2.2.

3 MEDIOS DE CULTIVO

Medios de cultivo. Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones

adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que un
control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Características:
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,
como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan
lugar.
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo
productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificaste y de que otros
tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).
Aplicaciones:
Diagnóstico clínico en medicina humana y veterinaria:
 Detección de microorganismos patógenos a partir de muestras de fluidos,
tejidos y excretas y sus toxinas causantes de enfermedades.
Industria farmacéutica y biotecnológica
 Cultivo masivo de microorganismos productores de metabolitos (proteínas,
factores de crecimiento, aminoácidos, péptidos, antibióticos, etc.)
  Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos
terminados, aguas, residuales y ambiente)
Industria alimenticia
 Cultivo masivo de microorganismos productores de sustancias nutritivas y
alimentos (proteínas y compuestos saborizantes entre otros)
 Obtención de alimentos fermentados (yogurt, otros productos lácteos y
alimenticios)
 Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos
terminados, y ambiente)
Otras industrias y sectores productivos (agricultura, química)
 Cultivo masivo de microorganismos (obtención de polímeros, azúcares y
otros)
 Control de la calidad (control de proceso, materias primas, productos
terminados y ambiente)
Control del medio ambiente
 Control de las aguas y fuentes de abasto
 Control ambiental (aire, suelos)
 Control de residuales
Investigaciones
 Estudios morfológicos, funcionales, sistemáticos y de otro tipo, dirigidos al
conocimiento de la flora microbiana.
 Investigaciones relacionadas con el desarrollo de sustancias o productos en
las industrias y sectores anteriormente señalados.
Procedimiento:
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de
sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles
comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso
de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con
ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
2.2.3.1 EVOLUCIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo llega del micólogo Brefeld,
que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a
base de gelatina. Este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor
tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado
al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata
como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido,
diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido
transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las
colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en
relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-
agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal
planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre
las bacterias quimio autótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron
gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento.
Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química
favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus
procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos
nutrientes del medio.
En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores
de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la
producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.
Clasificación de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios pero los más
importantes son aquellos que se basan en:
a) Su consistencia
b) Su utilización
c) Su composición
d) Su origen
Según su estado físico (consistencia).
1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose
por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo
nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se
utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una
suspensión bacteriana de una determinada concentración
2) Medios solidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un
agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar gelatina: Es
una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que
es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado
porque su punto de fusión es bajo.
3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando
a estos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar
medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las
bacterias
Según su utilización
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para
que pueda producirse el crecimiento de las bacterias que no necesitan
requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar
nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este requerimiento se hace por
adición de sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores.
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una población poli microbiana. El fundamento
de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una
población microbiana específica.
4) Medio inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo
impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina
inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante
más restrictiva de los medios selectivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características
bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de
azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin
6) Medio de identificación: Son los destinados a comprobar alguna calidad
especifica que pueden servirnos para reconocer la identidad de un
microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para
asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que
vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.
7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de celular a
partir de unos microorganismos ya aislado. Se emplean en la obtención de
 vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados
para la multiplicación suelen ser líquidos
8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por
diversas reacciones nos interese mantener. Fundamentalmente se utiliza
como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el
laboratorio de microbiología.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que
no pueden sembrarse inmediatamente. Sustitución debe hacerse
introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del
medio.
Atendiendo a su composición
Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de
cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se
preparan a partir de tejidos animales y más raramente vegetales. Su
composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales donde la reproductibilidad no podrá ser exacta.
2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen su composición
exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua
destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de
composición perfectamente definida.
3) Medio semisinteticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos
para ciertos gemenes hace que la fabricación de un medio sintético para
estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan
los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico completo
Según su origen:
a) Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya
composición química no se conoce exactamente
b) Sintéticos: Son los medios que contienen una composición química definida
cual y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproductibles
c) Semisinteticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por
ejemplo el extracto de levadura
2.2.3.2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la
especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en
medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan
determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados;
normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso rehidratar. En estos
casos la preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles, se esterilizan por filtración
y se añaden al resto de los componentes después de que estos hayan sido
previamente esterilizados en la autoclave y enfriados a temperatura ambiente o a
40-50ºC si se trata de medios con agar.
Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes
adecuados (tubos, matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de distribuir en
tubos o en matraces será necesario fundir el agar en baño
María u horno microondas, una vez fundido y homogenizado, se distribuye en
caliente a los tubos o matraces (no en placas Petri) se tapa y se esteriliza en la
autoclave.
Una vez finalizada la esterilización los medios se dejaran enfriar a temperatura
ambiente y en el caso de medios sólidos contenidos en tubos deberán, en su caso,
inclinarse para que al solidificarse adopten la forma de agar inclinado o pico de
flauta(slant) si tal es su finalidad.
Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ellas
y en un ambiente aséptico (por ejemplo en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen) es conveniente homogenizar el medio en el transcurso de la operación
para evitar que el agar sedimente en el fondo del recipiente y no se distribuya por
igual en todas las placas. También es posible conservar el medio destinado a
preparar placas Petri solidificado y estéril en tubos que se fundirán al baño maría en
el momento de la preparación de las mismas.
Los caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a
temperatura ambiente pero para reducir su deshidratación y el consiguiente cambio
en las concentraciones de sus componentes es preferible conservarlos a 4ºC.