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Juan Alberto Grisales, Patricia Milena García Romero, Gineth Dayana Grueso
Ficha: 1619388
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
Para comprender cómo funcionan las enzimas, es necesario saber qué son y conocer la importancia de
su estructura. Las enzimas son proteínas globulares formadas por una o más cadenas polipeptídicas
plegadas, creando una “hondonada” donde encaja el sustrato y tiene lugar la reacción.
(LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed. Omega,
Barcelona, 2006)
En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se
convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas
se las denomina reacciones enzimáticas.
Las celulosas tienen un papel fundamental en la intrincada red de degradación de la celulosa, que
pertenece a los más abundantes polisacáridos sobre la biósfera. El hombre, por ejemplo, consume
alimentos de origen vegetal y toda la celulosa presente en estos es considerada como “fibra cruda”.
Posteriormente es eliminada con las heces, pues no cuenta con enzimas para su digestión. (Raquel, s.f.).
Para determinar la actividad enzimática de la celulasa se utilizó la celulosa presente en el papel filtro
que han sido fabricados a partir de algodón de alta calidad tratado para alcanzar un contenido en celulosa
alfa del 98% (Whatman). Estos filtros de celulosa se usan en aplicaciones generales de filtración con
retención de partículas tan baja en los laboratorios.
MATERIALES Y MÉTODOS
En primer lugar se procedió a preparar 500 ml de tampón citrato a 0,05 M y para esto se pesó 5,25 g de
citrato de ácido cítrico monohidratado y se disolvió en 20 mL de agua luego se le adiciona el hidróxido
de sodio hasta que el pH de la solución fue de 4,3. Se aforó la solución hasta 25 mL, se Verificó que el
pH fuera de 4, 5; después, se Transfirió la solución a un balón aforado de 500 mL se aforó y se Verificó
que el pH fuera de 4,8. Como segundo paso se procedió a preparar el reactivo: ácido dinitrosalicílico
(DNS) para esto se Pesó 5,3 g de DNS y 9,9 g de hidróxido de sodio, se Disolvió en 500 mL de agua
destilada, se le Adiciono 3,8 mL de fenol fundido y 4,15 g de metabisulfito de sodio y se protegió el
recipiente de la luz directa. Para cuantificación de azúcares reductores totales, se tomó 100 mL de la
solución preparada, se le adiciono 30,6 g de tartrato de sodio y potasio. se calentó hasta la disolución
completa de sólidos y se completó con agua destilada hasta 146 mL. Como tercer paso se realizó la
Curva de calibración glucosa y para esto se preparó 100 mL de solución madre de glucosa (10 mg/mL)
en solución tampón de citrato y a partir de la solución madre se preparó soluciones seriadas en tubos
de ensayo de: (1,0 mL + 0,5 mL buffer = 1:1.5, 1,0 mL + 1,0 mL buffer = 1:2 , 1,0 mL + 2,0 mL buffer
= 1:3 , 1,0 mL + 4,0 mL buffer = 1:5) también se preparó otros 4 tubos de ensayos y se les adiciono a
cada uno 0,5 mL de cada una de las soluciones anteriores y se les adiciono 1 mL de tampón citrato.
Para la Determinación de la actividad enzimática se preparó una solución de enzima 1:20. se utilizó
tampón citrato para realizar las diluciones luego, En balones aforados de 20 mL se adiciono 3,5 mL,
3,0 mL, 2,0 mL, 1,0 mL y 1,5 mL de la solución (1:20) y se aforó con la solución tampón de citrato. Se
preparó 5 tubos de ensayo y se le adiciono a cada tubo 1mL de tampón citrato y 50 mg de papel filtro
enrollado. se llevó los tubos a un baño termostático a 50 °C durante 10 minutos, a cada tubo se le
adiciono 0,5 mL de las soluciones diluidas de enzima. Se dejó actuar la enzima durante 60 minutos.
después, se preparó tres tubos de ensayo adicionales con: Blanco: 1,5 mL de tampón citrato, Control
enzima: 1 mL de tampón citrato + 0,5 mL de enzima, Control sustrato: 1,5 mL de tampón citrato + 50
mg de papel filtro y todas las muestras (El blanco, controles y estándares de glucosa y enzima) se
incubaron a 50 °C durante 60 minutos y al final se detuvo la reacción ya que se le adiciono 3,0 ml de
reactivo DNS. se hirvió todos los tubos de ensayo 5,0 minutos en un baño de agua hirviendo. Para las
lecturas espectrofotométricas, se centrifugo los tubos con el papel filtro y se Diluyeron todos los tubos
en agua (0,400 mL de mezcla de cada tubo, más 5 mL de agua) y finalmente se determinó la formación
de color midiendo la absorbancia frente al blanco de reactivo a 540 nm.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Reacción del ácido cítrico con el hidróxido de Sodio, utilizada como solución buffer
Se realizó una solución patrón de glucosa y a partir de esta se hicieron disoluciones para la curva de
calibración obteniendo los siguientes datos:
3,33 0,762
2,5 0,551
1,66 0,384
1 0,206
Fuente: propia
se realizó una solución madre de enzimas y a partir de esta se hicieron disoluciones obteniendo los
siguientes datos:
ACTIVIDAD ENZIMATICA
3.0000
2.6145
2.4821
2.5000
2.0000 1.7940
1.4393
1.5000 1.2342
1.0000
0.5000
0.00250 0.00375 0.00500 0.00750 0.00875
0.0000
Fuente: propia
Con la anterior ecuación se calculó que fue necesaria una concentración de enzimas de 0,0070 para
obtener 2 mg de glucosa. Como se puede observar en la gráfica N°2
0,37
𝑈𝑃𝐹 = = 52,86
0,0070
Ecuación #2
Con la anterior ecuación se obtuvo que la actividad enzimática fue de 52,68 UPF
La UPF está basada en la Unidad Internacional (Ul), que corresponde a una conversión de sustrato de
1 µmol en un minuto. En el caso de actividad enzimática sobre papel de filtro, la UPF se define como
la formación de 1 umol/min de azucares reductores.
CONCLUSIONES
Los datos en los gráficos no presentan mucha dispersión ya que su R2 es mayor a 0,95, por lo
tanto, son aceptables.
BIBLIOGRAFÍA
https://addi.ehu.es/bitstream/handle/10810/14292/4-
%20Cap%C3%ADtulo%20I.%20Las%20enzimas.pdf?sequence=4&isAllowed=y
http://recursostic.educacion.es/ciencias/biosfera/web/profesor/practicas/Actividad_enzi
matica.pdf
http://www.scielo.org.co/pdf/abc/v11s1/v11s1a05.pdf