FILOGENIA DEL GENERO PANTHERA DE LA FAMILIA FELIDAE, A PARTIR

DE DNA mitocondrial Y DNA NUCLEAR

Laura Alejandra Pabón Viteri1*
laura.pabon@javeriana.edu.co1
*Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia, Estudiante Facultad de

Ciencias

Resumen
El género panthera consiste de león (P. leo), tigre (P. tigris), jaguar (P. onca),
leopardo (P. pardus) y leopardo de las nieves (P. uncia). El linaje panthera divergió
del actual grupo de felidae hace aproximadamente menos de 11millones años.
Debido a la gran radiación de panterinos en el Plioceno, no se tiene claro sus
relaciones evolutivas. Se ha usaron los genes mitocondriales ND5, cytb, 12s y
16SrRNA, y genes nucleares IRBP, TTR para reconstruir estas relaciones
filogenéticas. Tambien se evaluaron datos de GenBank para construir una
supermatriz usando máxima similitud, e inferencia filogenética Bayesiana, en
conjunto con de árboles de especies (BEST). Se contrasta los resultados
obtenidos frente a las relaciones filogenéticas, en donde se comprueban
relaciones filogenéticas y se contrasta la ubicación de especies hermanas.

1. Introducción
Gran parte de las especies de la familia Felidae son consideradas como especies
que corren peligro, esto está muy denotado en los panterinos (Baillie et al, 1996;
Davis et al, 2010). Actualmente se está buscando usar la información genética de
dichas especies, con el fin de buscar alternativas de conservación (Schipper et al,
2008; Davis et al, 2010). Los panterinos han sido el linaje que ha evolucionado
más recientemente, divergido hace aproximadamente 1-8 millones de años,
además es de los grupos más grandes de la familia Felidae. El género Panthera
está conformado por grandes félidos y de mediano tamaño. Se han asignado de 2
a 13 géneros clasificados bajo diferentes esquemas (Nowak, 1999; Yu et al, 2005),
aunque las relaciones que se han designado has sido muy controversiales.
Fig 1. Hipótesis filogenéticas del genero Panthera. Basados morfológicamente (A-
B). Basados en estudios bioquímicos y moleculares (C-M). (Davis et al, 2010)
Existe un registro fósil que provee muy poca información sobre los félidos. Estos
tuvieron una gran propagación en el Plioceno, los procesos de especiación
sucedían en un periodo de tiempo que podía llegar a ser menor a 1 millon de años
(Johnson et al, 2006; Davis et al, 2010). Se han tratado de establecer las relación
filogenéticas usando características morfológicas, bioquímicas y moleculares (Yu
et al, 2005).
Los marcadores moleculares se han usado para el estudio estructural de las
poblaciones, evalúa variación intra específica, y relaciones filogenéticas (Avise,
1994; Heup et al 2001). El DNA mitocondrial, es una molécula circular cerrada de
15-20kb. La región de control, es una región que no codifica, esta es la región que
evoluciona más rápidamente en el DNA mitocondrial (Lopez et al, 1997, Heup et
al, 2006). Existen dos casos datados en los que se usan numts (secuencia
homologas al genoma mitocondrial), en Felidae, se han hecho en gatos doméstico
(Felis catus) (Lopez et al, 1994; Heup et al, 2006).
El séptimo intron del gen Wbrinogen, del ADN nuclear se uso para establecer
relaciones filogenéticas entre panterimos altamente relacionados. Este gen ha sido
muy útil para estudios en aves y reptiles(Moyle, 2004; Creer et al, 2003), hasta el
momento no se había usado en mamíferos. Se evaluaron los genes mitocondriales
NADH deshidrogenasa (ND2 y ND4), 12SrRNA, citocromo b, 16SrRNA y ND5
(Johnson y O´brien, 1997), junto con genes nucleares interphotoreceptor retinoid-
binding protein (IRBP) y transthyretin (TTR) (Yu et al, 2004).
En estudios previos acerca de las relaciones entre félidos, se observó que el
cromosoma Y tiene bajos niveles de homoplasia ya sea por sustitución
convergente paralela o inversa (Pecon-Slattery et al, 2004). El cromosoma
haploide Y es de carácter uniparental, por lo que se hereda de padre a hijo, y no
es muy afectado por la recombinación. Siendo los haplotipos específicos de E
importantes para el estudio de la filogenia, ya que su único cambio se daría por
mutación, no por recombinación, preservando intacta gran parte de su información
e historia evolutiva (Pecon-Slattery et al, 2004).
2. Materiales y Métodos
2.1 Selección de marcadores.
Se obtuvo la secuencia completa en GenBAnk del gato doméstico de cDNA para
cada gen reportado ligado a Y X-degenerado. SMCY (EU879977), EIF1AY
(EU879973), EIF2S3Y (EU879975), DDX3Y (EU879971), USP9Y (EU879980),
UBE1Y (DQ329521), UTY (EU879982), y ZFY (EU879984) (Murphy et al., 2006;
Pearks- Wilkerson et al., 2008). Los limites putativos exon–intron se definieron
usando BLAST.
2.2 Muestras de ADN , amplificaciones PCR y secuenciación.
Se usaron muestras de P. leo (león), P. tigris (tigre), P. pardus (leopardo), P. onca
(jaguar), P. uncia (leopardo de las nieves), Neofelis nebulosi (leoparo moteado),
Otocolobus manul (Pallas’s cat), Profelis temminckii (gato asiático dorado),
Prionailurus bengalensis (leopardo asiatico), Lynx lynx (lince), Puma concolor
(puma), y Acinonyx jubatus (guepardo). Se usaron dos representantes de gatos
domesticos y un taxón outgroup de la familia Viverridae o Hyaenidae. Se asilo el
ADN de la sangre, o tejido de pelo usando el método de Sambrook et al (1989). Se
hizo una reacción en cadena de polimeraza con dos primers especificos para
félidos FGB-FeIF y FGB-FeIR para amplificar el intron 7 Wbrinogen. Para el ADN
mitocondrial se amplifico usando los primers ND2-FeIF/ND2-FeIR para ND2 y
ND4-FeIF/ND4-FeIR para ND4. Las condiciones usadas para la PCR fueron 95°C
iniciales por 5 min, 35 ciclos de 94°C de denaturacion por 1 min, anillamiento a 50-
56°C por un min, y extensión a 72°C por 1min.
Los primers EPIC (exón-primes, intron crossing) fueron diseñados usando Primer
3 (Rozen and Skaletsky, 2000). Se aislo ADN del cromosoma Y de gatos
domestiscos, se usaron clones BAC para asegurar la amplificación del cromosoma
Y. La PCR se realizó con condiciones de 94°C por 15s de denaturación,
anillamiento a 58°C por 30s, extensión a 72°C por 5 min. Se secuenciaron los
pares de primers que produjeron amplicon de una sola banda y robusta. Se evaluó
posteriormente en jaguar y leopardo moteado.
2.3 Análisis de datos.
Las secuencias se ingresaron a GenBank para realizer BLAST. Las distancias se
calcularon basado en el método TN93 de Tamura y Nei (1993). Los análisis
filogenéticos se realizó usando máxima parsimonia, máxima similitud y Bayesiano.
Para hacer pruebas para confidencialidad nodal se hizo análisis Bootstrap
heurístico (Felsenstein, 1985).

2.4 Construcción de la matriz

Para construir la supermatriz se usaron secuencias previamente publicadas de
seis especies, obtenidas en GenBank. Todas las secuencias fueron de la misma
longitud y en promedio menos un pequeño gap por segmento de gen, por lo cual
fue alineado a ojo.

3. Resultados y Discusión
Se seleccionaron los marcadores moleculares, a partir del genoma del gato
doméstico, ya que este ya ha sido secuenciado completamente. Los espacios
encontrados en el alineamiento de la secuencia de cDNA felino relativos al
genoma humano y a los ratones fueron usados para aproximar la ubicación de los
límites de los exones y de los intrones. Se asignaron los primers, para secuencias
del jaguar, y posteriormente se secuencio su genoma. Se secuenciaron tres
segmentos de genes, para todas las especies de panterinos. Con las secuencias
se construyó una matriz incluyendo todas las redundancias representadas por
nuevas secuencias. Se realizaron arboles de probabilidad de similitud: Los arboles
de los genes se estimaron independientemente para cada locus (Davis et al,
2010).
Las inferencias de filogenia provistas por análisis de máxima similitud, inferencia
filogenética Bayesiana y BEST, todos reconstruyen la misma topología (Fig. 2)
Fig. 2. Probabilidad de emparentamiento teniendo en cuenta los datos usado para armar la matriz
(Davis et al, 2010).

Los leones, leopardos y jaguares comparten un set características comunes que

las distingue de un segundo clado que contiene al tigre. Los resultados apoyan la
monofilia del león-leopardo-jaguar y tigre- leopardo de las nieves. Esto apoyado en
análisis mitocondrial RFLP. La supermatriz apoya la monofilia entre león, leopardo
y jaguar, basado en datos morfológicos y moleculares (tabla 1).
Tabla 1. Relación de las especies del genero Panthera para la supermatriz y análisis particionado.
Máxima similitud, valores no paramétricos de bootstrap, probabilidades posteriores Bayesianas
(Davis et al, 2010).

Fig. 3 Hipótesis de las relaciones filogeneticas de Panthera deducido de A) genes parciales

12SrRNA. B) Genes parciales 16SrRNA y ND5. C) Construcción de un superarbol uniendo 25 años
en estudios de sistemática. D) Genes parciales 12SrRNA, 16SrRNA, ND5 y cyth incluyendo
caracteres morfológicos. E) Señales químicas. F) Region de control mtDNA complete.

Se encontro que P.tigris es el taxon hermano de otros mienbros del genero

Panthera, en donde el clado contiene a los otros miembros del género, P.uncia y
P.pardus las cuales son especies hermanas, seguidas de P.leo y finalmente P.
onca. Estudios moleculares y morfológicos favorecen el posicionamiento de P.
uncia como el taxón más basal en el género (Fig 3.B-D) (L. Yu et al, 2005).

Conclusión
Se desarrolló una filogenia para independiente para los panterinos, usando
información previamente publicada como complemento. Se sacaron inferencias
filogenéticas, a partir de las probabilidades de emparentamiento y de la inferencia
filogenética Bayesiana. Se construyó una topología para el género pantera más
exacta partiendo de una cantidad considerable de regiones genómicas. Se
demostró que la interpretación que se tenía de la filogenia del genero Panthera en
publicaciones previas presenta varias inconsistencias. Los tiempos de divergencia
entre las especies fueron estimados. Con la matriz armada, se apoya la monofilia
de los leones, leopardos y jaguares, considerando también rasgos morfológicos
(Davis et al, 2010).

Bibliografía:
Avise, J.C., 1994. Molecular Markers, Natural History and Evolution, Chapman and
Hall, New York.
Baillie, J., Groombridge, B., 1996. IUCN red list of threatened animals.
International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, Gland,
Switzerland.
Schipper, J., Chanson, J.S., Chiozza, F., Cox, N.A., Hoffmann, M., Katariya, V.,
Lamoreux, J., Rodrigues, A.S.L., Stuart, S.N., Temple, H.J., Baillie, J., Boitani, L.,
Lacher Jr., T.E., Mittermeier, R.A., Smith, A.T., Absolon, D., Aguiar, J.M., Amori,
G., Bakkour, N., Baldi, R., Berridge, R.J., Bielby, J., Black, P.A., Blanc, J.J.,
Brooks, T.M., Burton, J.A., Butynski, T.M., Catullo, G., Chapman, R., Cokeliss, Z.,
Collen, B., Conroy, J., Cooke, J.G., da Fonseca, G.A.B., Derocher, A.E., Dublin,
H.T., Duckworth, J.W., Emmons, L., Emslie, R.H., Festa-Bianchet, M., Foster, M.,
Foster, S., Garshelis, D.L., Gates, C., Gimenez-Dixon, M., Gonzalez, S., Gonzalez-
Maya, J.F., Good, T.C., Hammerson, G., Hammond, P.S., Happold, D., Happold,
M., Hare, J., Harris, R.B., Hawkins, C.E., Haywood, M., Heaney, L.R., Hedges, S.,
Helgen, K.M., Hilton-Taylor, C., Hussain, S.A., Ishii, N., Jefferson, T.A., Jenkins,
R.K.B., Johnston, C.H., Keith, M., Kingdon, J., Knox, D.H., Kovacs, K.M.,
Langhammer, P., Leus, K., Lewison, R., Lichtenstein, G., Lowry, L.F., Macavoy, Z.,
Mace, G.M., Mallon, D.P., Masi, M., McKnight, M.W., Medellin, R.A., Medici, P.,
Mills, G., Moehlman, P.D., Molur, S., Mora, A., Nowell, K., Oates, J.F., Olech, W.,
Oliver, W.R.L., Oprea, M., Patterson, B.D., Perrin, W.F., Polidoro, B.A., Pollock, C.,
Powel, A., Protas, Y., Racey, P., Ragle, J., Ramani, P., Rathbun, G., Reeves, R.R.,
Reilly, S.B., Reynolds III, J.E., Rondinini, C., Rosell-Ambal, R.G., Rulli, M.,
Rylands, A.B., Savini, S., Schank, C.J., Sechrest, W., Self-Sullivan, C.,
Shoemaker, A., Sillero- Zubiri, C., De Silva, N., Smith, D.E., Srinivasulu, C.,
Stephenson, P.J., van Strien, N., Talukdar, B.K., Taylor, B.L., Timmins, R., Tirira,
D.G., Tognelli, M.F., Tsytsulina, K., Veiga, L.M., Vie, J.-C., Williamson, E.A., Wyatt,
S.A., Xie, Y., Young, B.E., 2008. The status of the world’s land and marine
mammals: diversity, threat, and
knowledge. Science 322, 225–230.
Brian W. Davis, Gang Li; William J. Murphy. 2010. SUpermatrix and species tree
methods resolve hylogenetic relationships within the big cats, Panthera (Carnivora:
Felidae). Molecular Phylogenetics and Evolution 56: 64-76.
Jae-Heup Kim, Agistinho Antunes, Shu-Jin Luo, Joan Menninger, William G. Nash,
Stephen J. O´Brien, Warren E. Johnson., 2006. Evolutionary analysis of a large
mtDNA translocation (numt) into the nuclear genome of the Panthera genus
species. Gene. 366: 292- 302.
Kim Jae-Heup, E. Eizirik, S.J. O¨Brien, W.E. Johnson., 2001. Sttruture and
patterns of sequence variaation in mitochondrial DNA control región of great
cats.Mitochondrion 14: 279-292.
Lopez, J.V., Yuhki, N., Masuda, R., Modi, W., O’Brien, S.J., 1994. Numt, a recent
transfer and Tandem amplification of mitochondrial DNA to the nuclear genome of
the domestic cat. J. Mol. Evol. 39 (2), 174–190.
Li Yu, Ya-ping Zhang., 2005. Phhylogenetic studies of pantherine cats (Felidae)
base don multiple genes, with novel application of nuclear B-fibrinogen intron 7 to
carnivores. Molecular Phylogenetics and Evolution. 35: 483-495.
Nowak, R.M., 1999. In: Walker’s Mammals of the World, sixth ed., vol. 2. Johns
Hopkins University Press, Baltimore, MD
Felsenstein, J., 2004. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6.
Department of Genome Sciences. University of Washington, Seattle, WA.

Tamura, K., Nei, M., 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in
the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol.
Evol. 10, 512–526.

Rozen, S., Skaletsky, H.J., 2000. Primer3 on the WWW for general users and for
biologist programmers. In: Krawetz, S., Misener, S. (Eds.), Bioinformatics Methods
and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp.
365–386.