S M..

Meftah
C.Q.F.A
-République Algérienne Démocratique et Populaire

GUIDE PRATIQUE

D’ANALYSES MICROBIOLOGIQUES

DES DENREES ALIMENTAIRES

Selon Institut pasteur d’Algérie

Service de Bactériologie alimentaire

Version Janvier 1999

Rédiger par :

 S.M. MEFTAH *

TS Fabrication Agroalimentaires.
Option : Contrôle de qualité

* Bureau d’hygiène Nedroma

Chef de service : Technicien du laboratoire:

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1. Préparation des échantillons :
1.1. Prise d’essai :
Les prise d’essai sont effectuées sur l’échantillon homogénéisé en tenant compte de
plusieurs facteur a savoir :
* la nature de produit
* Le nombre d’échantillons
* Les opération analytiques a conduire………..

1) Prélèvement en surface :
-Méthode Ecouvillonnage : Un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une
solution stérile de Ringer au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween
(0,5°/°°). Le prélèvement est effectué par frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon
est alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10 ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse
est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue.

Schéma 1 : Prélèvement en surface (Méthode Ecouvillonnage)

2) Prélèvement de produits liquides :

La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut
néanmoins toujours s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de
prélever à la pipette (ou avec un flacon lesté stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.

3) Prélèvement de produits solides :

Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et
produits mous) ou à la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au
prélèvement. Si le produit est hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la
bonne représentativité du prélèvement.

* En générale, en prélèvement deux fois 25 gramme :

Les premières serviront a l’analyse bactériologique courante
Les seconds serviront à la recherche de salmonella

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1.2. Suspension mère et dilution décimales :
1.2.1. Cas des produits solides:

Exemple : Viande, produit carnés, fromages,…..

Instruire aseptiquement 25 g de produit a analysée dans un flacon préalablement taré ou

dans un sachet stérile de type < Stomatcher> contenant au préalable 225 ml de diluant soit le
TSN (Tryptone Sel Eau). Homogénéiser

Cette Suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond donc a la dilution
1/10.

Instruire ensuite aseptiquement à l’aide d’une pipette en verre graduée et stérile, 1ml de
la DM dans un tube a vis contenant au préalable 9 ml du même diluant ; cette dilution est
alors 1/100…ainsi de suite jusqu’un l’obtention de la dilution 1/100000 soit 10-5 . (Schéma
n°2)

1.2.2. Cas des produits Liquides :

Exemple : Lait pasteurisé, …….

Procèdes de façon aseptique au mélange de quelques sachets (5 en moyenne) pris au

hasard parmi le lot de lait à analyser, dans un erlenmeyer stérile.

Ce mélange constitue donc la solution mère (SM).

Suivront ensuite les dilution décimales de la même manière que dans le cas des produit
solides, tout en considérant la SM a 1, la première dilution sera donc au 1/10. (Schéma n°3)

Remarques :
Au moment de la réalisation des dilution décimales, il impératif de changer de pipettes
entre cheque dilution.
Contrairement à cela, lors de l’ensemencement, il est recommander de commencer par la
plus haute dilution dans le but justement de ne pas changer de pipettes.
On travaillera alors à l’aide d’une pipette graduée en verre stérile de 5ml.

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Schéma 2 : Suspension mère et dilution décimales

Cas des produits solides:

1ml 1ml 1ml

10-1

9 ml de TSE

25g + 225ml de TSE 10-2 10-3 10-4

(DM)

Schéma 3 : Suspension mère et dilution décimales

Cas des produits liquides:

1ml 1ml 1ml

9 ml de TSE

Mélange de Liquide 10-1 10-2 10-3

(SM)

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2. METHODES DE RECHERCHE ET DENUMERATION
2.1. Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux:

 Ils sont présents dans les aliments à la faveur d'un couple

temps / température favorable à leur croissance.
 Germes (= microbes = bactéries + levures + moisissures) qui se
développent en présence d'air (aérobie) à température moyenne
(mésophile: 25 – 30°C).
Ces caractéristiques sont celles de la méthode d'analyses en
laboratoire. Elles correspondent à des conditions optimales de développement de ces germes,
appelés aussi germes d'altération.
Pouvoir pathogène: Bien que, pour la plupart des espèces, ces bactéries ne soient pas
dangereuses pour la santé, leur détection dans les aliments traduit une altération. Elle
amoindrit la qualité intrinsèque de la denrée (goût, odeur, aspect).

 Technique:
A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1 voire 1, porter aseptiquement
1 ml dans une boite de Pétri vide préparée à cet usage
Compléter ensuite avec environ 20 ml de gélose PCA ou TDYM fondue puis refroidie à
45±1°C
Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à
l’inoculum de se mélanger à la gélose utilisée.
Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 5 ml de la même
gélose ou de gélose blanche. Ce double couche à un rôle protecteur contre les contaminations
diverses. (Schéma n°4)

 Incubation :
Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72 heures avec :
- première lecture à 24 heures,
- deuxième lecture à 48 heures, et
- troisième lecture à 72 heures.

 Lecture :
Les colonies des G A M T se présentent sous forme lenticulaire en masse.

 Dénombrement :
Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des
facteurs suivants :
- ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies,
- multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution,
- faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions

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10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml

20ml de gélose PCA ou TDYM

PCA PCA PCA

 Laisser solidifier sur paillasse

 Ajouter une double couche (5 ml)

 Incuber à 30°C, 24 – 48 et 72 h

 Dénombrer les colonies lenticulaires en masse.

Schéma 4:Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles.

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2.2. Recherche et dénombrement des coliformes totaux et coliforme fécaux:

 Coliformes : Il s’agit de Bacilles Gram Négatifs (BGN),

aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, ne possédant pas
d’oxydase, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et
capables de fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz
en 24 à 48 heures à une température comprise entre 36 et 37°C,
selon l’ISO.
 Coliformes Thermo-tolérants : Il s’agit là de coliformes
possédant les mêmes caractéristiques que les coliformes mais à
44°C ; ils remplacent dans la majorité des cas l’appellation de
«Coliformes fécaux ».
 Escherichia coli: Il s’agit là de coliformes Thermo-tolérants qui produisent, en outre, de
l’indole à partir du tryptophane à 44°C.
 Pouvoir pathogène: Les coliformes étant des bactéries vivant dans les intestins d'animaux
ou humains, leur présence dans l'aliment indique une pollution fécale. Ce sont donc des
organismes indicateurs de la qualité de l'aliment. Ils ne provoquent pas d'intoxication sauf
Escherichia coli

En Milieu Solide :
 Technique:
A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml de
chaque dilution dans deux boites de Pétri vides préparées à cet usage et numérotées comme
l’indique le Schéma n°5
Compléter ensuite chaque boite avec environ 20 ml de la gélose VRBL, fondue puis refroidie
à 45±1°C.
Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour permettre à
l’inoculum de bien se mélanger à la gélose utilisée.

 Incubation :
Une série de boites sera incubée à 37°C, pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de
Coliformes totaux,
L’autre série sera incubée à 44°C pendant 24 à 48 h et servira à la recherche de Coliformes
fécaux.

 Dénombrement :
Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des
facteurs de dilutions, de plus :
- ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies,
- multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution,
- faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes dilutions.

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- il est impossible de trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux.

Que se soit à 37 ou à 44°C, les premières lectures se feront au bout de 24 h et consistent à

repérer les petites colonies rouges ayant poussé en masse mais fluorescentes, ce qui signifie
que la lecture doit se faire dans une chambre noire et sous une lampe à UV.
Les autres colonies non fluorescentes ne sont ni des coliformes totaux ni des coliformes
fécaux.

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10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml
1ml 1ml 1ml

20ml de VRBL 20ml de VRBL 20ml de VRBL

VRBL VRBL VRBL

37°C, 24 à 48 h (CT)

20ml de VRBL 20ml de VRBL 20ml de VRBL

VRBL VRBL VRBL

44°C, 24 à 48 h (CF)

 Laisser solidifier sur paillasse

 Ajouter un double couche (5 ml) de la même gélose ; cette double couche a u rôle
protecteur contre les diverses contaminations

 Dénombrer les colonies fluorescentes ayant poussé en masse

*CT….coliforme totaux
*CF….coliforme fécaux

Schéma 5:Recherche et dénombrement de coliformes totaux et fécaux en

milieu solide

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En Milieu Liquide:
La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir.
-Le test de présomption : réservé a la recherche des coliformes totaux.
- Le test confirmation : appelé encore test de Mac Kenzie et resrvé a la recherche des
coliformes fécaux a partir des réaction positives du test de présomption.

1. Test de présomption :
Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif VBL a raison de trois
tubes par dilution.
A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml de chaque
dilution dans chaque des trois tubes correspondant a une dilution donnée comme l’indique le
schéma n°6.
Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu
et l’inoculum.

 Incubation :
L’incubation se fait à 37°c pendant 24 à 48 heures.

 Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes présentant a la fois :
un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche)
un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui constitue le
témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu)
Ces deux caractère étant témoins de la fermentations de lactose dans les conditions
opératoires écrites.
La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady qui se trouve en
annexe.

Exemple et interpritation :
Si à la dilution 1/10 3tubes sur 3 sont positifs…….3
à la dilution 1/100 2tubes sur 3 sont positifs……2
à la dilution 1/1000 1tubes sur 3 sont positifs…....1
Le nombre caractéristique est donc <321> se qui correspondons sur la table de Mac Grady au
nombre 15.
On considère alors qu’il y a 15 coliformes par gramme ou millilitre vde produit a la dilution
1/10.
Pour obtenir le nombre réel de coliformes totaux, il suffit de multiplier ce nombre par
l’inverse de la première dilution pour revenir a 1 soit :
15*10=150 coliformes totaux par gr ou ml de produit analyser.

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2. Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :

Les tubes de VBL trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes totaux seront
l’objet d’un repiquage d’un ose bouclée dans a la fois :
Un tube de VRBL muni d’un cloche
Un tube d’eau peptonée exempte d’indole comme l’indique le schéma n°7.

 Incubation :
L’incubée se fait cette fois-ci a 44°C pendant 24 à 48 h

 Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes présentant a la fois :
un dégagement gazeux dans les tubes de VBL (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche)
un anneau rouge en surface, témoin de la production d’indole par Eschérichia Coli après
adjonction de 2 a 3 gouttes du réactif de Kowacs dans dans le tube d’eau peptonée
exempted’indole.
La lecture finale s’effectue également selon des prescription de la table de Mac grady en tenant
compte du fait que Echérichia Coli est a la foit producteur de gaz et l’indole a 44°c.

Exemple et interpritation :
En reprenant le même exemple concernant le dénombrement des coliformes totaux , cela
suppose que nous avons 6 tubes a repiquer a savoir :
3 tubes de la dilution 1/10
2 tubes de la dilution 1/100
1 tube de la dilution 1/1000
* si sur les 3 tubes repiqués à partir de la dilution 1/10 :
- 2 tubes sont positifs aussi bien en gaz qu’en indole et,
2
- 1 tube seulement positif en gaz.
* si sur les 2 tubes repiqués à partir de la dilution 1/100 :
- 1 tubes sont positifs aussi bien en gaz qu’en indole et,
-l’autre est positif seulement positif en indole.
1
* si le tube repiqué à partir de la dilution 1/1000 :
0
- la réaction est négative aussi bien en gaz qu’en indole,
Le nombre caractéristique est donc <210> se qui correspondons sur la table de Mac Grady au
nombre 1,5 a la dilution 1/10.
Pour obtenir le nombre réel de coliformes fécaux, il suffit de multiplier ce nombre par
l’inverse de la première dilution pour revenir a 1 soit :
1,5*10=15 coliformes fécaux par gr ou ml de produit analyser.

Le résultat final sera donc de :

150 coliformes totaux par gr ou ml de produit analyser.
15 coliformes fécaux par gr ou ml de produit analyser.

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1ml
1ml
1ml
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Tableau Récapitulatif

Test de confirmation
Dilutions Test de présomption
VBL 44°C EP Exempte d’Indole
+ + +
1/10 + + +
+ + -
+ - +
1/100 + + +
-
+ - -
1/1000 -
-
Nombre
321 210
Caractéristique

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10-1 10-2 10-3

1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
1ml 1ml
1ml 1ml

VBL + Cloche a 37°C pendant 24 a48h

Trouble Microbien
... Gaz dans la cloche

Réaction Positive Réaction Négative

Schéma n°6:Recherche et dénombrement de coliformes totaux et fécaux en

milieu liquide

Test de présomption

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.
..
Réaction Positive

1 ose 1 ose

VBL EPEI

44°C pendant 24 a48h

+ 2 gouttes du réactif de
Kowacs
Trouble Microbien
Gaz dans la cloche Anneau Rouge

Réaction Positive

Schéma n°7:Recherche et dénombrement de coliformes totaux et fécaux en

milieu liquide

Test Confirmation

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2.3. Recherche et dénombrement de Streptocoques fecaux:

 Technique:
La recherche de streptocoque fecaux ou streptocoque du groupe <D> de la
classification de Lancefield, se fait en milieu liquide par la technique du nombre le plus
probable (NPP).
Cette technique fait appel à deux tests consécutivement à savoir :
test de présomption : qui se fait sur milieu de Roth S/C.
test de confirmation : qui se fait sur milieu Eva Lytski.

3.1. Test de présomption :

Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif de Roth S/C à
raison de trois tubes par dilution.
A partir des dilution décimales 1/1000 a 1/10 voir1, porter aseptiquement 1 ml dans chacun
des trois Tubes correspondant a une dilution donnée comme l’indique le schéma n°8. bien
mélanger l’inoculum dans le milieu.

 Incubation :
L’incubation se fait cette fois-ci a 37°C pendant 24 à 48 h

 Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes présentant un trouble microbien.

 Remarque :
Aucun dénombrement ne se fait a ce stade, Les Tubes positifs feront l’objet d’un repiquage.

3.1. Test de confirmation :

Chaque tube de Roth positif fera donc l’objet d’un repiquage a l’aide d’une anse bouclée
sur Tube contenant le milieu Eva Lytsky.
Bien mélanger l’inoculum dans le milieu.

 Incubation :
L’incubation se fait cette fois-ci à 37°C pendant 24 à 48 h

 Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes d’Eva Lytsky à la fois :
un trouble microbien et
une pastille blanchâtre ou violette au fond du tub.
Le nombre de streptocoques fécaux est exprimé par le NNP selon la table de Mac Grady.

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Exemple et interpritation :

Tableau Récapitulatif

Test de présomption Test de confirmation

Dilutions
Rothe S/C EVA-Lytsky
+ +
1/10 + -
-
+ -
1/100 + -
-
+ +
1/1000 -
-
Nombre
/ 101
Caractéristique

Le nombre caractéristique est donc <101> se qui correspondons sur la table de Mac Grady au
nombre 0.7.
On considère alors qu’il y a 0.7 streptocoques fécaux par gramme ou millilitre vde produit a
la dilution 1/10.
Pour obtenir le nombre réel de streptocoques fécaux, il suffit de multiplier ce nombre par
l’inverse de la première dilution pour revenir a 1:
0.7*10=7 streptocoques fécaux par gr ou ml de produit analyser

 Remarque :
L’isolement a partir des Tubes d’Eva positif sur milieu Barnes puis leur incubation a 37°c 24 a
48heures permet d’avoir quelques indication sur les espèces de streptocoques de groupe <D>
a savoir :

Colonie a centre rouge avec liseré blanc Streptococcus faecalis

Grosses colonies blanches ou faiblement rosées Streptococcus durans
Petites colonies blanches ou roses Streptococcus bovis
Colonies de couleur rouges foncée Streptocoques lactiques

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Schéma n°8:Recherche de des Streptocoques fécaux:

Test de présomption

10-1 10-2 10-3

1ml
1ml
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
1ml 1ml

Rothe
S/C
Rothe S/C a 37°C pendant 24 a48h

Trouble

Réaction Positive Réaction Négative

Test Confirmation

EVA
37°C pendant 24 a48h

Trouble
+
Pastille

Réaction Positive Réaction Négative

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2.4. Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus:

Famille: Micrococcaceae
Genre: Staphylococcus.
Espèce: aureus
Morphologie: gram positif, coque en amas (grappes de raisin),
immobile.
Caractères biochimiques: catalase positif, oxydase négatif,
coagulase positif, fermente le glucose sans gaz et dégrade le mannitol sur la gélose Chapman.
Caractères culturaux: anaérobie facultative préférentielle, mésophile, neutrophile, halophile.
Pouvoir pathogène: Elle est responsable d'intoxications alimentaires dues à une entérotoxine
produite dans l'aliment ingéré

Selon la disponibilité des milieu de culture, trois technique différentes sont recommandé
pour la recherche de staphylocoque aureus a savoir :
* Méthode Baird Parker
* Méthode d’enrichissement sur milieu Giolliti Cantonii
* Méthode sur gélose Chapman

2.4.1. Méthode de Baird Parker

 Préparation du milieu:
Au moment de l’emploi faire fondre un flacon contenant 225 ml de gélose Baird
Parker , le refroidir ensuite dans un bain d’eau à 45°C , puis ajouter 15 ml d’une solution de
jaune d’œuf au Téllurite de potassium.
Mélanger soigneusement et aseptiquement, puis répartir le milieu en boites de pétri à raison
de 15 à 18 ml par boite.
Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis les sécher en les plaçant retournées couvercle en
bas (bord de la boite sur le bord du couvercle) dans une étuve de séchage réglée entre 45 à
55°C.

 Ensemencement:
A partir des dilutions décimales 10-3 dans le cas des contrôles de routine, porter
aseptiquement 1 ml de chaque dilution réparti en surface à raison de 3 fractions sensiblement
égales dans trois boites contenant le milieu de Baird Parker puis étaler à l’aide d’un même
étaleur en commençant par les boites de plus forte dilution, comme l’indique le schéma n°9

 Incubation:
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.

 Lecture:
Seront considérées comme positives, les boites contenant des colonies caractéristiques
à savoir des colonies noires, brillantes, convexes entourées d’une zone de transparence qui
peut être translucide.

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Après 24 heures, peut apparaître dans cette zone transparente, un anneau opalescent
immédiatement au contact des colonies.

 Remarque:
Pour s’assurer qu’il s’agit bien de colonie de staphylococcus aureus, effectuer des tests
biochimiques rapides à savoir :
Une preuve a la catalase (à l’aide de l’eau oxygénée)
Une preuve a la coagulase (à l’aide de plasma de lapin)

10-1 10-2 10-3

3 gttes 3 gttes 3 gttes

4 gttes
4 gttes 4 gttes
*2 *2 *2

Etalement les gouttes

Incubation à 37° C, 24 a 48 h

Dénombrement des colonies noires avec zone de transparence

Catalase, coagulas…..

Schéma 9 : Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus

Méthode de Baird Parker

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2.4.3. Méthode d’enrichissement au milieu de Giolliti Cantonni :

 Préparation du milieu d’enrichissement:
Au moment de l’emploi, ouvrir aseptiquement le flacon contenant le milieu de Giolliti
Cantonni pour y ajouter 15 ml d’une solution de tellurite de potasssium.
Mélanger soigneusement, le milieu est alors prêt à l’emploi.

 Ensemencement:
A partir des dilutions décimales retenues, porter aseptiquement 1 ml par la dilution dans un
tube vis stérile.
Ajouté par la suite 15 ml du milieu d’enrichissement comme l’indique le schéma n°10.
bien mélanger le milieu et l’inoculom.

 Incubation:
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.

 Lecture:
Seront considérés comme positifs, les tubes ayant virés au noire.
Pour s’assuré qu’il s’agit bien d’un développement de staphylococcus auréus, ces tubes feront
l’objet d’un isolement sur gélose Chapman.

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10-1 10-2 10-3

1ml 1ml
1ml

Ajouter 15 ml de Giolliti Cantonni

Bien Mélénger milieu et inoculim
Incubation à 37° C, 24 a 48 h

Tube Noir

Réaction Positive Réaction Négative

Isolement sur gélose Chapman

Incubation à 37° C, 24 a 48 h

Chapman

Dénombrement, Catalase, Coagulase

Schéma n°10 : Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus

au milieu de Giolliti Cantonni

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2.4.2. Recherche et dénombrement sur milieu Chapman :

 Incubation:
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.

 Lecture:
Staphylocoque aureus se présente alors sous forme de colonie de taille moyenne, lisse,
brillante, en jaune et pourvues d’une catalase et d’une coagulase.

10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml

Chapman Chapman Chapman

Etalement des gouttes
Incubation à 37° C, 24 a 48 h

Schéma 11 : Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus

Sur milieu Chapman

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2.5. Recherche et dénombrement de Clostridium sulfito-reducteurs:

Genre: Clostridium
Espèce: perfringens
Famille: clostridiaceae
Ordre: clostridiales
Morphologie: bacilles, gram positif
Caractères culturaux: anaérobie stricte, sporulée, immobile,
croissance optimale à 45°C, pH compris entre 5,0 et 8,0, réduction des sulfites en
sulfures, production d'H2S lorsqu'il est une présence un acide aminé soufré.
Pouvoir pathogène: cette bactéries est du a sa capacité de produire des entérotoxines, qui
est responsable a des toxi-infections alimentaires.

 Technique:
Selon la disponibilité des milieux de culture, deux techniques sont recommandées pour
la recherche de Clostridium perfringens à savoir :
 méthode générale sur gélose Viande – Foie à 37°C,
 méthode sélective sur gélose TSN ou TSC à 46°C. (Clostridium perfingens)

 Préparation du milieu:
Au moment de l’emploi faire fondre un flacon de gélose Viande foie, le refroidir dans un bain
d’eau à 45°C puis ajouter une ampoule d’Alun de Fer et une ampoule de sulfite de sodium.
Mélanger soigneusement et aseptiquement.
Le milieu est ainsi prêt à l’emploi, mais il faut le maintenir dans une étuve à 45°C jusqu’au
moment de l’utilisation.

 Ensemencement:
Les tubes contenant les dilutions 10-2 et 10-1 seront soumis :
 d’abord à un chauffage à 80°C pendant 8 à 10 minutes.
 puis à un refroidissement immédiat sous l’eau de robinet, dans le but d’éliminer les
formes végétatives et de garder uniquement les formes sporulées.
A partir de ces dilutions, porter aseptiquement 1 ml de chaque dilution en double dans deux
tubes à vis stériles de 16 mm de diamètre, puis ajouter environ 15 ml de gélose Viande Foie
prête à l’emploi, dans chaque tube comme l’indique le schéma n°13. Laisser solidifier sur
paillasse pendant 30 minutes. (Schéma 12 )

 Incubation:
Ces tubes seront ainsi incubés à 37°C pendant 16, 24 ou au plus tard 48 heures

 lecture:
La première lecture doit se faire impérativement à 16 heures, car,
- d’une part les colonies de Clostridium Sulfito-réducteurs sont envahissantes auquel cas on
se trouverait en face d’un tube complètement noir rendant alors l’interprétation difficile
voire impossible et l’analyse est à refaire.

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- d’autre part, il faut absolument repérer toute colonie noire ayant poussé en masse et
d’un diamètre supérieur à 0,5 mm.
Dans le cas où il n’y a pas de colonie caractéristique ré-incuber les tubes et effectuer une
deuxième lecture au bout de 24 heures voire 48 heures.

10-1 10-2
Chauffage à 80°C/8 à 10 min

1ml 1ml 1ml 1ml

Ajouter 15 ml de gélose V F par tube

Laisser solidifier sur paillasse, puis incuber
à 37°C, 48h

Dénombrer les colonies noires ayant poussé en profondeur

Schéma 12 : Recherche et dénombrement de Clostridium sulfito-

reducteurs

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1.6. Recherche et dénombrement des levures et moisissures:

o Les levures:
Une levure est un champignon unicellulaire1 eucaryotes apte à
provoquer la fermentation des matières organiques animales ou
végétales. Ces micro-organismes, de forme variable selon l’espèce
(sphérique, ovoïde, en bouteille, triangulaire ou apiculée, c'est-à-dire
renflée chaque bout comme un citron) mais généralement ovales,
d'environ 6 à 10 microns et jusqu’à 50 microns.

o Les moisissures:
Elles sont multicellulaires mais la notion de cellules est assez floue
car leur structure est mycélienne et coenocytique. La paroi est riche
en cellulose ou en chitine. Le corps d'une moisissure est fait de deux
parties; le mycélium et les spores. Le mycélium est un ensemble de
plusieurs filaments appelé hyphes.Chaque hyphe mesure de 5 a 10
micrometres de diamètre et possède un cytoplasme commun.

o Caractère physiologique:
Ce sont des eucaryotes, non photosynthétiques, hétérotrophes et immobiles.
Elles sont acidophiles et sont obtenues sur milieu à PH acide.
Elles sont mésophiles et d'autres sont multipliés à une température inférieure à 15°c.

 Technique:
A partir des dilutions décimales, 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 4 gouttes dans une boite de
pétri contenant de la gélose OGA, comme l’indique la schéma n°13
Etaler les gouttes à l’aide d’un râteau stérile, puis incuber à 22°C pendant 5 jours.

 Lecture:
La première lecture doit se faire à partir de la 48 eme heure d'incubation; elle consiste d'abord
en la lecture des deux boites témoins car si l'une d'entre elles présente des levures ou des
moisissures, l'analyse est à refaire.
Dans le cas échéant, dénombrer les colonies de levures a part et les colonies des moisissures a
part.

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10-1 10-2 10-3

1ml 1ml 1ml

OGA 1ml OGA OGA

Etalement / incubation 20° C pendant 5 jours

Schéma13: Recherche et dénombrement des levures et moisissures.

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1.6. Recherche des salmonelles:

Famille: Enterobacteriaceae
Ordre: enterobacterial
Morphologie: Bacilles à Gram Négatifs, mobiles ou immobiles
Caractères biochimiques: Oxydase (-), Catalase (+), Glucose (+),
Nitrate réductase (+), Lactose (-), H2S (+) ou (-).
Caractères culturaux: Aéro-anaérobie facultatif,
Pousse sur milieu ordinaire, La température optimale de croissance et de culture des
Salmonella est de 37°C.
Pouvoir pathogène: responsable a des toxi-infections par sa capacité de produire des
endotoxines, qui dus des fièvres typhoïdes et paratyphoïde et les gastro-entérites.

 Technique:
La recherche des Salmonella nécessite une prise d’essai à part.

Jour 1 : Pré enrichissement.

Prélever 25 gramme de produit dans un flacon de 225 ml d'Eau peptonée amponnée + 1 ml de
vert brillant qui sera incubé à 37°C pendant 18 à 24 heures.

Jour 2 : Enrichissement primaire :

L’enrichissement doit s’effectue sur deux milieux sélectifs différent à savoir :
 Le milieu de Rappaport Vassiliadis réparti a raison de 10ml par tube.
 Le milieu de Sélénite – Cystéiné réparti a raison de 100ml par flacon.
L’enrichissement proprement dit, se fait donc à partir du milieu de pré-enrichessement de la
façon suivante :
 0.1 ml en double pour les tubes de Rappaport Vassiliadis.
 10ml en double pour les flacons de Sélénite – Cystéiné, comme l’indiqie schéma n°

Le premier tubes de RV sera incuber a à 37°C pendant 18 à 24 heures.

Le deuxième tubes de RV sera incuber a 44°c pendant 24 a 48 heures.
Le premier flacon de SFM sera incubé à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Le deuxième flacon de SFM sera incuber a 44°c pendant 24 a 48 heures.

Jour 3 : Isolement :
Prélever 0.1 ml de tube d'enrichissement et faire et talonner sur la gélose HEKTOEN ou
gélose Bilié lactosé au vert brillant.
Incuber à 37°C pendant 24 h.

Remarque : Les salmonelles se présentent sous forme de colonies le plus souvent grises
bleue a centre noir sur gélose HEKTOEN.
Colonies roses entourées d’une zone rouge sur gélose BL VBRP.

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Jour 1: pré enrichissement: 25g de produit
37°C /18 à 24 h 225 ml EDS
1ml VB
10ml
10ml 0.1ml
0.1ml

Jour 2 : enrichissement: SFM SFM

S/CRV S/C RV
37°C /18 à 24 h 44°C /18 à 24 h

GH
Jour 3 : isolement:
37°C / 24 h

Jour 4 : lecture et identification :

Schéma 14: Recherche des salmonelles

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3. Interprétation des résultas :

L’interprétation des résultas des analyses bactériologique se fera conformément a

l’arrêté interministériel du 27 Mai 1998 paru sur le journal officiel N° 35/98, Fixant les
critères microbiologique des principale denrée alimentaires.
Ces résultats sont exprimés selon trois critères :
 Satisfaisant : c’est dire conformes aux normes imposées par la législation.
 Non satisfaisant : c'est-à-dire pour lesquels le seuil d’acceptabilité est dépassé.
 Acceptable : pour lesquels on applique le rapport c/n qui doit être inférieur a 2/5.

c : étant le nombre d’unité d’échantillons donant des valeurs comprises entre m et M.

n : étant le nombre d’unité par échantillon.

Sat max cor

satisfaisant acceptable Non satisfaisant

Sat : 30* nome / milieu liquide

10* norme/ milieu solide

Max : 10* norme/ milieu liquide

3* norme/ milieu solide

Cor : 1000* norme /sauf staph aureus = 50.000

4. Technique de numération en surface :

Si la dilution 1/10, le nombre de colonie est 35, se nombre sera multiplié par l’inverse
de la dilution correspondante a savoir10, on obtiendra alors 350 germes a la dilution 1/10.
Si on obtient 350 colonie a 1/10, 200 colonie a 1/100, et 50 colonie a 1/1000, le nombre de
germes sera donc de : (350+200+50)/3 = 200 germes par ml.

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5. Les diluants :

Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes

peuvent être inhibés ou même altérés par le changement du milieu lié à l’addition de diluant
(changement de pH mais surtout de force ionique).

Ringer Eau Eau

Tryptone sel (solution physiologiqu peptonée
mère) e tamponnée

tryptone 1g NaCl 9g NaCl 9g bacto peptone

NaCl 8,5 g KCl 0,42 Eau D 1000 ml 20 g
Eau D 1000 ml g NaCl
CaCl 0,48 5g
pH = 7 g Na HPO 9
NaHCO3 0,2 g
g K H PO 1,5
Eau D 1000 g
ml Eau D
1000 ml

pH = 7,2

Tous ces diluants sont stérilisés à 121°C pendant 20 minutes.

Il faut noter que les milieu tryptone-sel et eau peptonée tamponnée permettent, dans des
conditions particulières (température, temps), de réaliser une revivification.

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1. Germes Aérobies Mésophiles Totaux :

milieu solide PCA

TDYM

2. Coliformes totaux et fécaux :

Remarque
milie Gélose lactosé bilié au vert brillant
VRBL
u et au rouge de phénol
solid Gélose désoxycholate -
e DCL
citrate - lactose
BLBVB bouillon lactosé bilé au vert (utilisé pour la plupart des
milie / brillant
produits alimentaires)
u VBL
liquid BCP
bouillon lactosé au pourpre
e / (colimétrie de l’eau)
de bromocrésol
BCPL

3. Identification d’E. coli :

Eau peptonée exempte

EPEI
milieu d’indole
+
liquide +
RK
Réaction du Kowacs

4. Streptocoques du groupe D

Remarque
ROTHE test présomptif
milieu liquide
LITZKY test confirmatif

5. ANAEROBIES SULFITOREDUCTEURS

milieu Clostridium sulfito-reducteurs VF viande-foie

solide sulfité

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Tryptone -
TSC sulfite -
Cyclosérine
Clostridium perfringens
Tryptone -
TSN sulfite -
néomycine

6. Staphylococcus aureus :

milieu liquide CHAPMAN

CHAPMAN
Giolliti
milieu solide
Cantonii
Baird Parker

7. Salmonelles

EPT eau peptonée tamponnée Pré-

enrichissem
ent

bouillon au sélénite et à la Enrichissem

cystine ent
(milieu mieux adapté au
contrôle des aliments)

milieu SS (Salmonella Shigella )

S-S Isolement
solide
Hektoe
n
gélose au vert brillant
et au rouge de
phénol

8. Levures et moisissures

gélose
glucosée à
l’oxytétracycli OGA
ne et extrait
de levure

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milieu gélosé
à la pomme PDA
de terre

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