DETERMINACION DE PROTEINAS – METODO DE BRADFORD

FUNDAMENTO DE METODO DE BRADFORD

Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos

de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante Azul Coomassie.Absorbe luz a 595 nm.
El rango de determinación de proteínas es de 1 a 10 mg/ ml ( ensayo micro) y de 0.5 a 1.4
mg/ml(ensayo estándar). La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos
básicos y aromaticos. Método por unión de colorantes. En condiciones adecuadas los grupos
acidos o básicos de las proteínas pueden interaccionar con grupos organicos de determinados
colorantes para dar lugar a precipitados con un color característico. Para el ensayo de
Bradford se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G-250. Se basa en la conversión de la
forma leuko de colorante(marron – naranja) a una de color intensamente azul cuando los
grupos anionicos de colorante interaionan on los grupos amino de las proteínas. Dicha
reacción se mide por absorbancia a 595 nm y también existe una relación lineal dentro de
determinadas concentraciones de proteínas.Este método es muy sensible y se puede trabajar
en un rango de 20 a 140 microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50
microgramos para el micro-ensayo.

MATERIAL

- Tamiz(60 mesh)
- Mortero
- Espectrofotometro
- Agitadores
- Barras magneticas
- Centrifuga
- Tubos de ensayo
- Pipetas

Preparacion de la muestra:

- Tomar 50 gr. De frijol y moler hasta una granulometría < de mesh. Reservar una porion
para determinaion de Nitrogeno total.
- Preparar suspensiones de 5%, 10%, 15% y 20% en soluiones de Nal 0.15M y agitar por
1 hora( una por grupo)
- Centrifugar y medir el volumen de sobrenadante. Reservar una alícuota para
determacion de notrigeno total 5ml(Kjedahl)
- La muestra debe se preparada a partir de extracto haciendo una dilución de 1/20 y
tomando alícuotas de 0,1 y 0,2 ml.

Proedimiento de metdodo de Bradford

- Se prepara una solución estándar de albumina, contenida 10mg disueltos en 100ml de

NaCl 0,15M. La concentración de albumina en la solución se comprueba con un
análisis espetrofotoetrico a 278nm, en el espectro UV; la absorbancia a esta longitud
de onda, debe ser de 0,66 , si este dato no se obtiene es necesario ajustar la
conetracion.
 - Las soluciones conteniendo de 10 a 100ug de estándar de albumina, se pipetean en
tubos de 12 x 100 mm y en un volumen de 0,1ml. El volumen en el tubo de prueba
también se ajusta a 1,0ml on solución de NaCl 0,15M.
- Se agregan 5ml de reactivo, el cual se prepara de la siguiente forma: se disuelven 100
mg de azul brillante de Coomasie G- 250 en 50 ml de etanol al 95%. A esta solución se
le agregan 100ml de aido fosfórico al 85%(p/v), la solución resultante se diluye a un
volumen final de 1 litro.
- Se dibuja una grafica patrón de proteínas: cantidad de albumina( eje de la abcisas)
contra absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595nm( eje de las ordenadas)
- La solución problema se diluye on NaCl 0,15M. Se pipetea en cada en cada tubo un
volumen de 0,1 ml de la solución problema en tubos de 12 x 100mm, se le agregan 5
ml de reactivo y se lee a una longitud de onda de 595nm. Se prepara un blanco que
contenga 1,0 ml de NaCl 0,15M mas 5 ml de reactivo.
- La absorbania resultante de problema se interpola a la urva patrón y se extrapola de
esta al eje de las X para conocer la cantidad de proteína ontenida en la muestra.

Albumina [ ]ug/ml Abs

0 0,87
67 1,07
100 1,16
133 1,2
167 1,23
200 1,385