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E HISTOLOGIA
APLICADA À FARMÁCIA
PROFA. ADRIANA BOZZI
CRONOGRAMA
CITOLOGIA E HISTOLOGIA:
O QUE ESTUDAM?
MATRIZ
CÉLULAS + EXTRACELULAR (MEC)
Produzem ü Variedade de moléculas:
Controlam fibrilas, membrana basal etc
Associações e arranjos
entre células e MEC
Associações de vários
tecidos
Associações de vários
órgãos
TECIDOS ANIMAIS BÁSICOS:
TECIDO EPITELIAL TECIDO NERVOSO TECIDO CONJUNTIVO
TECIDO MUSCULAR
COMO ESTUDAR OS TECIDOS QUE SÃO
COMPOSTOS POR ESTRUTURAS TÃO PEQUENAS?
MICROSCÓPIOS!!!
TÉCNICAS
Aliado à: HISTOLÓGICAS
Química
Fisiologia
Imunologia
Patologia
MICROSCOPIA
Olho
Ocular
ObjeBva
Condensador
fonte de luz
Medidas usadas no estudo das células
CÁLCULO DA AMPLIAÇÃO TOTAL DE UM ESPÉCIME:
α-actinin Merged
100μm
DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia de Fluorescência
IMUNOFLUORESCÊNCIA
DIRETA INDIRETA
DIFERENTES SISTEMAS DA MICROSCOPIA DE LUZ
Microscopia Confocal
Detector
Lente objeMva
Célula
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
Baseia-se na interação entre elétrons e componentes dos tecidos
MICROSCÓPIO ÓPTICO X MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
TIPOS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA
TRANSMISSÃO VARREDURA
Formação da imagem
Ampliação da imagem
Elétron-densa
Elétron-
transparente
15.000X
Micrografia eletrônica de uma glândula adrenal
Gocculas lipídicas
Mitocôndrias
19.000X
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
Os elétrons não atravessam o espécime, mas os elétrons varrem uma delgada camada de
metal previamente aplicada ao espécime e são refleBdos pelos átomos do metal, que são
capturados por um detector e transmiBdos a amplificadores que geram o sinal.
PREPARAÇÃO DE TECIDOS PARA
VISUALIZAÇÃO AO MICROSCÓPIO
Congelamento
COLETA E SEGMENTAÇÃO DO MATERIAL
HISTOLÓGICO
o Consiste na obtenção do fragmento de órgão a ser estudado
o O material é reBrado e recortado em faBas de no máximo 3 mm de espessura.
FIXAÇÃO
o Evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes nas células (autólise);
o Evitar putrefação;
o Endurecer os fragmentos;
o Preservar estrutura e composição molecular dos tecidos.
DESIDRATAÇÃO DIAFENIZAÇÃO
INCLUSÃO
Parafina líquida
(56oC – 60oC)
Molde para
parafina
MICROTOMIA
o Obtenção de cortes finos (1 a 10μm de espessura);
o Blocos de parafina contendo o tecido são seccionados em um micrótomo por
lâmina de aço ou vidro;
o Os cortes são colocados para flutuar sobre a supermcie de água aquecida
(distender os cortes) e depois colocados sobre as lâminas de vidro, onde
aderem e são corados
PLANOS DE CORTE
COLORAÇÃO
Acidófilo ou Basófilo?
Núcleo (hematoxilina – azul
ou violeta)
Acidófilo ou Basófilo?
COLORAÇÃO
EXEMPLOS HISTOQUÍMICOS:
Polissacarídeos em células caliciformes do intesBno Enzima lisozima (marrom) de lisossomos
(Técnica de ácido periódico-Schiff - PAS) em células do intesBno delgado
MÉTODOS CITOQUÍMICOS E HISTOQUÍMICOS
EXEMPLO CITOQUÍMICO:
Proteína desmina (verde) idenBficada por anBcorpo em cultura de célula decidual
de camundongo. Núcleo corado pelo DAPI. Técnica de imunofluorescência.
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Manter as células vivas fora do corpo para estudá-las!
APLICAÇÕES:
Etc...
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Fatores msicos:
o Temperatura, humidade, gases: incubadoras
o Supermcies para o crescimento celular: placas, garrafas, discos de
cultura etc
CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS
Cultura primária:
Cultura de células-tronco mesenquimais
derivadas da medula óssea humana
CITOMETRIA DE FLUXO
o Caracterizar as células;
o Separar as células (Fluorescence-AcBvated Cell
SorBng – FACS);
o UBliza anBcorpos ligados à fluorocromo para
idenBficar a molécula alvo;
CITOMETRIA DE FLUXO
Tamanho x Complexidade
QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS
LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA:
LASER
Tamanho x Complexidade
AULA PRÁTICA: PROCEDIMENTOS
1- Organização dos alunos nas bancadas
2- Uso do roteiro de aula práBca (ObjeBvos, material, procedimentos, exercícios)
3- Jaleco, Lápis de cor, Atlas e livro texto (Bibliografia, acesso ao site ICB)
4- Ao fazer os desenhos ou esquemas , procure ser o mais fiel possível, indique os
nomes dos componentes visualizados na microscopia de luz ou nas micrografias
eletrônica, e faça as anotações.
5- Ao término da aula: deixe o material em ordem, reBre a lâmina e guarde-a na caixa
apropriada , cerBfique-se que:
a plaBna e o condensador estão abaixados, o diafragma esteja aberto, a menor objeBva
esteja colocada para observação, diminua a intensidade luminosa, desligue a lâmpada,
limpe e cubra o microscópio.
USO DO MICROSCÓPIO
1- Antes de iniciar o trabalho observe se há alguma anormalidade na estrutura do
equipamento
2- Acenda a lâmpada e aumente a luminosidade, gradaBvamente
3- Regule a distância entre as oculares de modo a obter a visualização de apenas
um círculo luminoso
4-CerBfique-se de que o condensador encontra-se na parte mais elevada
5- CerBfique-se de que o diafragma encontra-se aberto
6- Verifique se a plaBna está abaixada
7- Verifique se a menor objeBva está colocada na posição de observação
8- Coloque a lâmina
9- Com o uso do macrométrico aproxime a plaBna da objeBva (CUIDADO)
10- Melhore a focalização com auxílio do micrométrico
11- SEM ABAIXAR a plaBna, troque de objeBva, corrigindo as distorções com
auxílio do micrométrico
LÂMINAS:
69, 03 e 05
LÂMINA 69: Corte de ygado
Coloração histológica: HE
Hematoxilina: corante básico (cor arroxeada)
Eosina: corante ácido (cor rósea)
LÂMINA 03: Corte de ygado
Técnica histoquímica: PAS
Contra-coloração: hematoxilina
Especificidade: grãos de glicogênio (cor bonina)
LÂMINA 05: Corte de intesMno grosso
Técnica histoquímica: Alcian Blue
Contra-coloração: hematoxilina
Especificidade: radicais ácidos (glicoproteínas e glicosaminoglicanos) – cor azulada