CITOLOGIA

E HISTOLOGIA
APLICADA À FARMÁCIA
PROFA. ADRIANA BOZZI
CRONOGRAMA
 CITOLOGIA E HISTOLOGIA:
O QUE ESTUDAM?

CITO = CÉLULA HISTO = TECIDOS

Unidades morfofuncionais Estudo dos tecidos do corpo e

básicas da maioria dos de como estes se organizam
organismos vivos para consBtuir os órgãos
 TECIDOS

MATRIZ
CÉLULAS + EXTRACELULAR (MEC)
Produzem ü  Variedade de moléculas:
Controlam fibrilas, membrana basal etc
Associações e arranjos
entre células e MEC

Associações de vários
tecidos

Associações de vários
órgãos
TECIDOS ANIMAIS BÁSICOS:
 TECIDO EPITELIAL TECIDO NERVOSO TECIDO CONJUNTIVO

TECIDO MUSCULAR
 COMO ESTUDAR OS TECIDOS QUE SÃO
COMPOSTOS POR ESTRUTURAS TÃO PEQUENAS?

MICROSCÓPIOS!!!

TÉCNICAS
Aliado à: HISTOLÓGICAS
Química
Fisiologia
Imunologia
Patologia
 MICROSCOPIA

Observação de células e tecidos ao microscópio

 Microscópio de Luz ou ÓpMco ou Fotônico
Imagem visualizada por um feiche de luz que
atravessa o espécime (corte histológico)
ConsMtuição:
ü  Parte mecânica
ü  Parte ópMca
 MICROSCÓPIO DE LUZ OU ÓPTICO OU FOTÔNICO
PARTE ÓPTICA: sistema de lentes
ConsMtuição:
 Como a imagem se forma no microscópio ópMco?

Olho

Ocular

ObjeBva

Condensador

fonte de luz
Medidas usadas no estudo das células
CÁLCULO DA AMPLIAÇÃO TOTAL DE UM ESPÉCIME:

Aumento da ObjeMva X Aumento da Ocular

 PODER DE RESOLUÇÃO / LIMITE DE RESOLUÇÃO:
ü  Menor distância em que dois pontos muito próximos ainda aparecem
como objetos separados
ü  Imagem aumentada e com muitos detalhes

O tamanho das células e suas estruturas é inferior ao poder de resolução

humano
 DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia de Contraste de Fase
o  Células vivas (não coradas);
o  Usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes
(sem coloração);
o  Luz muda sua velocidade ao atravessar as estruturas celulares
o  Essas estruturas aparecem mais claras ou mais escuras - Contraste

Microscopia de luz Microscopia de Microscopia de contraste de

convencional contraste de fase fase diferencial

Céls. da crista neural

Grande aumento
 DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia de Fluorescência

o  Células ou tecidos corados com

fluorocromos fluorescentes Td Tomato
(corantes fluorescentes): FITC,
PE, DAPI etc;
o  Visualizado no microscópio por
luz ultravioleta (UV): substância
fluorescente brilha num fundo
escuro;
o  UBliza técnicas imunológicas
(anBcorpos) para idenBficar
(corar) parcculas específicas.
 DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia de Fluorescência

Cardiomiócitos diferenciados de iPSC Células de rim de hamster coradas

com alaranjado de acridina
Nucleus TNNT

α-actinin Merged

100μm
DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia de Fluorescência

IMUNOFLUORESCÊNCIA

DIRETA INDIRETA
 DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia Confocal

o  Maior precisão da imagem: um só plano é analisado de cada vez!

o  A iluminação é provida por uma fonte de laser.

Luz originada de um plano do corte cruza

o pequeno oríficio

Raios de outros planos são bloqueados

Microscópio Microscópio de
Confocal fluorescência comum

Detector

Lente objeMva

Célula
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
Baseia-se na interação entre elétrons e componentes dos tecidos
MICROSCÓPIO ÓPTICO X MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
TIPOS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA

TRANSMISSÃO VARREDURA

o  Alcssima resolução (0,1nm) o  Imagens pseudotridimensionais;

o  Cortes muito delgados (40-90nm) o  Elétrons não atravessam o espécime:
o  Parcculas ou moléculas isoladas: aumento de “varrem” a sua supermcie;
até 400.000x o  Imagens em preto-e-branco com
o  Cortes delgados de células e tecidos: aumento locais sombreados fornecendo uma
de até 120.000x ideia de três dimensões
o  Elétrons atravessam o espécime
o  Imagem resultante é sempre em preto-e-
branco: áreas escuras são elétron-densas e
áreas claras são elétron-lucentes ou elétron-
transparentes
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
Aquecimento e liberação de elétrons

Captura e aceleração de elétrons: formação de

um feixe de elétrons

Feixe de elétrons Focalização do feixe de elétrons no espécime

Formação da imagem

Ampliação da imagem

Visualização da imagem: captura dos elétrons

por um detector
Micrografia eletrônica de um macrófago

Elétron-densa

Elétron-
transparente

15.000X
Micrografia eletrônica de uma glândula adrenal

Gocculas lipídicas

Mitocôndrias

19.000X
 MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

Os elétrons não atravessam o espécime, mas os elétrons varrem uma delgada camada de
metal previamente aplicada ao espécime e são refleBdos pelos átomos do metal, que são
capturados por um detector e transmiBdos a amplificadores que geram o sinal.
 PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA
VISUALIZAÇÃO AO MICROSCÓPIO

Formação da imagem Feixe de luz atravessa Camadas delgadas de

no microscópio de luz alguma estrutura células ou tecidos

Tecidos e órgãos espessos não permitem a passagem

adequada de luz para a formação da imagem

DEVEM SER FATIADOS EM SECÇÕES OU

CORTES HISTOLÓGICOS MUITO DELGADOS
ETAPAS DO PROCESSAMENTO DE TECIDOS

Congelamento
 COLETA E SEGMENTAÇÃO DO MATERIAL
HISTOLÓGICO
o  Consiste na obtenção do fragmento de órgão a ser estudado
o  O material é reBrado e recortado em faBas de no máximo 3 mm de espessura.
 FIXAÇÃO
o  Evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes nas células (autólise);
o  Evitar putrefação;
o  Endurecer os fragmentos;
o  Preservar estrutura e composição molecular dos tecidos.

MÉTODO QUÍMICO MÉTODO FÍSICO

Agentes desnaturantes ou agentes que §  Congelamento de tecidos;

estabilizam moléculas formando pontes com §  Elimina as outras etapas de
moléculas vizinhas: FIXADORES desidratação e inclusão: tecido
pronto para ser seccionado;
Exemplos: §  M i c r ó t o m o p a r a t e c i d o s
§  Formaldeído 4%; congelados: criostato
§  Glutaraldeído

 DESIDRATAÇÃO E DIAFINIZAÇÃO
Preparo do corte histológico para receber a próxima etapa:
inclusão em parafina ou plás1co
o  DESIDRATAÇÃO: remoção da água do tecido para a entrada da substância
de inclusão; banhos de soluções de concentrações crescentes de etanol.
o  DIAFINIZAÇÃO: reBrada do álcool por solvente orgânico (miscível em
etanol e parafina ou plásBco) para a entrada da susbstância de inclusão.

DESIDRATAÇÃO DIAFENIZAÇÃO
 INCLUSÃO

o  ReBrada do diafanizador e penetração do meio de inclusão nos vazios

deixados pela água e gordura;
o  Endurece o tecido: consistência adequada para o corte em micrótomo

Parafina líquida
(56oC – 60oC)

Molde para
parafina
 MICROTOMIA
o  Obtenção de cortes finos (1 a 10μm de espessura);
o  Blocos de parafina contendo o tecido são seccionados em um micrótomo por
lâmina de aço ou vidro;
o  Os cortes são colocados para flutuar sobre a supermcie de água aquecida
(distender os cortes) e depois colocados sobre as lâminas de vidro, onde
aderem e são corados
PLANOS DE CORTE
 COLORAÇÃO

Obje1vo: facilitar a visualização dos tecidos no microscópio

Os corantes evidenciam os componentes dos tecidos, células

e MEC:

CORANTES ÁCIDOS CORANTES BÁSICOS

o  Coram estruturas básicas: o  Coram estruturas ácidas: ácidos

mitocôndrias, grânulos de nucléicos, glicosaminoglicanos,
secreção, proteínas glicoproteínas ácidas....
citoplasmáBcas e colágeno... principalmente NÚCLEO!!!
principalmente CITOPLASMA!!! o  Estruturas BASÓFILAS: afinidade
o  Estruturas ACIDÓFILAS: afinidade pelo corante básico;
pelo corante ácido; o  Exemplos: hematoxilina, azul de
o  Exemplos: eosina, orange G, toluidina, azul de meBleno
fucsina ácida
 COLORAÇÃO

Exemplo coloração por hematoxilina-Eosina (HE):

Acidófilo ou Basófilo?
Núcleo (hematoxilina – azul
ou violeta)

Citoplasma (eosina – rosa)

Acidófilo ou Basófilo?
 COLORAÇÃO

Outras combinações de corantes: TRICRÔMICO DE MASSON

Colágeno: verde azulado

Citoplasma: rosado
Núcleo: negro
Músculo: roxo
 MÉTODOS CITOQUÍMICOS E HISTOQUÍMICOS

o  IdenBficam substâncias em cortes histológicos (métodos histoquímicos)

ou cultura de células (métodos citoquímicos);
o  Diversificados: reações químicas específicas ou interações de alta afinidade
entre moléculas;
 MÉTODOS CITOQUÍMICOS E HISTOQUÍMICOS
EXEMPLOS HISTOQUÍMICOS:
Íons de cálcio em corte de osso Enzima fosfatase alcalina em corte de rim
idenBficado por histoquímica idenBficado por histoquímica (Gomori)

Fosfato de cálcio: negro Fosfato alcalina em negro

CarBlagem não calcificada: marrom
 MÉTODOS CITOQUÍMICOS E HISTOQUÍMICOS

EXEMPLOS HISTOQUÍMICOS:
Polissacarídeos em células caliciformes do intesBno Enzima lisozima (marrom) de lisossomos
(Técnica de ácido periódico-Schiff - PAS) em células do intesBno delgado
 MÉTODOS CITOQUÍMICOS E HISTOQUÍMICOS

EXEMPLO CITOQUÍMICO:
Proteína desmina (verde) idenBficada por anBcorpo em cultura de célula decidual
de camundongo. Núcleo corado pelo DAPI. Técnica de imunofluorescência.
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
 CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Manter as células vivas fora do corpo para estudá-las!

APLICAÇÕES:

Etc...
 CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS

MimeMzar o ambiente in vivo das células:

Nutrientes: meio de culBvo celular
o  Soluções de composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas)
o  Suplementos de cultura celular: soros (soro fetal bovino), matriz
extracelular, proteínas etc..

Fatores msicos:
o  Temperatura, humidade, gases: incubadoras
o  Supermcies para o crescimento celular: placas, garrafas, discos de
cultura etc
 CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Cultura primária:
 Cultura de células-tronco mesenquimais
derivadas da medula óssea humana

Microscopia de luz – contraste de fase – 100x

 Cultura de células-tronco mesenquimais
derivadas da medula óssea humana

Microscopia de luz – contraste de fase diferencial – 100x

 FRACIONAMENTO CELULAR
Técnica para isolar organelas e outros componentes
das células e tecidos
o  Processo msico: centrifugação
o  Princípio de separação por coeficientes de sedimentação
o  Série de centrifugações com aumento gradual da velocidade
 OUTRAS TÉCNICAS UTILIZADAS NO ESTUDO DAS
CÉLULAS

CITOMETRIA DE FLUXO

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

o  Caracterizar as células;
o  Separar as células (Fluorescence-AcBvated Cell
SorBng – FACS);
o  UBliza anBcorpos ligados à fluorocromo para
idenBficar a molécula alvo;
 CITOMETRIA DE FLUXO

Exemplo de citômetro de fluxo

 CITOMETRIA DE FLUXO

Tamanho x Complexidade
QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS
LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA:

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

 CITOMETRIA DE FLUXO

Tamanho x Complexidade
 AULA PRÁTICA: PROCEDIMENTOS
1- Organização dos alunos nas bancadas
2- Uso do roteiro de aula práBca (ObjeBvos, material, procedimentos, exercícios)
3- Jaleco, Lápis de cor, Atlas e livro texto (Bibliografia, acesso ao site ICB)
4- Ao fazer os desenhos ou esquemas , procure ser o mais fiel possível, indique os
nomes dos componentes visualizados na microscopia de luz ou nas micrografias
eletrônica, e faça as anotações.
5- Ao término da aula: deixe o material em ordem, reBre a lâmina e guarde-a na caixa
apropriada , cerBfique-se que:
a plaBna e o condensador estão abaixados, o diafragma esteja aberto, a menor objeBva
esteja colocada para observação, diminua a intensidade luminosa, desligue a lâmpada,
limpe e cubra o microscópio.
 USO DO MICROSCÓPIO
1- Antes de iniciar o trabalho observe se há alguma anormalidade na estrutura do
equipamento
2- Acenda a lâmpada e aumente a luminosidade, gradaBvamente
3- Regule a distância entre as oculares de modo a obter a visualização de apenas
um círculo luminoso
4-CerBfique-se de que o condensador encontra-se na parte mais elevada
5- CerBfique-se de que o diafragma encontra-se aberto
6- Verifique se a plaBna está abaixada
7- Verifique se a menor objeBva está colocada na posição de observação
8- Coloque a lâmina
9- Com o uso do macrométrico aproxime a plaBna da objeBva (CUIDADO)
10- Melhore a focalização com auxílio do micrométrico
11- SEM ABAIXAR a plaBna, troque de objeBva, corrigindo as distorções com
auxílio do micrométrico
LÂMINAS:
69, 03 e 05
LÂMINA 69: Corte de ygado
Coloração histológica: HE
Hematoxilina: corante básico (cor arroxeada)
Eosina: corante ácido (cor rósea)
LÂMINA 03: Corte de ygado
Técnica histoquímica: PAS
Contra-coloração: hematoxilina
Especificidade: grãos de glicogênio (cor bonina)
LÂMINA 05: Corte de intesMno grosso
Técnica histoquímica: Alcian Blue
Contra-coloração: hematoxilina
Especificidade: radicais ácidos (glicoproteínas e glicosaminoglicanos) – cor azulada