OBJETIVO:

El objetivo de este estudio es generar conjuntos a nivel de cromosomas de tres especies de aves: halcón saker (Falco
cherrug), periquito (Melopsittacus undulatus), avestruz (Struthio camelus); las cuales previamente fueron reportadas
como reorganizadas cariotípicamente en comparación con la mayoría de las aves.

INTRODUCCIÓN:
El número de conjuntos de secuencias del genoma de la nueva especie aumenta exponencialmente; sin embargo,
relativamente pocos contienen un andamio. Tales ensamblajes son esenciales para los estudios de asociación de
genotipo a fenotipo, evolución genómica gruesa y especiación. Las diferencias entre especies pueden surgir de los
cambios cromosómicos fijados durante la evolución. La hipótesis previamente planteada establece que una fracción
mayor de elementos bajo selección negativa contribuyó a los fenotipos específicos de las aves y la estabilidad de la
organización del genoma aviar.

DISCUSIÓN:
El número de conjuntos de secuencia del genoma de novo (nueva especie) aumenta
exponencialmente. Las tecnologías mejoradas están generando lecturas más largas, mayores
profundidades de lectura y, en última instancia, conjuntos con menos contigos más largos por
genoma; sin embargo, la capacidad de ensamblar un genoma con la misma cantidad de andamios
o contigos que los cromosomas (ensamblaje de "nivel de cromosomas") sigue siendo el objetivo
final de un esfuerzo de secuenciación de novo. Esto se debe a varias razones, entre ellas el
requisito de un orden establecido de marcadores de ADN como requisito previo para revelar
asociaciones de genotipo a fenotipo para la selección y reproducción asistida por marcadores, por
ejemplo, en especies criadas regularmente para la producción de alimentos, compañía, o con
fines de conservación
Las asambleas a nivel de cromosomas se establecieron rápidamente para animales agrícolas
(pollos, cerdos, vacas, ovejas) en parte porque se ensamblaron como mapas antes de la
secuenciación. Sin embargo, los animales criados para la conservación (p. ej., halcones y loros) y
los animales de compañía (p. ej., aves de compañía) todavía están pobremente representados, en
parte porque inicialmente se ensamblaron utilizando solo datos de NGS.
Nuevas técnicas, por ejemplo, mapeo óptico, BioNano, Dovetail y secuenciación de lectura larga
PacBio, dan pasos significativos hacia esto. El progreso reciente en el genoma de la cabra, por
ejemplo, resultó en un ensamblaje a nivel de cromosoma utilizando la secuencia de lectura larga
PacBio; Sin embargo, otros encuentran problemas técnicos: BioNano contigs no puede mapear a
través de múltiples regiones de sitios de nick de ADN, centrómeros o grandes bloques de
heterocromatina, y PacBio requiere material de partida de cientos de microgramos de ADN de
alto peso molecular, lo que limita su uso. Por lo tanto, para lograr un ensamblaje de nivel de
cromosoma a menudo se requiere una combinación de tecnologías para integrar los datos de
secuencia, por ejemplo, mapeo de enlaces, ensambles de referencia de nivel de cromosoma
preexistentes y / o citogenética molecular. Con este fin, se hizo uso de enfoques bioinformáticos,
por ejemplo, el algoritmo de ensamblaje de cromosomas asistido por referencia (RACA). Sin
embargo, RACA está limitado en la necesidad de una especie de referencia estrechamente
relacionada para la comparación y el mapeo adicional de los superescampos físicamente a los
cromosomas. Por lo tanto, recientemente se desarrollo un enfoque en el que RACA produce
fragmentos de cromosomas pronosticados (PCF) de tamaño subcromosómico que posteriormente
se verifican y mapean en cromosomas utilizando métodos moleculares. Al hacerlo, establecimos
previamente un enfoque novedoso e integrado que permite mapear genomas ensamblados de
novo directamente en los cromosomas de interés y mostrar la información en un navegador
interactivo para permitir una comparación directa a nivel de cromosomas. Sin embargo, hasta la
fecha, solo dos genomas, la paloma ( Columba livia ) y el halcón peregrino ( Falco
peregrinus ) , se han reunido de esta manera
El estudio actual se centra en generar conjuntos de nivel de cromosomas para otros tres genomas
aviares. Estos son los siguientes: El halcón saker ( Falco cherrug —FCH), clasificado como en
peligro, es fenotípicamente notable por su agudeza visual y velocidades de aceleración. Tiene
una estructura genómica aviar atípica (2 n  = 52) con microcromosomas fusionados. En segundo
lugar, seleccionamos el periquito común ( Melopsittacus undulatus —MUN) que también tiene
un cariotipo altamente reordenado con múltiples fusiones (2 n  = 62). Como miembro de la
orden Psittaciformes(loros), el periquito es uno de los animales de compañía más populares del
mundo, así como un modelo muy valioso para los estudios sobre el aprendizaje vocal
[ 22 ]. Finalmente, seleccionamos el avestruz ( Struthio camelus — SCA), el animal terrestre
bípedo existente más grande [ 23 ]. El avestruz puede viajar largas distancias con un notable
grado de economía metabólica [ 24 ]. Aparentemente posee un cariotipo aviar típico (2 n  = 80),
con un alto grado de homología con el pollo (como otras aves ratite) el cual se revelo por la
pintura cromosómica entre especies [ 25 - 27], sin embargo, supuestamente tiene 26
reordenamientos intercromosómicos previamente no detectados en comparación con el cariotipo
aviar ancestral como lo revela el análisis de ensamblaje de secuencia de datos de mapeo óptico
[ 28 ]. Para estas tres especies, utilizamos nuestro enfoque previamente descrito que combina
algoritmos computacionales para ordenar andamios en fragmentos de cromosomas predichos
(PCF) que luego mapeamos físicamente directamente a los cromosomas de interés usando un
conjunto de sondas de cromosomas artificiales bacterianos universales de aves (BAC) [ 15] ]
Las asambleas a nivel de cromosomas también informan los estudios de evolución y especiación
dado que las diferencias entre especies surgen de los cambios cromosómicos fijados durante la
evolución Recientemente se propuso la hipótesis de que una fracción mayor de elementos bajo
selección negativa involucrados en la regulación génica y la estructura cromosómica en genomas
aviares (~ 7%) [ 40 ] en comparación con los mamíferos (~ 4%) [ 41 ] podría contribuir a
algunos factores específicos fenotipos, así como la estabilidad evolutiva de la organización
general de la mayoría de los genomas aviares [ 39] Además, estudiamos el destino de los CNEs
en los EBR que flanquean los reordenamientos intercromosómicos de un genoma aviar altamente
reorganizado, descubriendo que, en el halcón peregrino, los EBR intercromosómicos contienen
12 veces menos CNE que los intracromosómicos
Para investigar más a fondo el papel de los CNEs en los reordenamientos cromosómicos, por lo
tanto, nos concentramos en especies que previamente se habían reportado como altamente
reorganizadas cromosómicamente. El estudio de estos genomas altamente reorganizados a esta
resolución proporcionó información sobre los mecanismos de reordenamiento cromosómico.
RESULTADOS

Fragmentos cromosómicos predichos para tres nuevas especies

Se generaron fragmentos de cromosomas predichos para secuencias de genoma completo de
halcón saker fragmentado, periquito y avestruz utilizando RACA [ 17 ]. El pinzón cebra y los
conjuntos de cromosomas de pollo se usaron como referencia y grupo externo respectivamente
para todas las reconstrucciones, excepto para el avestruz. Para el halcón saker, se generaron 95
PCF que representan el 97.26% del genoma original, mientras que para el avestruz y el periquito
se produjeron 100 y 84 PCF . Estos conjuntos de PCF iniciales contenían ~ 10% de andamios
supuestamente quiméricos tanto para el avestruz como para el halcón saker, mientras que para el
periquito, ~ 31% de los andamios fueron divididos por RACA debido a la escasa lectura y / o
evidencia comparativa para apoyar sus estructuras.

Ensambles a nivel de cromosomas para tres especies nuevas

Se generó con éxito ensambles a nivel de cromosomas para las tres especies de aves de interés,
con una cobertura similar a la secuenciación de Sanger genomas ensamblados. Nuestro método
implica a) La construcción de PCF para conjuntos fragmentados basados en los datos comparativos y de lectura de
secuencia implementados en el algoritmo RACA
b) PCR y verificación computacional de un número limitado de andamios que son esenciales para revelar estructuras
cromosómicas específicas de la especie
c) La creación de un conjunto refinado de PCF utilizando los andamios verificados y los umbrales de adyacencia
ajustados en RACA
d) El uso de un panel de clones BAC "universales" para anclar PCF a los cromosomas de una manera de alto
rendimiento. Usando este enfoque, para el avestruz (2 n = 80), Para el periquito (2 n = 62), Para el halcón Saker
(2 n = 52).

El ensamblaje a nivel de cromosoma se realizó para todos los homólogos del cromosoma GGA
(pollo) con la excepción del cromosoma GGA16 para el cual los clones BAC no estaban
disponibles. Se generaron PCF que varían en tamaño.
Para el periquito (2 n  = 62), el mapeo FISH dio como resultado 21 pares de autosomas de
periquito y el cromosoma Z se ensambló con una mejora cuádruple en el andamio N50 de 11 a
38 Mb. El 93,56% del ensamblaje original se colocó en cromosomas y el 77,93% estaba
totalmente orientado. Para el halcón Saker (2 n  = 52), en total, 19 autosomas y el cromosoma Z
se ensamblaron a nivel cromosómico, con una mejora de cinco veces en N50, lo que resultó en el
90.12% del ensamblaje original asignado a los cromosomas y el 67.52% del ensamblaje
completo orientado. En el curso de los experimentos FISH realizados, no detectamos ningún
punto de corte que abarque BAC.

Reordenamientos del ancestro aviar

El patrón general de reordenamiento cromosómico evidente en las tres especies por divergencia
del ancestro aviar inferido. Dada la similitud intercromosómica de pollo y avestruz, y el
conocimiento previo de que GGA4 surgió de la fusión de dos cromosomas ancestrales, la única
diferencia intercromosómica se deriva fácilmente. Para los cambios intracromosómicos, el uso
de avestruz como un grupo externo infiere los cambios desde la divergencia del antepasado
Neognathe (ver arriba). En ausencia de un genoma de grupo externo ensamblado
cromosómicamente para todas las aves en este estudio, no es fácil determinar si las diferencias
intracromosómicas son ancestrales o derivadas en pollo y avestruz respectivamente.
Había dos fisiones comunes tanto al periquito como al halcón saker. El primero de ellos
involucró al homólogo del cromosoma 1 de pollo donde el punto de corresponde al punto de
ruptura visto en el genoma del pinzón cebra ensamblado cromosómicamente y probablemente en
todas las Passerines según los estudios de zoo-FISH. El segundo fue una fisión que ocurrió en el
homólogo del cromosoma 5 de pollo, cuyos productos derivados formaron los cromosomas 4 y 8
del periquito y los cromosomas 7 y 10. Saker Finalmente, una fisión presente en el halcón pero
no en el periquito (cromosoma 2 céntrico)
En el genoma del periquito, 13 homólogos de pollo no mostraron evidencia de fisión o fusión y
en el saker, 8 homólogos no mostraron evidencia de reordenamiento intercromosómico. El
cromosoma Z fue el único macrocromosoma que no se reorganizó intercromosómicamente en
todas las especies analizadas.

Se reveló que el avestruz tenía el menor número de diferencias intracromosómicas con

respecto al pollo, con un total de 14 identificadas, tres de las cuales estaban en el
cromosoma 3. El periquito, aunque muy reorganizado intercromosómicamente, parecía
tener un número similar de reordenamientos intracromosómicos, con evidencia de 16
inversiones, 3 de las cuales estaban en el homólogo de GGA3 (aunque diferente de las
observadas en el avestruz). Sin embargo, el halcón saker, aunque también se reorganizó
a un nivel intercromosómico, también exhibió una gran cantidad de cambios
intracromosómicos en relación con las otras especies con 36 inversiones. Ningún
reordenamiento intracromosómico fue evidente en los homólogos de los cromosomas
19, 21 y 25

Conclusiones
Al combinar el análisis de secuencia comparativo, la PCR dirigida y la citogenética molecular de
alto rendimiento, los resultados presentados aquí proporcionan evidencia adicional para un
enfoque que es teóricamente aplicable a cualquier genoma animal como un medio rentable de
transformar ensambles fragmentados a nivel de andamio a nivel cromosómico . El N50 de cada
genoma mejoró significativamente y se identificaron una serie de reordenamientos intra e
intercromosómicos que antes no se podían detectar. La mayoría de los genomas de aves
permanecen notablemente conservados en términos de su número de cromosomas (en 60-70% de
las especies 2 n  = ~ 80), y los cambios intercromosómicos son relativamente raros, pero cuando
ocurren, tienden a ser específicos del linaje, por ejemplo,
en Psittaciformes (loros), Falconiformes (halcones) y Sphenisciformes (pingüinos). La fusión es
el mecanismo de cambio más común, todavía no hay evidencia de translocación recíproca y
todos los microcromosomas permanecen "intactos", incluso cuando se fusionan con cromosomas
más grandes. Por qué algunos grupos exhiben un alto grado de reordenamiento
intercromosómico sigue sin estar claro; algunos (por ejemplo, martines pescadores) tienen un
número inusualmente alto (2 n  = 130+) y desviaciones más altas y más bajas del típico (2 n = ~
80) la organización puede ocurrir en el mismo grupo. Por ejemplo, el pingüino Adelia (2 n  = 96)
y el pingüino emperador (2 n  = 72) sugieren que mecanismos similares pueden causar una
reducción rápida y un aumento rápido en el número de cromosomas. El corto período de tiempo
durante el cual ocurren estos cambios en los pingüinos y los cariotipos reordenados de
los Falconiformes y los Psittaciformes (pero no el grupo hermano, los Passeriformes ) sugiere
que estos cambios pueden ocurrir rápidamente. Los vertebrados con genomas grandes y ricos en
repeticiones (como mamíferos y anfibios) con frecuencia demuestran reordenamientos rápidos
intra e intercromosómicos [ 31] Los resultados presentados aquí sugieren que las aves también
pueden experimentar cambios similares en ciertos grupos, aunque hay poca evidencia de que
estos genomas aviares altamente reorganizados sean particularmente grandes o más ricos en
repetición que otros genomas aviares.