A Ñ O D E L A D I V E R S I F I C A C I O N P R O D U C T I VA Y D E L

F O RTA L E C I M I E N T O D E L A E D U C A C I O N

Universidad Nacional de
Piura
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS
BIOLOGICAS
PROFESOR: Ing. ROBERTO Mendoza
Rendón

A LU M N O S : A R A N D A A LV A R A D O
JONATHAN

SEMINARIO N* 7 :
EXPERIMENTO DE KORNBERG
REFERENTE A LA COMPOSICION DE
LA S B A S E S D E L A D N
BREVE INTRODUCCION AL EXPERIMENTO DE ARTUR KORNBERG :

• Fue un bioquímico estadounidense.

• Nacido en Brooklyn el 3 de marzo de

1918, estudió en el City College de
Nueva York y obtuvo el título de
graduado en Medicina por la
Universidad de Rochester en 1941,
siendo después alumno interno en el
Strong Memorial Hospital en
Rochester.

• Desde 1942 hasta 1952 trabajó en los

laboratorios de los Nacional Institute of
Health (NIH), haciendo algunas
estancias en otros centros de
investigación. Una de ellas fue en la
Universidad de Nueva York para Arthur Kornberg (Brooklyn,
trabajar con Severo Ochoa, con quien Nueva York, 3 de marzo de
compartiría, posteriormente, el Premio 1918 - 26 de octubre de
Nobel de Fisiología o Medicina (1959). 2007)
Objetivo del experimento :
• Su objetivo fue lograr la síntesis de ácidos
nuclèicos fuera de la célula viva, utilizando como
patrón ADN natural, generando asi un ADN
completamente sintético que posea las mismas
propiedades que el material nativo.
Hipótesis de la investigación :
Hipótesis sobre la aplicación de los átomos radiactivos:

Esta hipótesis se basa en el uso de átomos radiactivos para

marcar el nucleótido, de modo que incluso en pequeñas
cantidades, pudiéramos detectar su incorporación en el ácido
nucléico.
Lamentablemente los sistemas enzimáticos para la síntesis
del acido nucleico, encontrados en extractos de timo, médula
ósea y células bacterianas, poseen una potente actividad para
degradar los ácidos nucleicos, y por esta razón agregaron los
nucleótidos marcados a un conjunto de ácidos nucleicos,
porque aunque en la mezcla hubiera destrucción neta de
ácidos nucleicos, podría detectarse la síntesis de unas pocas
moléculas atrapadas en el conjunto.
Hipótesis de la precipitación de Ácidos nucleídos:

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su

purificación y concentración. Se basa en la
simultánea neutralización de las cargas negativas
(mediante el añadido de sales), y deshidratación de
la molécula (mediada por el agregado de alcoholes,
típicamente etanol o isopropanol ), lo cual lleva a su
precipitación.

La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no
debe ser confundido ni con la desnaturalización
(potencialmente reversible) ni con la degradación
(irreversible) de los mismos.
Hipótesis del Análisis del vecino más próximo:

Esta determina la frecuencia relativa con que

dos nucleótidos resultan unidos lateralmente
en una molécula de ADN sintético. Hay en
total 16 combinaciones posibles y, de ellas,
cuatro secuencias posibles de vecinos más
próximos de Adenina (Adenina Adenina,
Adenina Guanina, Adenina Timina y Adenina
Citocina ), cuatro de Guanina ( Guanina
Adenina, Guanina Guanina, Guanina Timina,
Citocina Guanina) y, análogamente, cuatro de
Timina y cuatro de Citocina.

Este análisis consiste en utilizar primero,

durante la síntesis, un trifosfato marcado con
un atomo de fosforo radiactivo y tratar
después el ADN sintetizado con una enzima
especifica que rompa el ADN, dejando el
átomo de fosforo radioactivo unido a su
vecino más inmediato.
Hipótesis del Broche:

Dado el problema en el cual el ADN polimerasa no se sabia

si podría ser posible que se orientase a si misma e iniciara la
replicación sobre un moldede ADN que no tenia extremos,
como el del virus bacteriano de lazo cerrado ΦX174.

Por su apariencia en las imagines obtenidas por el

microscopio electrónico del virus ΦX174 si preguntaban si
solo era realmente un simple lazo, con el hecho de que
parecía un collar con broche, en el que cuya composición
intervenían sustancias no relacionadas con los nucleótidos.
Por el trabajo de Sinsheimer, en el que el ADN del ΦX174
tenia que constituir un lazo completamente cerrado para ser
infeccioso, y conocían también que su polimerasa solo podía
catalizar la síntesis de moléculas lineales de ADN.
Investigando mas sobre el problema, pudieron
encontrar una enzima unidora de polinucleotidos
que tiene la capacidad de reparar mellas en la
cadena de ADN. Las mellas ocurren donde hay
rotura en la columna vertebral azúcar-fosfato de
un filamento de la molécula de ADN. La enzima
solo puede reparar una rotura cuando todos lo
que falta es el enlace covalente entre un azúcar y
su fosfato vecino en el espinazo del ADN.
Metodología del experimento :
• a.- Materiales:

• * El virus ΦX174: que posee una cadena sencilla en

forma de lazo cerrado.

• * Bacteria Escherichia coli: que al ser infectada por el

virus QX174 el lazo de la cadena sencilla de ADN
actúa de molde dirigiendo la síntesis enzimática de
un segundo lazo de ADN sintético. Los dos lazos
forman una doble hélice anular, similar a las hélices
de ADN que se encuentran en las células bacterianas
y en los organismos superiores.
• * Enzimas celulares: con la ayuda deesta Kornberg
pudo realizar sus experimentos, estas son usadas
como catalizadores.

• * Enzimas purificadas: ayudan en la sintetización de

grandes moléculas en sistemas libres de células,
junto con las coenzimas.

• * Coenzimas: ayudan en la sintetización de grandes

moléculas en sistemas libres de células.

• * Bromouracilo: se necesito cambiar la timina por 5

bromouracilo, que contiene un átomo de bromo (Br)
en el lugar de la timina que lleva un grupo de CH3
siendo mas ligero, para así marcar el ADN sintetico.
• * Átomos radiactivos, para
marcar el nucleótido.

• * Desoxitimidina: compuesto
radiactivamente marcado q
fue incorporado al ADN por
células de medula osea y
otras células animales, en los
primeros ensayos de
Kornberg.

• * Tubo de ensayo: contenedor

de vidrio para realizar
mezclas.
• b.- Experimentación:
•
* La síntesis del ADN del virus ΦX174, se consiguió a
través de los siguientes pasos:
•
1.- Se utilizó como molde el ADN circular de cadena
sencilla, marcado con tritio del ΦX174.
•
2.- Se le añadieron junto con ADN polimerasa, nucleótidos
activados de Adenina, Guanina, Citocina y, en lugar de
Timina, 5 bromouracilo. Uno de los nucleótidos activados
se marco con fosforo radioactivo. El ADN sintetizado sobre
molde era completo, pero todavía no constituía un lazo
cerrado. ´
•
3.- La unión de los extremos del lazo se efectuo añadiendo
la enzima de cierre.
• 4.- Ahora se añadió suficiente nucleasa para conseguir la
rotura de una de las cadenas en aproximadamente la mitad
detodas las cadenas dobles.
•
5.- Esto dio lugar a una mezcla de lazos dobles completos,
lazos del molde, lazos sinteticos, cadenas lineares del molde y
cadenas lineares sinteticas. Puesto que las cadenas sintéticas
contenían 5 bromouracilo eran más pesadas que las cadenas
del molde y pudieron ser separadas que las cadenas molde y
pudieron ser separadas por centrifugación.
•
6.- Los lazos sintéticos fueron ahora aislados y utilizados como
moldes para hacer lazos dobles completamente sintéticos.

* Para poder marcar el ADN sintético se puede sustituir la

timina por 5 bromouracilo, que contiene un átomo de bromo
(Br) en el lugar en que la timina lleva un grupo de CH3,
haciendo mas ligero el ADN.
Resultados de la investigación :
• En las experimentaciones de Kornberg y sus
colegas tuvieron hallazgos importantes para
lograr su objetivo que luego revolucionaría la
ingeniería genética.

• Se demostró que el ADN sintético era una

molécula con la estructura química típica del ADN
y con la misma proporción de pares Adenina-
Timina y Guanina-Citocina que el ADN utilizado
como patrón para dirigir la reacción.
• .
• Al examinar las propiedades físicas del ADN sintético, observó
que tenía la alta viscosidad, la comparativamente lenta
velocidad de sedimentación y otras propiedades físicas típicas
del ADN natural. El ADN nuevo era por tanto como el natural,
una molécula polimérica larga y fibrosa. Además, cuanto mas
tiempo se dejaba incubar la mezcla de los ingredientes
activos mayor era la viscosidad del producto, lo cual era
unaprueba directa de que el ADN sintético continuaba
creciendo en longitud y en cantidad.

• Se realizaron también varias técnicas para comprobar la

funcionabilidad del ADN sintético; una de ellas se le llama
‘‘Análisis del vecino mas próximo’’. De este análisis se dedujo,
entre otras cosas, el reconocimiento de un hecho básico sobre
la estructura de la doble hélice, La dirección de la cadena de
ADN sintetizada durante la replicación era opuesta a la de su
molde. Por inferencia podemos concluir que las cadenas de la
doble hélice del ADN natural tienen que discurrir en
direcciones contrarios, como propusieron Watson Y Crick.
• Sin embargo la exactitud del análisis de la
frecuencia de vecinos más próximos no puede ser,
aunque este se efectué con el mismo cuidado,
superior al 98 por ciento. Consecuentemente,
continuaron desconfiados respecto a la precisión
de la copia de cadenas conteniendo, según la
longitud de los genes 1.000 o más nucleótidos
Antecedentes de la investigacion :
• El Doctor Arthur Kornberg: basó su trabajo sobre un
estudio anterior realizado por él mismo, en el cual ,a
partir de 60 Kg de Escherichia coli, logró obtener
miligramos de una enzima que él denominó ADN
polimerasa; ésta era capaz de sintetizar una nueva
cadena de ADN a partir de una cadena existente
empleando nucleótidos trifosfato.
• Esta enzima cataliza la producción de nuevas
cadenas de ADN, además mostró cómo una sola
hebra de ADN forma nuevas cadenas de nucleótidos,
y demostró la estructura de doble hélice del ADN.
• Podemos concluir con que
Kornberg descubrió una
enzima en la bacteria
intestinal Escherichia coli,
la ADN polimerasa, con la
cual sintetizó por primera
vez ácido
desoxirribonucleico (ADN )
en el tubo de ensayo, lo
que le valió el Nobel que
compartió con su maestro
y amigo el científico
Severo Ochoa.
Datos Curiosos :
• Algo curioso que
descubrimos mientras
realizábamos el trabajo fue
la longevidad del Dr.
Kornberg, ya que murió a
la edad de 89 años, y que
al igual su hijo llamado
Roger David Kornberg
obtuvo un Premio Nobel,
Kornberg lo obtuvo en
Medicina en 1959 mientras Roger David Kornberg (
que su hijo en el área de St. Louis, Missouri, USA, 
Química en el 2006. 24 de abril de 1947)