UNIDAD 6.

TECNOLOGÍA DEL DNA

RECOMBINANTE (5.0 horas)

Objetivo:
Reconocer las herramientas moleculares necesarias
para realizar modificación genética de las células.

6.1 Enzimas involucradas en la ingeniería genética

6.2 Vectores de clonación
6.3 Transformación genética
6.4 Clonación de genes
Transgénesis: elemento a incorporar en los programas
de mejoramiento, donde y cuando.

Dra. Ernestina Valadez Moctezuma

Universidad Autónoma Chapingo
El arte del corte

y confección de

moléculas de DNA

biológicamente

activas
 Ingeniería Genética

Es una Es también conocido como

Requiere cuatro
pasos básicos
Tecnología Clonación de genes
autorizada Tecnología del DNA
Generación recombinante
de fragmentos Clonación de moléculas
Que involucra de DNA

Cortar, modificar Tiene aplicaciones en

Surge como
y unir moléculas
de DNA
Genética molecular
Unirlos a un Ciencia pura y Microbiología
Usando vector molecular
Biotecnología
Enzimas
Usado Medicina
para Introducción a
una célula
Tales como Y fue primera
hospedera vez lograda
Pero se elevó a algunas

En 1972 en la
Enzimas de DNA Selección de Cuestiones éticas
Universidad
Restricción ligasa la secuencia y legales
de Stanford
deseada

Puede ser usado para

 Etapas básicas de la Ingeniería Genética

Ø  Método para romper y unir moléculas de DNA

procedentes de distintas fuentes: corte y confección
Ø  Disponer de un elemento genético autorreplicable
(vehículo de clonación) capaz de transferir el DNA
exógeno al organismo recipiente: vector
Ø  Método para introducir esta molécula quimérica a una
población bacteriana: transformación génetica
Ø  Método para seleccionar una población bacteriana que
lleve la molécula recombinante: selección de la clona
 Vectores

Ø  Plásmidos
Ø  Fagos, Virus
Ø  Moléculas híbridas
Ø  Cromosomas modificados
 Enzimas involucradas en la Ingenieria Genética

A. Enzimas de restricción: catalizan la hidrólisis de las uniones

fosfodiéster en ambas cadenas del DNA, ocasionando un
rompimiento de la molécula en esa zona:

ü  Son enzimas de origen bacteriano.

ü  Son endonucleasas: cortan la doble helice en regiones internas

ü  Reconocen secuencias palindrómicas de 4 a 8 pb (sitios altamente

específicos) a las que se les llama: sitios de restricción

ü  Las enzimas tipos I y III tienen actividad de endonucleasa y

metilasa y la II sólo presenta actividad de endonucleasa.
Corte de las enzimas generando extremos romos
Corte de la enzima de restricción generando extremos cohesivos
B. Enzimas DNA ligasas: Une los fragmentos de restricción.

C. Enzimas polimerasas de DNA y de RNA: Replican el

DNA o RNA

D. Enzimas modificadoras del DNA: fosfatasas, metilasas,

exonucleasas y endonucleasas.
Restricción y Metilación
Ligasa: cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre un grupo
fosfato del extremo 5´ de uno de los fragmentos y el grupo 3´ hidroxilo
del otro (unión covalente)
 ETAPAS NECESARIAS PARA CLONACIÓN

1. Obtención del gen de interés

2. Unión del gen o cassette de información a un vector molecular

3. Incorporación a huésped

4. Detección y purificación de los clones deseados

5. Producción de gran número de células o bacteriófagos que

contengan los clones deseados para su separación y análisis
Recombinación genética
en plásmidos,
transformación y selección
Agrobacterium

tumefaciens

Importancia

patogénica
Vector con elementos necesarios para la transformación en plantas
Protección para virus
Principios de la

resistencia al

herbicida

Glifosato
Potenciales aplicaciones

de la ingeniería genética

de plantas
Pasos para la

Regeneración de

Plantas de tabaco
Regeneración de plantas a partir de protoplastos
 Introduction of foreign DNA into plants
(a) The cloning vector is a plasmid carrying
sequences essential for replication and
selection in E. coli as well as Ti plasmid
sequences. Foreign DNA can be inserted
into this vector and ultimately integrated
into the genome of the host plant. In the
example shown, the luciferase gene from
firefly is transformed into a tobacco plant
using the Ti plasmid. (b) Watering the plant
with a solution of luciferin (the substrate for
firefly luciferase) results in the generation
of light by all plant tissues. This plasmid
(Ti), from the soil bacterium Agrobacterium
tumefaciens, can transform many kinds of
plants. The plasmid grows first in the
bacterium. Upon infection of the plant, the
bacterium passes the plasmid into the
plant cell. From the infected portion of the
plant, another plant can be grown in which
the plasmid has infected all cells (as in the
tobacco plant shown.) Offspring will also
have the plasmid in each cell.

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GUS 1
GUS 2
Microinyección: Consiste en inyectar el DNA en el núcleo de las células. Al
introducirlo directamente allí, se evita la degradación. Se realiza mediante un
micromanipulador y un microscopio que permite la visualización.
Liposomas: En 1965 se descubrió que los liposomas
(bolsas rodeadas de una membrana lipídica a
semejanza de una célula eucariota animal) eran
capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta
1980 se consiguió la eficiencia adecuada.

Biobalística: Consiste en el bombardeo de tejidos

con partículas de oro o tungsteno que llevan
adheridas el DNA de interés. El bombardeo se realiza
con helio comprimido como si fuera una pistola (de
allí el nombre de la técnica). Esta técnica puede
realizarse "ex vivo" (en el caso de células animales) e
"in vivo" (en el caso de células vegetales).
Transformación genética en animales y comprobación de la misma
Clonación y expresión de genes de importancia médica
Producción biotecnológica de insulina humana
DEFECTOS GENÉTICOS RESPONSABLES
DE LA OBESIDAD

ob/ob db/db
RATONES TRANSGÉNICOS PORTADORES
DE GENES “OBESOS”

fa/fa
db/db
 “Cualquier modificación biológica no
debe alterar el equilibrio y la armonía de
la Naturaleza”