MODULO 1

Replicacion del DNA:

1. Rápida: ocurre entre 100-1000 bp/segundo

2. Completa: escencialmente casi cada par de bases debe ser replicada en el genoma
3. Precisa: 1 error por cada 1010 pb sintetisadas.

Chemestry of DNA replication:

La reacción es escencialmente irreversible. Lo que hace principalmente es liberar pirofosfatp (p2)

Lo que hace la polimeraza es catalizar la síntesis de DNA. Para esto utiliza un primer 3´OH y se
anida con un secuencia de ssDNA, esto es lo que conocemos como la Primer Template Junction
(PTJ). Y ademas de esto necesita los 4 dNTPs
La porción 3´ siempre será la que tiene el OH y es la que siempre se extiende.

The DNA polymerase active site:

La polimerasa tendría la capacidad de catalizar hasta 16 reacciones como mínimo, debido a las
diferentes combinaciones y posiciones que pueden tener los nucleótidos. Pero aunque puede
catalizar 16 reacciones solo tiene un sitio activo.

Una forma que tiene la enzima es que entre nucleótidos y las bases nitrogenadas, hay una simetría
entre las estructuras. Tiene dimensiones iguales.

Pero como hace para que solo un sitio activo sea capaz de catalizar la reacción? Esto lo hace
debido a que solamente hace los enlaces entre las bases nitrogenadas CG o AT peuntes de
hidrogeno y eso pone en posición correcta al trifosfato que va a reaccionar con el OH loverando
Pi2. Si pusiera una adenina en lugar de un T en el ejemplo no podrán estar en el sitio correcto y
eso va a evitar que ocurra la catálisis.

Estructure of DNA polymerase:

Lo que tiene es una estructura de mano, esto lo dicen debido a que los dedos don los que catalizan
la reacción mientras que el pulgar siempre se mantiene estable. La palma se guna la PTJ que es
ssDNA.
Como se puede ver, la palma recibe la ssDNA (la hebra verde) y ahí es donde empieza a poner los
dNTPs que están ubicados por su cadena. The backbone es a donde se una la polimerasa el
backbone de fosfato y además a los major Groove que tiene el DNA. Dependiendo de la base que
tenga se puede leer que tiene el DNA. Pero se usa el minor groive que es mas fácil de leer y están
en la misma posiciones entre purinas y primidinas.

Esto significa que hay interacciones que no son secuencia especificas. Pero son wtson/Crick base
pare especifica en el minur Groove. Asi es como e capaz de decir que si es un par de bases y saber
si de verdad están bien unidas o no.

DNA Replication and Repair:

La unidion de dNTPs esta mediada por emparejamiento de bases y la utilización de un catión

divalente Mg2+. Los dedos de la enzima que son las O-ehlix QUE ES AL’PHA HELIX. Que forma
PIPIinteractions. La tirosina es la que principalmente se une a las bases nitrogenadas
Después están la lisina y la arginina que son las que interactúan con los beta y gama fosfatos que
tiene el nucleótido. Las dos bolitas verdes representran e Mg2+ que lo que permite es que los
fosfatos queden en la posición correcta para hacer la catálisis.

Desues de esto, se libera el pirofosfato y se separa la O hélix, debido a que hay menor afininidad
por la lina y la arginina y de esa manera vuelve a su posición original para volver a empezar con un
nuevo nucleótido. Este proceso ocurre base por base, al mismo tiempo. La unicion de los dNTPs es
mediado por el base pairing y por la utilización de Mg2+, si se usa SDS o EDTA se mata esta
reacción.

Mystakes by DNA polymerase:

La DNA polimerasa hace 1 error por cada 100000pb sintetizadas. Pero porque ocurren estos
errores en la enzima? La mayoría de los errores son purina a purina y pirimidina a pirimidina y eso
ocurre por algo conocido como los tautomeros.
Pone un G en vez de una A o pone un C en vez de una T

Hay un cambio en la posición de las bases nitrogenadas.

Al final lo que genera es que pueda unirse con otras bases en esas posiciones, generando un error
en la secuencia del genoma. Pero después esa G que estaba en enol pasa a estar en Keto lo que
hace que se separe la base que se acaba de unir incorrectamente. Una vez que hay error, la
polimerasa se detiene y ya no funciona mas.

Proofreading Exonucleases:

No es una reaccion irreversible debido a que cuando se elimina la base nitrogenada seria
esperable que se recuperaran los 2 fosfatos que se perdieron en la catálisis.

Las exonucleases degradan el DNA de una terminación. Tambien es conocida como una enzima de
restricción, las endonucleasas cortan dentro y las exonucleasas cortan en los exatremos, esta
proofreading actual en la dirección 3´a 5´. Cuando hay un error la reaccion se detiene. La
exonucleasa tiene una alta afinidad por la temrinacion 3´OH, lo que hace es quitar no solo la base
mala sino que quita algunas mas y asi vuelve a empezar de nuevo la polimerasa. La ventaja de
PREnuclease es que incrementa la precisión de 1 error en 107 en vez de 106 que se tiene
normalmente con la polimerasa.

MODULO 2

Incorporation Assay:

La idea general es que necesitamos poder separar el DNA que vamos a producir con la polymerasa
de los dNTPs que quedan en la solución con la que hacemos la reacción.

Pasos:

1. Creamos un sustrato PTJ (Primer template junction) en este caso será una ssDNA. siempre debe
ser una complementaria que sea 5´ a 3´
2. adicionar un buffer + una DNA polimerasa.

3. se inicia la reacción adicionando dNTPs y al menos un dNTP debe estar marcado con un
fluroforo o con un marcador radioactivo. (si es radioctivo hacemos sustituciones en la base
nitrogenada) un fluroforo sera como una estructura de casi 7 aniñños pegados. p32 atom en el
fosfato alfa que es el primero, beta y gamma son los otros fosfatos que hay.

4. despues de eso lo que se hace es tomar tiempo (e.g., 60 seg, 120 seg...) y necesitamos parar la
reaccion con EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético) o SDS (dodecilsulfato sódico)

Filter Binding Aincorporation Assay:

en este caso ya cuando hiciemos la incorporacion y la amplificacion, lo que necesitamos es

separar esa nueva cadena de los dNTPs que no se unieron.

1. podemos usar un papel filtro cargado positivamente (e.g., DE-81)

2. se pone la raccion en el papel.

3. lavamos el papel con un buffer que contenga sales a una cantidad supficiente que permita la
liberacion de los dNTPs pero no el DNA que acabamos de hacer. (un dNTP tiene maximo 3 cargas
negativas por el fosfato, pero un DNA tendra miles de cargar negativas por cada molecula de
fosfato que contiene) eso hace que sea facil liberar los dNTPs pero no la moleculas de DNA que
acabamos de hacer.

4. lo ultimo es cuantificar la fluorescencia o la radioactividad.

ventajas: es muy rapido de hacer y cuantitativo.

desventajas: no me dice que tan largo fue la extensión del DNA que acabamos de producir.

Electrophoresis Incorporation Assays: en este caso es cuando yo quiero saber que tanto DNA
produje con esos dTNPS fluorescentes o radiomarcados.

la idea es separar los productos de mi reaccion mediante una electroforesis.

1. para podersaber que tan largo fue mi producto tendria que hacer un gel denaturante, una
forma seria calentandolo con hidroxido de sodio si es de agarosa o usando urea si es de
poliacrilamida.
Aquí lo que vemos es que a medida que aumenta el tiempo de las reacciones podremos ver una
mayor cantidad de producto de mi reacción, alcanzando casi 5000 pares de bases.

Desventajas: puedo tener información sobre la longitud de mi producto.

Ventajas: toma mucho mas que un ensayo de incorporación de otras moléculas y es menos
cuantitativo porque no estoy cuantificando florescencia ni radioactividad.

Primer Extension Assay:

En otras ocasión lo que buscamos es

determinar el punto de partida de un gen
mirando la porción 5´ de mi template.
Hacemos una PTJ marcada. Generalmente se
hace con RNA para detectar el punto de
trascription de inicio y permite una primera
visión del sitio donde se localiza el promotor.
Lo que se usa es un primer de DNA que se va a
unir a un RNA en su porción 5´ y ahí inicia a
agregar los dNTPs la retrotranscriptasa. Algo
interesante es poder hacer una secuenciación
con una secuencia anolga que es
completamente fluresente. La cantidad de la
señl radioactiva o de flueoresencia es
directamente producional a la cantidad de
RNA. Es muy útil para detectar inserciones o
deleciones entre alelos.
 1. Lo que se hace es marcar una PTJ y no se usan dNTPs marcados.
2. No se puede analizar por flitros ni tampoco por separación de geles.

Lo que vamos a ver es bandas que son de flouresencia simiar dado que solo es esta parcando el
punto 5´de iniciación. Por esto es que no se ve como con el bromuro de etidio que hay un
manchurrón mas grande cada vez que aumenta el tiempo de la reacción pero si vamos a tener un
amplicon de igual tamaño en pb.

Processivity:

Esto se define como en numero de ciclos enzimáticos por unicion de polumerasa, otra deifnicion
es la cantidad de dNTP adicionados por cada evento de union a PTJ. Una polimerasa toma 1
milisegundo para aidicionar un dNTP una vez se ha unido. Eso quiere decir que una polimerasa
puede unier 1000 dNTPs por segundo. Pero si hablamos de replicar el genoma podríamos decir
que aproximadamente habran 50mil pegadas de dNTPS por cada PTJ.

DNA polymerase Processivity Assay:

1. Adicionamos 2x ecesos de DNA por cada PTJ que esta radiomarcada

2. Adicionamos dNTP + 1000x PTJ (que no esta marcado)
3. Después dejamos que pase el tiempo necesario para que pueda sintetizar la cantidad
suficiente. (podrían ser 50000 bp después de una unión de PTJ) eso debería tomar
5segundos. Pero se dejan 30 segundos.
4. Después lo que hacesmo es separar ese DNA por medio de un gel denaturante.
Lo que uno vería es que hay una que pudo tener una alta cantidad de producto después de la
reacción, mientras que la de baja procesividad tuvo poco producto después de la reacción.

MODULO 3

Replication in Living Cells:

1. Leading Strand DNA Polymerase: se mueve en la misma dirección que la replicación del
DNA, significa que tiene un primer que le va a permitir unirse a la reaccion. Es decir hacia
abajo. Esto lo lee en dioreccion 3´a 5´ pero sintetisa un dna que tiene estructura 5´a 3´. La
DNA polimerasa siempre requiere un primer para sintetizar DNA. El inicio de la enzima
puede darse por RNA o por DNA. En una PCR actual, la polimerasa se mueve a 1kb por
minuto (que es mucho mas lento de lo usual in vivo).
2. Laggin Strand DNA Polymerase: Se mueve lejos de la replicación del dsDNA es decir hacia
arriba. Esto se debe a la estructura antiparalela que tiene el DNA.Esto forma unos
fragmentos que se conocen como lo fragmentos de okasaki, que es porque la polimerasa
cuando va en sentido contrario se encuentra con el primer y no puede seguir mas,
entonces para y vuelve a empezar donde encuentra un primer.
3. Primase: es una DNA polimerasa pero si es una RNA polimerasa, sintetiza 6 a 8 bp RNA
primers en los replications Fork. Debido a que las polimerasa no empezar sin un primer, la
primase lo que hace es hacer primers para arranzar la accion de la DNA polimerasa (Nota:
una RNA polymerasa puede empezar un nuevo RNA basado en 2 rNTPs). Esta enzima tiene
una baja procesividad. Esta enzima es activada por la interaccion con otra enzima de
repliccionde DNA que es la DNA helicasa en bacterias. Esto es para controlar la activacion
de la replicación.

4. DNA helicase: Los que hace es separar las hebras de DNA. Esta enzima usa ATP para
separar las dos hebras del DNA. Las helisas están formadas como Ring-Shaped hexamers. Y
ese aniño lo que hace es encircles 1 banda de DNA y desplaza la segunda hebra. Por en en
el dibujito esta redonda. Lo que va pordentro de la helicasa es el DNA lo que esta por
fuera siempre va a ser desplazada. Esta enzima esta conformada por 6 componentes
diferentes, cada una de las seis estructuras tiene actividad catalitica
Lo que se ve gris en el centro es el ssDNA,

Lo que hace la enzima es que usa ATP para separar las base snitrogenadas y libera ADP, al liberar
ese ADP lo que hace es seguir con el siguiente nucleótido y lleva la cadena de DNA hacia abajo. En
las bacterias las helicasa encircles la cadena lagging y en eucariotas encircle la leading strand, es
decir la mas importante. Ahora, como podemos medir la activida de las helicasas?:

 Aquí no podemos hacer ensayos de incorporación ni nada de radioactividad o

fluoresencia. La idea es incubar nuestro circulo con un primers con helicasa, atpo, buffer y
el Mg+2, la diferencia con los otros es que la helicasa lo que hará es separar las dos hebras
que se generaron de la unión con el primer. Como lo hacemos en sal, no se podrán
reannealing. Y si calentaramos el gel, de igual forma tendríamos que obtener el mismo
resultado.
Asi se vería si se usara un primer que este unido a un fluorocromo a un primer radioactivo. Y este
es un non denaturating gell. Porque sino el gel se vería todo Pink hacia abajo. Las bajas
concentraciones de sal inhiben el reannealing. Cuando hay mucha sal eso ayuda a que se unan de
nuevo.

Propiedades helicasas: se mueven directionalmente sobre el ssDNA, esto es conocido como la

polaridad y puede ser 5´a 3´o al reves. Las helisacas solo puedne usirse a ssDNA, nunca pueden
unirse a dsDNA. Ahora vamos a ver un ensayo para evaluar la polaridad de la helicasa. Lo que
hacemos es el mismo ejemplo pero ahora cortamos con un enzima de restricción que me corta
dsDNA y me deja todo en ssDNA

Lo que hace es que se corta esa hebra de dsDNA y ahí en el punto de corte ya podria pegarse la
helicasa para poder separar las hebras del DNA. Ahora la cosa es saber que va a pasar con los
fragmentos que se van a obtener. Cogemos un gel no denaturante y lo ponemos en un X.RAY fulm
o en flourimage. El resultado seria el que se muestra a continuación.
5. Porque las hebras no se reaannealing de inmediato?
 Porque la leading strand polymerase es capaz de repilicar el ssDNA muy rápido.
 The lagging strand template se une rápidamente a SSB (single stranded DNA
binding protein). Se une al ssDNA pero no se une a dsDNA con alta afinidad. Asi
mismo previene strand annealing , esta enzima también se une a ssDNA de
manera coperativa, esto significa que cuando la enzima se pega a un ssDNA otra
llega y se pega al lado y asi suceivamente.

 Cuando se una SSB las bases persistente expuesta cuando SSB se une, asi
permite que siga la replicación por la polimerasa. Asi mismo, la afinidad de la
polimerasa por ese ssDNA sigue siendo alta.
 MODULO 4

6. Topoisomerase: la idea es que cuando la helizasa esta abriendo las dos hebras de DNA, la
cadena de dsDNA se va encogiendo entre ella misma, eso hace que sea difil mantener la
estabilidad del DNA. Esto haría que la helicasa necesite muchísima energía para poner
seguir haciendo el mismo proceso. Una hebra optima de DNA tiene 10.4 pb por cada
vuelta de las dos hebras, eso es lo optimo (eso es lo que se conoce como unstrande DNA).
Un DNA que esta upestrandes tiene menos de 10.4pb por vuelta (overwound DNA). Y
cuando tiene mas de 10.4 pb por vuelta se conoce como underwound. Lo que hace la
topoisomerasa es unwind overwound DNA or overwind underwound DNA.

La topo rompe los enlaces entre bases nitrogenadas pero los mantiene unidas, como si fuera un
puente. En este caso una tirosina se una al fosfato del extremos 5´ mientras que el otro extremo
se una al OH del 3´

La topoisomerasa vuele a unir esas bases nitrogenadas y resulta que no gasta energía, es un
proceso energéticamente neutral. No usa ATP ni nada.
La pre-topoisomerasa lo que hace es romper el enlace entre las dos, y después lo que hace es
reunirlas para permitir que el otro DNA se comparte de nuevo y forma casi como una nueva vuelta
de DNA. Lo que va a hacer esto es aumentar el numero de giros o vueltas por molecula de DNA.

Al final tenemos mas giros de los que teníamos inicialmente. Existen dos tipos de topoisomerasas,
las tipo 1 que rompen 1 strand y pasa un cadena por el roto u orificio. La tipo 2 lo que hace es
romper dos hebras y pasa dos hebras, es decir que maneja mas cantidad. Como se ve es lo
siguiente:

Uno de los problemas que tiene la tipo 1 es que no puede

decatenar 2 círculos. Los circulos después de la replicación
forma catenanes que es un anillo entrelazado con otro anillo,
mientras que las tipo puede decatenate o catenate esas
estructuras.
Aquí en la figura el writhe es 2 porque hay una doble hebra que estaba abajo mas una doble hebra
que esta arriba.

En las bacterias existen topoisomerasas tipo 2 que son mas especializadas. En las bacterias se
llama la girasa que remueve los enlaces en el DNA llevando a underwound or negatively
supercoiled DNA. Lo que hace es facilitar DNA unwind que es muy importante para la replicación y
la iniciación de la transcripción. Alfo interesante es que esta girasa necesita energía para poder
funcionar. AT/NADH.
DNA Topology:

Twist es el numero de giro de una hebra respecto a la otra. Y se puede medir contando
cuantaveces se gira sobre otra. Mientras que el whrite es cuantas veces la hebra de DNA se
entrecruza a ella misma.

El DNA circular puede tener un entrecurzamiento negativo o positivo y eso es el Writhe.

Un DNA que sea overwound tiene menos de 10.4 pb por vuelta y tiene un linking number mas
alto. Esto se va a caracterizar porque tiene una estructura mas positiva.

Por el contrario uno que es underwound tiene mas de 10.4 pb por vuelta y tiene un linking
number mas bajo debido a que va a tener menos entrecruzamientos. Por el contrario aquí tendrá
una orientación negativa.

Las topoisomerasas lo que hacen es disminuir o

aumentar el linking number que tienen las
hebras de DNA. La girasa en las bacterias lo que
aparentemente hace es supercoil el DNA de
manera negativa. Mientras que hay otras que lo
que hacen es hacerla girar de manera positiva
como algunas bacterias termófilas. Esta ultima se
conoce como la rever gyrase
¿Porque algunas bacterias usarían están enzima para
hacer DNA super enrollado y negativo? Esto es
porque esa configuración representa una mejor
capacidad para almacenar la energía. También es
mucho más fácil desenrollar el DNA que sea
enrrollado de manera negativa.

Mientras que cuando esta super enrollado, el gasto de energía será mayor y va a ser mas difícil
desenrollarlo.

Assay for Topoisomerase:

Como se hace entonces usamor típicamente un dna circular y un gel denaturante. En la imagen del
eejmplo usamos dna de e coli, y hay super coile porque la girasa lo pone en esas características. El
peso molecular de una que esta enrrollada de una que esta extendida es el mismo, pero la que
esta superocoil se mueve mucho mas rápido porque esta enrrollado. Porque ocupa menos espacio
el super coiled. El linear quedaría como en la mitad de todo eso. Como se muestra en la figura
siguiente.
Lo que pasari si pongo la toposiomerasa es que esa enzima iría con el tiempo desenrrolando el dna
hasta que llega a una estructura mas relajada. Como se ve en la figura de abajo, la progresión del
desenrrolamiento.

Una cosa que podemos hacer fácilmente es usar la critidia que tiene un DNA que esta muy
enrrollado y eso permite poder hacer un buen ensayo para medir la actividad de la toposiomerasa.
Especialmente la que ctua en este punto es la topo tipo 2 qu decatenate la K DNA de crithidia.
Okasaki Fragment Repair:

estos fragmentos aparecen aproximadamente cada 300pb. Lo que ocurre es que uno no termina la
replicación del DNA sin haber eliminado esos fragmentos de okasaki, que realmente son pequeños
fragmentos de RNA.

Este proceso es un excision repair. Los pasos son:

1. Rnase H degrada el RNA en RNA-DNA hybrid regions. Lo unico que no puede hacer la
enzima es que no puede remover el rNMP pegado al dNMP. Eso significa que el fragmeto
naranja que esta en esa cola no la puede eliminar. Eso significa que necesita otro proceso
de hidrolisis para eliminar ese RNA nucleotide.

2. Aquí es donde usamo una 5´a 3´exonuclease que quita el ultimo fragmento de RNA y
alguno de DNA. Al final lo que uno obtiene es una PTJ.
3. Despues lo que pasa una DNA polimeraza completa el gap

4. Pero al final no se pega completamente y aquí es donde aparece la DNA ligasa que une
5´pi to 3ÓH solo a nucleótidos adyacentes. Es decir que solo puede unir cuando falta 1
base, pero no se faltan 2 o mas.
Different DNA poliumerases:

La idea es que hay varias polimerasas con diferentes funciones. La DNA pol 1 actua en las 2
direcciones, eso significa que es un proffreading porque puede actuar en todas las direcciones,
pero debido a que tiene una procesividad baja solo puede arreglar algunas pb cuando existen
fragmentos de okasaki. Esta enzima es muy especializada en eso.

Las pol II, IV y V tienen mecanismos de reparación pero solo la pol II tiene la capacidad de hacer
proofreading. Mientras que la IV y la V no. Estas dos ultimas hacen proceso de bypass y no son
muy especificas en la reparación, simplemente hacen pequeños cambios. Son como un iltimo paso
para eivta grandes daños, pero algunoi errores simplemente los ignoran.
La DNA pol II core: se caracteriza porque tiene 3 subunidades, pero tiene una procesividad baja. Es
muy parecido a la pol III holo enzima que la diferencia es que tiene una procesividad mucho mas
alta.

DNA POL III HOLO ENZYME:

1. Esta enzima tiene tres copias de DNA pol II core enzime, es como la unión de 3. Tiene una
subunidad para la leading y 2 ara la lagging.
2. También tiene algo conocido como el sliding DNA clamp loader que tiene tres cipia de algo
llamado como T- y cada una se una a un subunidad del la DNA POL II HOLOENZYME, 1
copia es de delta y otra copia es de delta prime.
3. La tercera cosa es la Sliding DNA clamps, estos son factores de procesividad de la DNA pol,
tiene forma de anillo, es el circulito rojo en la figura. Y tiene 2 a 3 subunidades que pueden
estar en trimeros o dimeros. La humana tiene 3 subunidades. Lo que tienen es un agujero
en la mitad para permitir la entrada de DNA de soble cadena.
Los pasos son que primero el clamp loader se una al ATP. Y cuando se una al atro ya se puede unir
al slinding clampy cuando se une aquí el anillo de abre y le permite unirse a PTJ. Cuando pasa por
el anillo una ssDNA del DNA se pega al ATP y produce liberación de ADP. Si no pasa por el anillo,
esa liberación de ATP no ocurre.

Despues de que pasa eso, el anillo de separa y se cierra alrededor del DNA

Como funcionan todas al tiempo?

1. La parte del T en la POL III hol enzyme, estimula DNA helizase activity. Dependen entre
ellas.
2. DNA primase es estimulada por la helicasa.
3. Los sliding clamps estimulas POL III procesivity.

Después de que se libero el ADN, se une a la polymerasa el anillo o poll II en la PTJ , lo que
normalm,ente haría la pol después de avanzar es salirse de la PTJ pero el anillo no deja que se vaya
y eso aumenta la procesividad de esa enzima.
Y cuando temrina la reacción, el anillo libera rápidamente de la doble hebra.

The Trombone Model of DNA Replication:

Aquí es como se ve realmente el proceso de la replicación del DNA

Aquí se puede ver como T activa la helicasa para que vaya corriengo y separando las hebras.
También en la hebra lagging se puede ver como hay SSb debido a que se producen mas
fragmentos de okasaki. En la hebra lagging también la primase va a sintetizar un pequeño primer
en ese sentido, pero se podría esperar que la polymerasa ya haya alcanzado después a corregir
todos estos fragmento de RNA

esa primase lo que facilita es que después pueda anclarse al anillo para volver a empezar la
replicación.

Lo que provocara después es que la polymerasa pueda unirse a esa y empezar nuevamente, eso
permite que hayan 2 enzimas trabajando en la lagging y de esa manera podría eventualmente
alcanzar la velocidad de la leading strand (las tres Pol son la misma enzima).
Al final lo que pasa es que una enzima acaba y pasa a esperar nuevamente que la primase le
coloque una secuencia complementaria para arrancar.