препараты НМГ имеют ряд преимуществ, в том
ным эффектом НФГ является тромбоцитопения, которая развивается у 1– числе, они приводят к значительно меньшему количеству осложнений.
3 % больных и может привести к серьезным осложнениям. При лечении
НМГ частота тромбоцитопении ниже, чем при использовании НФГ. При 3.4. Контроль и стандартизация гепаринов
появлении тромбоцитопении на фоне введения НФГ его не следует менять
на НМГ, учитывая высокую частоту перекрестной их реактивности с гепа- Требования к качеству НМГ изложены в Государственной Фарма-
рин-зависимыми антителами. Остеопороз развивается при длительном копее Украины и Европейской фармакопеи. В соответствии с требованиями
применении НФГ, особенно при беременности. Случаи его описаны и при фармакопей НМГ представляют собой соли сульфатированных глюко-
лечении НМГ, хотя препараты этой группы реже вызывают развитие осте- заминогликанов со средней молекулярной массой меньше 8,0 кDа, которой
опороза. Частота аллергических кожных реакций при лечении НМГ низ- должно быть не менее 60 % общей массы. НМГ имеют разную химиче-
кая, хотя возможно её до сих пор несколько недооценивают. Аллергиче- скую структуру на концах полисахаридных цепочек.
ские реакции включают в себя крапивницу, эритему, некроз кожи, нередко Контроль осуществляют по следующим характеристикам:
сочетающийся с тромбоцитопенией.  идентификация: А – ядерномагнитный резонанс (в сравнении с
НМГ различаются по способу производства, молекулярной массе и соответствующим стандартным образцом); В – определение отношения ак-
активности. В связи с этим не рекомендуется в ходе лечения заменять тивности антифактора Ха к активности антифактора IIа (не менее 1,5);
один препарат на другой. С – эксклюзивная хроматография (молекулярные массы должны соответ-
Таким образом, проанализировав данные о побочном действии НМГ,
ствовать препарату сравнения производителя); D – субстанция должна да-
зарегистрированных сегодня в Украине, мы можем отметить следующее:
вать реакции либо на натрий, либо на кальций;
 кровотечения в разных местах более частые у больных с другими
 испытания на чистоту: рН – от 5,5 до 8,0; азот – от 1,5 до 2,5 %;
факторами риска;
кальций – от 9,5 до 11,5 % (для гепарина кальция); натрий – от 9,5 до
 описаны спорадические случаи тромбоцитопений, иногда
12,5 % (для гепарина натрия);
тромбообразующих;
 молярное соотношение сульфат ионов к карбоксилат ионам – не
 кожные реакции;
менее 1,8;
 описаны отдельные случаи кожного некроза, обычно возникаю-
 тяжелые металлы – не более 0,003 %;
щие в месте введения, при применении стандартного гепарина и НМГ;
 потеря в массе при высушивании – не более 10,0 %;
 небольшие гематомы в месте введения;
 бактериальные эндотоксины – менее 0,01 МЕ/МЕ анти-Ха актив-
 обратимая эозинофилия;
ности;
 генерализованные реакции повышенной чувствительности, вклю-
 количественное определение – активность не менее 70 МЕ актив-
чая отек кровеносных сосудов;
ности анти-фактора Ха (также проводят определение активности к анти-
 повышенный уровень трансаминаз;
фактору IIа).
110 111
Проанализировав указанные тесты, мы не обнаружили методов, поз- составом по молекулярным массам все же отличаются один от другого и
воляющих оценить присутствие в препаратах гепарина гиперсульфатиро- по разному влияют на систему свертывания крови. Все НМГ отличаются
ванного хондроитин сульфата и дерматан сульфата. В то же время, именно между собой средней молекулярной массой, её распределением и биологи-
с одним из этих компонентов (гиперсульфатированным хондроитин суль- ческой активностью in vitro и in vivo. НМГ более длительный период цир-
фатом) связывают серьезные побочные эффекты. В настоящее время, в кулируют в крови, значительно дольше инактивируют (на фосфолипидных
России предложено всем производителям ввести в нормативную докумен- мембранах) фактор Ха (не снижая его синтез), минимально ингибируют
тацию тестирование субстанций по данному продукту. В качестве метода тромбин. Высокое родство НМГ к антитромбину III, их пролонгированная
предлагается капиллярный электрофорез в свободном растворе (зональный антитромбиновая активность дают возможность использовать меньшие су-
капиллярный электрофорез). На электрофореграмме тестируемого раство- точные дозы, при однократном подкожном введении надежно предотвра-
ра не должен присутствовать остроконечный пик гиперсульфатированного щать тромбоэмболии, в том числе и послеоперационные. После подкожно-
хондроитин сульфата перед пиком гепарина. Допускается наличие пика го введения НМГ полностью адсорбируются и длительность полувыведе-
дерматан сульфата после пика гепарина. Также предлагается проведение ния их анти-Ха активности почти в два раза больше, чем НФГ. В то же
ЯМР спектроскопии в диапазоне 1,5–2,5 м.д.; не допускается присутствие время, период элиминации анти-IIа активности такой же, как у НФГ. Био-
характерного для гиперсульфатированного хондроитин сульфата сигнала доступность НМГ достигает 90 %. Даже при низких дозах доступность
при м.д. Необходимо отметить, что ряд производителей вводят дополни- НМГ выше, чем у НФГ. Последнее связано с низкой аффинностью НМГ к
тельные тесты, например, содержание дерматан сульфата не более 0,9 % эндотелию, белкам плазмы, внеклеточному матриксу, а также к 4 фактору
(Shenzhen Hepflink (TONGDA) Biological Technology Co. LTD). Кроме того, тромбоцитов, которые нейтрализуют антикоагулянтный эффект НФГ.
обязательным является определение: остаточных органических раствори- НМГ усиливают фибринолиз: они высвобождают из эндотелия сосудов эн-
телей, используемых при производстве (ацетона, этанола, метанола и др.); догенные антитромботические вещества и активаторы плазминогена,
микробиологической чистоты; специфического оптического вращения (не непосредственно повышают антитромботический потенциал стенок сосу-
менее чем 35 °). Возможно применение масс-спектроскопии для получения дов и опосредовано стимулируют выделение антитромботических глико-
информации о структурной организации гликозаминогликанов. В Евро- заминогликанов и простациклинов – эффективных ингибиторов агрегации
пейской фармакопее представлена монография «Надропарин кальция». тромбоцитов и вазодилаторов, которые являются существенным компо-
Для идентификации субстанции необходимо определять фракционный со- нентом антикоагулянтной активности этих гепаринов. Одним из важней-
став и анти-фактор Ха активность. Фракционный состав предлагается оп- ших факторов для более широкого использования НМГ является экономия
ределять методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектором; анти-фактор средств для лечения больных. Так, по данным ряда исследователей, учиты-
Ха с помощью реактивов для спектрофотометрического определения. вая, что терапевтический эффект наблюдается при приеме НМГ 1 раз в
сутки, стоимость лечения практически в два раза ниже, чем при использо-
Заключение вании НФГ. В отличие от НФГ различные препараты НМГ могут быть
дифференцированы по биологическим и клиническим признакам. НМГ
Хотелось бы отметить, что НМГ (Дальтепарин, Эноксапарин, Над- рассматриваются специалистами как различные лекарственные средства,
ропарин и др.) существенно различаются между собой по фармакодинами- требующие определения дозировки и спецификаций для каждого продукта.
ке влияния на каскад свертывания и фармакокинетическим характеристи- Различия между НМГ обусловлены их молекулярными и структурными
кам. Анализ литературы позволяет нам рассматривать НМГ как различные свойствами. В зависимости от метода деполимеризации: химическая
препараты, каждый из которых характеризуется собственным профилем (Эноксапарин), ферментативная (Тинзапарин), обработка азотистой кисло-
эффективности и безопасности. Таким образом, даже препараты с близким той (Дальтепарин), окислением (Ардепарин) мы сталкиваемся с различны-
112 113
ми по составу и свойствам препаратами. В каждом препарате установлено Контрольные вопросы
различное соотношение отдельных цепей гепарина, обуславливающее раз-
личные молекулярные массы. Любые минимальные изменения технологи- 1. Какой механизм действия характерен для гепарина?
ческого процесса могут изменять ряд свойств препаратов НМГ: плотность 2. Классификация гепаринов по спектру действия и химической
заряда, формирование ангидро-манно или ангидро-глюко группировок, структуре.
различное содержание сульфо- и ацетил- групп. Так, например, для Энок-
3. Какими свойствами обладает нефракционированный гепарин?
сапарина около 30 % молекул не охарактеризованы путем прямого анали-
4. В чем преимущества низкомолекулярного гепарина?
за. Таким образом, существует вероятность, что могут быть определенные
различия между различными препаратами НМГ. 5. Какими методами определяют биологическую активность гепари-
В то же время при клиническом применении НМГ существует про- нов?
блема правильного подбора препарата и его вводимой дозы, что вызвано 6. Каковы основные методы применяют для получения низкомолеку-
отличающимися свойствами гепарина из-за различной специфичности, мо- лярных гепаринов?
лекулярной массы, различного состава и наличия сопутствующих приме- 7. Охарактеризуйте основные технологические этапы получения ге-
сей. По нашему мнению, необходимо в субстанциях препаратов опреде-
паринов и методы их очистки.
лять содержание каждой молекулярной фракции. При средней молекуляр-
8. Какие ферменты используются для получения низкомолекулярных
ной массе от 3,8 до 5,0 кDа, по-видимому, необходимо определять содер-
жание именно этого компонента. Кроме того, необходим контроль препа- гепаринов?
ратов по другим примесным компонентам: xондроитинсульфату (присут- 9. Схема производства эноксапарина натрия.
ствие в препаратах хондроитинсульфата может приводить к реакциям ана- 10. Каким образом влияют примеси низкомолекулярных гепаринов
филактического типа), гиперсульфатированному хондроитинсульфату, на их фармакологическую активность?
дерматан сульфату и др. Учитывая, что соотношение антифактора Ха к ан- 11. Описать сырьевые источники для получения различных видов
тифактору IIа даже в пределах одного продукта широко варьирует (так, для гепаринов.
надропарина кальция это соотношение колеблется от 2,5 до 4,0) необходи-
12. С какой целью при получении низкомолекулярных гепаринов ис-
мо стандартизовать продукт по этому показателю. Используемые сегодня
пользуется ультрафильтрация?
НМГ должны рассматриваться как оригинальные, а не генерические пре-
параты (непатентованные лекарственные препараты, являющиеся воспро- 13. Привести основные фармакопейные требования к низкомолеку-
изведением оригинального препарата, на действующее вещество которого лярным гепаринам.
истёк срок патентной защиты, могут отличаться от оригинального препа- 14. Физико-химические и фармакологические свойства гепаринов.
рата по составу вспомогательных веществ), отличающиеся по способам 15. Какие основные лекарственные формы гепаринов?
получения, составу и клиническому действию. Все это требует проведения 16. Какие методы применяют для характеристики гепаринов?
соответствующих исследований по изучению их физико-химических, био- 17. Какова роль гепаринов в системе свертывания крови?
логических и клинических свойств. Перспективы у тех производителей
18. Чем объясняется необходимость в препаратах гепарина?
НМГ, которые сумеют своевременно дополнить требования фармакопеи
19. При каких патологических состояниях применяют гепарин?
методами анализа, позволяющими стандартизовать препараты низкомоле-
кулярных гепаринов с целью снижения побочного действия.

114 115
ГЛАВА 4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ или неспособности биохимических систем организма включать витамины
ВИТАМИНОВ в обменные процессы (эндогенные гиповитаминозы); увеличение выведе-
ния витамина из организма или повышенная его утилизация в биохимиче-
ских или физиологических процессах (в период кормления грудью, бере-
Витамины – низкомолекулярные органические вещества разнооб- менности, тяжелых инфекционных болезнях, при экстремальных темпера-
разной химической структуры, которые являются биологическими катали- турах и тяжелой физической работе).
заторами химических реакций проходящих в живой клетке, необходимы Избыток витаминов (гипервитаминоз) наблюдается при чрезмерном
для нормального обмена веществ и жизнедеятельности организма. Термин поступлении витаминов в организм. Наблюдается, например, при приеме
витамины предложил в 1911–1912 году польский ученый К. Функ. Многие высоких доз жирорастворимых витаминов, которые характеризуются вы-
витамины – это предшественники коферментов, берущих участие в фер- раженной липофильностью и способны задерживаться в организме. Так,
ментативных реакциях. Сегодня известно около 30 витаминов и витамино- гипервитаминоз витамина D может развиваться при увеличенном потреб-
подобных соединений. По физико-химическим свойствам витамины раз- лении печени и жира некоторых морских рыб, а также у детей при передо-
деляют на водорастворимые (В1 – тиамин, В2 – рибофлавин, В5 – пантоте- зировке витамина D в процессе лечения рахита. При гипервитаминозе ви-
новая кислота, В6 – пиридоксин, В12 – кобаламин, РР – никотиновая кисло- тамина D возникает гиперкальциемия и гиперфосфатемия вследствие де-
та, Н – биотин, фолиевая кислота, С – аскорбиновая кислота, Р – рутин) и минерализации костной ткани, активации процессов всасывания Са2+ в
жирорастворимые (А – ретинол, D – кальциферол, E – токоферол, вита- кишечнике и реабсорбции в почках.
мин К). Наука о витаминах развивается более 130 лет с конца XIX века:
Человек и животные получают большинство витаминов с пищей. В  1881 г. – русский ученый Лунин Н. И. провел эксперименты с пи-
ряде случаев с продуктами питания в организм попадают не витамины, а щевыми веществами: извлекал белки, жиры, углеводы и минеральные соли
вещества близкие к ним по строению, так называемые, провитамины из молока и кормил этой смесью лабораторных мышей. Животные болели
(предшественники витаминов), которые в организме превращаются в ви- и умирали. Луниным Н. И. был сделан вывод о том, что для удовлетворе-
тамины. Кроме того, ряд витаминов синтезируется микрофлорой кишечни- ния потребностей организма животных, кроме указанных веществ, необхо-
ка человека и животных. димы и другие вещества;
Недостача или отсутствие витаминов приводит к тяжелым заболева-  1911 г. – английский ученый Хопкинс Ф. Г. расширив эксперимен-
ниям (цинга, рахит, куриная слепота, полиневрит и др.). Витаминная недо- ты Лунина Н. И. и проведя анализ проведенных результатов, выступил с
статочность (гиповитаминоз) – патологическое состояние, обусловленное теорией о «дополнительных» питательных веществах, необходимых орга-
недостатком в организме отдельного витамина или комплекса витаминов, низму для нормального развития;
что сопровождается нарушениями биохимических и физиологических  1911 г. – польский ученый К. Функ, работающий в Лондоне, опуб-
процессов и возникновением специфической патологии. Основными при- ликовал результат своих исследований экстрактов из семян риса. Выделив
чинами гиповитаминоза является: уменьшение поступления определенного вещество в кристаллическом состоянии, он назвал его «витамином»
витамина в организм в составе продуктов питания (экзогенные гиповита- (vita (жизнь) + aminus – т.е. азотосодержащие вещества, необходимые для
минозы); нарушения при усвоении определенных витаминов клетками ор- жизни). К. Функ ввел новое понятие – авитаминоз;
ганизма, вследствие снижения их всасывания в пищеварительном тракте

116 117
 1920 г. – ученые К. Матилл и А. Конклин показали, что в смешан- Исследования, направленные на изучение структуры витаминов и их
ной пище содержится вещество, которое абсолютно необходимо для нор- биологического значения продолжаются и сегодня.
мального размножения животных. Активное вещество, предохраняющее от Таким образом, витамины представляют собой группу незаменимых
бесплодия, было выделено из масла пшеничных зародышей и из хлопково- органических соединений различной химической природы, необходимых
го масла и названо витамином Е; любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем ка-
 1924 г. – американские ученые А. Гесс, Г. Стинбок и М. Вайншток
талитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного вита-
из растительных масел и продуктов питания после облучения их УФ-
мина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности
лучами с длиной волны 280–310 нм получили активный препарат, предот-
организма, приводя к развитию патологических состояний. Витамины не
вращающий развитие рахита у детей. Вещество было идентифицировано с
эргостерином и названо витамином D1. В 1936 году ученый А. Виндаус образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают
выделил эргостерол из дрожжей и показал, что истинным витамином D яв- лишь автотрофы, в частности растения. Многие микроорганизмы также
ляется не эргостерин, а продукт его превращения, образующийся при УФ образуют целый ряд витаминов. В связи с этим синтез витаминов с помо-
облучении, который был назван витамином D2. щью микроорганизмов стал основой для разработки технологий промыш-
 1927–1929 г.г. – американский ученый Сент-Дьерди А. установил ленного производства этих биологически активных соединений.
структуру витамина С – аскорбиновой кислоты; Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов (про-
 1929 г. – установлено, что витамины связаны с ферментами, явля- дуцентов витаминов) и выяснению путей биосинтеза каждого из них со-
ясь для них кофакторами. Хопкинс Ф. Г. и Эйкман Х. были удостоены Но- здана теоретическая основа для получения микробиологическим способом
белевской премии за открытие антиневрического витамина (В1 – тиамин) и
практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с по-
открытие витамина роста;
мощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по
 1930–1931 г.г. – швейцарский ученый Каррер П. установил, что из
строению витамины: В2, В12, -каротин (провитамин А) и предшественни-
β-каротина образуется витамин А;
 1933 г. – Каррер П. установил, что вещество рибофлавин идентич- ки витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источ-
но витамину В2; ников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в
 1933 г. – американский ученый, биохимик Р. Вильямс открыл пан- качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и
тотеновую кислоту – витамин В5; кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процес-
 1929–1939 г.г. – датский ученый Дам Х. и американский ученый сов.
Дойзи Э. А. открыли витамин К; Необходимо отметить, что в организме человека и животных источ-
 1936 г – американский ученый Сент-Дьерди А. из кожуры лимона ником синтеза витаминов являются микроорганизмы кишечника. Так,
выделил рутин, названный витамином Р; микроорганизмы синтезируют фолиевую кислоту в количествах, достаточ-
 1937 г. – американский ученый Эльвегейм К. А. из экстракта пече-
ных для удовлетворения потребностей организма в этом витамине. Вита-
ни выделил чистую никотиновую кислоту – витамин РР;
мин В12 (кобаламин) также может синтезироваться микрофлорой кишечни-
 1934 г. – Сент-Дьерди А. получил Нобелевскую премию за откры-
ка при условии доставки с пищей кобальта. Микрофлорой кишечника так-
тие витамина В6 – пиридоксина;
 1948 г. – американским ученым Дороти Кроуфут-Ходжкин открыт же синтезируется витамин В3 (пантотеновая кислота) и фолиевая кислота в
витамин В12. количествах, достаточных для удовлетворения потребностей организма в
этом витамине. Микрофлора кишечника является важным источником

118 119
биотина (витамин Н), пиридоксина (витамин В6), тиамина (витамин В1), Таблица 10 – Химические структуры витаминов
частично обеспечивающая потребность организма человека и животных.
Производство витаминов осуществляется следующими основными Витамины Химическая структура
путями: 1 2
1. Экстракция витаминных препаратов из растительного или жи-
вотного сырья. С этого направления начиналась витаминная промышлен-
ность, поскольку первые витаминные препараты были получены именно
таким путем. Например, витамин В12 получали из сырой печени крупного Витамин В2
рогатого скота, каротин – из моркови. Но в настоящее время доля витами- (рибофлавин)
нов, получаемых этим методом, незначительна ввиду очень низкого со-
держания их в природном сырье и ограниченности сырьевых ресурсов.
2. Химический синтез витаминов. Производство синтетических ви-
таминов занимает, пожалуй, ведущее место в современной витаминной
промышленности. Основная номенклатура витаминов представлена веще-
ствами, полученными химическим синтезом из химических видов сырья
или сочетанием химического синтеза с биосинтезом. Однако такой способ
производства витаминов представляет собой сложный, многоступенчатый
процесс, сопряженный с большими производственными затратами, что по-
вышает себестоимость продукции и делает конечные продукты слишком
дорогими. Витамин В12
3. Биосинтез витаминов. Получение витаминов осуществляют мик- (цианокобаламин)
робиологическим способом с использованием штаммов-продуцентов. Се-
годня, основные витамины, используемые в фармации, получены при по-
мощи биосинтеза: рибофлавин, цианокобаламин, аскорбиновая кислота,
эргокальциферол, никотиновая кислота и др.
В табл. 10 представлены химические структуры витаминов, исполь-
зуемых в составе лекарственных препаратов.

Витамин А
(ретинол)

120 121
Продолжение таблицы 10 4.1. Производство витамина В2 (рибофлавин)

1 2
Витамин В2 (рибофлавин C17H20N4O6) входит в состав флавиновых
ферментов, участвующих в транспорте водорода (тканевом дыхании) и об-
разовании АТФ в митохондриях. Рибофлавин используют для лечения лю-
Витамин Н дей с гиповитаминозом, конъюнктивитом, кератитом, вирусным гепати-
(биотин) том А, заболеваниями печени, железодефицитной анемии, лучевой болезни
и др.
Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из
природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в морко-
ви и печени трески. Из 1 тонны моркови можно выделить только 1 грамм
Витамин В6 рибофлавина, а из 1 тонны печени – 6 грамм витамина. В 1935 году обна-
(пиридоксин) ружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, спо-
собный при выращивании на 1 тонне питательной смеси синтезировать
25 кг витамина В2. Сверхсинтез рибофлавина добиваются действием на
дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования
синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением со-
Витамин В1 става культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к ана-
(тиамин) логу витамина В2 – розеофлавину.
В состав среды для роста продуцентов витамина В2 входят ком-
плексные компоненты – соевая мука, кукурузный экстракт, меласса, саха-
роза, карбонат кальция, натрия хлорид, гидрофосфат калия, витамины, ми-
неральные вещества. Продуценты витамина В2 выращивают на средах, где
Витамин С в качестве источника углерода используют глюкозу, сахарозу, крахмал,
(L-аскорбиновая пшеничную муку, а в качестве источника азота используют молочную сы-
кислота) воротку, рыбную и кукурузную муку, казеин и др. Для культивирования
продуцента используют биотин, тиамин, инозит, ростовые вещества, со-
держащиеся в зародыше пшеницы, картофельном соке и автолизате дрож-
жей. Установлено, что биосинтез рибофлавина продуцентом Eremothecium
ashbyii стимулируется липидами. Так, при добавлении в питательную сре-
ду кукурузного или соевого масла (0,5–1,0 % отходов масложировых ком-
бинатов) выход рибофлавина увеличивается вдвое. Грибы весьма чувстви-
тельны к изменению состава среды и подвержены инфицированию. Перед
подачей в ферментер, среду подвергают стерилизации, добавляя к ней ан-

122 123
тибиотики и антисептики. Готовят жидкую питательную среду и посевной І этап – конструирование с применением генетико-селекционных ме-
материал культуры дрожжей в разных емкостях – ферментере и посевном тодов реципиентного штамма B. subtilis Y6 с нарушенной системой реком-
аппарате. Культивирование продуцента проводят поверхностным или глу- бинации;
бинным способом. Витамин накапливается в клетках гриба-продуцента, ІІ этап – конструирование с применением генетико-селекционных
либо в виде предшественника – флавина дениннуклеотида, либо в свобод- методов рекомбинантной плазмиды, несущей рибофлавиновый оперон
ном состоянии. штамма B. subtilis 53A с нарушенной негативной регуляцией;
Среда проходит стерилизацию при 120–122 °С в течение 1 часа. ІІІ этап – конструирование рекомбинантного штамма продуцента ри-
Культивирование ведут при оптимальной температуре 28–30 °С и давле- бофлавина B. subtilis 62/pMX30ribО 186.
нии 104 Па при расходе воздуха 1,5–2,0 литра в минуту до начала лизиса Известно, что биосинтез рибофлавина B. subtilis подвержен нега-
клеток и появления спор, которые определяют микроскопически. При био- тивному контролю. Имеется два вида мутаций, снимающих этот кон-
синтезе рибофлавина начальное значение рН 6,0–7,0; в процессе роста троль: мутации в операционной области рибофлавинового оперона ribO и
грибов (Eremothecium ashbyii, Ashbyii gossipii) рН снижается до 4,5. Поэто- мутации по репрессору биосинтеза рибофлавина ribC. На первом этапе по-
му для эффективного синтеза рибофлавина величину рН постоянно под- лучения резистентного штамма в штамм B. subtilis RK6121 методом гене-
держивают на уровне 9,5. После окончания процесса ферментации культу- тической трансформации вводят мутации ribС 862 и ribO 186. Затем для
ральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппа- увеличения пула предшественника рибофлавина (гуанозин-5-трифосфата)
раты, где её нагревают до 80 °С с целью разрушения (термолиза) клеточ- методом мутагенеза in vivo под действием N-метил-N-
ных структур с одновременным концентрированием. нитрозонитрогуаницина и ультрафиолета последовательно вводят мута-
В качестве посевного материала используют споры Eremothecium ции, определяющие устойчивость к 0,5 мг/мл 8-азагуанина и к 10 мг/мл
ashbyii, выращенные на пшене (7–8 дней при 29–30 °С). После стерилиза- метионин-сульфоксида. Этот штамм синтезируют до 4 г/л рибофлавина за
ции, жидкий посевной материал подается в ферментер. При процессе фер- 48 часов.
ментации грибов для получения кормового рибофлавина концентрация ви- Конструирование рекомбинантной плазмиды: к бациллярному век-
тамина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По заверше- тору рМХ30 определяющему устойчивость бацилл к эритромицину и име-
нии процесса ферментации культуральную жидкость концентрируют в ва- ющему размер 18,3 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) присоединяют фрагмент
кууме, высушивают на распылительной сушке (до влажности 5–10 %) и ДНК с рибофлавиновым опероном B. subtilis 53A, содержащим мутацию
смешивают с наполнителями. ribO 186 в операторной области. В результате была получена плазмида, ко-
В 1983 году во ВНИИ генетики микроорганизмов был сконструиро- торой присвоено название pMX30ribO 186, обуславливающая устойчи-
ван рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризую- вость к 10 мкг/мл эритромицина и имеющая размер 28,6 т.п.н.
щийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибо- Конструирование рекомбинантного штамма B. subtilis
флавина. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из со- 62/pMX30ribO 186: в штамм B. subtilis Y6 методом генной трансформации
зданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент вита- вводят плазмиду pMX30ribO 186. Полученный продуцент позволяет полу-
мина В2, способный синтезировать втрое больше по сравнению с чить высокий выход рибофлавина: 12,4 г/л за 42 часа аэрации (культивиро-
Eremothecium ashbyii количество рибофлавина всего за 42 часа фермента- вание при температуре 37–43 °С, аэрация 15 г О2/ч).
ции. Работа по получению продуцента проходила в несколько этапов: Для получения рибофлавина с повышенным выходом, постоянно
проводится изучение продуцентов витамина и создание новых рекомби-

124 125
нантных штаммов, разработка оптимального состава питательных сред и 2 % соевой муки, 0,2 % (NH4)2HPO4). В оптимальных условиях выход ри-
определение условий культивирования. бофлавина достигал 5,0 г/л. Установлено, что 8 % глюкозы может быть
Так, например, морские дрожжи Candida membranifaciens subsp. полностью израсходовано за 60 часов культивирования.
Flavinogenie W14-3, выделенные из вод Восточно-Китайского моря секре- В заключение хотелось бы отметить, что для выделения рибофлавина
тируют рибофлавин в среду при росте на ксилозе в течение 24 часов и тем- в лабораторных и производственных условиях используют культуры раз-
пературе около 25 °С. Культивирование оптимизировали с использованием личных микроорганизмов (см. табл. 11).
4-х переменных: содержания ксилозы, величины рН, температуры выра-
щивания, а также скорости перемешивания дрожжевых клеток при инку- Таблица 11 – Микроорганизмы, являющиеся продуцентами
бации. Исследователи добились выхода рибофлавина не менее 22 мг/мл рибофлавина
при 54 часах инкубации. Максимальное количество витамина наблюдалось
во время нахождения клеток в поздней стационарной фазе. Выход витамина
Микроорганизмы – продуценты
Рядом исследователей были отобраны мутанты Ashbya gossypii, про- (мг, %)
дуцирующие повышенное количество рибофлавина и способные к эффек- Clostridium acetobytylicum 97
тивному синтезу витамина на среде с апельсиновой кожурой. Такая среда Mycobacterium smegmatis 58
богата маслами, утилизируемыми микроорганизмами, продукты которого Mycocandida riboflavina 200
активизируют образование рибофлавина. Когда в ферментационной среде Bacillus subtilis 24A1/pMx45 500
отобранных мутантов, солодовый экстракт был замещен апельсиновой ко- Candida flaveri 567
журой (0,3 %) максимальная продукция витамина была на 180 % выше Bacillus subtilis 62/pMX30ribO186 1240
контроля, выращенного в культуральной среде, содержащей солод. Candida membranifaciens subsp. Flavinogenie W14-3 2200
Проведено изучение метаболических изменений при биосинтезе ри- Eremothecium ashbyii 2480–6000
бофлавина на примере периодического культивирования сверхпродуцента Ashbyii gossipii 6420
витамина Bacillus subtilis PK. При разрушении гена оксидазы bd Bacillus
subtilis PK обнаружено повышение удельной скорости развития культуры Для получения рибофлавина можно использовать химический син-
и увеличение выхода биомассы. У мутанта cyd синтез побочного продукта тез, в котором в качестве исходных компонентов применяют
снижался, и образовывалось больше ацетоина. Метаболические потоки 3,4-диметиланалин и D-рибозу, полученную микробиологическим путем.
были сокращены и источники углерода расходовались на синтез биомассы Для биосинтеза рибозы используют транскетолазные мутанты: Bacillus
и рибофлавина (повышение на 30 %). Корреляция между выходом биомас- Subtilis, Penicillium brevi-compactum и Pseudomonas reptilivora. В питатель-
сы и продуктивностью Bacillus subtilis PK cyd указывает на возможность ных средах для культивирования продуцентов в качестве источника угле-
эффективной генерации энергии для экспоненциального роста сверхпро- рода используются глюкоза и крахмал. В среду вносят соли аммония, фос-
дуцента рибофлавина при периодическом культивировании. Оптимизиро- фаты калия, соли магния. В ряде случаев в состав среды вводят дрожжевой
ван состав питательной среды, а именно источники азота для продукции и кукурузный экстракт. Например, в случае Bacillus Subtilis D-рибозa на-
рибофлавина ccpA мутантом Bacillus subtilis 24A1/pMx45. Оптимальный чинает накапливаться пропорционально потреблению глюкозы на 1–2 день
состав среды: 8 % глюкозы (источник углерода), 2 % дрожжевого порош- и заканчивается на 4-й день. Максимальный выход D-рибозы наблюдается
ка, 0,05 % MgSO47H2O и 3 источника азота (0,1 % дрожжевого экстракта, при температуре культивирования 36,5–36,6 °С. Выделение и очистку

126 127
D-рибозы осуществляют из культуральной жидкости после отделения Витамин В12 регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в
микробных клеток центрифугированием и путем колоночной хроматогра- метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых ос-
фии с использованием сильноосновного анионита в боратной форме. По- нований, стимулирует образование предшественников гемоглобина в
лученный раствор витамина В2 подвергают кристаллизации. Необходимо костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной ане-
отметить, что производство рибофлавина микробиологическим методом мии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т.п. Добавление
по сравнению с химическим синтезом имеет существенные преимуще- витамина к кормам способствует более полноценному усвоению расти-
ства, а именно: тельных белков и повышает продуктивность сельскохозяйственных жи-
 использование доступного сырья; вотных на 10–15 %.
 осуществление процесса получения витамина в одну технологи- Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного
ческую стадию; сырья, однако из 1 тонны печени можно было выделить всего лишь 15 мг
 отсутствие токсических выбросов в атмосферу. витамина. Единственный способ его получения в настоящее время – мик-
робиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного
4.2. Получение витамина В12 (цианокобаламин) продукта при производстве антибиотиков в значительной степени стиму-
лировало поиск организмов-продуцентов витамина и изучение путей его
Витамин В12 (Со[-(5,6-диметилбензимидазолил)]-Со-циано- образования. Однако механизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до
кобамид – C63H88CoN14O14P – цианокобаламин) активизирует обмен угле- настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при вы-
водов, белков и липидов, участвует в синтезе лабильных метильных групп, соких концентрациях витамин полностью репрессирует синтез ключевых
в образовании холина, метионина, нуклеиновых кислот, способствует ферментов своего новообразования.
накоплению в эритроцитах соединений с сульфгидрильными группами. Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении слу-
Являясь фактором роста, стимулирует функцию костного мозга, что необ- жат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии,
ходимо для нормобластного эритропоэза. Цианокобаламин способствует одноклеточные водоросли. В 70-х годах ХХ века интерес ученых привлек-
нормализации нарушенных функций печени и нервной системы, активизи- ли пропионовокислые бактерии, известные еще с 1906 года и широко ис-
рует свертывающую систему крови, в высоких дозах вызывает повышение пользующиеся для приготовления препаратов в животноводстве. Выделено
тромбопластической активности и активности протромбина. 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12. Для
В организме человека и животных определенное количество циано- получения высокоочищенных препаратов витамина В12 пропионовокислые
кобаламина синтезируется микрофлорой кишечника, что не удовлетворяет бактерии культивируют периодическим способом на средах, содержащих
потребность организма в витамине, и дополнительное количество его ор- глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид
ганизм получает с продуктами питания. кобальта. Добавление в среду предшественника 5,6-диметилбензимидазола
Витамин В12 открыт в 1948 году одновременно в США и Англии. В (способствует переводу неактивных форм в природный продукт) по окон-
1972 году в Гарвардском университете был осуществлен химический син- чании первой ростовой фазы (5–6 суток) стимулирует быстрый (18–24 ч)
тез корриноидного предшественника витамина В12. Химический синтез синтез витамина с выходом последнего 5,6–8,7 мг/л. Путем селекции, оп-
корнестерона (структурного элемента корринового кольца витамина), тимизации состава среды и условий культивирования выход витамина В 12
включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за в промышленных условиях был значительно повышен. Так, выход витами-
сложности процесса. на на среде с кукурузным экстрактом и глюкозой при поддержании ста-

128 129
бильного значения рН около нейтрального достигает 21–23 мг/мл. Мутант Источником углерода в питательной среде служит ацетонобутиловая
пропионовокислых бактерий продуцирует до 30 мг/мл витамина. Бактерии и спиртовая барда, которую поставляют заводы, перерабатывающие зерно
плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар- и мелассу. Для оптимизации питательной среды в неё добавляют соедине-
агар, крахмал) предотвращающих оседание бактерий, а также использова- ния кобальта (хлорид кобальта – 4 г/м3), который входит в состав молеку-
ние высоко анаэробных условий и автоматического поддержания рН поз- лы витамина В12 и субстраты для роста метанобразующих бактерий – низ-
воляет получить наиболее высокий выход витамина – 58 мг/л. шие жирные кислоты и низшие спирты, что позволяет значительно повы-
Из культуральной жидкости витамин В12 выделяют экстракцией, ор- сить выход витамина В12.
ганическими растворителями, ионообменной хроматографией с последу- Подготовленное сырье освобождают в декантаторе от взвешенных
ющим осаждением витамина из фракций в виде труднорастворимых со- частиц и непрерывно подают в нижнюю часть ферментера – емкость. Од-
единений. В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокис- новременно в ферментер поступает посевной материал культуры микроор-
лых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, ганизмов, предварительно выращенной в специальных аппаратах. Для вы-
сложные и дорогостоящие питательные среды. Усовершенствование тех- ращивания продуцента требуются облигатно анаэробные условия, так как
нологического процесса идет в направлении удешевления компонентов даже следовые количества кислорода подавляют рост бактерий. При со-
питательных сред и перехода с периодического культивирования на непре- здании анаэробных условий в среду подают диоксид углерода или газы,
рывный процесс. В последние годы исследуется возможность получения выделяющиеся в процессе ферментации. Ежедневно из ферментера отби-
витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых рают 20–30 % объема среды. Продукт ферментации стабилизируют, под-
бактерий. Учитывая высокую светочувствительность витамина В12 при кисляя соляной или фосфорной кислотой до рН 6,3–6,5, а также добавляют
проведении биотехнологического процесса необходимо все операции осу- 0,2–0,25 % сульфита натрия, что предотвращает разрушение витамина при
ществлять в затемненных условиях или используя красный свет. тепловой обработке (особенно существенное в щелочной среде). В даль-
Для нужд животноводства сотрудниками института им. А. Н. Баха нейшем отобранная часть культуральной жидкости дегазируется, упарива-
предложена простая и дешевая технология получения витамина В12. По ется в вакууме; концентрат высушивается в распылительной сушке до
указанной технологии ферментацию осуществляет сложный биоценоз тер- влажности 10–15 % и смешивается с наполнителями.
мофильных микроорганизмов, производящих метановое брожение. Ком- Для медицинских целей субстанцию витамина В12 получают в виде
плекс микроорганизмов включает целлюлозоразлагающие, углеводсбра- кристаллического темно-красного порошка, содержащего не менее 99 %
живающие, аммонифицирующие, сульфитвосстанавливающие и метан- основного вещества. Из субстанции готовят различные лекарственные
образующие бактерии. На первой фазе процесса (10–12 дней) развиваются формы: растворы для инъекций и таблетки.
термофильные углеводсбраживающие и аммонифицирующие бактерии. Активно продуцируют витамин В12 представители рода
При этом в слабокислой среде (рН 5,0–7,0) органические соединения пре- Propionibacterium, природные штаммы которых образуют от 1,0 до 8,5 мг/л
вращаются в жирные кислоты и аммиак. На второй фазе, когда среду под- витамина, а полученный искусственный мутант P. Shermanii M-82 спосо-
щелачивают до рН 8,5; в биоценозе преобладают метанобразующие бакте- бен накапливать витамин В12 до 58 мг/л.
рии, которые сбраживают возникающие на первой фазе продукты до мета- Практический интерес для микробиологического синтеза В12 имеют
на и диоксида углерода. Именно метанобразующие бактерии – главные представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Витамин
продуценты витамина. Обогащение сред очищенными культурами ме- В12 в значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л),
танобразующих бактерий увеличивает выход активных форм витамина В12. а также представители рода Micromonospora. Высокой кобаломинсинтези-

130 131
рующей активностью обладают метагенные бактерии, например, Количественное содержание витамина В12, продуцируемое
Methanosarcina barkeri, M. Vacuolita и отдельные штаммы галофильного Propionibacterium shermanii, устанавливают микробиологическим методом
вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л). по зонам роста витаминзависимого штамма E. Coli 133-3.
Витамин В12 синтезируют строго анаэробные бактерии из рода кло- Витамин В12 накапливается в клетках бактерий, поэтому по оконча-
стридий. В значительных количествах образуют витамин В12 ацетогенные нии процесса культивирования биомассу отфильтровывают или сепариру-
клостридии C. Thermoaceticum, C. Formicoaceticum и Acetobacter woodi, ют и экстрагируют из нее витамин при температуре 85 ± 5 °С водой, под-
синтезирующие ацетат из CO2. кисленный до рН 4,5–5,0.
Известны активные продуценты витамина В12 среди псевдомонад. Затем водный экстракт витамина охлаждают, доводят раствором ще-
Некоторые штаммы Pseudomonas denitrificans нашли применение для про- лочи рН до 6,8–7,2; к раствору добавляют сульфат аммония и раствор
мышленного получения цианокобаламина. Интерес представляют также хлорного железа для коагуляции белков. Коагулят белков, отделяют на
термофильные бациллы, а именно, Bacillus eirculans, Bacillus фильтр-прессе, и водный экстракт витамина В12 поступает на стадию вы-
stearothermophilus, которые растут при температурах, соответственно, деления и очистки кристаллического продукта.
60 °С и 75 °С и за 18–24 часа культивирования без соблюдения стерильных Витамин В12 из водного экстракта, освобожденного от белков, сор-
условий дают высокий выход витамина. бируют на ионообменной смоле СГ-1 и элюируют водным раствором ам-
Например, в России в качестве основного продуцента витамина В12, миака. Далее элюат пропускают через колонки с окисью алюминия, при
получаемого для медицинских целей, используют культуру этом витамин сорбируется на окиси алюминия, а примеси удаляются с ма-
Propionibacterium shermanii. Для получения витамина В12 Р. shermanii точным раствором.
культивируют периодическим методом в анаэробных стерильных условиях С окиси алюминия В12 элюируют водным ацетоном, к водно-
в питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли ко- ацетоновому элюату добавляют безводный ацетон до помутнения раствора
бальта и сульфат аммония. и смесь выдерживают при температуре 3 ± 1 °С в течение 24–48 ч, при
Образующиеся в процессе брожения органические кислоты нейтра- этом происходит кристаллизация витамина В12. Выделившиеся кристаллы
лизуют раствором щелочи, добавление которой регулируются автома- технического витамина отфильтровывают, промывают безводным ацето-
тически. Через 72 часа культивирования в среду вносят предшественник ном, эфиром и сушат в вакууме.
биосинтеза – 5,6-диметилбензимидазол. Без введения предшественника Для химической очистки витамина В12 используют его способность
бактерии синтезируют не имеющий клинического значения псевдовитамин образовывать аддукты (комплексы) с фенолом, резорцином или крезолами.
В12, в котором азотистым основанием служит аденин. После введения Для этого водный концентрат витамина обрабатывают водным раствором
предшественника ферментацию продолжают ещё 72 часа до содержания фенола, отделяют фильтрованием выделившийся комплекс, затем его раз-
витамина в биомассе не менее 250 мкг/г. лагают путем обработки водным ацетоном. Витамин при этом выделяется
Установлено, что основное накопление содержания витамина В12, в виде осадка, а фенол и примеси уходят с водно-ацетоновыми маточными
синтезируемое пропионовыми бактериями, выращенными на сывороточ- растворами. Для окончательной очистки осуществляют одно- или двукрат-
ной среде, наблюдается на ранней фазе логарифмического роста (до 72 ча- ное переосаждение цианокобаламина из водного раствора ацетоном.
сов инкубации). Необходимо отметить, что штаммы пробиотиков кишечника челове-
ка и животных способны продуцировать цианокобаламин. Поддержание
микрофлоры кишечника является гарантией обеспечения нашего организ-

132 133
ма витамином В12. Так, например, Lactobacillus reuteri CRL 1098 предот- СН3
СН3 СН3 СН3
вращает побочные эффекты, вызванные дефицитом при питании витамина
В12. Кроме того, обнаружено влияние содержания и типа аминокислот на
продукцию витамина В12 при культивировании Lactobacillus reuteri.
УФ Н 2С
Н3С
4.3. Получение витамина D2

СН3 СН3
В группу витаминов D объединены близкие по своей структуре и
функции соединения – витамины D2 и D3. Они оба обладают антирахити- СН3 СН3
НО НО
ческим действием. Недостаток витамина D в рационе детей приводит к
СН3 СН3
возникновению широко известного заболевания – рахита, в основе разви-
тия которого лежат изменения фосфорно-кальциевого обмена и нарушения
Эргостерин Витамин D2 (эргокальциферол)
отложения в костной ткани фосфата кальция. Поэтому основные симптомы
рахита связаны с нарушением нормального процесса костеобразования.
Развивается остеомаляция – размягчение костей. Кости становятся мягки-
ми и под тяжестью тела принимают уродливые формы.
СН3 СН3
Витамин D2 (эргокальциферол) получают путем микробиологиче- СН3 СН3
ского синтеза, при производстве которого применяют дешевое сырье (уг-
леводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лу-
чей на синтез эргостерина культурой дрожжей. Эргостерин и является УФ Н 2С
Н3С
предшественником жирорастворимого витамина D2 Установлено, что под
действием ультрафиолета в дрожжевых клетках происходит фотохимиче-
ское превращение эргостерина в эргокальциферол. С химической точки
зрения эргостерин представляет собой одноатомный ненасыщенный цик- СН3 СН3
НО НО
лический спирт, в основе структуры которого лежит кольцо циклопента-
СН3 СН3
нопергидрофенантрена. Под действием УФ-лучей эргостерин через ряд
промежуточных продуктов (люмистерин, тахистерин) превращается в ви-
7-Дегидрохолестерин Витамин D3 (холекальциферол)
тамин D2. В 1936 году Брокман выделил активный в отношении рахита
препарат из рыбьего жира и назвал его витамином D3. Установлено, что
предшественником витамина D3 является не эргостерин, а холестерин. На Рисунок 14 – Получение витамина D2 и D3
рис. 14 показано получение витамина D2 и D3.

134 135
Продуценты эргостерина представлены в табл. 12. 4.4. Получение β-каротина

Важное место в обмене веществ у животных занимает -каротин, ко-


Таблица 12 – Содержание эргостерина у микроорганизмов
торый в печени превращается в витамин А (ретинол). Ретинол (вита-
мин А – (С20Н30О)) необходим для нормального течения метаболических
Количество эргостерина, %
Микроорганизмы процессов, в том числе для регуляции роста и развития организма. Обеспе-
(на сухое вещество)
чивает нормальную функцию зрения, структурную целостность тканей,
Saccharomyces ellipsoids 1,2–1,5
повышает резистентность организма к воздействию неблагоприятных фак-
Rhodotorula glutinis 0,7–0,9
торов окружающей среды. При неполноценном питании и некоторых забо-
Candida utilis 0,4–0,6
леваниях пищеварительного тракта и печени наблюдается дефицит вита-
Candida tropicalis 0,2–0,3
мина А (авитаминоз). Ранним признаком последнего является ухудшение
Aspergilius 1,2–1,4 сумеречного зрения, снижение аппетита, уменьшение массы тела, сниже-
Penicillium Westlingii 2,2 ние неспецифической резистентности организма к инфекциям, нарушения
со стороны кожи и др. Кроме того, в последнее время появились сообще-
Для получения витамина D2 из дрожжей или мицелия их биомассу ния о том, что ретинол связан с регулированием сигнальных путей ядер-
гидролизуют в автоклаве, используя на 100 кг дрожжей или грибного ми- ных рецепторов, что активирует гены в организме человека и животных.
целия 20 л воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты. Гидролиз Установлено, что витамин А отвечает за активацию ядерного рецептора
проводят при температуре 10 °С в течение 20–30 минут. Затем гиролизо- TR4. Известно, что TR4 влияет на производство сперматозоидов, липидов
ванную массу обрабатывают спиртом (40–50 мин) при 75–78 °С в специ- и липопротеидов, развитие клеток центральной нервной системы и регули-
альном коагуляторе. Массу охлаждают до 10–15 °С и фильтруют. Филь- рование синтеза гемоглобина в зародыше. Ядерные рецепторы отвечают за
трат концентрируют, отделяя спирт и часть воды, получают концентрат активирование генов, обеспечивающих важные биологические процессы в
витаминов группы В. Массу, оставшуюся после фильтрации, промывают организме. Одновременно, исследователям удалось выделить молекулы
водой, отгоняют спирт и воду. Полученную массу сушат до влажности 2 % веществ, участвующих в транскрипции TR4, а именно, синтезе РНК на
и размельчают. Порошок дрожжей при 78 °С в экстракторе обрабатывают матрице ДНК. Полученные данные могут быть использованы для создания
трехкратным объемом спирта-ректификата. После отделения раствора оса- нового поколения лекарственных препаратов, полученных биотехнологи-
док повторно экстрагируют спиртом, который удаляют из экстракта, а оса- ческим путем.
док сгущают до 70 % содержания сухих веществ. Из 100 кг дрожжей полу- В организме человека и животных каротины не образуются. Основ-
чают 20–25 кг липидного концентрата. Концентрат омыляют щелочью, по- ные источники -каротина для животных – растительные корма; человек
сле чего раствор кристаллизуют при 0 °С и облучают УФ-лучами при
получает -каротин также из продуктов животного происхождения. Из ря-
280–230 нм. На выход витамина D2 оказывает влияние длительность облу-
да растительных объектов (морковь, тыква, облепиха, люцерна) можно вы-
чения УФ-лучами, температура и наличие сопутствующих примесей.
делить -каротин. В начале 60-х годов ХХ века была разработана схема
микробиологического синтеза -каротина, которая стала основой промыш-
ленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы
(фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи) синте-
зируют -каротин. Характерно, что содержание -каротина у микроорга-
136 137
низмов во много раз превышает содержание этого провитамина у расте- Установлено, что интенсивный биосинтез и накопление -каротина
ний. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг -каротина, в то время происходит, в основном, во второй фазе развития, которая характеризуется
как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3–8 тыс. мкг. Разработаны прекращением роста мицелия, снижением рН среды и уменьшением со-
опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для держания липидов в культуральной жидкости, вследствие их активной пе-
синтеза -каротина, основной недостаток которых – высокая стоимость реработки в -каротин.
сырья и большая длительность процесса. Технологический процесс производства -каротина, принятый
Основными продуцентами -каротина являются гетероталлические промышленностью, включает следующие основные стадии:
микроскопические грибы (дрожжи), из них наиболее широкое применение 1. Подготовка посевного материала.
нашли различные штаммы культуры Blakeslea trispora. При гетероталлиз- 2. Приготовление питательной среды.
ме особи различного пола внешне неразличимы, но отличаются по физио- 3. Культивирование.
логическим и генетическим характеристикам. Гетероталлизм грибов вы- 4. Термолиз и фильтрование мицелия.
ражен в образовании разнополого женского (+) и мужского (-) мицелия, 5. Сушка и размол биомассы.
при слиянии клеток которых образуются зиготы. Мицелий (+)-формы со- 6. Приготовление готовой лекарственной формы препарата или по-
держит больше -каротина и поэтому окрашен в более яркую желтую лучение кормового препарата микробиологического -каротина.
окраску, чем мицелий (-)-формы. Но максимальное количество -каротина Подготовка посевного материал. Главная особенность подготовки
синтезируется при совместном культивировании (+) и (-) форм, а именно, в посевного материала в производстве -каротина – раздельное выращива-
5–17 раз больше, чем при раздельном культивировании этих форм микро- ние (+) и (-) форм микроорганизмов продуцентов, начиная с выращивания
организмов. на скошенных средах в пробирках и заканчивая посевными аппаратами. Их
Созданы высокопродуктивные штаммы, способные синтезировать и слияние происходит лишь в реакторе при совместном культивировании.
накапливать до 3000–4000 мг -каротина на 1 л среды (для сравнения: Исходные музейные культуры представляют собой споровый или ве-
в 1 кг моркови содержится в среднем 60–70 мг -каротина). гетативный материал, хранящий раздельно (+) и (-) формы соответствую-
В Российской Федерации при производстве -каротина, в основном, щих штаммов.
используется культуры гриба Blakeslea trispora штаммы (+)МБ и (-)МБ, а В лаборатории их высевают на твердые среды в пробирках. Затем
также (+)С и (-)С, (+)8А и (-)8А. Эти штаммы способны синтезировать от выращивание ведут на жидких питательных средах в колбах (объемом
2000 до 3200 мг -каротина на 1 л культуральной жидкости. Продуценты 0,75 л) в стерильных боксах на встряхивающих устройствах. На этой ста-
могут размножаться половым, бесполым и вегетативными путями. Поло- дии подготовки посевного материала увеличивают примерно в 1,5 раза ко-
вое размножение осуществляется при совместном выращивании, бесполое личество (-)-форм по отношению к (+)-формам. В посевных аппаратах со-
– спорами, вегетативное – отростками (обрывками) мицелия. Активность отношение (+) и (-)-форм достигает уже 1 : 10 т.е. объем аппарата с
культур максимальная при совместном выращивании (+) и (-) форм и зави- (-)-формой должен в 10 раз превышать объем аппарата с (+)-формой. При
сит от их соотношения, которое подбирается экспериментально в микро- этом состав питательной среды для разных форм одинаковый, режим вы-
биологической лаборатории. В среднем соотношение (+) и (-) форм со- ращивания обеих форм в посевных аппаратах тоже практически не отлича-
ставляет 1 : 15, т.е. мужская (-)-форма используется с пятнадцатикратным ется (температура 28 ± 2 °С, время культивирования от 36 до 72 часов).
избытком. Приготовление питательной среды. Основу питательной среды со-
ставляют пшеничная или рисовая мука и растительные масла (хлопковое,

138 139
кукурузное или подсолнечное). Кроме того, в питательную среду добавля- 2. Стерилизация в индивидуальных бактериальных фильтрах, уста-
ют пеногасители (керосин, ПАВы), антиокислители (бутилоксианизол, ли- новленных на линии подачи стерильного воздуха в барботер каждого био-
монную или аскорбиновую кислоты), витамины (тиамин) и стимуляторы реактора и посевного аппарата.
синтеза -каротина. В качестве стимулятора наиболее эффективным явля- Культивирование осуществляется в типовых биореакторах вмести-
ется -ионон, который можно заменить на более дешевую цитрусовую ме- мостью от 10 до 32 м3, снабженных барботажным устройством, трехъярус-
ной турбинной мешалкой, рубашкой для охлаждения и внутренними теп-
лассу. Как заменители -ионона используют изопреновые димеры и три-
лообменниками для отвода избыточного тепла, выделяемого грибами в
меры, производные циклогексана, среди которых наибольшую активность
процессе своего роста.
проявляет 2,6,6,-триметил-1-ацетилгексан.
В биореактор загружают расчетное количество стерильной пита-
В составе питательной среды для первой генерации находится: под-
тельной среды, далее в стерильных условиях из посевных аппаратов пода-
солнечный шрот – 8–12 %, меласса 1–2 %, КН2РО4 – 0,05 %, баковый от-
ют сначала (-)-форму, а затем (+)-форму в соотношении, указанном инже-
стой – 4,2–5,0 %, тиамин хлорид – 0,0002 %. До стерилизации вводят био- нером-биотехнологом (обычно 15 : 1). Выращивание культуры ведут при
стимуляторы каратиноидообразования – 0,05–0,15 %; антиоксидант интенсивной аэрации и перемешивании. Температуру культуральной жид-
0,03–0,05 %, рН среды составляет 6,0–6,5. кости (процесс экзотермический) поддерживают в пределах 28 ± 2 °С пу-
В составе питательной среды для второй генерации: мука соевая – тем подачи холодной воды в рубашку и теплообменники.
2,3 %, мука кукурузная 4,7 %, КН2РО4 – 0,05 %, рН среды 6,1–6,5. Прово- Гашение пены осуществляется обычно механическим пеногасящим
дят контроль питательных сред: количество редуцирующих веществ устройством, установленным в верхней части вала мешалки. Если уровень
0,8–3,0 %; азота аминного 70–150 мг, %. пены превышает определенный предел, автоматически включается система
Культивирование проводят 40–48 часов при 26–28 °С и постоянном подачи стерильного пеногасителя.
перемешивании в колбах при 220–240 об/мин. Периодически отбирают В процессе культивирования ведут постоянный контроль за ростом
пробы для контроля стерильности, рН, количества биомассы. гриба и содержанием -каротина в культуральной жидкости путем отбора
Стерилизацию питательных сред проводят при 120 °С 30 минут в проб не реже, чем два раза в сутки.
установках непрерывной стерилизации или непосредственно в аппаратах Содержание биомассы в культуральной жидкости должно находить-
(инокулятарах, в посевных аппаратах). Учитывая особую чувствительность ся в пределах 28–40 г/л, а содержание -каротина – не менее 2000 мг/л. Ес-
штаммов Blakeslea trispora к посторонним микроорганизмам, в некоторых ли эти показатели не достигнуты, в культуральную жидкость добавляют
случаях после стерилизации в питательную среду добавляют антибиотики -ионон или другой стимулятор, тиамин, антиокислители и продолжают
для создания гарантированных стерильных условий в процессе культиви- культивирование до получения положительных результатов.
рования. Термолиз и фильтрация мицелия. По окончании процесса культиви-
Стерильный воздух получают по типовой схеме, характерной для рования осуществляют тепловую обработку культуральной жидкости
микробиологических аэробных процессов. Как правило, стерилизацию (термолиз) с целью инактивации продуцента и дезактивации ферментов.
осуществляют в две ступени: Для этого нагревают культуральную жидкость острым паром до темпера-
1. Термическая стерилизация за счет подъема температуры воздуха туры 85 ± 5 °С и выдерживают при этой температуре не менее 15 минут.
до 200–250 °С при его сжатии в компрессоре; Поскольку культуральная жидкость лучше фильтруется в горячем виде, её
без охлаждения направляют на пресс-фильтры, где происходит отделение
мицелия от нативного раствора. Мицелий представляет собой трудно

140 141
фильтруемый слизистый осадок, поэтому для его фильтрации применяют Готовый продукт (каротин в масле) представляет собой пищевое
сжатый до 3–6 МПа азот. подсолнечное масло, содержащее 2–2,2 г/кг -каротина. Его фасуют в же-
Мицелий промывают водой и тщательно отжимают сжатым азотом стяные банки по 7 кг или в алюминиевые фляги по 50 кг и направляют на
до минимального содержания влаги. Применение сжатого азота или друго- предприятия пищевой промышленности для целевого назначения в каче-
го инертного газа предотвращает процессы окисления -каротина кисло- стве пищевой добавки в различные продукты питания (маргарин, сливоч-
родом воздуха. ные масла различных сортов, хлебопекарская и кондитерская продукция и
Сушка и размол биомассы. Сушку биомассы осуществляют в вакуум- т.п.).
барабанной сушке с ворошителем при температуре 85 ± 5 °С и давлении Кристаллический -каротин. В основе получения кристаллического
0,02–0,01 МПа до содержания остаточной влаги не более 7 %. продукта также используются процессы экстракции -каротина из биомас-
Для получения однородного порошка высушенную биомассу пере- сы продуцента. Раньше экстракцию осуществляли подсолнечным или дру-
малывают в мельницах растирающего типа и просеивают через стандарт- гими растительными маслами и, после соответствующей обработки экс-
ное сито. Дальнейшая переработка сухой биомассы зависит от вида выпус- тракта, кристаллический -каротин выделяли путем длительного процесса
каемой каротинсодержащей продукции. кристаллизации. При этом выход целевого продукта был невысок и, хотя
Кормовой препарат микробиологического каротина представляет со- маточные растворы использовались для получения другого продукта (ка-
бой мелкопластинчатую массу или сыпучий порошок, от оранжево- ротина в масле), потери этого ценного витамина были велики.
красного до красно-коричневого цвета, содержащий не менее 1 % Современная технология производства кристаллического -каротина
-каротина и не более 7 % влаги. Высушенную, растертую и просеянную основана на использовании в качестве экстрагента фреона. Этот раствори-
биомассу без дополнительной обработки фасуют в полиэтиленовые мешки тель весьма избирательно и полно экстрагирует -каротин из сухой био-
или барабаны и отправляют потребителю. массы, а затем легко удаляется из экстракта, образуя пересыщенные рас-
Каротин в масле. В эмалированный аппарат-экстрактор помещают творы -каротина в смеси липидов, из которых он кристаллизуется с ми-
сухую тонко измельченную биомассу и -каротина экстрагируют подсол- нимальными потерями. Для удаления органических примесей используется
нечным маслом или слабой мисцеллой, образующейся после промывки обработка спиртом кубового остатка после отгонки хладона и, чтобы из-
биомассы на фильтр-прессе. Для интенсификации процесса экстракции бежать выделение примесей, кристаллизацию ведут при температуре
применяют роторно-пульсационный генератор. 15 ± 5 °С.
После экстракции суспензию сжатым азотом подают на фильтр- Кристаллический -каротин представляет собой довольно крупные
пресс, где отделяют масляный экстракт от шрота, при этом получают кон- оранжево-красные с фиолетовым отливом кристаллы, температура плавле-
центрированную мисцеллу, содержащую до 1 % -каротина. Шрот на ния которых составляет 181–182 °С.
фильтре промывают подсолнечным маслом, тщательно отжимают сжатым Готовый продукт фасуют в плотно закрытые стеклянные банки тем-
азотом и полученную при этом слабую мисцеллу используют для экстрак- ного цвета, обернутые черной бумагой для защиты светочувствительного
ции свежих порций -каротина. -каротина.
Масляный экстракт (концентрированную мисцеллу) промывают эти- Потребителями кристаллического -каротина является пищевая про-
ловым спиртом, при этом извлекаются органические примеси, придающие мышленность, где он применяется в тех же целях, что и каротин в масле.
экстракту горький привкус. Спирт отделяется от экстракта в делительной Кроме того, этот продукт находит применение в медицине и ветеринарии
воронке и направляется на регенерацию, а экстракт для удаления остатков для производства некоторых лечебно-профилактических и витаминных
спирта и летучих примесей выдерживается в вакууме при температуре препаратов.
35 ± 5 °С и фильтруется для отделения возможного хлопьевидного осадка.
142 143
4.5. Производство L-аскорбиновой кислоты (витамин С) синтез аскорбиновой кислоты осуществляется енолизацией его важнейше-
го промежуточного продукта – 2-кето-L-гулоновой кислоты (2-KLG), ко-
Витамин С относится к широко распространенным в природе вита- торая в кислых условиях превращается в L-аскорбиновую кислоту. Ее,
минам. Наиболее важными его источниками для человека служат продук- 2-KLG, получают методом двухстадийного микробиологического синтеза,
ты растительного происхождения: овощи и фрукты. Много витамина С состоящего из окисления D-глюкозы в 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту
находится в перце, салате, капусте, хрене, рябине, черной смородине и (2,5-DKG – редуктаза) под действием Acetobacter, Gluconobacter или му-
особенно в цитрусовых. Из непищевых источников богаты витамином С тантного штамма Erwinia punctata) и биотрансформации последней под
шиповник, хвоя и др. Витамин С предохраняет человека от развития цин- действием Сorynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, синтезирующих
ги. У человека при недостатке витамина С отмечается похудание, общая фермент 2,5-DKG в 2-кето-L-гулоновую кислоту. При использовании этих
слабость, одышка, боли в сердце, сердцебиение. микроорганизмов выход целевого продукта составляет около 90 % от ис-
Синтез аскорбиновой кислоты (витамина С) является многоступен- ходного количества глюкозы. Предлагаемый метод постоянно совершен-
чатым процессом, в котором только одна стадия представлена биотранс- ствуется за счет совместного культивирования указанных микроорганиз-
формацией. Эта стадия трансформации D-сорбита в L-сорбозу при участии мов. Так, например, предложен способ, в котором первоначально штаммы
ацетатных бактерий. Для получения L-сорбозы используют глубинную культивировали отдельно на среде следующего состава: D-сорбита – 2,0 %,
ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращи- дрожжевой экстракт – 0,3 %, говяжий экстракт – 0,3 %, кукурузный экс-
вают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером тракт – 0,3 %, пептон – 1,0 %, мочевина – 0,1 %, KH2PO4 – 0,1 %,
(для усиления аэрации) и культивировании продуцента в течение 20–40 ча- MgSO47H2O – 0,02 %, CaCO3 – 0,1 %; рН среды до стерилизации 7,0–7,2.
сов с результатом по выходу L-сорбозы до 98 % исходного количества Питательную среду стерилизуют при 121 °С в течение 20 минут. Культи-
сорбита в среде. Обычно для достижения такого высокого выхода целевого вирование проводят в течение 24 часов при постоянном перемешивании
продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт при 220 об/мин и температуре 30 °С. Полученные культуры вносили в
в количестве около 20 %. По окончании ферментации L-сорбозу выделяют ферментер в количестве 10 % (равные объемы). Состав среды для основно-
из культуральной жидкости. Переход от периодического культивирования го процесса ферментации: D-сорбита – 8,0 %, кукурузный экстракт – 1,0 %,
продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному в аппарате колоночно- мочевина – 1,5 %, KH2PO4 – 0,1 %, MgSO47H2O – 0,01 %, CaCO3 – 0,6 %,
го типа увеличивает скорость образования L-сорбозы в 1,7 раза. Фермен- пеногаситель – 0,1 %; рН среды до стерилизации 7,0. Питательную среду
тацию Gluconobacter oxydans проводят на средах содержащих D-сорбит в стерилизовали при 121 °С в течение 20 минут, культивирование проводили
количестве 20 % при интенсивной аэрации 8–10 литров кислорода в час. при 30 °С и постоянном перемешивании при 180–700 об/мин в течение 96
Выход L-сорбозы может достичь 98 % за 1–2 суток. При достижении куль- часов (аэрация до 1 л/мин). В процессе культивирования значение рН под-
турой log-фазы можно дополнительно внести в среду D-сорбит до концен- держивается на постоянном уровне (6,5–7,0) с помощью 4НNа2СО3. Куль-
трации 25 %. тивирование проводят под контролем накопления 2-кето-L-гулоновой кис-
В настоящее время широкое использование биотехнологических лоты, которую определяли методом ВЭЖХ. Выход 2-KLG составлял 76,8
процессов позволяет совершенствовать синтез витамина С, путем сокра- % от используемого количества D-сорбита.
щения многоэтапных и дорогостоящих химических стадий. Например,

144 145
Одним из перспективных направлений может являться создание од- CH2OН CH2OН CH2OН
ного микроорганизма, синтезирующего все ферменты необходимые для
HO C H HO C H HO C H
превращения D-глюкозы в 2,5-DKG. Erwinia herbicola осуществляет пре- Каталитическое Сорбитолде- Химическое
вращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий, катализируемых раз- HO C H восстановление HO C H гидрогеназа HO C H окисление
ными ферментами. Для превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только H C OH H C OH H C OH
одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного H2 NAD NADH2 O2
HO C H HO C H HO C H
микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в
выделении гена 2,5-DKG-редуктазы Corynebacterium sp. и введении его в CHO CH2OН CHO
H 2О
Erwinia herbicola. При помощи генетических манипуляций метаболические D-глюкоза D-сорбитол L-сорбоза

реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуще-


ствить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать O C COONa CОOН
конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой орга-
HO C OH C ONa C O
низм можно использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменя- O Обработка
ющую первые три стадии в процессе получения L-аскорбиновой кислоты, HO C OH кислотой C ONa HO C H
который используется в настоящее время. H C H C OH H C OH
2H
На рис. 15 представлен промышленный синтез L-аскорбиновой кис- HO C H HO C H HO C H
лоты. Одна из стадий процесса, а именно превращение D-сорбитола в L-
сорбозу, осуществляется при участии бактерии Acetobacter suboxydans, ко- CH2OН CH2OН CH2OН

торая синтезирует фермент сорбитолдегидрогеназу. Остальные стадии 2-KLG, натриевая соль


L-аскорбиновая кислота (енольная форма) 2-KLG
представляют собой чисто химические реакции.

Рисунок 15 – Промышленный синтез L-аскорбиновой кислоты

4.6. Получение никотиновой кислоты (витамин РР)

Одним из наиболее распространенных биотехнологических способов


получения коферментной формы никотиновой кислоты – никотинамида-
денинуклеотида (НАД) является экстракция его из микроорганизмов, как
правило, пекарских дрожжей. Для повышения НАД в дрожжевых клетках
культивирование проводят на средах с предшественником синтеза никоти-
новой кислоты. Так, при добавлении в культуральную среду аденина или
самой никотиновой кислоты получают до 12 мг НАД на 1 грамм клеток.
Использование мутантных штаммов Brevibacterium ammoniagenes с одно-

146 147
временным изменением проницаемости мембран клеток микроорганизмов  Рибофлавин (витамин В2) – катализатор процессов клеточного
(коферменты через мембраны не проникают) с помощью поверхностно- дыхания и зрительной рецепции, играет важную роль в образовании ДНК,
активных соединений (цетилсульфата натрия) позволяет получать НАД до стимулирует процессы регенерации тканей;
6 г/л.  Пиридоксин (витамин В6) – в качестве кофермента принимает
участие в метаболизме аминокислот и белков в синтезе нейропептидов;
4.7. Витамины в составе лекарственных препаратов  Цианокобаламин (витамин В12) и фолиевая кислота принимают
участие в синтезе нуклеотидов, в процессе эритропоэза необходимы для
Субстанции витаминов широко используются в составе многих ле- функционирования нервной ткани и для роста организма;
карственных препаратов. В качестве примера можно привести данные о  Никотинамид принимает участие в процессах тканевого дыхания,
том, что в Украине зарегистрировано более 200 лекарственных препаратов,
липидного и углеводного обменах;
в состав которых входят витамины. Препараты выпускают в нескольких
 Аскорбиновая кислота (витамин С) – играет важную роль в регу-
формах: для инъекций, таблетки, капсулы, кремы, аэрозоли и др. Кроме
лировании окислительно-восстановительных процессов, обеспечивает син-
лекарственных препаратов, на рынке представлены средства для космети-
тез коллагена, принимает участие в синтезе стероидных гормонов и ка-
ки и биологически активные добавки, содержащие широкий спектр вита-
техоламинов, нормализует проницаемость капилляров, принимает участие
минов. Ряд фармацевтических предприятий специализируются на выпуске
в синтезе гемоглобина, повышает неспецифическую резистентность, обла-
данных видов продукции, например, фирма «Unipharm» выпускает серию
дает антидотными свойствами, оказывает влияние на обмен аминокислот
препаратов «Витрум», содержащих различные витамины. В Украине заре-
гистрировано более 20 препаратов данной серии. Препараты, содержащие ароматического ряда, метаболизм тироксина, биосинтез инсулина;
витамины выпускают в виде: монопрепаратов (содержат один витамин,  Альфа-токоферол (витамин Е) – обладает антиоксидантными
например, инъекционные формы аскорбиновой кислоты в виде 5 % или свойствами, обеспечивает защиту ненасыщенных жирных кислот в мем-
10 % растворов; рибофлавин в виде 1 % раствора; пиридоксина в виде 1 %, бранах клеток, снижает агрегацию тромбоцитов, угнетает синтез проста-
2,5 %, 5 % растворов и др.), комплексных препаратов, содержащих 2 и бо- гландина Е2, усиливает иммунные реакции, в том числе у пожилых людей;
лее витаминов.  Ретинол (витамин А) – незаменим для роста и репродукции, реге-
Приводим состав некоторых комплексных препаратов витаминов: нерации, для процессов роста и формирования костей (профилактика рахи-
«Витрум» – состав на одну мягкую желатиновую капсулу: та), нормального функционирования органов зрения. В сетчатке ретинол
β-каротин (1700 МЕ), α-токоферол (10 МЕ), колекальциферол (67 МЕ), ас- подвергается трансформации в цис-ретинол альдегид, который в реакции с
корбиновая кислота (40 мг), тиамин (2 мг), рибофлавин (2 мг), пантотено- опсином формирует фотопигмент родопсин – жизненно важное соедине-
вая кислота (10 мг), пиридоксин (5 мг), фолиевая кислота (133 мкг), циано- ние для адаптации глаза в сумеречном зрении, повышает резистентность
кобаламин (4 мкг), никотинамид (10 мг), биотин (133 мкг), холин (50 мг). организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.
«Витакап» – состав на одну мягкую желатиновую капсулу:  Колекальциферол (витамин D3) – регулирует обмен кальция и
α-токоферол (15 МЕ), колекальциферол (400 МЕ), аскорбиновая кис- фосфора в организме;
лота (75 мг), тиамин (5 мг), рибофлавин (5 мг), пиридоксин (2 мг), фолие-  Пантотенат кальция (витамин В5) – стимулирует образование
вая кислота (1000 мкг), цианокобаламин (5 мкг), никотинамид (45 мг), ре- кортикостероидов. Как составная часть кофермента А, обеспечивающего
тинол (5000 МЕ). процессы ацетилирования, участвует в углеводном и жировом обмене,

148 149
синтезе ацетилхолина. Оптимизирует энергетическое обеспечение сокра- Заключение
тительной функции миокарда, улучшает процессы регенерации.
В последние годы современная биотехнология развивалась необычно
Требования к качеству препаратов витаминов изложены в Государ-
динамично, особенно в области создания биотехнологических процессов.
ственной Фармакопее Украины и Европейской фармакопеи.
Для количественного определения ряда витаминов: α-токоферол (ви- Развитие биотехнологического производства витаминов определяется ря-
тамин Е), ретинол (витамин А), колекальциферол (витамин D3) и др. вве- дом причин.
дено понятие международный единицы (МЕ). При определении количества Важнейшим вопросом является создание и селекция новых высоко-
выделенного витамина обычно в качестве эталона используют химически эффективных штаммов-продуцентов витаминов. Выделенные штаммы-
чистый препарат с заранее известной величиной концентрации. МЕ – это продуценты витаминов часто вариабельны и нестабильны. Поэтому мето-
активность определенного весового количества витамина, принятого за дом селекции отбирают наиболее перспективные штаммы, а затем прово-
эталон. Ряд витаминов в препарате указывают в весовом количестве (мг): дят отбор индуцированных мутантов. Мутантное действие на микроорга-
аскорбиновая кислота – витамин С, рибофлавин – витамин В2, тиамин – низмы достигается применением различных источников (УФ-лучи, рентге-
витамин В1 и др. новские лучи, химические вещества и др.). Весьма перспективным являет-
Для определения содержания витаминов в лекарственных формах ся получение новых витаминов путем создания генно-инженерных продук-
используют методы: тов, в частности, рекомбинантных штаммов-продуцентов. Большой эффект
 ретинол (витамин А) – спектрофотометрически при длине волны может дать технология рекомбинантных ДНК. При помощи генетических
325 нм или при длине волны 620 нм (цветная реакция с хлоридом сурьмы); манипуляций метаболические реакции, протекающие в разных микроорга-
 тиамин (витамин В1) – флуориметрически при длине волны низмах можно осуществить в одном из них. Примером такого генно-
436 нм; инженерного штамма может быть полученный штамм-продуцент, синтези-
 рибофлавин (витамин В2) – флуориметрически при длине волны руемый L-аскорбиновую кислоту. Этот гибрид приобрел способность син-
440 нм; тезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути.
 пиридоксин гидрохлорида (витамин В6) – спектрофотометрически Усиление продукции пантотената (витамин В5) основано на исполь-
при длине волны 600 нм (цветная реакция);
зовании рекомбинантных микроорганизмов характеризующихся высокой
 цианокобаламин (витамин В12) – используют микробиологиче-
ферментативной активностью и обеспечивающих получение пантотената с
ский метод, например, с E. coli 113-3 в качестве тест-микроорганизма
высоким выходом.
(определяют диаметры зон стимуляции роста тест-микроорганизма иссле-
Постоянно проводятся исследование по поиску альтернативных ис-
дуемым препаратом и стандартным образцом);
точников биотехнологического получения витаминов. Так, например,
 кислота никотиновая (витамин РР) – спектрофотометрически при
установлено, что микроводоросли Chlamydomonas способны синтезировать
длине волны 440 нм (по цветной реакцией);
тиамин (витамин В1) в количестве 71–90 мг/кг биомассы водорослей по су-
 кислота аскорбиновая (витамин С) – титрометрически;
хому весу, что позволяет считать водоросли альтернативным источником
 -токоферол ацетат (витамин Е) – спектрофотометрически при
получения тиамина. Установлено, что штамм Saccharomyces oviformis
длине волны 520 нм (цветная реакция).
Y-2635, выращенный на среде с использованием геотермальной воды от-

150 151
личается повышенной внутриклеточной концентрацией водорастворимых ловека. Сегодня известные липосомы, содержащие как водорастворимые
витаминов группы В. В ряде случаев для получения витаминов проводят (витамин С и группа витаминов В), так и жирорастворимые (витамины А
обработку культуры микроорганизмов определенными агентами. Так, и Е) витамины. Преимуществом липосомальной формы является их легкое
например, культура Bacillus natto была обработана расчетным количеством проникновение в кожу. Липосомы быстро усваиваются, взаимодействуя с
хитозана, отфильтрована, сконцентрирована и высушена. Культивирование фосфолипидами клеточных мембран, обогащая кожу липидами и высво-
проводится в аэробных условиях при 32–34 °С в течение 72–96 часов. По- бождая витамины, например, ретинол, α-токоферол, коэнзим Q10. Указан-
лучен витамин К2 в количестве 2 мкг/г сухой массы продуцента. ные вещества в липосомах проникают в кожу на такую глубину, на кото-
Необходимо остановится на трансгенных растениях, продуцирую- рую они сами продиффундировать не способны. Например, витамин А
щих в качестве вторичных метаболитов витамины. Растения, трансформи- способствует обновлению рогового слоя, тем самым активируя регенера-
рованные химерным геном, кодирующим фермент биосинтеза витамина Е тивные процессы в клетках. Витамин С в липосомах полностью сохраняет
также является перспективным альтернативным источникам получения свою активность и хорошо проникает в кожу, стимулирует синтез коллаге-
α-токоферола. на, восстанавливает липидный барьер кожи, предотвращает старение кожи.
Развитию производства витаминов также способствуют достижения Кроме того, при попадании в организм липосомальные лекарственные
в создании оригинальных технологических схем с использованием формы витаминов обладают выраженным пролонгированным действием
высокотехнологического оборудования. За последние годы предложены по сравнению со свободными формами витаминов. Липосомы, содержа-
биотехнологические установки для производства субстанций витаминов. щие витамины сливаются с наружной мембраной клеточной стенки и про-
Так, например, в Европе на разработке таких установках специализируется никают во внутрь. По нашему мнению, в ряде случаев, липосомальная
фирма «Uhde» (Германия). Первоначальное компьютерное моделирование форма витаминов позволит расширить их применение в клинике.
планируемой установки позволяет определить узкие места технологии и Таким образом, развитие биотехнологических исследований, созда-
упростить расчет реакторов и емкостей. Имитационная модель описывает ние новых штаммов продуцентов витаминов, включая рекомбинантные,
культивирование клеток с их последующим сбором и переработкой, а так- разработка технологических схем и производство высокоэффективного
же отображают такие функциональные шаги, как подготовка систем оборудования, расширяет номенклатуру лекарственных форм и состав
CIP/SIP, приготовление вспомогательных и питательных сред, промежу- препаратов и даёт возможность увеличения выпуска субстанций витами-
точных продуктов, деактивирования и утилизации. Предложены опти- нов и их готовых лекарственных форм.
мальные схемы концентрации и очистки полупродуктов, позволяющие по-
лучать витамины высокой степени чистоты.
Необходимо становиться еще на одном направлении: создании ори-
гинальных лекарственных препаратов, содержащих витамины, что подра-
зумевает создание как продуктов с новым составом, так и препаратов на
основе различных форм, например, наночастиц. Весьма перспективной яв-
ляется липосомальная форма витаминов, открывающая значительные воз-
можности для более эффективного воздействия витаминов на организм че-
152 153
Контрольные вопросы ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ
ГОРМОНАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
1. По каким критериям классифицируют витамины?
2. Какие методы получения витаминов Вам известны?
5.1. Производство препаратов инсулина
3. Почему получение витаминов биотехнологическими методами
экономически целесообразно? Инсулин – гормон белковой природы, вырабатываемый -клетками
4. Назовите штаммы бактерий продуцентов витаминов: аскорбино- островков Лангерганса поджелудочной железы для поддержания гомеоста-
вой кислоты, рибофлавина, цианокобаламина и охарактеризуйте их. за глюкозы в крови. Кодируют этот белок 70 % мРНК, выделенных из этих
клеток. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или
5. Укажите роль штаммов пробиотиков в синтезе витаминов.
наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом. Это
6. Проведите анализ технологии получения витамина В2 и укажите системное заболевание, неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а
методы межоперационного контроля. без лечения – к смерти.
7. Какие питательные среды используют для культивирования Известно, что человеческий инсулин представляет собой полипептид
с молекулярной массой 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые
штаммов-продуцентов витаминов (цианокобаламина, рибофлавина, аскор-
образуют две полипептидные цепи, соединенные дисульфидными мости-
биновой кислоты и др.)? ками. Одна цепь, называемая А содержит 21 аминокислоту, вторая цепь –
8. Какими фармакопейными методами проводят определение вита- В содержит 30 аминокислотных остатков. Аминокислотный состав цепей
минов в лекарственных препаратах? видоспецифичен. Пептидные цепи А и В соединены посредством двух ди-
сульфидных мостиков (-S-S-), которые необходимы для проявления гор-
9. Какова роль витаминов в жизнедеятельности организма?
мональной активности инсулином (их разрушение приводит к потере ак-
10. В каких лекарственных формах производят витаминные препара-
тивности). Предшественник инсулина продуцируется внутри -клеток по-
ты для медицины и ветеринарии? средством ДНК и РНК-управляемого синтеза. Синтезируется инсулин в
11. Проанализируйте технологическую схему получения витами- виде одноцепочечного предшественника – препроинсулина (107 амино-
кислотных остатков), содержащего концевой сигнальный пептид (23 ами-
на D2 – эргокальциферола.
нокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид).
12. Что означает гетероталлизм и какую роль он играет в получении
При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из
-каротина? 86 аминокислотных остатков, в котором цепи инсулина (А и В) соединены
13. Опишите технологическую схему получения витамина С – аскор- С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыка-
нии дисульфидных связей. Длинная цепь проинсулина в аппарате Гольджи
биновой кислоты.
упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре
14. Какими методами проводят очистку и концентрацию витаминов? аминокислоты с образованием инсулина и связывающего С-пептида. Ин-
15. Укажите основные методы идентификации и контроля препара- сулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секретируются в ответ
тов, содержащих витамины. на все стимуляторы секреции инсулина (глюкоза, манноза). После протео-

154 155
литического отщепления С-пептида образуется инсулин. В гранулах  1935 г. – Хагедорн Г. Х. в Дании оптимизировал действие инсулина
-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, состоящих из двух в организме, предложив пролонгированный препарат – протамин-цинк-
атомов цинка и шести молекул инсулина. Цинк, концентрация которого в инсулин (вводили один раз в сутки);
-клетках островков Лангерганса достигает высоких значений, формирует  1952 г. – получен гомогенный кристаллический инсулин, называе-
комплексы с инсулином. Инсулин всех позвоночных образует димеры с мый однокомпонентным;
помощью водородных связей между пептидными группами остатков В24 и  1954 г. – английский биохимик Сенджер Г. получил Нобелевскую
В26 двух мономеров, которые при высоких концентрациях гормона, в
премию за установление структуры инсулина;
свою очередь, реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цин-
 1963–1965 г.г. – тремя коллективами исследователей в США, Китае
ка в каждом. Наличие таких высокоупорядоченных комплексов суще-
и ФРГ, а в начале 70-х годов советскими учеными осуществлен синтез
ственно облегчило изучение кристаллической структуры инсулина. При
обеих цепей и их соединение дисульфидными связями для получения ин-
физиологических концентрациях инсулин находится в мономерной форме.
Сахарный диабет по распространенности и тяжести занимает третье сулина. Данный метод синтеза не нашел промышленной реализации в свя-
место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. зи с низким выходом, высокой ценой и сложностью проведения синтеза
Учитывая тяжесть заболевания диабетом, становится понятным, по- полипетидного гормона, состоящего из десятков аминокислотных остат-
чему уже более 100 лет проводятся разноплановые исследования по созда- ков;
нию и изучению препаратов инсулина. В связи с этим представляет инте-  1980 г – датская компания «Novo» разработала метод превращения
рес история создания лекарственных препаратов инсулина: инсулина свиньи в инсулин человека путем ферментативного замещения
 1902 г. – русский врач И. М. Соболев установил, что уровень саха- 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. В дальнейшем прово-
ра в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной дили хроматографическую очистку продукта, чистота которого была не
железы;
ниже 99 %. Оба инсулина не отличались по активности и времени дей-
 1921 г. – впервые инсулин был выделен из поджелудочной железы
ствия.
в чистом виде канадскими учеными Бантингом Ф. и Бестом Ч., и применен
Только в конце 50-х, начале 60-х годов ХХ века были выяснены от-
в Торонто с высоким эффектом для лечения 10-летнего мальчика, больного
личия структуры человеческого инсулина от инсулинов животного проис-
диабетом;
 1923 г. – фирмой «Eli Lilly» (США) промышленно получен инсулин хождения, которые вызывали аллергические реакции. Результаты данных
из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин из исследований легли в основу разработок промышленного получения инсу-
крупного рогатого скота обладает несколько большей антигенностью для лина человека. В настоящее время основными способами получения инсу-
человека по сравнению со свиным инсулином (из 1200 кг поджелудочной лина, идентичного человеку, являются полусинтетический и генно-
железы возможно получить около 100 г кристаллического инсулина). Ин- инженерный.
сулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается тре- Возможность создания человеческого инсулина стала реальной толь-
мя аминокислотами от инсулина человека, свиной – одной аминокислотой. ко после установления факта, что биосинтез инсулина в -клетках остров-
Инсулин, выделенный из поджелудочной железы животных, использовали
ковой ткани происходит по следующим основным этапам:
до начала 80-х годов XX века;
 закодированная информация о структуре инсулина содержится в
гене инсулина (участок ДНК) 11-й хромосомы;
156 157
 в результате стимулирующего действия, прежде всего глюкозы и В 1980 году У. Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из
некоторых других веществ, эта информация списывается РНК- опухоли -клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной
полимеразой с инсулинового гена в виде мРНК на рибосомах, в которых транскриптазы получили с неё кДНК. Полученную кДНК встроили в плаз-
осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. На рибо- миду pBR322 E. Coli, в среднюю часть гена пенициллиназы. Рекомбинант-
сомах происходит сборка полипептидной цепи из 109 аминокислот с обра- ная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина. В резуль-
зованием препроинсулина под влиянием рестриктаз, в результате образу- тате трансляции мРНК в клетках синтезировался гибридный белок, содер-
ются фрагменты от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов; жащий последовательности пенициллиназы и проинсулина, который вы-
 при синтезе препроинсулина в -клетках поджелудочной железы щепляли из такого белка трипсином.
первые 23 аминокислоты «проводят» молекулу через мембрану клетки. В 1980 году американскими учеными Миллером и Бакстером был
Эти аминокислоты отщепляются рестриктазами и образуется пептид про- впервые описан процесс клонирования человеческого гена в E. Coli с по-
инсулин, состоящий из 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачи- следующей индукцией и получением белка инсулина, идентичного челове-
вается таким образом, что начальный и конечный её сегменты сближаются, ческому.
а центральная часть молекулы удаляется под влиянием фермента рестрик- В промышленных условиях рекомбинантный инсулин впервые был
ции. получен американской фармацевтической компанией «Eli Lilli» совместно
Работы по генно-инженерному получению инсулина начались с с биотехнологической компанией «Genentech» (США) и продукт был вы-
1978 года, когда появилось сообщение (США) о получении штамма ки- пущен на рынок в 1982 г. При производстве человеческого инсулина ис-
шечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин. пользована технология рекомбинантных ДНК: помещают кДНК гена чело-
В 1978 году были синтезированы отдельные цепи человеческого ин- веческого проинсулина в E. Coli или S. serevisae и гидролизуют получен-
сулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli. ный проинсулин до молекулы инсулина.
Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3′-концу ге- В это же время компания «Novo-Nordisk» (Дания) разработала тех-
на фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). нологию получения генно-инженерного инсулина человека, основанную на
Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмида- использовании генетически модифицированных дрожжевых культур в ро-
ми, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента ли суперпродуцентов инсулина человека. Использование эукариот, имею-
-галактозидазы и A или B пептида инсулина, присоединенного к ней че- щих сходную с человеческой систему процессинга белков в роли проду-
рез остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пеп- центов инсулина, позволило получить гормон или его предшественник в
тид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между об- нативной форме. Значительным преимуществом данной технологии явля-
разованными цепями инсулина происходило с трудом. ется полное отсутствие в препаратах бактериальных токсинов и пирогенов
В 1981 году синтезирован ген-аналог проинсулина – мини клеточной стенки. Несмотря на все эти преимущества, получение инсулина
С-проинсулин, в котором 35-звенный С-пептид был заменен на сегмент из с использованием бактериальных штаммов суперпродуцентов остается бо-
шести аминокислот: Арг-Арг-Гли-Сер-Лиз-Арг и показана его экспрессия лее предпочтительным благодаря более высокому уровню экспрессии ин-
в E. Coli. сулина в составе гибридного белка.

158 159
В настоящее время генно-инженерный инсулин производят путем Культивирование штамма продуцента E. Coli JM109/pPINS07
ферментации генетически измененных микроорганизмов: кишечной па-
лочки или дрожжей, которые способны синтезировать предшественник ин- Разрушение клеток
сулина (проинсулин) в составе химерного протеина. Из полученного био-
синтетическим путем промежуточного продукта реконструируют инсулин Отделение осадка гибридного белка-сырца центрифугированием
человека (энзиматическим путем) по следующей схеме: культивирование
штамма со встроенным геном гибридного белка, включающим полную по- Растворение гибридного белка с одновременным восстановлением нерегулярных S-S
следовательность инсулина человека; очистка и ренатурация гибридного
Ренатурация гибридного белка с образованием правильных S-S
белка; протеолитическое расщепление гибридного белка с получением ин-
сулина; очистка инсулина. Данная схема во многом напоминает процесс
Хроматографическая очистка гибридного
биосинтеза инсулина в островках Лангерганса, где гормон сначала появля- белка на ионообменном сорбенте (КМ-сефароза)
ется в виде белка-предшественника (проинсулина), а потом протеолитиче-
скими ферментами от проинсулина отщепляется соединительный Гидролиз гибридного белка трипсином (получение диаргинининсулина)
С-пептид. В производстве для расщепления гибридного белка используют
сходные по специфичности ферменты: трипсин и карбоксипептидазу В. Хроматографическая очистка диаргинининсулина
на ионообменном сорбенте (SP-Sepharose FF)
Гидролиз производят путем обработки ферментами последовательно или
одновременно. Концентрирование фракций, содержащих 90% диаргинининсулина
Примером получения рекомбинантного инсулина является техноло-
гия, предложенная российскими учеными из ОАО «Национальные биотех- Трансформация диаргинининсулина карбоксипептидазой В
нологии», Института биоорганической химии РАН и Государственного (получение первичного инсулина)

института кровезаменителей и медицинских препаратов. Ими был создан


Очистка первичного инсулина методом обращено-фазовой
штамм-продуцент гибридного белка E. Coli JM109/pPINS07. ВЭЖХ до чистоты более 96 %
На рис. 16 представлена биотехнологическая схема получения ре-
комбинантного инсулина. Хроматографическая очистка генно-инженерного инсулина человека
от высоко- и низкомолекулярных примесей при помощи
гель-фильтрации

Кристаллизация и перекристаллизация инсулина в


присутствии ионов Zn+2

Сушка кристаллов Zn-инсулина

Рисунок 16 – Биотехнологическая схема получения рекомбинантного


инсулина
160 161
Как видно из приведенной схемы из выращенной биомассы выделя- JM109/pНINS11. По мнению авторов, использование предложенного ими
ется предшественник инсулина, гибридный белок, экспрессируемый в ко- штамма имеет ряд преимуществ перед штаммом E. Coli JM109/pPINS07,
личестве 40 % от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. который рассматривался нами ранее. Так, согласно рис. 16 видно, что при
Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последова- использовании штамма E. Coli JM109/pPINS07 получение рекомбинантно-
тельности, что и in vivo – отщепляется липидирующий полипептид, пре- го инсулина сводится к следующему: культивирование штамма-
проинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфи- продуцента E. Coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток
толиза с последующим восстановительным замыканием трёх дисульфид- дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный бе-
ных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. Как лок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, кис-
видно из схемы, для очистки инсулина используют различные виды хрома- лотное осаждение примесных соединений, очистку гибридного белка хро-
тографических очисток: ионообменные, гельфильтрационные и ВЭЖХ, матографией на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и
что позволяет получить инсулин высокой степенью чистоты. Использова- карбоксипептидазой В осуществляют последовательно, при этом продукты
ние аффинной хроматографии значительно снизило содержание в препара- трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, а полученную после
те балластных белков с молекулярной массой большей, чем у инсулина. К расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом
этим белкам относится проинсулин и частично расщепленные проинсули- обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ
ны, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител. ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией. В данном методе, по мнению
Особую роль играет обращено-фазовая ВЭЖХ. Использование ВЭЖХ яв- авторов, присутствует многостадийная технологическая цепочка. Кроме
ляется предпочтительным в крупномасштабном производстве, поскольку того, последовательное расщепление гибридного белка трипсином и кар-
метод лишен ряда недостатков, присущим другим видам хроматографии боксипептидазой В требует и последовательных хроматографических очи-
(например, ионно-обменную хроматографию отличает длительность сток диаргинин-инсулина после триптического гидролиза гибридного бел-
очистки за счет низких значений давления; высокая себестоимость метода ка и инсулина после расщепления карбоксипептидазой В, которые приво-
за счет низкой емкости сорбентов и их высокой стоимости). Определяю- дят к значительным потерям конечного продукта. Необходимо также отме-
щими факторами при проведении обращено-фазовой ВЭЖХ являются: рН тить, что использован штамм-продуцент E. Coli JM109/pPINS07, несущий
подвижной фазы, температура, добавки для введения в подвижную фазу, рекомбинантную плазмиду pPINS07, которая кодирует гибридный белок с
максимальная нагрузка на хроматографическую колонку и др. Одной из высокой долей лидерного пептида, составляющего около 50 %. Поэтому
основных проблем в производстве генно-инженерного инсулина человека использование данного штамма при получении инсулина удорожает про-
является очистка инсулина от родственных пептидов, в частности от цесс производства из-за повышения затрат на биосинтез и снижает выход
А21-дезамидоинсулина, отличающегося от инсулина дезамидированным целевого продукта.
аспарагином в 21-ом положении А цепи. Содержание инсулиноподобных Преимуществом созданной плазмиды pНINS11 является то, что она
примесей и А21-дезамидоинсулина в фармакопейных субстанциях инсу- обеспечивает более высокий выход конечного продукта инсулина за счет
лина человека жестко регламентируется. повышения выхода правильно свернутого гибридного белка после его ре-
В Российской Федерации вопросами получения генно-инженерного натурации.
инсулина занимается ряд ученых, в том числе, и специалисты ОАО «Наци- Полученный штамм-продуцент E. Coli JM109/pНINS11 характери-
ональные биотехнологии». Ими предложена промышленная схема получе- зуется следующими признаками:
ния препарата инсулина человека на основе штамма E. Coli

162 163
1. Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной фор- 4,2 т.п.о. при помощи электрофореза в 0,8 % геле легкоплавкой агарозы.
мы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1 х 3,5 мкм, подвижные Далее ДНК депротеинизируют фенолом, смесью фенола с хлороформом
с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза ги- (1 : 1), хлороформом, и осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл
бридного белка; воды. Полученный BcII-BamHI фрагмент, содержащий ген гибридного
2. Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB белка и векторную плазмиду pYINS05, лигируют с 20-кратным молярным
колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие серые. Край ров- избытком олигонуклеотидного дуплекса, полученного в результате отжига
ный, диметр колоний 1–3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких синтетических нуклеотидов oligo-link24A (SEQ ID NO:4) и oligo-link24B
средах характеризуется ровным помутнением. (SEQ ID NO:5).
3. Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температу- б) Компетентные клетки штамма E. Coli JM109 трансформируют ли-
ре 4–42 °С, оптимум рН 6,8–7,6. В качестве источника азота используют гированной смесью (10 мкл) и высевают на LB-агар, содержащий
как минеральные соли аммония, так и органические соединения: амино- 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших колоний выделяют плазмидную
кислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника уг- ДНК и секвенируют между сайтами рестриктаз EcoRI и BamHI для под-
лерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, тверждения вставки в линкерную часть гена гибридного белка. В результа-
аминокислоты; те получают плазмиду pHINS09.
4. Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма продуцента про- с) Для получения плазмиды с делецией по rор-гену (негативного ре-
являют устойчивость к ампициллину (до 500 мкг/мл), обусловленную гулятора копийности) к 5 мкг плазмидной ДНК pHINS09 в 20 мкл буфера
наличием в плазмиде гена -лактамазы (bIa); добавляют 10 ед. рестриктазы Eco47III и SnaI, генерирующие «тупые»
5. Стабильность плазмиды в штамме: при поддержании клеток в концы, и смесь инкубируют в течение 1 часа при 37 °С. Далее ДНК депро-
течение нескольких месяцев на агаризованной среде LB, содержащей ам- теинизируют фенолом, смесью фенола с хлороформом (1 : 1), хлорофор-
пициллин, не наблюдается потери или перестройки плазмиды, влияющей мом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл воды. Получен-
на экспрессию гибридного белка; ную таким образом ДНК лигируют в 30 мкл буфера для лигирования в
В конструированном штамме гибридный белок после индуцирован- присутствии 5 ед. ДНК лигазы фага T4 в течение 16 часов при 8 °С. Лиги-
ной экспрессии накапливается в виде телец включения и его содержание рованной смесью (10 мкл) трансформируют компетентные клетки штамма
составляет не менее 30 % от общего белка клетки. E. Coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампицилли-
Рассмотрим технологическую схему получения генно-инженерного на. Отбирают бактериальные клоны, несущие плазмидную ДНК размером
инсулина при использовании штамма-продуцента E. Coli JM109/pНINS11. 3,6 т.п.о. Выделенные плазмиды подвергают рестрикционному анализу и
1. Конструирование плазмиды pНINS11. секвенируют по методу Сенгера. В результате получают плазмиду
а) Плазмиду pHINS11 конструируют на основе известной плазмиды pHINS11.
рHINS05. Плазмидную ДНК pHINS05 подвергают исчерпывающему гид- d) Плазмидой pHINS11 трансформируют компетентные клетки
ролизу рестриктазами BeII и BamHI. Для этого 5 мкг плазмидной ДНК штамма E. Coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ам-
pHINS05 в 20 мкл буфера, содержащего 33мМ трис-ацетата, рН = 7,9; пициллина. Отдельно локализованную колонию трижды пересевают на
66 мМ K-ацетата, 10 мМ Mg-ацетата, 0,1 мг/мл БСА и 10 ед. рестриктазы чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученной
BeII и BamHI инкубируют 1 час при температуре 37 °С. Из полученного моноклоновой культурой инокулируют 5 мл жидкой среды LB с ампицил-
гидролизата выделяют BcII-BamHI фрагмент ДНК размером около

164 165
лином и инкубируют в течение ночи при интенсивном встряхивании при могенат клеток пропускают через проточную центрифугу (g = 18000). Ос-
37 °С. новная масса телец включения (не менее 90 %) осаждается в роторе цен-
Полученный штамм-продуцент E. Coli JM109/pHINS11 хранят в 20 % трифуги. Влажный осадок телец включения (2,6 кг) выгружают из ротора
глицерине при минус 40 °С. центрифуги, замораживают и хранят при минус 40 °С. Потери гибридного
2. Выращивание биомассы штамма-продуцента E. Coli белка при выделении телец включения не превышают 15 %.
JM109/pНINS11. 4. Растворение телец включения, содержащих гибридный белок, и
Культивирование клеток штамма E. Coli JM109/pНINS11 для полу- ренатурация гибридного белка.
чения инокулята и основного выращивания проводят на питательной среде В реактор объемом 30 л, заполненный 18 л буферного раствора, со-
следующего состава (г/л): гидролизат казеина соляно-кислотный – 30; экс- держащего 0,1 М трис-HСl, рН 8,0 и 8 М мочевины, загружают 1,8 кг пас-
тракт пекарских дрожжей – 14; двузамещенный фосфат калия трех- ты телец включения и включают перемешивающее устройство. После рас-
водный – 6; однозамещенный фосфат калия – 3; сульфат магния – 0,5; глю- творения телец включения в реактор добавляют дитиотреитол до конечной
коза – до 50; ампициллина натриевая соль – 0,05; вода очищенная до 1 л. концентрации 10 мМ и продолжают перемешивание в течение 10–12 ч при
Посевные культуры готовят в количестве 1/10 от объема засеваемой пита- 15 °С. Количество гибридного белка в растворе составляло 174 г.
тельной среды и выращивают до оптической плотности 7–8 единиц при В реактор с охлаждением объемом 250 л заливают 160 л глицин-
длине волны 540 нм, длина оптического пути 10 мм, рН культивирования NaOH буфера, рН 9–11 и охлаждают его до температуры 10–14 °С. После
6,9 ± 0,2 (корректировку проводят добавлением глюкозы и щелочи), дли- охлаждения буферного раствора в реактор подают раствор гибридного
тельность 4–6 часов; рО2 – 40 ± 15 %. белка с восстановленными дисульфидными связями. В течение 20–24 ч
Выращивание основной культуры проводят в ферментере емкостью инкубируют раствор гибридного белка, перемешивая и поддерживая тем-
150 л с 90 литрами питательной среды. Объем инокулята – 10 л. Культиви- пературу в реакторе 10–14 °С. После ренатурации гибридного белка с об-
рование проводят при следующим параметрах: температура 36,5 ± 0,5 °С; разованием правильно замкнутых S-S связей (контроль ОФ ВЭЖХ) прово-
рН 6,7–7,1; рО2 – 40 ± 15 %. Для индукции биосинтеза гибридного белка в дят кислотное осаждение примесных белков путем подкисления реакцион-
середине логарифмической фазы роста культуры при оптической ной среды в реакторе до рН 4,0–4,5 раствором соляной кислоты. Останав-
плотности 7–9 единиц вносят индуктор – 1-изопропил--D-1-тиогалакто- ливают перемешивание и через 4–5 ч супернатант осветляют на микро-
пиранозид. Культивирование продолжают до образования внутриклеточ- фильтрационной установке. Содержание ренатурированного гибридного
ных включений гибридного белка («телец включения» – ТВ) у 90–95 % белка в осветленном супернатанте составляет 85 г.
клеток. Экспресс-контроль процесса накопления ТВ осуществляют с по- 5. Очистка ренатурированного гибридного белка на КМ-сефарозе.
мощью фазово-контрастной микроскопии препаратов. Правильно свернутый гибридный белок сорбируют из фильтрата на
3. Выделение телец включения. ионно-обменную колонку объемом 5 л, заполненную КМ-сефарозой, пред-
Рост культуры в ферментере останавливают путем резкого сокраще- варительно уравновешенную 0,05 М Na-ацетатным буфером, рН 4,0–5,5.
ния интенсивности перемешивания, культуру охлаждают до 10–14 °С и Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом 0,1–0,6 М хлори-
концентрируют на сепараторе в 8–10 раз. В полученную суспензию добав- дом натрия в 0,05 М Na-ацетатном буфере, рН 4,0–5,5, содержащем 1,5 М
ляют трис-основной до концентрации 0,1 М, мочевину – до 1,5 М, ЭДТА – мочевины. Фракции, содержащие гибридный белок с чистотой не менее
до 1 мМ. Забуференную до рН 6,8–7,0 суспензию трижды пропускают че- 95 % (контроль методом ОФ ВЭЖХ), объединяют и используют для даль-
рез гомогенизатор при давлении 700–800 атм и температуре 15–20 °С. Го-

166 167
нейшей работы. В результате получают 63 г ренатурированного гибридно- значениях рН, подвергаются агрегации, что ухудшает качество продукта.
го белка с чистотой не ниже 90 %. Инсулин образует фибриллы при концентрации свыше 5 г/л в водных рас-
6. Совместный гидролиз гибридного белка трипсином и карбокси- творах, причем показано, что средняя молекулярная агрегатов может варь-
пептидазой В и очистка инсулина на СП-сефарозе. ировать от 10 до 200 кDa. Вид агрегации зависит от рН, температуры ион-
Расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б ной силы и природы органического растворителя. Так, при 25 °С в 3,5 М
проводят в реакторе из нержавеющей стали с охлаждением объемом 30 л, растворе уксусной кислоты (рН 2,6) инсулин существует преимущественно
снабженным перемешивающим устройством. В реактор вносят 13 л рас- в виде мономеров, что подтверждено при турбидиметрическом методе
твора гибридного белка, раствор охлаждают до 4–8 °С и доводят значение (длина волны 400 и 350 нм) Однако при снижении рН раствора до 2,0 или
рН раствора до 7,2–7,3 добавлением 1 М раствора трис-основного. Затем в при повышении температуры до 60 °С инсулин быстро образует волокни-
раствор вносят раствор трипсина и карбоксипептидазы В в массовом соот- стые структуры, которые со временем превращаются в нерастворимые аг-
ношении: гибридный белок : трипсин : карбоксипептидаза В – регаты. Предполагается, что кислая реакция среды ускоряет агрегацию пу-
2000 : 1 : 1,25. Реакцию гидролиза проводят в течение 10–12 часов, кон- тем образования заряженного окружения белковых молекул, в котором
тролируя методом ОФ ВЭЖХ накопление инсулина в гидролизате. Реак- увеличиваются силы притяжения между молекулами инсулина. В резуль-
цию расщепления останавливают, подкисляя гидролизат до рН 3,2–3,6 тате проведенных исследований установлено, что инсулин склонен к обра-
10 % -ным раствором соляной кислоты. В реактор добавляют хлористый зованию нерастворимых агрегатов, фибрилл, в растворах с рН 2,5–3,5.
калий до концентрации 40 мМ. Полученный раствор наносят на хромато- Наиболее интенсивно образование фибрилл протекает в растворах, содер-
графическую колонку объемом 5 л, заполненную СП-сефарозой, предвари- жащих такие неорганические кислоты, как азотная, ортофосфорная, серная
тельно уравновешенную буфером: 2 М мочевина, 0,1 М аммоний ацетат, или соляная. Подобная агрегация инсулина значительно снижает как каче-
рН – 3,6. Промывку колонки проводят тем же буфером. Элюцию сорбиро- ство очистки, так и срок эксплуатации сорбентов для хроматографии. Оп-
ванного инсулина проводят линейным градиентом хлористого калия от тимальной подвижной фазой, обеспечивающей минимальную способность
0 до 0,5 М в уравновешивающем буфере. Объединяют фракции, содержа- инсулина к агрегации, является подвижная фаза, включающая уксусную
щие 13,2 г инсулина с чистотой не менее 95 % (контроль методом ОФ кислоту. При этом увеличивается срок эксплуатации сорбентов.
ВЭЖХ). В молекуле инсулина обнаружены области, играющие повышенную
7. Получение высокоочищенного инсулина методом препаративной роль в его физико-химических и биологических свойствах. При внесении
обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией. мутационных изменений в аминокислотную последовательность этих об-
В подготовленную колонку при помощи насоса для подачи пробы из ластей существенным образом меняются свойства молекулы в целом. Уда-
емкости подают раствор инсулина с предыдущей стадии очистки в количе- лось получить аналоги с модификацией В-цепи, что приводит к значитель-
стве 13,2 г белка. Регистрацию процесса разделения ведут при 220 нм на ному увеличению гормональной активности по сравнению с природным
проточном спектрофотометре. Собранные фракции основного пика инсу- инсулином.
лина анализируются на содержание примесей методом ОФ ВЭЖХ. Контроль качества генно-инженерного инсулина предполагает кон-
После очистки получают 11,4 г высокоочищенного инсулина челове- троль дополнительных показателей, характеризующих стабильность ре-
ка с содержанием основного вещества 98 %. комбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетиче-
За последнее время рядом исследователей установлено, что молекулы ского материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др.
инсулина, хроматографическая очистка которых проходит при низких

168 169
Использование человеческого инсулина с самого начала терапии В настоящее время объем ежегодного потребления в мире субстан-
сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее ча- ции генно-инженерного инсулина человека составляет приблизительно
стые осложнения инсулиновой терапии – гипогликемические состояния, около 30000 кг, а с учетом постоянного роста заболевания диабетом в мире
что, прежде всего, проявляется в нарушении функций центральной нерв- выпуск рекомбинантного инсулина будет увеличиваться ежегодно.
ной системы (спутанность сознания, кома и др.).
В настоящее время в медицинской практике используют инсулины 5.2. Производство гормона роста человека
трех типов: (соматотропный гормон)
 короткодействующие с быстрым началом эффекта – регулярный
инсулин – представляет собой короткодействующий растворимый при Гормон роста человека (ГРЧ) – белок вырабатываемый передней до-
нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которо- лей гипофиза, который секретируется в кровь под воздействием гипотала-
го развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продол- мического соматостатина и ГРЧ-рилизинг-фактора соматолиберина. Вы-
жается 5–7 часов. С целью увеличения длительности действия все другие свобождение гормона регулируется соматостатином, а количество выделя-
препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной емого ГРЧ определяется соматолиберином. Гормон роста человека отно-
среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере – сится к группе анаболических гормонов.
протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) – Молекула ГРЧ представляет собой одну полипептидную цепь, состо-
НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере – ящую из 191 аминокислотного остатка, с молекулярной массой
инсулины ультраленте, ленте, семиленте; 22,125 кDa. По химической структуре, физическим, химическим и биоло-
 средней продолжительности действия – препараты содержат про- гическим свойствам ГРЧ сходен с пролактином и плацентарным лактоге-
тамин, представляющий белок средней молекулярной массы 4400, богатый ном. Молекула ГРЧ содержит 2 остатка триптофана, 2 тирозина и 4 цисте-
аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования ина. Последние образуют в молекуле два дисульфидных мостика, которые
комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1 : 10. После формируют две петли – большую, включающую центральный участок
подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, аминокислотной последовательности между цистеином-54 и цистеи-
позволяя инсулину всасываться; ном-165, и малую, находящуюся на С-концевом участке между цистеи-
 длительного действия с медленным проявлением эффекта. ном-182 и цистеином-189. Пространственную структуру молекулы сомато-
Лечение больных сахарным диабетом I типа включает использование тропина отличает высокая степень упорядоченности. В полипептидной це-
комбинации препаратов инсулина человека быстрого (короткого) и дли- пи ГРЧ выявлено 4 альфа-спиральных и 3 нерегулярных участка. Высокое
тельного (пролонгированного) действия. Короткодействующий инсулин содержание в молекуле гормона остатков неполярных аминокислот обу-
должен быстро достигать пика активности в соответствии с подъемом славливает образование в водном растворе димеров и более крупных агре-
уровня глюкозы, связанным с приемом пищи, и прекращать свое действие гатов.
после его падения. Инсулин пролонгированного действия, напротив, дол- Впервые гормон был выделен и очищен в 1963 году из гипофиза, по-
жен в течение длительного времени обеспечивать определенный базовый лученного из трупного материала. Дефицит этого гормона приводит к ги-
уровень глюкозы в промежутках между приемами пищи. Инсулиновая те- пофизарной карликовости, частота встречаемости которой оценивается как
рапия с использованием инсулина имеет ряд недостатков, которые удалось 10 случаев на 1 млн. человек (среди детей западных стран она составляет
преодолеть только после получения его генно-инженерных аналогов. 1 на 5000 человек). Гормон видоспецифичен и является единственным

170 171
средством лечения детей, страдающих от его недостатка. Внутримышечное На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и рас-
введение гормона роста человека (10 мг/кг в течение года по три инъекции щеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последователь-
в неделю) увеличивает рост в течение первого года лечения более чем на ность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормо-
6 см. Для достижения более ощутимых результатов введение гормона на, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтети-
необходимо продолжать от возраста 4–5 лет до половой зрелости и далее. ческий полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Да-
Общего количества фармацевтического препарата, выпускаемого лее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов и
компаниями крупных производителей соматотропного гормона, хватало участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг
для лечения лишь одной трети случаев гипофизарной карликовости в раз- на 1 мл культуры E. Coli (100000 молекул гормона на клетку). Гормон ро-
витых странах; Недостаток соматотропина оказался еще более острым с ста человека, синтезированный в бактериях, обладал нужной молекуляр-
учетом других случаев его применения: незаживающие переломы, ожоги,
ной массой и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого
язвы, нарушение гемопоэза.
его необходимо было бы отщеплять.
Кроме того гормон, выделяемый из трупного материала отличался
Изменяя аминокислотную последовательность гормона роста чело-
гетерогенностью. Несмотря на совершенствование выделения и очистки
века, т.е. его первичную структуру, посредством модификации кодирую-
гормона, у 5 % больных, получавших препарат, вырабатывались антитела,
щего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги
которые полностью инактивировали его биологическую активность. Необ-
гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы
ходимо также отметить, что гипофизарный материал заражен нейротокси-
(например, участков, которые стимулируют рост или оказывают действие
ческим вирусом с необычайно длительным инкубационным периодом. В
связи с этим дети, получавшие соматотропный гормон, нуждались в мно- на неоглюкогенез) и этиологии карликовости на молекулярном уровне.
голетнем медицинском наблюдении. Вирус, содержавшийся в препаратах Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и
гормона, нередко приводил к летальному исходу. С 1985 г. ВОЗ запрещено другие факторы роста, и факторы дифференцировки тканей, выделив вна-
применение гормона, выделяемого из человеческих гипофизов. чале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к со-
Рекомбинантный соматотропин, получивший название «Сомат- матомедину А (стимулирует фиксацию серы в хряще), образование кото-
рем», стал вторым, (после человеческого инсулина) фармацевтическим рого индуцируется соматотропином.
препаратом, полученным биотехнологическим путем. Гормон роста чело- В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, состоящий из
века, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впер- 44 аминокислотных остатков и обладающий полной биологической актив-
вые был получен в 1980 году фирмой «Genentech». Гормон, синтезирован- ностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ).
ный в генетически сконструированных клетках E. Coli, отличается от гор- Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина.
мона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной кар-
NH2-конце молекулы. Гормон обладает биологической активностью на- ликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенера-
тивного гормона и даже большим эффектом, чем гормон роста, выделен- ции тканей у людей, получивших сильные ожоги.
ный из гипофиза, по-видимому, по причине большей чистоты. У детей, Стратегию конструирования новых белков путем замены функцио-
страдающих гипофизарной карликовостью, зарегистрирован прирост нальных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно ис-
8–18 см в год, что несколько больше эффекта гормона, полученного из ги- пользовать для усиления или ослабления биологического действия белка.
пофиза. Например, нативный гормон роста человека связывается в разных типах

172 173
клеток, как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецепто- Биотехнология получения рекомбинантного гормона роста чело-
ром. века (соматотропного гормона).
Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе ле- 1. Ферментация.
чения, нужно исключить присоединение гормона роста человека к пролак- Культуру E. Coli BL21(DE3), трансформированную плазмидой
тиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связы- pES1-6/[Met-1]pГРЧ, выращивали в ферментере 1000 л, заполненную пита-
вающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательно- тельной средой (панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экс-
сти лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодей- тракт, K2HPO4, NaСl, MgSO4) при температуре 37 °С и рН 7,0. Количество
ствует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связы- посевного материала составляло 2 % от объема питательной среды.
вание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический В течение процесса культивирования в ферментер подавали стериль-
ный воздух, водный раствор аммиака и раствор глюкозы. Удельный расход
мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в
воздуха поддерживали на уровне 0,5 л в минуту. Повышения концентра-
боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21, Glu-174) – ли-
ции кислорода в среде достигали за счет увеличения скорости перемеши-
гандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоэффективного связывания
вания культуральной жидкости. Через 3 часа культивирования добавляли
гормона роста человека с пролактиновым рецептором. Полученный моди-
изопропил-тио--D-галактозид до концентрации 52 мг/л и продолжали
фицированный гормон роста человека связывается только со «своим» ре-
процесс еще 3 часа. При индукции с помощью изопропил-тио--D-
цептором. Однако, модифицированные гормоны роста человека пока не
галактозида происходил эффективный биосинтез рекомбинантного белка,
нашли применения в клинике.
который накапливался в клетках в виде телец включения. С помощью
Представляем технологию получения рекомбинантного гормона ро-
электрофореза в SDS-ПААГ показано, что через 3 часа после внесения ин-
ста человека (соматотропного гормона) предложенного российскими уче-
дуктора содержание целевого продукта в клетках продуцента достигало
ными института биоорганической химии РАН. Предлагаемый метод полу-
30 % от суммарного клеточного белка. На процесс ферментации оказывает
чения включает шесть основных стадий: ферментацию, выделение телец влияние температура, давление, рН, содержание растворенного кислорода
включения, ренатурацию, ионообменную хроматографию на носителе в культуральной жидкости и скорость подачи глюкозы. Одним из важней-
Q-Sepharose FF, гидрофобную хроматографию на сорбенте Butyl Sepharose ших параметров процесса ферментации является содержание в среде
4 FF и гель-фильтрацию с использованием Sephacryl S-100 HR. растворенного кислорода, который позволяет регулировать режимы пере-
Для создания штамма-продуцента был синтезирован искусственный мешивания культуральной жидкости, подачи воздуха и глюкозы. Содер-
ген [Met-1]рГРЧ, структура которого была оптимизирована для эффектив- жание растворенного кислорода в культуральной жидкости определяли с
ной транскрипции и трансляции в E. Coli BL21(DE3). Был получен соот- помощью датчиков парциального давления в процентах от максимального
ветствующий штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)|pES1-6, обладающий насыщения. После чего, клетки, содержащие тельца включения, осаждали
продуктивностью 300 мг целевого белка в 1 литре культуры при выращи- сепарированием на сепараторе «Westfalia CSA-19». Сырую биомассу сус-
вании в лабораторных условиях. пендировали в буферном растворе А (50 мМ трис-основание с ЭДТА,
рН 7,0) в соотношении 1 : 5 (масса : объем) и разрушали в проточном дез-
интеграторе «Gaulin». Для этого суспензию пропускали через дезинтегра-
тор 3–4 раза при давлении 600 атм. После дезинтеграции клеточную сус-
пензию сепарировали на сепараторе «Cepa Z81» при 16000 об/мин. Осадок

174 175
суспендировали в буферном растворе Б (50 мМ трис-HCl, рН 8,0) и вновь 3. Ренатурация.
центрифугировали в тех же условиях. Содержание рекомбинантного белка Ключевой стадией в процессе получения рекомбинантных белков
в суммарном клеточном лизате и чистоту телец включения анализировали является стадия ренатурации, в процессе которой денатурированный белок
при помощи электрофореза в ПААГ. приобретает нативную пространственную структуру, обеспечивающую его
2. Выделение телец включения. биологическую активность.
Процесс выделения телец включения из клеток сопровождается Раствор белка (Met-pГРЧ, 2 л), полученный после гель-фильтрации,
формированием димеров и олигомеров целевого белка с образованием ко- при постоянном перемешивании со скоростью 100–120 мл/мин добавляли
валентных связей между молекулами. Для получения мономерной формы к 80 л буферного раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl, 10 мМ NаCl,
не всегда достаточно применять только восстанавливающие агенты, такие 3 мМ цистеамина, 0,3 мМ цистамина, 0,05 мМ ЭДТА и 0,01 % детергента
как дитиотреитол, -меркаптоэтанол и др. Для достижения оптимального Brij 35P (Serva), pH = 8,5. Полученный раствор оставляют при 4 °С на
результата, как правило необходимо использовать буферные растворы, со- 4–6 часов.
держащие детергенты и хаотропные агенты. В условиях промышленного производства процесс ренатурации
Восстановление дисульфидных связей в рекомбинантном белке. необходимо проводить при оптимальном объеме раствора, полученного в
Влажные тельца включения (60 г) суспендировали в 1 л буфера, содержа- результате ренатурации; концентрация белка при этом должна быть мак-
щего 7 М гуанидин-HCl, 20 мМ трис-HCl, рН = 8,0; прогревали в течение симально возможной. Однако повышение концентрации белка влечет за
60 минут при 37 °С и затем добавляли 30 мМ дитиотреитола. Продолжали собой увеличение содержания в реакционной смеси нерастворимых белко-
инкубацию в течение 60 минут при 37 °С. Раствор восстановленного белка вых агрегатов. Наиболее интенсивная агрегация Met-pГРЧ происходит в
Met-pГРЧ центрифугировали 60 минут при 10000 g для получения солю- процессе ренатурации при переходе от сильноденатурирующих к слабоде-
билизата. натурирующим условиям. Применение неионных детергентов стабилизи-
Солюбилизацию Met-pГРЧ и телец включения проводят по стан- рует белок в водном растворе и препятствует образованию агрегатов не
дартной методике с применением высоких концентраций хаотропных ковалентной природы. Известно, что детергент Brij 35P блокирует образо-
агентов (7 М гуанидин-HCl, 8 М мочевина) в присутствии дитиотреитола вание агрегатов ГРЧ в растворе в концентрации, равной критической кон-
при 37 °С. Максимальная растворимость белка в 8 М мочевине составляла центрации мицеллообразования. Твин-80 обладает тем же свойством, но в
4–5 мг/мл. В то же время использование 7 М гуанидин-HCl позволило концентрации превышающей концентрацию мицеллообразования. Поэто-
обеспечить наиболее полное растворение телец включения, восстановле- му в качестве стабилизатора Met-pГРЧ в процессе ренатурации был вы-
ние дисульфидных связей в молекуле и увеличить концентрацию солюби- бран Brij 35P.
лизованного Met-pГРЧ до 9–10 мг/мл. Для образования нативных дисульфидных связей была использована
Гель-фильтрация на носителе Sephadex G-25. Раствор восстановлен- система буферных растворов, содержащих окислительно-восстановитель-
ного Met-pГРЧ (1 л) наносили на колонку BPG (140 х 500 см), заполнен- ную пару цистеамин / цистамин в соотношении 1 : 0,1. Оптимизацию усло-
ную носителем G-25 Fine. Колонку предварительно уравновешивали бу- вий проводили по нескольким параметрам: степень и скорость разбавления
ферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl, и 8 М мочевины, солюбилизата, состав буферного раствора для ренатурации. Процесс вели
рН = 8,0. Этот же буферный раствор использовали для проведения разде- методом разбавления белка буферным раствором с низкой ионной силой.
ления при скорости потока 120 мл/мин. Содержание белка в элюате изме- Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала раство-
ряли с помощью проточного фотометра при длине волны 280 нм. ренный в 7 М гуанидин-хлориде белок с помощью гель-фильтрации пере-

176 177
водили в буферный раствор, содержащий 8 М мочевины и 10 мМ цистеа- белка; уменьшение концентрации аминопептидазы сопровождается сни-
мина. Условия процедуры были подобраны таким образом, чтобы конеч- жением степени гидролиза Met-pГРЧ.
ная концентрация белка составляла 4–5 мг/мл. Затем полученный раствор 5. Гидрофобная хроматография.
белка разбавляли при комнатной температуре буферным раствором для К раствору рГРЧ после отщепления N-концевого остатка метионина
ренатурации и инкубировали в течение 8 часов. добавляли NaCl до конечной концентрации 2 М. Затем полученный рас-
4. Ионообменная хроматография. твор наносили на аксиальную колонку BPG (140 х 500 мм) («Amersham-
Хроматографическую очистку рекомбинантного соматотропина про- Bioscience»), заполненную гелем Butyl Sepharose 4 FF и предварительно
водили при температуре 4 °С на радиальной и аксиальной колонках объе- уравновешенную буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl, 2 M
мом 0,5 и 1 л, соответственно. В качестве сорбента использовали NaCl, pH = 8,0. После нанесения колонку промывали тем же буферным
Q-Sepharose FF. Раствор белка после ренатурации (82 литра) с помощью раствором. Элюцию проводили при скорости потока 80 мл/мин с помощью
перистальтического насоса («Masterflex») со скоростью 300 мл/мин нано- обратного градиента NaCl (контролировали с помощью кондуктометра
сили на радиальную колонку («Sepragen 500»), уравновешенную 20 мМ производства «Amersham-Bioscience») от 2 до 0 М в том же буферном рас-
трис-HCl буферным раствором, рН = 8 (стартовый буфер). После нанесе- творе при температуре 4 °С. Детекцию осуществляли с помощью проточ-
ния всего объема белка сорбент промывали тремя объемами стартового ного УФ-детектора с фильтром 280 нм. Фракции, содержащие не менее
буфера. Затем к выходу радиальной колонки присоединяли аксиальную 95 % мономерной формы рекомбинантного белка, объединяли.
колонку («Phafmacia XK50»), также предварительно уравновешенную 6. Гель-проникающая хроматография.
стартовым буферным раствором. Белок элюировали в соответствии с фо- Окончательную очистку рГРЧ проводили на колонке BPG
тометрическим профилем при длине волны 280 нм. Фракции, содержащие (140 x 950 мм) геля Sephacryl S-100 HR, предварительно уравновешенной
Met-pГРЧ, объединяли (1,0–1,2 л). буферным раствором, содержащим 20 мМ Na2HPO4, 0,2% глицина и 4 %
Отщепление N-концевого метионина. К раствору белка, полученного маннита, рН = 6,8. Этот же буферный раствор использовали для фракцио-
после очистки на Q-Sepharose FF, добавляли лейциновую аминопептидазу нирования при скорости потока 35 мл/мин. Белок в элюате детектировали с
(Aeromonas proteolitica) в расчете 7,5 ед. на 1 г белка. Реакцию отщепления помощью проточного фотометра при длине волны 280 нм. Фракции, со-
проводили в течение 16 ч при комнатной температуре, полноту гидролиза держащие рГРЧ в мономерной форме, объединяли. Полученный белок раз-
контролировали с помощью изократической ОФ ВЭЖХ на колонке водили до концентрации 1,3 мг/мл, замораживали и хранили до использо-
Symmetry 300 C18 (4,6 х 250 мм). После окончания гидролиза пик, соответ- вания при минус 20 °С.
ствующий Met-pГРЧ, на хроматограмме не выявляется. В результате экс- В заключение хотелось бы отметить, что в настоящее время в клини-
периментов обнаружено, что более высокие значения степени гидролиза ке используется субстанция соматотропина, представляющая собой реком-
достигнуты при температуре 20–22 °С и 37 °С. Однако при и 37 °С проис- бинантный гормон роста человека – пептид, содержащий 191 аминокисло-
ходило образование побочных продуктов гидролиза. Проведение реакции ту, идентичный человеческому гипофизарному гормону роста по амино-
при температуре 20–22 °С обеспечивало, с одной стороны, высокую сте- кислотной последовательности и составу, а также по пептидной карте, изо-
пень отщепления N-концевого метионина, а с другой – низкий выход не- электрической точке, молекулярной массе, изомерной структуре и биоло-
желательных примесей. Поэтому для проведения гидролиза была выбрана гической активности. Соматотропин применяется при задержке роста у де-
комнатная температура. Однако при 20–22 °С количество внесенного в ре- тей, обусловленного снижением или отсутствием секреции эндогенного
акционную смесь фермента должно поддерживаться на уровне 7,5 ед/г гормона роста; задержке роста у девочек с дисгенезией гонад (синдром

178 179
Шерешевского – Тернера). Как у взрослых, так и детей соматотропин под- В Российском научном центре вирусологии и биотехнологии «Век-
держивает нормальную структуру тела, стимулируя рост мышц и способ- тор» была получена линия клеток штамма продуцента эритропоэтина че-
ствуя метаболизму жира. ловека (СНОрЕ) путем трансфекции клеток СНО ТК (дефектных по тими-
На фармацевтическом рынке Украины присутствуют препараты ре- динкиназе) рекомбинантной плазмидой, содержащей ген эритропоэтина
комбинантного гормона роста человека: «Биосома» (Teva, Израиль), «Ге- человека, с последующей селекцией. Клетки СНОрЕ обеспечивают синтез
нотропин» (Pfizer Inc., Швеция), «Нордитропин» (Novo Nordisk, Дания), и секрецию в культуральной жидкости белка рекомбинантного человече-
«Нутропин Aq» (Beaufour Ipsen International, США), «Растан» (Россия), ского эритропоэтина (рчЭПО). Культура клеток состояла из эпителиопо-
«Сайзен» (Industria Farmaceutica Serono s.p.a., Италия) и др. Необходимо добных и веретеновидных клеток с крупными ядрами неправильной фор-
отметить, что препарат «Сайзен» получен методом генной инженерии с мы, содержащими от одного до трех ядрышек; цитоплазма зернистая, ва-
использованием линии клеток млекопитающих, а именно с помощью кле- куолизированная. Клетки субстратзависимы, склонны к неравномерному
ток молочной железы. Другие перечисленные препараты получены с ис- росту, образуют многослойные островки. При длительном культивирова-
пользованием бактерий E. Coli. нии в течение 23 последовательных пассажей морфология клеток не изме-
нялась; индекс пролиферации культуры составлял 3–4; монослой форми-
5.3. Производство эритропоэтина человека ровался на 3-и сутки роста при кратности рассева 1 : 3–1 : 4. Хранение в
жидком азоте не приводило к изменению свойств культуры клеток.
Эритропоэтин – гликопротеиновый гормон, образуемый клетками Клетки культивировали в питательной среде Игла МЕМ с добавле-
почек и печени в ответ на снижение парциального давления кислорода в нием 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота и смеси ГАТ
крови (гипоксия) и обуславливающий начало эритропоэза. Это полипеп- (13,61 мкг/мл гипоксантина, 0,191 мкг/мл аминоптерина, 3,88 мкг/мл ти-
тид, состоящий из 165 аминокислот с молекулярной массой 30400 Da. мидина). Культивирование проводили при температуре 37 °С. Культуру
Эритропоэтин широко применяют в клинической практике при заболева- криоконсервировали и хранили при температуре минус 196 °С в жидком
ниях сопровождающихся анемией. При анемии индукция эритропоэтина азоте.
повышена, что стимулирует образование эритроцитов в костном мозге и Исследование специфической активности эритропоэтина in vitro по-
приводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной казало, что штамм-продуцент обладает способностью выделять в культу-
недостаточностью и выраженной анемией. В настоящее время препараты ральную среду целевой белок с активностью в среднем 247,6 МЕ/мл в
эритропоэтина входят в число необходимых и часто используемых фарма- сутки. Активность рчЭПО в течение времени культивирования увеличива-
цевтических средств. Получение эритропоэтина из физиологического ма- лась с 102,2 МЕ/мл (первые сутки) до 332,1 МЕ/мл (четвертые сутки) и за-
териала – процесс трудоемкий и затратный, что делает невозможным при- тем постепенно снижалась. Снижение активности, вероятно, связано с не-
менение природного гормона в клинической практике. Альтернативным обратимыми процессами в клетках, недостатком питательных веществ и
вариантом является получение белка методами генной и клеточной инже- накоплением вредных метаболитов в среде. Очистка препарата основана
нерии с помощью штамма-продуцента на основе перевиваемой культуры на комбинации аффинной и ионообменной хроматографии. Получение
сорбента для аффинной хроматографии – путем иммобилизации монокло-
клеток, что позволяет получать более дешевый и доступный белок.
нальных антител к эритропоэтину человека, на CNBr (активированной
Культура клеток яичника китайского хомячка (штамм СНО) и её
Sepharose FF). Источником моноклональных антител является асцитиче-
производные используются в качестве продуцентов различных рекомби-
ская жидкость мышей или культуральная жидкость. Сорбент уравновеши-
нантных белков.
вали фосфатным буфером, содержащим 0,02 % Твин-20. Культуральную
180 181
жидкость, содержащую эритропоэтин концентрировали на ультрафильтра- ния фармацевтических белков используют в основном 6 видов животных:
ционных волокнах с порогом отсечения 10 кDa при температуре 4–10 °С. мышей, кроликов, свиней, коз, овец и коров.
Культуральную жидкость концентрировали в 10–20 раз (исходный объем – Основным методом получения таких трансгенных животных являет-
28 л). Культуральную жидкость, содержащую 300 мг рекомбинантного ся метод микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы. Отрицательным мо-
эритропоэтина, наносили на колонку с аффинным сорбентом (высота стол- ментом является низкая эффективность трансгенеза (около 1 % от числа
ба сорбента 12,7 см). Сорбент промывали последовательно 4 объемами пересаженных эмбрионов), причем экспрессия трансгенов наблюдается
фосфатного буфера с 0,02 % Твина-20; 3-мя объемами фосфатного буфера, только у 60 % полученных трансгенных животных. Существует подход,
содержащего 1 М NaCl и 0,02 % Твина-20; 2-мя объемами фосфатного бу- который позволяет устранить указанные недостатки – использование ре-
фера с 0,02 % Твина-20. Элюирование проводили 0,1 М раствором лимон- тровирусных векторов, которые позволяют с высокой эффективностью
ной кислоты. В 160 мл элюата – 285 мг белка эритропоэтина. Выход на осуществлять трансформацию клеток мишеней как in vitro, так in vivo.
этой стадии составляет 95 %. Чистота эритропоэтина более 95 %. Полу- Преимуществом ретровирусных систем переноса генов является возмож-
ченный раствор эритропоэтина подвергали диализу против 0,01 М трис- ность получения так называемых соматических трансгенных животных,
буфера с 0,02 % Твина-20, рН = 6,8. Затем эритропоэтин подвергают гра- т.е. животных с трансформацией клеток отдельных органов и тканей. В ос-
диентной ионообменной хроматографии на Q-Sepharosа. Элюирование нове получения таких животных лежит принцип, используемый в генной
проводят линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М раствором. Выход на терапии. Векторные конструкции, содержащие интересующий ген, вводят
этой стадии составляет не менее 75 %. Контроль препарата проводили ме- непосредственно в органы и ткани взрослых животных. Наличие в генных
тодом ВЭЖХ и электрофореза в ПААГ. Чистота эритропоэтина не менее конструкциях тканеспецифических промоторов обеспечивает экспрессию
98 %. Препарат гомогенен и представлен мономером. целевого гена только в определенных тканях.
Рассматривая технологии получения рекомбинантных белков нельзя В качестве примера рассмотрим получение эритропоэтина человека
не остановиться на получении данных продуктов с помощью трансгенных на трансгенных животных.
сельскохозяйственных животных. Использование сельскохозяйственных Для получения эритропоэтина человека были использованы два ре-
животных в качестве биореакторов рассматривается как альтернатива тра- тровирусных вектора pLN- и pLN-G-CSF, полученные на основе вируса
диционным методам получения белков для фармацевтической промыш- лейкемии мышей Молони. Обе конструкции были созданы на основе век-
ленности. В результате генно-инженерных манипуляций домашние живот- тора pLNS путем встраивания в прямой ориентации в сайт XhoI геномных
ные становятся живыми системами, продуцирующими рекомбинантные последовательностей эритропоэтина человека (pLN-) под контролем про-
белки человека в кровь или молоко. Выбор трансгенных животных в каче- мотора S1-казеина крупного рогатого скота.
стве источника фармацевтических белков обусловлен тем, что в их орга- Для упаковки генных конструкций в вирусные частицы были ис-
низме могут осуществляться посттрансляционные модификации, делаю- пользованы два типа пакующих клеток – Gpevn-AM12 и pg13. Обе линии
щие продуцируемые рекомбинантные белки биологически активными. получены на основании эмбриональных фибробластов мыши, в которые
Экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных жи- последовательно были встроены вирускодирующие последовательности.
вотных может достигать 40 г/л, при этом выделение белков из молока воз- Технология получения соматических трансгенных животных вклю-
можно уже при их концентрации 25 нг/мл. С помощью трансгенных жи- чала следующие этапы: выращивание пакующих линий клеток в культуре
вотных в лабораторных условиях получен широкий спектр рекомбинант- и их оценку на наличие рекомбинантной ДНК методом ПЦР; введение ви-
ных белков: антитромбин III, 1-антитрипсин, α-глюкозидаза, эритропо- русного препарата (клеток-упаковщиц) в молочную железу взрослых жи-
этин, -интерферон, -лактоглобулин, С-протеин, сывороточный альбу- вотных; анализ молока подопытных животных на наличие рекомбинант-
мин, -интерферон, факторы свертываемости крови VIII и IX. Для получе- ной ДНК и определение в нем уровня экспрессии рекомбинантного про-
182 183
дукта. Эксперименты по трансформации клеток молочной железы прово-
дили на трех видах животных: коровах, козах, свиноматках. Контрольные вопросы
Введение генных конструкций в клетки молочной железы осуществ-
ляли как in vitro, так и in vivo. Трансформацию клеток-мишеней in vitro 1. Какова роль гормона инсулина в организме человека? Опишите
проводили путем совместного культивирования с клетками- структуру гормона.
упаковщицами. Для трансформации клеток молочной железы in vivo ис-
2. Какие этапы синтеза инсулина в -клетках островковой ткани Вам
пользовали суспензию клеток-упаковщиц, которые вводились непосред-
известны?
ственно в паренхиму вымени взрослых животных. Учитывая, что ретрови-
русы способны инфицировать только делящиеся клетки, введение клеток- 3. Опишите историю создания производства природного и рекомби-
упаковщиц осуществляли в период беременности, когда наблюдается нантного инсулинов.
наиболее активная пролиферация клеток молочной железы. Экспрессия 4. Проведите анализ технологии получения рекомбинантного инсу-
рекомбинантного эритропоэтина человека наблюдалась практически у всех лина и укажите методы межоперационного контроля.
видов подопытных животных. Концентрация рекомбинантного эритропоэ- 5. Каким образом проводят конструирование плазмиды несущей ген
тина человека в молоке животных составляла до 600–1000 нг/мл. Необхо-
инсулина человека?
димо отметить, что при введении генной конструкции в кровь среднее со-
6. Что представляют собой тельца включения? Каким образом про-
держание рекомбинантного продукта в молоке составляло лишь
5–11 нг/мл. водится процесс ренатурации?
Аналогично был получен гранулоцит-колониестимулирующий фак- 7. Какова роль гормона роста (соматотропина) в организме человека?
тор (pLN-G-CSF), количество которого в молоке до 200 нг/мл. Опишите структуру гормона.
Таким образом, создание трансгенных животных может позволить 8. Проведите анализ технологии получения рекомбинантного гормо-
расширить номенклатуру генно-инженерных биотехнологий, позволяющих на роста и укажите методы межоперационного контроля.
получать промышленные количества фармацевтических субстанций. 9. Какова роль эритропоэтина в организме человека? Опишите
Хорошо известны готовые инъекционные формы рекомбинантного
структуру гормона.
эритропоэтина человека на основе субстанции под названием Эпоэтин-
10. Опишите линии клеток, используемых для получения эритропоэ-
альфа и Эпоэтин-бета, представляющие собой лиофилизированные лекар-
ственные формы для инъекций. Эпоэтин-альфа по биологическим свой- тина.
ствам не отличается от человеческого эритропоэтина, применяется при 11. Какие этапы включат получение трансгенных животных?
анемиях, связанных с хронической почечной недостаточностью. Эпоэтин- 12. Проведите анализ технологии получения эритропоэтина и укажи-
бета применяется при анемиях различного генеза (при хронической почеч- те методы межоперационного контроля.
ной недостаточности, у недоношенных новорожденных, химиотерапии 13. По каким параметрам проводят контроль качества гормональных
злокачественных новообразований) и при подготовке к аутогемотрансфу- препаратов?
зии.
14. Аппаратурно-технологическая схема производства гормонов.
На фармацевтическом рынке Украины присутствуют препараты ре-
комбинантного эритропоэтина: «Вепокс» – Эпоэтин-альфа (Wockhardt),
«Гемакс» – Эпоэтин-альфа (Sidus-Bio-Sidus), «Рекормон» – Эпоэтин-бета
(Roche), «Эпрекс» – Эпоэтин-альфа (Cilag) и др.
184 185
ГЛАВА 6. НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИЗГОТОВЛЕНИИ муномодуляторов, повышающих иммунный ответ; создание новых систем
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ переносчиков, например, липосом для доставки антигенов или иммуномо-
дуляторов; рекомбинантных вакцин и ряда других.
6.1. Биотехнология вакцин Интенсивное развитие биотехнологии, биохимии, иммунологии
определило прогресс в развитии мировой фармации и создания высокоэф-
Ни одной медицинской науке человечество не обязано спасением фективных вакцин, как традиционных, так и вакцин нового поколения;
стольких жизней, как вакцинологии. Вакцинопрофилактика доказала свою препаратов крови, интерферонов, цитокинов и рекомбинантных продуктов
эффективность как наиболее экономичное средство предупреждения ин- различной направленности. С развитием технологии рекомбинантных ДНК
фекционных болезней. Созданы вакцины против 34-х социально значимых стало возможным создание вакцин следующего поколения, лишенных не-
инфекций, что привело к значительному снижению заболеваемости дифте- достатков традиционных вакцин.
рией, столбняком, корью, туляремией, полиомиелитом и исчезновению В данной публикации невозможно осветить вопросы, касающиеся
оспы. разработки и производства всех существующих сегодня в мировой практи-
Основной задачей исследования в области вакцинологии является ке вакцин. В связи с этим мы остановились только на принципиальных
разработка безопасных и высокоэффективных вакцинных препаратов. Весь подходах к созданию новых высокоэффективных вакцинных препаратов.
путь создания вакцин был возможен только при использовании основных В этой главе суммированы основные технологии, ключевые проблемы и
достижений биотехнологической науки – открытие анатоксинов и возмож- иммунологические цели создания различных видов активных вакцин. В
ность их получения, создание клеточных культур, аттенуация вирусов и наших предыдущих работах были подробно освещены технологии получе-
бактерий, выделение и очистка полисахаридов, создание рекомбинантных ния основных вакцин действующего в Украине Календаря прививок.
технологий. Каждое открытие биотехнологии и иммунологии это очеред- Технологии и примеры, представленные здесь, должны предоставить
ной шаг к созданию новых вакцин, причем, не только для профилактики читателю четкую структуру, которая дала бы ему возможность оценить
инфекционных заболеваний. Сегодня вакцины активно используются для различные подходы к исследованиям и разработке новых вакцин. Данный
лечения ряда заболеваний: аллергических, аутоиммунных, онкологических раздел настоящего учебного пособия должен рассматриваться совместно с
и др. Так, например, в Украине зарегистрированы две вакцины для лечения материалами, изложенными в учебном пособии: Краснопольский Ю.М.,
и профилактики онкологических заболеваний: вакцина URO-BCG, приме- Борщевская М.И. «Фармацевтическая биотехнология: Технология произ-
няемая для лечения поверхностного рака мочевого пузыря (производства водства иммунобиологических препаратов».– Харьков, НТУ «ХПИ», 2009.
NVI, Нидерланды) и вакцина Гардасил против вируса папилломы челове- В табл. 13 представлен перечень вакцин, полученных с использова-
ка, рекомбинантная (производство «Merck Sharp & Dohme B.V.», Нидер- нием различных технологий.
ланды). Многообещающими являются комбинированные вакцины, обеспе-
чивающие иммунизацию против нескольких инфекционных заболеваний.
Совершенствование и развитие производства традиционных вакцин идет
параллельно с развитием технологий принципиально новых вакцинных
препаратов: ДНК-вакцин; вакцин на основе пептидов; мукозальных и ри-
босомальных вакцин; создание препаратов, с помощью которых появится
возможность влиять на иммунную систему при использовании новых им-

186 187
Таблица 13 – Перечень вакцин, полученных с использованием Продолжение таблицы 13
различных технологий
1 2
Вакцины на основе белков:
Технологии вакцины Вид микроорганизма
 Природные Вирус гепатита В (HBV), ко-
1 2
клюш
Классическая стратегия для вирусов:
 Аттенуация в клеточной культуре Вирус полиомиелита, вирус
 Химически инактивированные Столбняк (Clostridium tetani),
кори, вирус эпидемического
дифтерия (Corynebacterium
паротита, вирус краснухи,
diphtheriae), коклюш
вирус ветряной оспы

 Генетически инактивированные Коклюш, дифтерия


 Мутанты отобранные путем Ротавирус, вирус гриппа
температурного воздействия
 Рекомбинантный полипептид Болезнь Лайма (Borrelia
Вирус простого герпеса
Рекомбинантные вирусы burgdorferi), HBV
(HSV)
Вирус коровьей оспы,
Рекомбинантные вирусные векторы  Гибридный белок Малярия
аденовирус
Классические стратегии для бактерий:
 Конъюгат Малярия
 Бактериальные Туберкулез (бацилла Кальме-
та – Герена) (БЦЖ),
 Клеточный эпитоп Рак, HBV
брюшной тиф (Salmonella
Вакцины на основе полисахаридов:
typhi)
 Простой полисахарид Haemophilus influenza тип b
Рекомбинантные бактерии Холера (Vibrio cholerae)
(Hib), менингококковый
Холера (Vibrio cholerae),
Рекомбинантные бактериальные (Neisseria meningitides),
брюшной тиф (Salmonella
векторы пневмококковый
typhi), Shigella flexneri
(Streptococcus pneumoniae)
Субъединичные / инактивированные
вакцины (целый патогенный организм):
 Конъюгат Hib
 Инактивированные бактерии Коклюш (Bordetella pertussis),
Вакцины на основе ДНК Грипп, гепатит В
холера
 Инактивированные вирусы Вирус полиомиелита, вирус
Стратегическое решение по поводу разработки живой, субъединич-
гриппа, вирус бешенства,
ной / инактивированной вакцины или вакцины на основе нуклеиновой ки-
вирус японского энцефалита,
слоты необходимо принимать, взвесив эпидемиологические, патогенетиче-
вирус гепатита А
ские и иммунобиологические аспекты рассматриваемых инфекций или за-
188 189
болевания, а также техническую выполнимость различных подходов. Эпи- лировать иммунную реакцию, аналогичную вызываемой природной ин-
демиология диктует целевую популяцию вакцины. Возраст и состояние фекцией. Живая вакцина аттенуируется, что означает, что ее способность
здоровья этой популяции обычно определяют конкретные стратегии в ка- вызывать заболевание исключается. Необходимо обеспечить, чтобы живая
честве более предпочтительных для стимуляции защитного иммунитета. вакцина не оставалась ни недостаточно аттенуированной (не сохраняла па-
Например, для вакцины, предназначенной для здоровых младенцев, очень тогенность даже в минимальной степени), ни чрезмерно аттенуированной
важна минимальная реактогенность, а некоторые типы вакцин бесполезны (не была недостаточно инфекционной для функционирования в качестве
для младенцев, поскольку они не стимулируют защитный иммунитет. Од- вакцины). Живые вакцины обычно вызывают как гуморальный иммунитет
нако, уровень реактогенности менее важен в таких случаях, как терапевти- (антитела), так и клеточный (например, цитотоксические Т-лимфоциты).
ческая противораковая вакцина. Знание иммунобиологии может помочь Хотя эти свойства сами по себе делают живые вакцины весьма жела-
выявить природу защитного иммунитета, который должен стимулировать- емыми, это является технически недостижимым для большинства вакцин,
ся вакциной; определенные иммунные реакции могут быть защитными, а разрабатываемых в настоящий момент. Живая вакцина может быть недо-
другие – бесполезными для предотвращения или лечения конкретной ин- статочно аттенуирована, и впоследствии вызывать свое природное заболе-
фекции. Например, выведение природной инфекции может коррелировать вание с низкой частотой, или быть полностью аттенуированной, что в зна-
с появлением антител против определенного микробного антигена. Это чительной степени снижает иммуногенность. Благодаря тому, что живая
определяет, что данный антиген является вероятным вакцинным иммуно- вакцина может реплицироваться, существует потенциальная возможность
геном. С другой стороны, исследование иммунобиологии значительным ее превращения в более свойственную ей патогенную форму. Живые вак-
образом облегчается или становится возможным при разработке экспери- цинные штаммы могут передаваться из вакцины не вакцинированному че-
ментальной животной модели, наличие которой позволяет тестировать и ловеку, что может быть достаточно серьезным в случае, если реципиент
оптимизировать возможные вакцины для достижения эффективной защи- обладает иммунодефицитом или подвергается химиотерапевтическому ле-
ты, до того, как выводить лучшие из них в фазу клинических испытаний. чению рака.
Для конкретной вакцины имеется только ограниченный ряд технических Классические стратегии
подходов. Тем не менее, учитывая возрастающее количество технических Термин «классические стратегии» касается технических стратегий,
подходов, в будущем, вероятно, будет возможно создавать многие вакци- в которых не используется технология рекомбинантных ДНК. Производ-
ны «по заказу» для достижения оптимальной эффективности и переноси- ство живых вирусных вакцин основано на эффективном размножении ви-
мости. руса в клеточной культуре.
Аттенуация in vitro. Разработка живых аттенуированных бактери-
6.1.1. Живые вакцины альных вакцин классическими методами путем культивирования бактерий
in vitro для их аттенуации при сохранении иммуногенности является не
Некоторые живые вакцины значительно приближаются к «идеальной
всегда успешным. Конкурентное или селективное давление на бактерии,
вакцине», будучи способными стимулировать защиту на всю жизнь с ми-
делающее их менее вирулентными при пассировании in vitro может быть
нимальной реактогенностью при использовании одной или двух доз. Такие
небольшим; бактерии могут прекратить экспресссировать факторы виру-
вакцины могут быть доступны в случаях, когда природная инфекция дает
лентности in vitro, но вернуться к их экспрессии in vivo (реверсия).
хозяину защиту на всю жизнь. Такие вакцины состоят из микроорганизмов
Одна из широко распространенных живых бактериальных вакцин,
(обычно вирусов), которые реплицируются в организме хозяина таким же
основанная на серийных пассажах in vitro – это вакцина против туберкуле-
образом, как и природный микроорганизм, то есть вакцина может стиму-
190 191
за. В первые десятилетия ХХ века важнейшей попыткой создания живых (BCG – 1 Russia), содержащий 4 антигена, которые отсутствуют у боль-
вакцин была разработка вакцины против туберкулеза. Она известна как шинства других субштаммов, занимающий при высокой иммуногенности
БЦЖ – бацилла Кальметта – Герена (BCG), по имени двух французских среднее положение по остаточной вирулентности среди других субштам-
ученых, получивших ослабленный штамм туберкулезных бактерий. Вак- мов, т.е. при высоких защитных свойствах вакцина обладает невысокой
цина была получена в течение 13 лет путем многократных серийных пас- реактогенностью. В настоящее время для вакцинации детей в Украине ис-
сажей (231 последовательный пересев – in vitro) штамма Micobacterium пользуют вакцину БЦЖ SSI производства Дании (Государственный серо-
bovis. Вакцина состоит из живого аттенуированного штамма логический институт, штамм Copenhagen 1331, относящийся к более силь-
Mycobacterium bovis. БЦЖ фактически была первой живой бактериальной ным штаммам).
вакциной, в широких масштабах примененной на человеке (её повсемест- Имеющиеся вакцины БЦЖ отличаются переносимостью, иммуно-
ное внедрение было отсрочено трагическим событием в Германии, где генностью и степенью эффективности защиты в клинических испытаниях.
партия вакцины оказалась зараженной). Опыт показал, что вакцины, при- Вакцины БЦЖ обычно обладают приемлемыми профилями переносимо-
готовленные из этих ослабленных туберкулезных бацилл, совершенно без- сти. Следует ожидать, что для аттенуации нового бактериального штамма
опасны и с 1950 года в Великобритании и большинстве других стран будут применяться методики рДНК-технологии. Поэтому, учитывая име-
начались широкие компании по иммунизации школьников. Сегодня, им- ющиеся технические и регуляторные стандарты, весьма маловероятно, что
мунизация вакцинной БЦЖ проводится у новорожденных на 3–7 день будет разработана новая живая бактериальная вакцина, аттенуированная с
жизни внутрикожно. Ревакцинацию проводят детям в возрасте 7 и 14 лет. применением исключительно классической стратегии.
Ежегодно вакциной БЦЖ прививаются около 100 млн. человек. Применение первой классической стратегии для вирусов стало воз-
Вакцина БЦЖ представляет собой лиофилизированные живые мико- можным в 1950-х гг., вместе с возможностью выращивания вирусов в
бактерии вакцинных штаммов, высушенные в стабилизаторе глутаминате культурах клеток. Этот подход является эмпирическим, т.е. вирус дикого
натрия. В одной дозе 0,05 мг вакцины содержится 1,5 х 105–6,0 х 105 жи- типа, изолированный из человеческой инфекции, проходит пассажи in vitro
вых микробных клеток. Всего зарегистрировано 16 субштаммов БЦЖ (из- через один или более тип клеток, с целью ослабления его патогенности. В
вестно более 30). Субштаммы различаются по морфологии клеток и коло- таком случае может иметь место селективное давление в сторону меньше-
ний (от длинных палочек до кокковидных форм), остаточной вирулентно- го повреждения клеток. Механизм, благодаря которому в ходе аттенуации
сти, иммуногенности, антигенному составу. Так, например, субштамм То- вводятся мутации, ясен не до конца. В некоторых случаях (например, ви-
кио-172, полученный в Японии характеризуется очень мелкими клетками, рус полиомиелита) было возможно продемонстрировать аттенуацию на
низкой остаточной вирулентностью, сниженной иммуногенностью и не- приматах, хотя в большинстве случаев аттенуация подтверждается лишь в
значительной реактогенностью. Такие субштаммы принято называть «сла- ходе интенсивных клинических испытаний. Успех данного эмпирического
быми». «Сильные» субштаммы отличаются большей остаточной виру- подхода, который применялся как для вакцин для перорального введения
лентностью и высокой защитной способностью. В то же время эти штаммы (вакцина вируса полиомиелита (OPV) для перорального введения), так и
более реактогенны (штаммы, используемые во Франции – Pasteur 1173 Р2, для вакцин, вводимых инъекционным (парентеральным) путем (корь, эпи-
Дании – Copenhagen 1331, Болгарии – Sofia SL 222 и др.). Вакцины, изго- демический паротит, краснуха, ветряная оспа) подтверждается количе-
товленные из «сильных» субштаммов вызывают большой процент гной- ством имеющихся лицензированных вакцин. Реактогенность таких вакцин
ных лимфаденитов при вакцинации. Ранее, в Украине использовали только достаточно низка для того, чтобы некоторые из них (полиомиелит, корь)
вакцину, произведенную в России, в которой применен субштамм БЦЖ были широко приняты во всем мире в обычной педиатрической практике.

192 193
Благодаря интенсивным программам иммунизации OPV полиомиелит ми по способности к росту in vitro при температурах ниже физиологиче-
движется в сторону искоренения во всем мире. ских (37 °C), т.е. до 25 °C. Идея, воплощенная в этом подходе, заключается
Реассортантные геномы. Вирус-реассортант, полученный после в том, что вирусы будут менее активными при росте in vivo, чем их роди-
совместного инфицирования культуры двумя разными вирусами с сегмен- тельские вирусы дикого типа, а следовательно, менее вирулентными и фе-
тированными геномами, содержит гены обоих родительских вирусов. Для нотипически аттенуированными. Живые гриппозные вакцины, впервые
повышения эффективности ротавирусов животных были изолированы ро- предложенные А.А. Смородинцевым в 1938 году, успешно применяются в
тавирусы-реассортанты, содержащие в основном гены ротавирусов живот- России на протяжении многих лет. В США живая интраназальная вакцина
ных, несущие фенотип аттенуации для человека, а также ген(ы) поверх- была одобрена FDA в июне 2003 г. и разрешена для использования в воз-
ностного белка ротавирусов человека, стимулирующие выработку серо- растной категории от 5 до 49 лет. Благодаря многократным пассажам на
тип-специфических нейтрализующих антител ротавируса человека. Эти куриных эмбрионах в условиях снижения температуры стало возможным
ротавирусы-реассортанты обладали большей эффективностью в качестве получение ослабленного вируса, который не реплицируется при высоких
возможной вакцины, чем родительские вирусы животных. Квадривалент- температурах, характерных для легких человека, но способен размножать-
ная реассортантная ротавирусная вакцина (на основе ротавируса резуса) ся в носоглотке при температуре 34 °С, вызывая локальную инфекцию,
была лицензирована в 1998 г. Однако, вследствие повышенного уровня приводящую к выработке секреторного и генерализованного иммунного
проникновения в ткани (1 : 10000), наблюдавшегося сразу после иммуни- ответа. В связи с тем, что вакцинация живой гриппозной вакциной напо-
зации, применение вакцины было прекращено. Этот отзыв показывает, что минает природную транзиторную инфекцию, она обладает достаточно вы-
безопасность является ключевой проблемой при разработке новых живых сокой эффективностью и по различным данным характеризуется 94 %-ной
вакцин. Аналогичный подход был применен к вакцинам против гриппа, в сероконверсией у детей, а в комбинации с инактивированной вакциной вы-
которых новый отобранный вирус гриппа предоставлял гены, кодирующие зывает положительный иммунный ответ у 68 % пожилых людей.
иммуногенные поверхностные гликопротеины (гемагглютинин и нейра- Химический мутагенез. Еще одной методикой создания аттенуиро-
минидазу), а аттенуированный вирус обеспечивал все остальные гены, а ванного штамма является химический мутагенез с последующей селекци-
также фенотип аттенуации. Такие вирусы гриппа – реассортанты могут ей. Таким образом, был получен штамм Ty21a Salmonella typhi, предназна-
быть адаптированы к росту в клеточных линиях млекопитающих, таких ченный для предотвращения брюшного тифа. Разрешение на использова-
как MDCK12, в качестве клеточного субстрата вместо куриных яиц. По- ние аттенуированного штамма получено на основе данных о его безопас-
давляющее большинство сезонных и пандемических вирусов имеют реас- ности и эффективности.
сортантное происхождение. Это в первую очередь относится и к современ- Рекомбинантные вирусы
ному вирусу гриппа H1N1v-2009, вызвавшему пандемию гриппа. Поэтому Повышенная стабильность фенотипа аттенуации достигается вслед-
применение живых гриппозных вакцин с целью предупреждения появле- ствие создания модификаций или делеций в вирусных генах, достаточно
ния реассортантов с новыми свойствами ограничено на подъеме заболева- обширных для того, чтобы возвращение к исходному состоянию путем об-
емости гриппом и тем более в условиях пандемии гриппа. ратных мутаций было невозможным или крайне маловероятным. В отли-
Термочувствительные мутанты. Вирусные мутанты могут отби- чие от этого, аттенуированные вирусы, полученные с применением клас-
раться по их способности к росту при различных температурах. Эти виру- сических стратегий, могут иметь только точечные мутации, а следователь-
сы называются термочувствительными (ts), неспособными к росту при по- но, и способность к возврату в исходное состояние.
вышенных температурах, или адаптированными к холоду (ca), отобранны-

194 195
В гене вируса простого герпеса (HSV), кодирующем гликопротеин, ветствующий патогенный микроорганизм человека. Рекомбинантный по-
необходимый для проявления инфекционности, была создана мутация. липептид экспрессируется в инфицированной клетке и либо транспортиру-
Данный гликопротеин вводится в вирус из клеточной линии в ходе культи- ется к клеточной поверхности с целью стимулирования выработки анти-
вирования in vitro, и благодаря этому полученный вирус может иницииро- тел, либо распадается на пептидные фрагменты, которые транспортируют-
вать инфекцию in vivo, но не способен распространяться, что обеспечивает ся к клеточной поверхности. Данная стратегия также имеет потенциальное
его молекулярную аттенуацию. преимущество амплификации иммуногенного сигнала при репликации жи-
Рекомбинантные бактерии вого вектора.
Конструировать аттенуированные бактерии сложнее, чем конструи- Вирусные векторы. Прототипом вирусного вектора является вирус
ровать вирусы, учитывая значительно больший размер бактериальных ге- коровьей оспы. В вирусе коровьей оспы экспрессировали десятки различ-
номов. Стратегия состоит в выявлении гена(-ов), ответственных за бакте- ных рекомбинантных полипептидов. По меньшей мере, на 25 моделях для
риальную вирулентность или колонизацию и выживание, а затем либо различных инфекций было показано, что вакцинация животных может за-
удаление гена (предпочтительный вариант), либо исключение или модули- щитить их от патогенного микроорганизма, кодирующего рекомбинантный
рование его экспрессии in vivo. Как и для вирусов, может существовать ба- полипептид. Рекомбинантные вирусы коровьей оспы, экспрессирующие
ланс между вирулентностью и активностью в качестве вакцины, что озна- опухолевые антигены, также обладали защитными функциями в исследо-
чает возможность чрезмерной аттенуации бактериального штамма до та- ваниях с введением антигенного стимула на модели рака грызунов. Учи-
кой степени, когда он более не способен реплицироваться в достаточной тывая известные осложнения иммунизации против оспы, более тяжелые у
мере для стимуляции эффективного иммунного ответа. людей с ослабленным иммунитетом, вирус коровьей оспы был сам по себе
Аттенуация штаммов V. cholerae была проделана путем рДНК- сконструирован таким образом, чтобы снизить его вирулентность без
направленной делеции генов, кодирующих факторы (такие как холерный уменьшения его эффективности как живого вирусного вектора. Цитокины
токсин (CT)). Живые аттенуированные возможные вакцины холеры, изго- могут оказывать влияние на природу или величину иммунной реакции. С
товленные таким способом, прошли клиническую оценку, и одна из них целью селективного манипулирования типом иммунного ответа на вак-
была лицензирована. Чтобы закрепить аттенуацию, снизив вероятность цинный антиген в контексте вакцинации живым вектором, был сконструи-
возврата в исходное состояние, желательно делетировать два или более не- рован рекомбинантный вектор, экспрессирующий как цитокин, так и ре-
зависимых гена или генетических локуса, участвующих в обеспечении ви- комбинантный вакцинный антиген. Вирусы оспы домашней птицы и кана-
рулентности. рейки разрабатываются в качестве живых векторов, способных инфициро-
вать клетки человека, но не давать инфекционного вирусного потомства.
6.1.2. Рекомбинантные векторы Эта неспособность к распространению позволяет классифицировать дан-
ные вирусные векторы также как вакцины на основе ДНК.
Другим применением технологии рДНК к разработке новых живых
Другие вирусы млекопитающих также послужили основой для кон-
вакцин является конструирование вирусов в качестве векторов для «чуже-
струирования живых векторов. Штаммы аденовирусов, которые широко
родных» полипептидов других патогенных микроорганизмов. Целью со-
используются в качестве вакцин среди военнослужащих с целью предот-
здания таких векторов является презентация чужеродного антигена им-
вращения острых респираторных заболеваний, были сконструированы та-
мунной системе в контексте живой инфекции, чтобы иммунная система
ким образом, чтобы экспрессировать чужеродные полипептиды, и стиму-
реагировала на антиген как на живой иммуноген, и таким образом выра-
лировали защитный иммунитет на нескольких вирусных моделях антиген-
батывала более широкий иммунитет (гуморальный и клеточный) на соот-
196 197
ного стимула у животных. Оптимизация экспрессии рекомбинантных по- мы доставки. Тем не менее, следует начинать программу разработки с по-
липептидов остается важной технической задачей для всех этих живых ви- ниманием того, что для достижения длительного защитного иммунитета
русных векторов. требуется неоднократное введение вакцины, зачастую – с последующим
РНК-вирусы могут быть сконструированы аналогичным образом. введением бустерных доз. Такие вакцины обычно функционируют путем
Sindbis и другие α-вирусы пользовались повышенным вниманием благода- стимулирования гуморальной иммунной реакции, а также инициирования
ря их широкому спектру, способности инфицировать неделящиеся клетки, иммунологической памяти.
а также потенциальному высокому уровню экспрессии в пересчете на Необходимо отметить, что конструирование рекомбинантных вирус-
клетку. Учитывая эти свойства, из Sindbis была разработана вакцина на ос- ных вакцин включает в себя:
нове нуклеиновой кислоты.  клонирование и экспрессию в различных векторах индивидуаль-
Бактериальные векторы. На основе патогенных бактерий можно ных вирусных генов с целью получения вирусных антигенов в различных
сконструировать живые рекомбинантные векторы для экспрессии чуже- экспрессионных системах в качестве высокоочищенных вакцинных препа-
родных полипептидных антигенов. Наиболее частым способом примене- ратов;
ния было конструирование желудочных патогенных организмов таким об-  клонирование и экспрессию индивидуальных вирусных антигенов
разом, чтобы они могли индуцировать иммунитет слизистых оболочек с целью получения вирусоподобных частиц;
против чужеродного полипептида при его пероральном введении. В сфере  клонирование и экспрессию вирусных антигенов в эукарио-
разработки живых бактериальных векторов максимальные усилия, касаю-
тических векторах с целью получения ДНК-вакцин.
щиеся разработки штаммов, иммунологии, молекулярных разработок и
Для рассмотрения данного вопроса остановимся на противогриппоз-
клинических испытаний были сконцентрированы на S. typhi. V. cholera и
ных вакцинах. На поверхности вирусной частицы локализуются следую-
S. flexneri также были превращены в рекомбинантные векторы для перо-
рального введения для клинической оценки. Проблемой таких живых атте- щие белки-антигены: гемагглютинин (H), нейраминидаза (N) и белок M2.
нуированных векторов остается сохранение достаточной вирулентности Установлено, что в «головке» апикальной части молекулы H локализуется
для репликации в пищеварительном тракте и экспрессия чужеродных по- 5 антигенных сайтов и вируснейтрализующая активность антител связана с
липептидов на необходимом уровне, а также достижение достаточной ат- иммунным ответом на эти сайты. Антитела к H блокируют взаимодействие
тенуации для обеспечения хорошей переносимости. Способность некото- вируса с клеточными рецепторами, т.е. инфицирование клеток. Антитела к
рых из этих видов бактерий реплицироваться внутри клетки может уси- N блокируют выделение вирусов инфицированными клетками (т.е. распро-
лить способность экспрессируемых чужеродных полипептидов стимули- странение инфекции). Антитела к белку M2 также в значительной степени
ровать клеточные иммунные реакции против соответствующих патоген- блокируют отсоединение инфекционных вирусных частиц от мембран ин-
ных организмов. фицированных клеток. Исходя из вышесказанного ясно, что из трех основ-
ных поверхностных белков принципиальное значение имеет Н. Это и ле-
6.1.3. Субъединичные / инактивированные вакцины жит в основе технологии производства субъединичных вакцин, содержа-
Преимущество субъединичных вакцин состоит в их неспособности щих преимущественно Н. Считается, что иммунитет на N имеет вспомога-
размножаться в организме хозяина. Обычно они хорошо переносятся, осо- тельное значение. Белок М2 в силу высочайшей консервативности стал
бенно вакцины, подвергающиеся многоступенчатой очистке с целью уда- объектом для конструирования универсальной вакцины против гриппа А.
ления других макромолекул. Иммуногенность такой вакцины можно уси- Таким образом, рекомбинантные вакцины с использованием индиви-
лить путем ее совместного введения с адъювантом или при помощи систе- дуальных компонентов вирусов гриппа типа А ориентированы главным

198 199
образом на ключевой и сильно вариабельный компонент вируса – молеку- другими макромолекулами среды позволяет легко отделить частицы с ис-
лу Н. Из внутренних антигенов вирусной частицы активно рассматривают- пользованием простых технологий очистки, построенных на разделении
ся в качестве материала для получения вакцин белки NP, M1, NS1. частиц по размеру. К примерам таких вакцин относятся вирус полиомие-
лита, вирус гриппа, вирус бешенства и вирус японского энцефалита. В аль-
6.1.4. Цельные патогенные организмы тернативном подходе, применяемом в случае убитой вирусной вакцины
гепатита А (HAV), инфицированные клетки подвергают лизису и проводят
Самый ранний подход к изготовлению инактивированных вакцин
очистку вирусных частиц. Вирусные частицы инактивируются химическим
состоит в использовании целых бактерий или вирусов с целью стимулиро-
путем, обычно при помощи обработки формалином, а затем их действие
вания образования антител ко многим антигенам, некоторые из которых
может усиливаться за счет адъювантов (например, гидроокиси или фосфа-
смогут нейтрализовать патогенный организм.
та алюминия). Возможно использование липосом для усиления иммуно-
Бактерии. Эти вакцины изготавливаются путем культивирования
генности вирусных вакцин. Защитные эпитопы на поверхности многих не
бактерий, сбора клеток и их инактивации при помощи нагрева или хими-
капсулированных мелких вирусов, стимулирующие защитную иммунную
ческих агентов, таких как мертиолят или фенол, формалин. Конечная вак-
реакцию часто имеют конформационную структуру, будучи сформирован-
цина не подвергается дальнейшей очистке. Благодаря отсутствию очистки
ными из высокоорганизованной совокупности структурных белков в анти-
таких вакцин, которые содержат практически все бактериальные клеточ-
генные структуры. Для большинства перечисленных вирусов, для которых
ные компоненты (а также продукты метаболизма и следовые количества
были разработаны и зарегистрированы инактивированные вакцины, оказа-
питательных сред), реактогенность таких вакцин при их парентеральном
лось невозможным полностью воссоздать конформацию таких эпитопов
введении (например, Bordetella pertussis или St. aureus ) обычно выше, чем
при помощи других технологий, например, рекомбинантных полипепти-
у других типов вакцин. С другой стороны, инактивированные цельнокле-
дов. Инактивированные вирусные вакцины обычно обладают высокой им-
точные вакцины V. cholerae и энтеротоксигенной Escherichia coli (ETEC)
мунологической активностью, например, 1 доза вакцины гепатита А обес-
хорошо переносились при пероральном введении. Пероральная инактиви-
печивает защиту в количестве 50 нг. Таким образом, эта классическая
рованная цельноклеточная вакцина холеры (WCC), лишенная токсина (и
стратегия, характеризующаяся безупречной историей создания хорошо пе-
его токсического воздействия) оказалась хорошо переносимой, а ее уро-
реносимых и эффективных вакцин, остается весьма перспективной техно-
вень эффективности составил примерно 60 % при испытании на популяции
логией, избираемой для многих вирусных вакцин.
высокого риска в течение 3-х лет. Для стимуляции антител, которые смогут
нейтрализовать токсины и повысить эффективность, рекомбинантная
6.1.5. Белковые вакцины
В-субъединица токсина, не обладающая активностью токсина, независимо
экспрессируется, очищается, и вновь добавляется к вакцине WCC. Показа- Разработка вакцины на основе белка является предпочтительной
но, что эта комбинированная вакцина WCC + r-токсин имеет несколько стратегией для многих патогенных организмов, в которых полипептид со-
более высокий уровень эффективности, чем сама вакцина WCC. держит защитные эпитопы, учитывая вышеуказанные моменты, касающи-
Вирусы. Некоторые инактивированные вирусные вакцины исполь- еся инактивированных вакцин. Подходы, берущие за основу белок, по-
зуются уже в течение десятилетий, и обычно хорошо переносятся. По- строены на генетических, биохимических и иммунологических методиках,
скольку вирусы при выращивании in vitro, как правило, выходят в клеточ- позволяющих выявлять защитные эпитопы и их соответствующие поли-
ную культуральную среду, то собирают среду от инфицированных куль- пептиды как возможные вакцинные антигены.
тур, не содержащую клеток. Крупный размер частиц вирусов в сравнении с
200 201
В последнее время биотехнологи, вместо ранее необходимых биохи- распространение вируса и потенциально может развиться в цирроз и рак
мических данных или информации об антигенах, позволяют выявлять но- печени. Каждый год умирает более миллиона хронических вирусоносите-
вые вакцинные антигены. Как только получена полная последовательность лей. Вакцинопрофилактика является единственным эффективным спосо-
(или ее части) геномной ДНК или РНК, выявляются открытые рамки счи- бом предупреждения этого заболевания.
тывания. Полученную аминокислотную последовательность можно прове- Первоначально была создана вакцина для профилактики гепатита В,
рить на наличие структурных свойств, таких как гомология с белками дру- получаемая из плазмы человека. Весьма интересен опыт, накопленный в
гих родственных патогенных организмов, являющихся кандидатами для ходе создания инактивированной вакцины против вируса гепатита В, кото-
создания вакцин, или гидрофобные N-концевые последовательности, рый, как известно, не культивируется in vitro и не размножается в организ-
предполагающие поверхностную локализацию. Гены экспрессируются в ме пригодных для широкого использования животных. Клетки печени лю-
рекомбинантных клетках хозяина (обычно E. coli), а рекомбинантный по- дей, хронически инфицированных вирусом гепатита В, выделяют избыток
липептид очищается и используется для иммунизации животных с целью вирусного поверхностного белка, т.е. поверхностного антигена гепатита В
получения поликлональных антител, чтобы выявить, вырабатывается ли (HBs-Ag) в кровь в виде вирусоподобных частиц размером 22 нм с защит-
патогенным организмом данный гипотетический белок. Антисыворотку ными эпитопами. Поэтому для производства вакцины было предложено
можно использовать также для биологических анализов (нейтрализация извлекать из плазмы клинически здоровых антигеноносителей поверх-
вирусов, опсонизация бактерий), чтобы проверить, может ли данный белок ностный антиген (HBs-Ag), очищать и концентрировать его, а затем инак-
быть привлекательным кандидатом для создания вакцины. Новый белок тивировать формалином. Антиген выделяли с помощью ультрацентрифу-
может также использоваться для иммунизации и контрольного заражения гирования, хроматографии и ферментативной обработки. Полученный
животной модели. Некоторые из ранних приложений технологии геномики препарат подвергали инактивации для уничтожения вируса гепатита В и
к вирусам имели целью выявление вируса гепатита С (HCV) и вируса гепа- других потенциально патогенных контаминантов для организма человека.
тита Е (HEV), что привело к непосредственному определению вероятных Препарат проходил клинические испытания в США, Франции, Англии,
вакцинных антигенов. Геномный подход был применен и к Neisseria Голландии, Японии. Однако, в связи с технологическими трудностями при
meningitidis, в ходе чего было обнаружено несколько вероятных вакцин- получении вакцины, ограниченностью в сырье и возможности контамина-
ных антигенов. ции препарата, эта вакцина не получила широкого применения.
Природные источники антигенов. Первые вакцины на основе бел- С 1987 г. стали доступны две рекомбинантные вакцины, вырабаты-
ка были построены на природных источниках антигенов. В данном отно- ваемые дрожжами и содержащие главный поверхностный белок вируса ге-
шении уникальна вакцина гепатита В первого поколения. Уникальность патита В – S-белок (HBs-Ag), производимые лидерами производства вак-
состоит в том, что в ней в качестве источника вакцинного антигена ис- цин: «Merck Sharp Dohme» (СШA) и «Smith Kline Beecham» (Бельгия).
пользуется ткань человека (плазма). Оценка, проведенная FDA, признала безопасность вакцины против гепати-
Гепатит В – заболевание, передающееся парентеральным или поло- та В на основе исследования 12 млн. доз, введенных детям в возрасте до 12
вым путем и являющееся 9-ой причиной заболеваемости и смертности на месяцев. Вакцина продемонстрировала высокую эффективность для защи-
планете. Инфицирование вирусом гепатита В вызывает различные клини- ты от гепатита В. В настоящее время, рекомбинантную вакцину для про-
ческие проявления: молниеносную, острую, хроническую и скрытую фор- филактики гепатита В выпускают: «GlaxoSmithKline» (Бельгия),
мы гепатита. Молниеносная и острая формы являются крайне тяжелыми, и «Heberbiotec» (Куба), «Berna Biotech» (Корея), «Instituto Butantan» (Брази-
дают высокую смертность. Хронический гепатит несет ответственность за лия), Научно-производственная компания «Комбиотех» (Россия) и ряд

202 203
других производителей. В Украине данная вакцина входит в перечень обя- Первый этап связан с реакцией между формальдегидом и NH2-
зательных прививок. группами белка. При этой реакции образуется метилоаминная группа. На
Белки, очищенные из культур B. pertussis, комбинируются для созда- этом этапе детоксикация дифтерийного токсина протекает очень быстро;
ния неклеточных вакцин против коклюша, которые со временем должны уже в 1–2-е сутки наблюдается снижение токсичности на 95 %. Однако та-
заменить цельноклеточную вакцину коклюша для текущих педиатриче- кое обезвреживание обратимо, и если из препарата удалить избыток фор-
ских вакцинаций во многих развитых странах. В зависимости от количе- малина, токсичность восстанавливается (реверсия).
ства различных белковых антигенов, эти вакцины называют одно-, двух-, На втором этапе происходят внутримолекулярные реакции: мети-
трех-, четырех- или пятикомпонентными вакцинами. Данные вакцины бы- лоаминные группы взаимодействуют с некоторыми активными радикала-
ли зарегистрированы на основании недавних исследований эффективно- ми аминокислот (амидные, индольные, фенольные и др. группы), что при-
сти. Все эти вакцины содержат в качестве компонента токсоид коклюша, водит к созданию стабильных метиленовых мостиков. Стабильного обез-
подготовка которого описана ниже. вреживания можно добиться только после второго этапа формальдегидной
Химическая инактивация. Многие бактерии вырабатывают белко- детоксикации – образования метиленовых групп. Второй этап необратим.
вые токсины, ответственные за патогенез инфекции. Уже несколько деся- Он протекает достаточно медленно (20–40 суток) при температуре
тилетий назад стало известно, что если токсин после инфицирования оста- 39–40 °С в зоне нейтральных или слабо щелочных значений рН и заверша-
вался патогенным, антитоксины (антисыворотка, обогащенная токсин- ется образованием дифтерийного анатоксина. Необходимо бы отметить,
специфическими антителами), являвшиеся эффективными в нейтрализации что условия детоксикации токсинов специфичны для каждого вида токси-
активности токсина in vivo, могут предотвратить или изменить в лучшую на.
сторону симптомы некоторых бактериальных инфекций. Этот прецедент Генетическая инактивация. Химическая процедура получения
послужил основой для введения бактериальных токсинов в состав актив- анатоксинов имеет определенные недостатки, в том числе изменение за-
ных вакцин. Молекулы токсина очищаются из бактериальных культур щитных эпитопов, ведущее к снижению иммуногенности, и потенциаль-
(например, Corynebacterium diphtheriae (D), Clostridium tetani (T), ный возврат к биологически активному токсину (реверсия). Для получения
B. pertussis (P)), а затем проходят детоксикацию путем инкубации с таким стабильных анатоксинов коклюша создавалась мутация кодонов амино-
химическим реагентом, как формалин или глутаральдегид. Токсины, ли- кислот, требуемых для биологической активности токсина (аденозин-
шенные токсических свойств, называемые токсоидами (анатоксинами), дифосфат (ADP) рибозилтрансфераза). Измененный ген заменил собой на-
представляют собой две части (D, T) комбинированной вакцины против тивный ген в родительском организме, на основе которого затем был по-
дифтерии, столбняка и коклюша (DTP). PT45, совмещенный с другими ан- лучен иммуногенный, но стабильно инактивированный анатоксин коклю-
тигенами коклюша, составляет ацеллюлярные коклюшные вакцины. В ос- ша. В усовершенствованном варианте этой стратегии в токсин коклюша
нове процесса обезвреживания токсина заложен принцип необратимого были введены две мутации для обеспечения невозможности возврата в ис-
изменения участка его белковой молекулы, ответственного за проявление ходное состояние. Этот двойной мутант коклюшного токсина, который
токсичности, при полном сохранении антигенной активности. Например, также обрабатывается формалином в более мягких условиях, чтобы улуч-
метод детоксикации дифтерийного токсина формальдегидом при темпера- шить его иммуногенность или стабильность, является компонентом ацел-
туре 37 °С был предложен Рамоном в 1924 году. При изучении механизма люлярной вакцины коклюша. В близком к этому варианте применения, му-
анатоксинообразования было установлено, что процесс перехода токсина в тантные культуры C. diphtheriae скринировались для выявления секреции
анатоксин проходит в два этапа. ферментативно неактивных, но антигенных молекул анатоксина. После-

204 205
дующее клонирование и секвенирование одного из таких мутантных генов сле иммунизации стимулирует выработку антител, которые связываются с
токсина выявило мутацию одной аминокислоты в ферментативно актив- вирионами. Рекомбинантные VLP ротавируса и парвовируса также экс-
ном сайте (также ADP-рибозилтрансферазы). Этот генетический анатоксин прессировались в виде потенциальных родительских вакцин.
(CRM197)47 является белком-носителем лицензированной конъюгирован- Многие клетки хозяев использовались для экспрессии гетерологич-
ной вакцины H. influenzae тип b (Hib). Данная технология применялась ных рекомбинантных генов. В дополнение к указанным ранее (E. coli, S.
также к токсину V. cholerae (CT) и др. cerevisiae и CHO), были разработаны системы экспрессии для клеток из
Рекомбинантные полипептиды. Первым применением технологии других видов бактерий и дрожжей, а также других стабильных клеточных
рДНК при производстве вакцин было создание вакцины против гепатита В. линий (CCL) млекопитающих, например, клетки почки африканской зеле-
С учетом того, что полученный из крови HBsAg проявил себя как хорошо ной мартышки (Vero). Целые животные и растения также могут использо-
переносимая и эффективная вакцина, ген S, кодирующий HBsAg, экспрес- ваться в качестве хозяев для рекомбинантной экспрессии. В целом, более
сировали в пекарских дрожжах S. cerevisiae, что приводило к образованию мелкие белки, не требующие посттрансляционных модификаций, могут
частиц HBsAg размером 22 нм внутри клеток. Поверхность HBsAg подоб- эффективно экспрессироваться в исходной форме в микробных системах
на поверхности вирионов HBV. Вакцина, полученная из дрожжей, доступ- экспрессии. В отличие от этого, полипептиды, которым для иммуногенно-
ная во всем мире в больших количествах, в значительной мере вытеснила сти требуются посттрансляционные модификации, например гликозилиро-
настолько же эффективную и хорошо переносимую вакцину на основе вание для надлежащей иммуногенности, экспрессируются в CCL млекопи-
плазмы. Кроме того, HBsAg экспрессировали в трансгенных листьях таба- тающих, способных к правильному осуществлению таких модификаций.
ка и клубнях картофеля. Выделенный и очищенный HBsAg сохранял вы- Новым подходом в области рекомбинантных вакцин является при-
сокую иммуногенность. менение частиц дрожжей Ty в качестве убитых носителей чужеродных
Сейчас проводятся многочисленные научные исследования и разра- белков. Дрожжевая Ty – это частица, собираемая в S. cerevisiae, которая
ботки применения технологии рДНК к производству белков – возможных не способна к репликации в организме млекопитающих. Можно экспрес-
компонентов вакцин. Основной поверхностный белок Borrelia burgdorferi сировать ген, кодирующий чужеродный белок, совместно с генами Ty та-
(OspA), экспрессированный в E. coli в виде рекомбинантного липопротеи- ким образом, что чужеродные белки вместе с белками Ty будут собираться
на, был зарегистрирован в качестве вакцины против болезни Лайма. Полу- в смешанные частицы. Благодаря тому, что чужеродные белки экспресси-
ченные рекомбинантным путем гликопротеины HSV, экспрессированные в руются на поверхности этих крупных частиц, их иммуногенность в каче-
клетках яичников китайского хомяка (CHO) и введенные в вакцину, были стве вакцинных антигенов может быть усилена.
исследованы в клинических испытаниях. Носители, основанные на белках. Во многих случаях было возмож-
Чаще всего крупные частицы более иммуногенны, чем отдельные но идентифицировать в составе полипептида В-клеточные эпитопы, про-
полипептиды. Более того, как и в случае VLP HBsAg, частицы обычно тив которых направлено действие нейтрализующих антител. Многие
стимулируют выработку антител на конформационные эпитопы частицы, в В-клеточные эпитопы являются конформационными, образующимися
то время как изолированные поверхностные полипептиды частицы могут вследствие наложения в трехмерном пространстве остатков аминокислот
не стимулировать продуцирование таких антител. Вирион человеческого из различных частей полипептида, что означает, что данным эпитопам для
вируса папилломы (HPV) – это высокоорганизованная структура, основ- надлежащей иммуногенной презентации требуется полный полипептид. В
ным белком которой является L1. Экспрессия L1 в эукариотических клет- отличие от этого, другие пептидные эпитопы линейны по своей природе, и
ках (например, S. cerevisiae) приводит к образованию VLP L1, который по- обладают всеми антигенными свойствами даже в виде коротких линейных

206 207
последовательностей длиной порядка 6–20 последовательных аминокис- муногенную презентацию при сохранении эффективного формирования
лотных остатков полипептида. Некоторые линейные эпитопы обладают частиц.
слабой иммуногенностью при их презентации на фоне полного полипепти- Носители, основанные на конъюгатах. Пептид может быть хими-
да. В других случаях природные пептиды были бы эффективными вакцин- чески конъюгирован с белком-носителем. Пептидная последовательность
ными антигенами, если бы их можно было сделать достаточно иммуноген- синтезируется химическим путем вместе с реактивным аминокислотным
ными. Линейные В-клеточные эпитопы данного типа были определены для остатком, при помощи которого происходит конъюгация с белком-
малярийного белка сиркумспорзойте (CS) (повторная последовательность, носителем. Наиболее часто используемыми белками-носителями в конъ-
состоящая из 4-х аминокислотных остатков) и для белка пилус югатах являются бактериальные белки, с которыми часто сталкивается че-
Pseudomonas aeruginosa. Оба эти полипептида содержат линейные эпито- ловек, такие как столбнячный токсоид (TT), конъюгат которого с малярий-
пы, распознаваемые антителами, которые нейтрализуют соответствующие ным эпитопом CS прошел клинически испытания.
патогенные микроорганизмы, однако целые полипептиды лишь слабо сти- Носители, основанные на комплексном пептиде. Можно синтези-
мулируют выработку таких антител. Интересно предположение, что это ровать мультимеры пептидной последовательности для совместного свя-
явление может представлять собой механизм, при помощи которого эти и зывания в повторяющиеся массивы, что применяется для пептидных эпи-
другие патогенные организмы эволюционировали с целью избегания им- топов малярийного CS и gp120 HIV-1.
мунологического контроля, делая свои эпитопы нейтрализации менее им- Носители, основанные на Т-клеточных эпитопах. Пептидные
муногенными. эпитопы, распознаваемые CTL, могут быть полезными иммуногенами для
Применение следующих стратегий (слитый белок, конъюгат, ком- профилактики инфекций, вызываемых такими возбудителями, как HIV,
плексный пептид) к слабо иммуногенным линейным эпитопам привело к или для иммунотерапии хронических заболеваний, таких как гепатит В.
иммуногенным презентациям, стимулирующим значительно более высо- Эпитопы пептида CTL обычно являются слабыми иммуногенами. Поэтому
кие титры нейтрализующих антител в сравнении с теми, которые стимули- для иммунотерапевтической вакцины гепатита В эпитоп CTL из ядерного
руются эпитопами, презентированными на фоне природного целого поли- белка HBV был модифицирован путем ковалентного связывания с
пептида. Тем не менее, наиболее эффективная стратегия по показателям Т-хелперным эпитопом (из токсоида столбняка), а также с двумя молеку-
конечной клинической пользы должна определяться в зависимости от кон- лами пальмитиновой кислоты. В ходе клинических испытаний было пока-
кретного случая. зано, что данная вакцина обладает достаточной иммуногенностью для
Носители, основанные на слитом белке. Иммуногенность линей- стимуляции HBV-специфических CTL и CTL памяти. Меланома-
ных эпитопов можно повысить при помощи генетического слияния опре- специфические Т-клеточные эпитопы в виде пептидов использовались в
деленных эпитопов с белком-носителем, который формирует крупную ча- импульсной обработке дендритных клеток in vitro для доставки пациенту.
стицу с целью улучшения иммунной презентации пептида. Двумя обычно При этом наблюдалось некоторое снижение размера опухоли.
используемыми белками – партнерами по слиянию такого типа являются Носители, основанные на полисахаридах. Ряд грамотрицательных
HBsAg и ядерный белок гепатита В (частица размером 28 нм, кодируемая и грамположительных бактерий образуют капсульную структуру, содер-
вирусом гепатита В). Слияние может происходить по N-концу, C-концу жащую полисахариды (ПС). Способность бактерий к образованию капсул
или внутренней части полипептидной последовательности белка-партнера, в значительной степени определяет взаимодействие между бактериальны-
в зависимости от того, какое расположение обеспечивает наилучшую им- ми клетками и организмом хозяина при развитии инфекционного процесса.
Капсульные антигены играют важную роль в вирулентности и иммуноген-

208 209
ности бактерий. Имеется зависимость между наличием у бактерий капсулы щищать от инфекции. Эти наблюдения позволили использовать капсуль-
и их токсичностью. Установлено, что гемолитическая активность также ные ПС в качестве вакцинных антигенов.
свойственна преимущественно капсульным формам бактерий. Капсульные
антигены способны подавлять фагоцитоз бактерий и создавать условия для 6.1.6. Индивидуальные полисахаридные вакцины
размножения возбудителей инфекции в организме хозяина. Капсульные
Нативный капсульный ПС содержит до сотен повторяющихся еди-
полисахариды несут в себе основную серологическую антигенность бакте-
ниц, характерных для каждого вида бактерий и антигенного подтипа, в ко-
риальных видов и успешно взаимодействуют с антителами к данным бак-
тором каждый мономер состоит из сочетания моносахаридов, фосфатных
териям. Такие полисахариды представляют собой эффективные вакцинные
групп и мелких органических компонентов. ПС высвобождаются организ-
антигены. В качестве примера использования полисахаридных вакцин
мом по мере его роста и собираются из культуральной среды. Эти препара-
можно привести препарат, содержащий очищенные капсульные полисаха-
ты ПС обычно обладают иммуногенностью для взрослых и детей старше
риды Streptococcus pneumoniae (Pneumo 23 – PPV 23). Вакцина полива-
2-х лет и стимулируют выработку антител, которые могут опосредовать
лентна и содержит полисахариды из 23-х серотипов бактерий. Вакцина
опсонизацию организма, таким образом, защищая его от инфекции. Вак-
PPV 23 (Sanofi Pasteur) эффективна против 90 % нечувствительных к пе-
цины ПС лицензированы для Hib64 (моновалентные для серотипа b),
нициллину пневмококков и 96 % пневмококков, вызывающих заболевания.
Neisseria meningitides (квадривалент) и Streptococcus pneumoniae
В некоторых случаях для конкретного патогенного организма имеется
(23-валентный). Недостаток этих вакцин состоит в том, что ПС, будучи
единственный серотип полисахарида, например, Haemophilus influenzae
иммуногенами, независимыми от Т-клеток (TI), обладают слабой иммуно-
типа b (HIb) против инвазивного менингита H. Influenzae типа b. В этом
генностью или не обладают иммуногенностью у детей младше 2-х лет, и не
случае можно создать моновалентную вакцину. Однако в большинстве
стимулируют иммунологическую память у старших детей и взрослых.
случаев имеют место многочисленные серотипы капсульных полисахари-
Конъюгированные вакцины. Хотя дети младше 2-х лет не могут эф-
дов (около 90 для Streptococcus pneumoniae), и такие вакцины должны быть
фективно распознавать иммуногены TI, они могут проявлять иммунологи-
мультивалентными, чтобы обладать достаточно высоким уровнем общей
ческие реакции на зависимые от Т-клеток (TD) иммуногены, например,
эффективности. Эти вакцины первого поколения были просто очищенны-
белки. Химическая конъюгация ПС с белком-носителем превращает ПС из
ми полисахаридами и обладали низкими протективными свойствами.
TI в TD иммуноген. Вследствие этого, вакцины в виде конъюгата Ps-белок
Гемофильная инфекция (возбудитель – Haemophilus influenzae b) яв-
могут стимулировать защитный иммунитет IgG и иммунологическую па-
ляется основной причиной гнойного менингита у детей до двух лет жизни,
мять у младенцев и маленьких детей. Данная стратегия особенно важна
который часто приводит к серьезным неврологическим осложнениям и ле-
для инкапсулированных бактерий, таких как Hib и S. pneumoniae (пневмо-
тальным исходам. Кроме менингита Haemophilus influenzae b вызывает пе-
кокковые; Pn), вследствие преобладания инвазивных заболеваний, вызыва-
рикардиты, эндокардиты, перитониты и другие гнойно-септические забо-
емых этими бактериями у детей младше двух лет, для которых вакцина ПС
левания. Заражение происходит воздушно-капельным путем. По данным
неэффективна.
ВОЗ ежегодно от данных инфекций умирает около 500000 детей во всех
Первая лицензированная вакцина Haemophilus influenzae b (HIb) со-
странах мира.
держала полирибосилрибатолфосфат (PRP), полисахарид капсулы микро-
Во многих, если не в большинстве изученных инкапсулированных
организма. Однако полисахаридная вакцина была недостаточно иммуно-
бактерий, антитела, направленные против капсульных ПС, способны за-
генна для детей младше 2-х лет. В связи с этим она была разрешена к ис-
210 211
пользованию только для детей старше 18 месяцев. Изучение в Финляндии Таблица 14 – Состав комбинированной вакцины
(1977 г.) подтвердило значительное снижение HIb-заболеваний и эффек- Hemophilus influenzae b (HIb)
тивность PRP-вакцины в 90 % случаев. В то же время изучение вакцины в
США показало её менее надежную эффективность. В результате этих ис- Количество
Количество Соотношение
следований и существенной потребности иметь вакцину для малолетних Название полисахари- Название
протеина полисахарид –
детей начались разработки по созданию конъюгированных вакцин. Такие вакцины да в 1 дозе, протеина
в 1 дозе, мкг протеин
конъюгированные вакцины, в которых HIb-полисахарид связан с белком, мкг
обладают рядом преимуществ: Анатоксин
 индуцируют высокие титры антител; PRP-D 25 дифтерий- 18 1,38
 более иммуногенны для малолетних детей; ный
 демонстрируют высокий иммунный ответ при ревакцинации. HbOC 10 CRМ197 25 0,4
В 1989 году было разрешено к использованию у детей младше 18 ме- Анатоксин
PRP-T 10 20–30 0,33–0,5
столбнячный
сяцев четыре конъюгированных вакцин:
Neisseria
 PRP-D – содержала полисахарид, конъюгированный с дифтерий- PRP-OMP 7,5 125 0,06
meningitidis
ным анатоксином;
 HbOC – содержала полисахарид, конъюгированный с нетоксич-
Структура капсульного полисахарида, играющего важную роль
ным мутантным дифтерийным токсином, известным как CRМ197;
в вирулентности бактерии Hаemophilus influenzae, установлена как
 PRP-OMR – содержала полисахарид, конъюгированный с белком
3-В-D-рибофунарозил (1-1)-D-рибитол-5-фосфат.
наружной мембраны Neisseria meningitidis;
Таким образом, сегодня на рынке вакцин присутствует четыре раз-
 PRP-T – содержала полисахарид, конъюгированный со столбняч- личных лицензированных вакцины – конъюгатов Hib. Все они имеют раз-
ным анатоксином. ные белки-носители (TT, DT, CRM197 и внешний мембранный белковый
Доза каждой вакцины составляет 0,5 мл. комплекс N. meningitidis группы B) с разными размерами и иммунологиче-
Вакцины содержат различное количество полисахарида и конъюги- скими параметрами, различные длины цепи Ps и различные технологии
рованного белка, причем соотношения полисахарида к белку значительно конъюгации. Учитывая эти различия, четыре вакцины имеют одно или бо-
отличаются (см. табл. 14). Изучение иммуногенных свойств четырех вак- лее различий по следующим иммунологическим свойствам: реакция 2-х ме-
цин в процессе трех иммунизаций продемонстрировало существенные от- сячных младенцев на первую дозу вакцины; реакция 4-х и 6-ти месячных
личия в продукции антител. младенцев на вторые и третьи дозы; реакция детей старше 1 года на бу-
стерную дозу; кинетика снижения уровней антител; пик титра антител и
возраст, в котором может впервые проявиться защита от клинического за-
болевания.
Бактерия Pn (пневмококковая) состоит примерно из 90 серотипов,
что отражается в отличных структурах капсулярных ПС. Для создания пе-
диатрической конъюгированной вакцины Pn было определено 7 серотипов,

212 213
ответственных за 60–75 % основных педиатрических заболеваний Pn животных моделях инфекции, особенно вирусных моделях. В поисках но-
(острый средний отит, пневмония, менингит). Недавно была лицензирова- вого пути доставки ДНК без оболочки наносили на кожу мышей, откуда
на семивалентная вакцина. Другие вакцины, проходящие расширенные она поглощалась волосяными фолликулами с целью стимуляции иммунно-
клинические испытания, состоят из смесей до 11 отдельных конъюгатов го ответа. Хотя ДНК без оболочки и оказывает стимулирующее воздей-
Pn ПС. ствие на выработку специфических антител, она особенно эффективно
стимулирует клеточные иммунные реакции.
6.1.7. ДНК вакцины. Вирусная и бактериальная доставка Особо необходимо остановиться на вирусной доставке ДНК-вакцин.
Все вышеуказанные вакцины на основе нуклеиновых кислот приводят к
Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный
помещению плазмиды в клетку. С целью доставки ДНК при помощи виру-
ответ без введения антигена, основанный на включении в клетки животно-
са оспы домашней птицы экспрессионная кассета рекомбинантного белка
го-мишени гена, кодирующего белок-антиген привел к появлению нового интегрируется в вирусный геном. Эти птичьи поксвирусы могут инфици-
типа вакцин – ДНК-вакцин. Обнаружено, что фрагменты ДНК вирусов и ровать клетки млекопитающих (человека), но не могут продуцировать ин-
бактерий, имплантированные в клетки животных, способны синтезировать фекционный вирус, следовательно, данный подход можно считать осно-
собственные белки. Сами клетки, получившие гены другого организма, в ванным на нуклеиновых кислотах. Этого единственного цикла самоогра-
ответ начинают вырабатывать антитела на вновь синтезируемые белки. ничивающей инфекции может быть достаточно для стимуляции широкого
Эксперименты по созданию ДНК-вакцин преимущественно ведутся с бак- иммунитета против патогенного организма, рекомбинантный полипептид
териальными плазмидами – небольшими стабильными кольцевыми ДНК, которого экспрессируется этими птичьими поксвирусами в инфицирован-
которые содержатся вне хромосом. Плазмиды хороши в том плане, что са- ных клетках, в то время как реактогенность должна быть минимальной,
ми по себе не провоцируют развитие инфекции. Их используют в качестве учитывая неспособность вируса распространяться в организме хозяина.
вектора – средства доставки. Для того чтобы вызвать необходимый им- Одним из вариантов конструкции экспрессионной плазмиды является
мунный ответ, выделенные из бактерий плазмиды модифицируют, внося применение системы экспрессии ДНК на основе вируса, который может
определенные изменения в структуру ДНК, а именно, «вшивают» гены, повышать уровень РНК и белковой экспрессии, что происходит при живой
которые кодируют один или несколько определенных белков-антигенов, вирусной инфекции, как было разработано для вирусных векторов Sindbis.
вырабатываемых конкретными вирусами или бактериями. Так же встраи- Использование векторов для конструирования и производства виру-
ваются в плазмиду гены, необходимые для обеспечения экспрессии всей соподобных частиц в качестве вакцин является весьма перспективным.
конструкции. Очень важно, что фрагменты ДНК, ответственные за воспро- Аденовирусы многие годы используются в качестве инструмента в мо-
изводство и развитие инфекционного процесса в плазмиды не вводятся. дельных исследованиях по генотерапии. В последние годы преимущества
Одной из стратегий было внутримышечное введение раствора ДНК, векторов на основе аденовирусов привлекают специалистов в области кон-
кодирующего вакцинный антиген. Клетки поглощают плазмидную ДНК, струирования рекомбинантных вакцин. Особенно ценной является высокая
транскрибируют ее и синтезируют антиген, который может проходить та- продуктивность аденовирусов и высокая эффективность переноса генов и
кую же обработку, как и в процессе вирусной инфекции. Преимуществами экспрессии. Векторы для вакцин конструируются с делециями по ранним
использования ДНК являются относительная техническая простота изго- генам Е1 и Е2. В ряде исследований аденовирусные векторы используют
товления и возможность направлять синтез многочисленных копий мРНК для экспрессии индивидуальных вирусных антигенов и, в частности, ге-
туда, откуда следует ожидаемое усиление как синтеза антигена, так и им- магглютининов вирусов гриппа. Серьезным недостатком этих векторов яв-
мунной реакции. Такие вакцины проявили свою эффективность на многих ляется наличие в популяции людей широко распространенного иммуните-
214 215
та, что приводит к быстрому ограничению экспрессии целевых антигенов. Впоследствии выяснилось, что клонированную ДНК можно вводить в
От 15 до 25 % популяции людей в эпидемические периоды страдают аде- клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим ко-
новирусной инфекцией. Наиболее сильным антигеном среди белков адено- личеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необхо-
вируса является гексон, антитела к которому обнаруживаются у более димо в 103–104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами.
75 % здоровых людей. В связи с этим, при планировании работ по исполь- В одном из экспериментов более чем в 75 % случаев ген включался в клет-
зованию таких векторов следует учитывать их популяционную восприим- ки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител.
чивость. В одной из серий экспериментов мышам в задние конечности вводили рас-
Векторы на основе α-вирусов – относительно новый инструмент для твор с E. Coli-плазмидой, несущей ДНК нуклеопротеина вируса гриппа А,
конструирования рекомбинантных вакцин. Вирус венесуэльского энцефа- транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса сар-
ломиелита лошадей, избирательно патогенный для лошадей, относится к комы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклео-
привлекательным объектам вирусологов. Фундаментальные проблемы ре- протеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 не-
пликации и экспрессии генома РНК-содержащих вирусов исследуются с дели после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к виру-
начала 70-х годов. Экспрессия генома этого вируса обеспечивается двумя су гриппа А. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значи-
оперонами, ранними и поздними генами. В рамки считывания поздних ге- тельно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были
нов осуществляют вставку чужеродных генов с обеспечением высокого нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная
уровня их экспрессии, сравнимого с таковым поверхностных мажорных защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппоз-
белков α-вирусов. Компания «Alfa Vax» является мировым лидером в ис- ных вакцин. Позднее состоялись первые клинические испытания на чело-
пользовании α-вирусов в качестве векторов для конструирования вакцин. веке, которые, прежде всего, продемонстрировали безопасность нового ме-
При этом следует подчеркнуть безопасность векторов на основе тода. Гены ВИЧ вносили в клетки пациентов уже зараженных вирусом.
α-вирусов: они непатогенны для человека, и в человеческой популяции не Еще позднее аналогичные эксперименты провели со здоровыми людьми.
существует иммунитета против этих вирусов, так как они никогда не цир- Кроме генов ВИЧ пересаживали гены гриппа и гепатита В. Во всех случа-
кулировали среди людей. ях вакцины приводили к иммунному ответу в виде выработки специфиче-
В первых экспериментах такого рода E.Coli-плазмиду, содержащую ских антител. Вакцины вводили либо путем инъекций, либо с помощью
клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась так называемой «генной пушки». Этот аппарат, выпуская струю сжатого
под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микроча- гелия, пробивает клеточные мембраны микроскопическими металлически-
стицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши при помощи ми частицами, покрытыми ДНК. Эта технология «генной пушки», согласно
«генной пушки». В этом методе используется сжатый гелий, содержащий отчетам, мощно стимулирующая иммунную реакцию, уже прошла исход-
частицы коллоидного золота с сорбированными на нем плазмидами экс- ные клинические испытания. Для повышения эффективности всасывания
прессирующими антиген. При этом препарат вводится в эпидермис. Пре- ДНК заключали в оболочку из катионных липидов, липосперминов или
имуществами этого метода является попадание плазмид непосредственно в других молекул, которые нейтрализуют их заряд и обладают липидными
клетки и факт того, что большая часть плазмид прямо контактирует с клет- группами для улучшения проникновения сквозь мембрану. Такие составы
ками Лангерганса. Это важно в связи с тем, что кожа богата антиген- исследовались также на предмет альтернативных путей введения (напри-
представляющими клетками (клетки Лангерганса), синтезирующими моле- мер, пероральный или назальный), которые могут стимулировать иммуни-
кулы II класса МНС (главный комплекс гистосовместимости). Поэтому тет слизистых оболочек. Было показано, что анестезирующее вещество бу-
ДНК, введенная непосредственно в кожу может быть легко ими захвачена. пивакаин, вводимое совместно с ДНК, усиливает всасывание и экспрессию

216 217
ДНК. АДФ-рибозилирующие экзотоксины, вводимые совместно с ДНК и использование ДНК-вакцины приводит к так называемому Т-хелперному
наносимые на кожу, могут стимулировать чрезкожную иммунизацию. Су- ответу (Th-1), а обычная вакцинация – к Th-2. Интерес к ДНК-вакцинам
ществуют данные о возможности «выстреливать» ДНК-вакцину, упако- стимулируется рядом свойств, которыми они обладают. Используя один и
ванную в липосомы. Облегчение воздействия может происходить на уров- тот же плазмидный или вирусный вектор можно создавать вакцины против
не клеточного всасывания, экспрессии или иммунологической активации. различных инфекционных заболеваний, меняя только последовательность,
Бактерии, реплицирующиеся внутриклеточно, можно подвергнуть кодирующую необходимые антигены. В то же время, по мнению ряда ис-
генно-инженерной обработке с целью доставки плазмидной ДНК в клетки следователей, прямая инокуляция плазмидной ДНК должна приводить к
для экспрессии рекомбинантных белков. S. flexneri был аттенуирован пу- синтезу белков in vivo, конформационная и посттрансляционная модифи-
тем создания делеционного мутанта по жизненно важному гену (asd). Хотя кация которых идентична синтезируемым при инфекционном процессе за-
такой штамм может размножаться in vitro при наличии диаминопимелино- ражения вирусом.
вой кислоты (DAP) и может оккупировать клетки, он не способен размно- Преимуществом ДНК-вакцин являются: отсутствие специальных
жаться in vivo, при отсутствии DAP. Этот штамм был трансформирован методов доставки и высокая стабильность (ДНК-вакцины стабильны даже
плазмидой, несущей эукариотический промотор и рекомбинантный ген. при комнатной температуре), высокая степень очистки, отсутствие бал-
Полученный рекомбинантный штамм S. flexneri strain оказался способным ластных белков и контаминации посторонними агентами и индуцирование
заселять клетки млекопитающих in vitro и экспрессировать белок, кодиру- у животных системного и местного иммунитета. Двукратная внутримы-
емый плазмидой, в качестве потенциального вакцинного антигена. По- шечная вакцинация собак плазмидной ДНК, экспрессирующей гликопро-
скольку S. flexneri реплицируется в кишечнике и стимулирует иммунитет теин вируса бешенства защищает животных от контрольного заражения
слизистых оболочек, данный вектор можно вводить пероральным путем с вирулентным штаммом вируса бешенства. Уже разработаны и проходят
целью доставки ДНК к клеткам, в которых стимулируется иммунитет сли- испытания ДНК-вакцины против инфекций, вызываемых вирусами гепати-
зистых оболочек. Другие аттенуированные штаммы различных видов бак- та В и С, гриппа, лимфоцитарного хориоменингита, бешенства, японского
терий (например, Salmonella, способный к заселению клеток млекопитаю- энцефалита, туберкулеза, лейшманиоза, малярии и др. Нужный ген, встав-
щих, но не к делению), также могут доставлять рекомбинантные плазмиды ляют в плазмиду или безопасный вирус. Такой носитель-вектор проникает
пероральным путем для экспрессии рекомбинантных белков в качестве в клетку и синтезирует нужные белки, обладающие протективным дейст-
вакцинных антигенов. вием. Для внедрения этих вакцин в медицинскую практику требуется ре-
При введении ДНК-вакцины активизируются клетки иммунной си- шение еще очень многих вопросов. Например, генами кодируются белко-
стемы: В-лимфоциты вырабатывают антитела, нейтрализующие антигены вые антигены, и пока нет альтернативы полисахаридным антигенам, вхо-
в жидких межклеточных тканях (гуморальный иммунный ответ), а цито- дящим в состав ряда традиционных вакцин. Несомненно, важным является
токсические Т-лимфоциты разрушают бактерии и вирусы внутри клеток разработка методов получения и очистки плазмидной ДНК, освобождение
(клеточный иммунный ответ). Получены экспериментальные данные, что от балластных примесей бактериального происхождения, хромосомной
один и тот же антиген, введенный в организм обычным методом и с помо- ДНК и примесей РНК. Самостоятельным вопросом является подбор для
щью ДНК-вакцины, продуцирует разные варианты иммунного ответа. При ДНК-вакцин адъювантов и носителей. Обращает на себя внимание вопрос
ДНК-вакцинации синтезируются иммуноглобулины – IgG2a (максимум о судьбе введенной в клетку ДНК. На сегодняшний день нет однозначного
через 6 недель), а при традиционном введении IgG1 (через 1–2 недели). ответа. ДНК может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными
При ДНК-вакцинации Т-хелперы животных секретируют интерферон-γ, а последствиями, если при этом происходит злокачественная трансформация
после обычной вакцинации – интерлейкины ИЛ-4 и ИЛ-5. Таким образом, клеток или затрагивается какой-то важный ген, что приводит к мутагенно-

218 219
му эффекту. По мнению многих исследователей, такое развитие событий Адъюванты. Соли алюминия, такие как гидроксид или фосфат, на
считается крайне маловероятным. По их мнению, такая ДНК какое-то вре- данный момент являются единственными адъювантами, широко лицензи-
мя просуществует в клетке в виде нереплицирующегося внехромосомного рованными для использования людьми. Эти адъюванты уже используется
элемента, а затем разрушится. По нашему мнению эти вопросы еще недо- в течение десятилетий в вакцинах, которые вводились более чем 1 млн.
статочно изучены и внедрение ДНК-вакцин в медицинскую практику тре-
людей во всем мире. Вакцинный антиген образует стабильную связь с со-
бует всестороннего изучения, а именно: судьба введенной ДНК-вакцины;
лью алюминия за счет ионных связей, и образует макроскопическую сус-
длительность экспрессии антигена; безвредность ДНК-вакцин; образова-
пензию в растворе. Этот адъювант преимущественно стимулирует иммун-
ние антител к самой ДНК и примесям вакцины и т.п.
Таким образом, было показано, что после того, как клетки in vivo ную реакцию типа Th-2, т.е. основанную на антителах, что не является по-
принимают ДНК, кодирующую вакцинные антигены, они могут секрети- лезным в случаях, когда для защиты необходим опосредованный клетками
роваться или связываться с клеточной поверхностью таким способом, ко- иммунный ответ. Хотя соли алюминия полезны для некоторых вакцин
торый будет запускать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Бо- (например, гепатит В, коклюш), в случае остальных вакцинных антигенов
лее того, поглощение ДНК можно усилить химическим путем или при ис- они не обладают достаточной мощностью, чтобы стимулировать иммун-
пользовании для доставки вирусов или бактерий. Последние подходы со- ный ответ, опосредованный антителами, достаточно высокий для опти-
ответствуют определению вакцины на основе ДНК как неспособной реп- мальной эффективности. Показано, что соли алюминия не обладают поль-
лицироваться в организме человека. Недавно начали проходить клиниче-
зой для презентации вакцин, вводимых пероральным или интраназальным
ские испытания вакцины ДНК без оболочки, усовершенствованные и вво-
путем. Поэтому многие химические вещества, биохимические вещества из
димые при помощи вирусов. Несмотря на то, что ДНК-вакцины разраба-
тываются более 20 лет, ни одна из таких вакцин до сих пор не разрешена к природных источников, а также белки, обладающие активностью по отно-
применению. шению к иммунной системе (цитокины) исследовались в качестве потен-
циальных адъювантов. Адъювантная способность практически всех из-
6.1.8. Разработка состава вакцин вестных составов связана с местными или системными побочными эффек-
тами, которые могут быть основаны на определенном механизме, или быть
Иммунологическая эффективность вакцин (кроме живых) может по-
неспецифическими. Идеальный адъювант должен сохранять баланс меж-
вышаться путем подбора состава, что касается окончательной формы вак-
цины, которая должна вводиться in vivo. В дополнение к «активному веще- ду степенью побочных эффектов и усилением иммунного ответа.
ству» (антиген или ДНК), состав может включать в себя адъювант и / или Некоторым бактериальным токсинам с АДФ-рибозилирующей ак-
систему доставки в дополнение к наполнителям. Адъювант – это веще- тивностью уделялось значительное внимание при их рассмотрении в каче-
ство, которое стимулирует повышенный гуморальный и / или клеточный стве адъювантов слизистых оболочек в молекулярной инженерии. В част-
иммунный ответ на совместно введенный антиген. Система доставки ности, было показано, что столбнячный токсин обладает активностью
представляет собой носитель для обеспечения презентации вакцины клет- адъюванта слизистых оболочек для совместно вводимого антигена, пре-
кам иммунной системы или для стабилизации и высвобождения антигенов зентируемого пероральным, назальным, вагинальным или ректальным пу-
в течении длительного периода времени. Адъюванты и системы доставки тями, как было впоследствии показано для термолабильного токсина (LT)
могут перекрываться по структуре и функциям. Ожидается, что многие бу- ETEC. Эти токсины состоят из каталитической субъединицы А и пента-
дущие вакцины будут содержать новые адъюванты и системы доставки.
мерной субъединицы В, которая связывается с ганглиозидом GM1 на мно-
220 221
гих типах клеток. Однако, и столбнячный токсин, и LT токсичны для лю- на. Широко лицензированных систем доставки не существует. Наработка
дей, особенно при пероральном введении, в результате которого они вызы- клинического и фармацевтического опыта с новыми системами доставки и
вают диарею. Для разделения токсичности и адъювантной способности адъювантами остается ключевой целью в данной области.
столбнячного токсина и LT были созданы точечные мутации, которые В заключении хотелось бы сказать, что технологические разработки
привели к снижению или исключению АДФ-рибозилирующей активности, последнего десятилетия значительно расширили число общих стратегий
снижению токсичности, и заметному сохранению адъювантной способ- создания новых вакцин. В следующем десятилетии количество подходов
ности у мышей. Альтернативным подходом была элиминация будет и дальше расширяться, а технические аспекты дополнительно отта-
В-субъединицы и ее замена на синтетический димерный пептид, получен- чиваться, чтобы большинство антигенов можно было представить в
ный на основе белка А Staphylococcus aureus, который связывается с им- высокоиммуногенной форме в виде живой или субъединичной вакцины.
муноглобулином (Ig). Несомненный интерес представляют данные о воз- Белковые антигены в альтернативной форме можно представить в виде
можности использования в качестве адъювантов ганглиозидов GT1 и вакцины на основе нуклеиновых кислот. Дальнейшее понимание функций
GD1a, которые при введении животным их комплекса с вирусом бешен- генов вирусных и бактериальных патогенных организмов может позволить
ства SVS повышали иммуногенность вируса и снижали летальность зара- более стабильно и предсказуемо аттенуировать живые вакцины, как в виде
женных вирусом мышей. Переносимость и эффективность адъювантов, со- вакцин, так и в виде живых векторов для иммунизации против других па-
зданных генно-инженерным путем, должны проходить оценку на людях. тогенных организмов. Технологии адъювантов должны развиваться до тех
Тема адъювантов подробно рассмотрена нами в учебном пособии: Красно- пор, пока составы, более действенные, чем соли алюминия, и настолько же
польский Ю. М., Борщевская М. И. «Фармацевтическая биотехнология: хорошо переносимые, не станут широко применимыми для субъединич-
Технология производства иммунобиологических препаратов».– Харьков, ных / инактивированных вакцин, и пока не станет возможной пероральная
НТУ «ХПИ», 2009 г. доставка очищенных белков для иммунизации. Аналогичным образом, со-
Системы доставки. Помимо презентации антигена или ДНК клет- ставы ДНК могут улучшить действенность ДНК-вакцин и их пригодность
кам иммунной системы, система доставки может осуществлять другие для доставки путями, стимулирующими иммунитет слизистых оболочек.
ключевые функции. Может иметь место «эффект депо», когда поддержи- Весьма вероятно, что по мере совершенствования этих биотехноло-
вается наличие антигена в определенном месте in vivo для постоянной сти- гических достижений лимитирующим фактором в разработке новых вак-
муляции иммунной системы. Может происходить усиление стабильности цин для применения людьми будет оставаться более полное понимание
вакцины in vivo. Для вакцин, вводимых через слизистые оболочки, система иммунологии. Одной из областей, в которых возрастание знаний имело бы
доставки может обеспечить эффективную презентацию и поглощение практическую пользу для разработки вакцин, являются иммунобиология
М-клетками, после чего происходит трансцитоз в пейеровы бляшки и пре- белков, тип и специфичность иммунной реакции, требуемые для постоян-
зентация лимфоцитам с целью индукции иммунитета слизистых оболочек. ной защиты от заболевания, приобретение иммунитета слизистых оболо-
Для некоторых составов вакцина может поддерживаться in vivo внутри фи- чек, а также оптимальная стратегия вакцинации для достижения такой за-
зической структуры в течение значительного периода времени, на протя- щиты. Ожидаются и значительные достижения в области применения вак-
жении которого она высвобождается медленно или в пульсирующем ре- цин к лечению неинфекционных заболеваний, таких как рак и аутоиммун-
жиме, чтобы она могла функционировать как однократно вводимая вакци- ные болезни.
222 223
6.2. Биотехнология цитокинов Продолжение таблицы 15

Цитокины (медиаторы) – вещества белковой природы, которые об- 1 2 3 4


разуются преимущественно в иммунокомпетентных клетках и являются Стимулирует дифферен-
средством клеточного взаимодействия. Они обеспечивают теснейшую ИЛ-5 Т-клетки, цировку В-клеток и хе-
21,5
функциональную связь между различными группами клеток. В настоящее Интерлейкин-5 тучные клетки мотаксис
время описано более 100 различных цитокинов, составляющих самостоя- эозинофилов
тельную систему регуляции иммунной системы. Практически все описан- Т-клетки, Индуцирует созревание
ные цитокины участвуют в развитии антиинфекционного иммунитета ИЛ-6 моноциты, мегакариоцитов, стиму-
21–28
(см. табл. 15). Отдельные медиаторы достаточно хорошо изучены, клони- Интерлейкин-6 макрофаги, фиб- лирует
рованы их структурные гены, получены гомологичные образцы цитокинов, робласты гепатоциты
определена их аминокислотная последовательность. Костномозговые Стимулирует рост
ИЛ-7
стромальные 25 пре-В- и пре-Т-клетки
Интерлейкин-7
Таблица 15 – Цитокины иммунного ответа клетки
Моноциты, Усиливает хемотаксис
Название Главные ИЛ-8 макрофаги, нейтрофилов,
Молекулярная Основные 8–10
(сокращенное, клетки Интерлейкин-8 Т-клетки, базофилов,
масса (кД) функции фибробласты Т-лимфоцитов
полное) продуценты
Стимулирует
1 2 3 4 ИЛ-9
Т-клетки 32–39 Т-клетки, тучные клет-
ИЛ-1α Макрофаги, Интерлейкин-9
Стимулирует Т-, ки, мегакариоциты
ИЛ-1 моноциты, 17,5 Стимулирует
В- и ЕК-клетки Моноциты,
Интерлейкин-1α, В-клетки В-клетки, тучные клет-
ИЛ-10 макрофаги,
Стимулирует 19 ки, подавляет функцию
Интерлейкин-10 Т-клетки,
макрофагов и пролифе-
ИЛ-2 рост и дифферен- В-клетки
Т-клетки 15–20 рацию Т-клеток
Интерлейкин-2 цировку Т- и Стимулирует
В-клеток ИЛ-11
Фибробласты 20–23 образование
Интерлейкин-11
Стимулирует мегакариоцитов
ИЛ-3 Т-клетки, гемопоэтические Стимулирует индукцию
В-клетки,
Интерлейкин-3 тучные клетки
15–28
клетки- ИЛ-12 и созревание Т-клеток,
моноциты, 35
Интерлейкин-12 активирует
предшественники макрофаги
ЕК-клетки
Стимулирует ИЛ-13 Т-клетки Стимулирует рост
Т-клетки, 12
рост Т- и Интерлейкин-13 (CD4, CD8) В-клеток
ИЛ-4 тучные клетки
15–20 В-клетки, инги- Индуцирует дифферен-
Интерлейкин-4 и ИЛ-14
бирует ИЛ-1 и Т-клетки 16 цировку активирован-
базофилы Интерлейкин-14
ИЛ-1 ных В-клеток
224 225
Продолжение таблицы 15 Продолжение таблицы 15

1 2 3 4 1 2 3 4
ИЛ-15 Моноциты, Стимулирует Стимулирует лимфоциты,
14–15
Интерлейкин-15 фибробласты Т-клетки, ЕК-клетки нейтрофилы, эозинофи-
Моноциты, Стимулирует ЕК-клетки, ЛТ- лы, фибробласты, разру-
ИФ- макрофаги, В-клетки и Т-клетки 33
макрофаги, 16–27 Лимфотоксин  шает инфицированные и
Интерферон  экспрессию трансформированные
Т-, В-клетки антигенов ГКГ
клетки
Стимулирует ЕК-клетки,
Фибробласты, МИФ Ингибирует миграцию
ИФ- макрофаги, В-клетки и
моноциты, 20 Фактор торможе- макрофагов, моноцитов
Интерферон  экспрессию Т-клетки 12
макрофаги ния миграции мак-
антигенов ГКГ
рофагов
Стимулирует моноциты,
МХАТ Вызывает хемотаксис мо-
макрофаги,
Моноцит- Моноциты, ноцитов, макрофагов, ре-
ИФ-γ В-клетки, и экспрессию
Т-клетки 17 хемотаксичес-кий макрофаги, 8–10 гулирует экспрессию мо-
Интерферон γ антигенов ГКГ, ингиби-
и активирующий В-клетки лекул адгезии на поверх-
рует клеточную
фактор ности этих клеток
пролиферацию
Усиливает дифференци-
Стимулирует лимфоци- ГМ-КСФ
Т-клетки, ровку мультипотентных
Моноциты, ты, нейтрофилы, эози- Гранулоцит, мак-
фибробласты, клеток-предшествен-
ФНО- макрофаги, нофилы, рофаг колоние- 22
макрофаги, ников, стимулирует
Фактор некроза Т-клетки, 17 фибробласты, разрушает стимулирующий
нейтрофилы Т-клетки, моноциты,
опухоли  нейтрофилы, инфицированные и фактор
нейтрофилы
ЕК-клетки трансформированные
Усиливает дифференци-
клетки Г-КСФ Моноциты,
Гранулоцит ровку предшественников