PRIMER INFORME

“Aislamiento de bioactivos provenientes de la cáscara de semilla de aguacate con el fin de su

aprovechamiento antitumoral”

Resumen

“La parte menos apreciada de un aguacate pronto podría sufrir una transformación de la basura
al tesoro. En un primer estudio de su tipo, los científicos informan que las cáscaras de semilla de
aguacate, que generalmente se descartan junto con la semilla, son minas de oro ocultas que
contienen una plétora de compuestos químicos previamente no reconocidos. Dicen que estos
compuestos podrían eventualmente utilizarse para tratar una serie de enfermedades
debilitantes, así como para realzar el atractivo de los cosméticos, perfumes y otros bienes de
consumo”

“Los investigadores están presentando su trabajo hoy en la 254 Reunión Nacional y Exposición
de la Sociedad Americana de Química (ACS), la sociedad científica más grande del mundo”

“Podría muy bien ser que las cáscaras de semilla de aguacate, que la mayoría de la gente
considera un desperdicio de desechos, sean en realidad la gema de las gemas porque los
compuestos medicinales dentro de ellas podrían eventualmente usarse para tratar el cáncer,
enfermedades del corazón y otras afecciones” dice Debasish Bandyopadhyay, PhD. “Nuestros
resultados también sugieren que las cáscaras de semillas son una fuente potencial de químicos
usados en plásticos y otros productos industriales”.

Entre los componentes del aceite se encontraba el alcohol behenílico (también conocido como
docosanol), un ingrediente importante utilizado en los medicamentos antivirales; heptacosano,
que podría inhibir el crecimiento de células tumorales; y el ácido dodecanoico, que aumenta la
lipoproteína de alta densidad (conocida como HDL) y, como resultado, podría reducir el riesgo
de aterosclerosis.

Avanzando, Bandyopadhyay dice que su equipo modificará varios de estos compuestos

naturales para que puedan usarse para crear mejores medicamentos con menos efectos
secundarios.1

La semilla de aguacate y la cáscara de la semilla, son subproductos importantes en la

industrialización del aguacate, con importantes propiedades funcionales. El objetivo del
presente estudio fue la eficiencia en el aislamiento del heptocosano utilizando extracción por
solvente acelerada (ASE) y cromatografía líquida acoplada a Q-TOF de ultra alta definición de
masa.

Introducción

Además, la semilla de aguacate tiene una pequeña capa de semilla marrón, que se utiliza como
una característica interna de la fruta indicativa de la madurez. A pesar de que algunos estudios
sugirieron el potencial de las semillas de aguacate como anticancerígenas, antiinflamatorias,
antidiabéticas, antihipertensivas, hipocolesterolémicas, antimicrobianas e insecticidas.

Varios estudios reportaron la presencia de compuestos fenólicos en semillas de aguacate; sin

embargo, estas investigaciones no identificaron más de 16 compuestos, en todos los estudios

1
(Bandyopadhyay, 2017)
mencionados se utilizaron solventes incompatibles (metanol y acetona) con las industrias
farmacéutica, cosmética y alimentaria, limitando el uso de estos subproductos como aditivos
naturales. En este sentido, es necesario el uso de procedimientos de extracción compatibles con
solventes generalmente reconocidos como seguros o GRAS, como etanol, agua o sus mezclas.
Por lo tanto, la extracción de solvente acelerada es una tecnología verde que obtiene
rendimientos similares o mayores que los procedimientos tradicionales totalmente amigables
con este tipo de solventes.

Muestras

Todas las frutas se almacenaron a temperatura ambiente hasta su plena madurez. La semilla de
aguacate completa se separó manualmente y se limpió bajo un flujo continuo de agua del grifo.
Luego, estos subproductos se secaron en horno a 85°C durante 24h, momento en el que el
revestimiento de la semilla se separó manualmente y las semillas se cortaron para acelerar el
proceso de secado. Después de eso, el subproducto obtenido se cortó y se secó en horno a 85°C
mientras se giraba periódicamente para soportar una sequedad uniforme hasta un porcentaje
de contenido de humedad inferior al 10%. Luego, las muestras secas se molieron en un molino
ultra centrífugo ZM 200. La semilla de aguacate resultante y el revestimiento de la semilla tenían
un tamaño de partícula promedio de 0.5 mm. El material se almacenó a temperatura ambiente
y se protegió de la luz hasta su extracción y análisis. (Jorge G. Figueroa, Comprehensive
characterization of phenolic and other polar compounds in the seed and seed coat of avocado
by HPLC-DAD-ESI-QTQF-MS, 2017)

Extracción acelerada de solventes (ASE)

Las extracciones de compuestos bioactivos se realizaron utilizando un extractor de solventes
acelerado modelo ASE 350, según el método de Herrero con algunas modificaciones.
En resumen, se extrajeron 1.5g de muestra seca (semilla o capa de semilla) con etanol – agua
(1:1 v/v) a 200°C y 11MPa. El disolvente se sometió a sonicación previamente durante 15
minutos para eliminar el oxígeno disuelto para evitar cualquier posible oxidación. Además, para
evitar la obstrucción de las fritas metálicas, se colocaron filtros de celulosa desechables en cada
extremo de la celda. Los extractos obtenidos se enfriaron inmediatamente en huelo para
alcanzar una temperatura de 20-25°C y se centrifugaron durante 15 minutos a una RCF de 12902
y 4°C en una centrífuga Sorvall ST 16R.
Finalmente, los sobrenadantes se evaporaron al vacío (13 Kpa) a 35°C hasta sequedad en un
Savan SC250EXP SpeedVac. Los extractos resultantes se almacenaron a -20°C hasta análisis
adicionales. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Preparación de la muestra

Cada fruta fue pesada y luego se cortó para obtener la pulpa, la cáscara y la semilla, fracciones
que fueron pesadas. Una pequeña cantidad de cada fracción fue utilizada para determinarle su
contenido de humedad. El resto del material fue utilizado para su deshidratación la cual se logró
por liofilización en el caso de la pulpa, para la cáscara y semilla se utilizó deshidratación con un
horno de convección. La semilla después de obtenerla del fruto se lavó con agua con cloro al 5%
y luego con agua destilada antes de secar a 60°C hasta peso constante. Una vez seca se separa
la cáscara de la semilla haciendo fricción en la superficie de la semilla.2

2
(Figueroa, 2018)
Contenido de Polifenoles y Taninos en Semilla y Tegumento de la Semilla

Las semillas de las muestras del fruto de aguacate después de lavadas y secadas por su humedad
artificial fueron deshidratadas y luego molidas para tomar muestras para el análisis de taninos y
polifenoles. Durante la deshidratación se removió por fricción el tegumento que también es
analizado.

Todas las frutas se almacenaron a temperatura ambiente hasta su plena madurez. La semilla de
aguacate completa se separó manualmente y se limpió bajo un flujo continuo de agua de grifo.
Luego, estos subproductos se secaron en horno a 85°C durante 24h, momento en el que el
revestimiento de la semilla se separó manualmente y las semillas se cortaron para acelera el
proceso de secado. Después de eso, el subproducto obtenido se cortó y se secó en horno a 85°C
mientras se giraba periódicamente para asegurar una sequedad uniforme hasta un porcentaje
de contenido de humedad inferior al 10%. Luego, las muestras secas se molieron en un molino
ultra centrífugo ZM 200. La semilla de aguacate resultante y el revestimiento de la semilla tenían
un tamaño de partícula promedio de 0.5 mm. El material se almacenó a temperatura ambiente
y se protegió de la luz hasta su extracción y análisis.

Las extracciones de compuestos bioactivos se realizaron utilizando un extractor de solventes

acelerado modelo ASE 30, según el método con algunas modificaciones. En resumen, se
extrajeron 1.5g de muestra seca (semilla o capa de semilla) con etanol-agua (1:1, v/v) a 200°C y
11MPa. El disolvente se sometió a sonicación previamente durante 15 minutos para eliminar el
oxígeno disuelto para evitar cualquier posible oxidación. Además, para evitar la obstrucción de
las fritas metálicas, se colocaron filtros de celulosa desechables en cada extremo de la celda. Los
extractos obtenidos se enfriaron inmediatamente en hielo para alcanzar una temperatura de
20-25°C y se centrifugaron durante 15 minutos a una RCF de 12902 y 4°C en una centrífuga
Sorvall ST 16R. Finalmente, los sobrenadantes se evaporaron al vacío (13 kpa) a 35°C hasta
sequedad en un Savan SC250EXP SpeedVac. Los extractos resultantes se almacenaron a -20°C
hasta análisis adicionales. Todos los experimentos se realizaron por duplicado.3

Extracción y fraccionamiento de semillas de aguacate

Las semillas se liberaron de la pulpa de fruta, se limpiaron y se secaron completamente a 40°C y

luego se envasaron al vacío y se almacenaron a -20°C. Para el procesamiento adicional, las
semillas se liofilizaron, se pulverizaron en un molino de laboratorio y se desengrasaron con éter
de petróleo y se maceraron exhaustivamente con metanol para producir el extracto de metanol.

En otro proceso de extracción, las semillas de aguacate se desengrasaron y se extrajeron con

metanol antes de extraerlas con agua destilada y obtener el extracto acuoso. En un segundo
proceso, las semillas se separaron en los cotiledones y la testa. Los cotiledones de aguacate se
eliminaron con éter de petróleo y se maceraron con metanol. Par las subsiguientes etapas de
partición líquida-líquida, el extracto de metanol seco se disolvió en una mezcla de agua
nanopure y metanol (2:1 v/v) y en la primera etapa se compartió con éter de petróleo para
obtener la partición de éter de petróleo. En la segunda etapa, la fase de metanol residual se
repartió contra diclorometano para producir los compuestos semipolares en la partición de
CH2Cl2. En la etapa final, se usó acetato de etilo para extraer compuestos polares tales como
proantocianidinas y otros polifenoles de la fase metanol-agua para producir la partición de

3
(Bressani, 2009)
EtOAc. El residuo final se denominó MeOH-H2O. Los extractos y particiones obtenidos se
filtraron a través de filtros de papel y se concentraron a vacío a 35°C. La partición M de metanol-
agua se fraccionó por cromatografía de contracorriente de alta velocidad.4

Semilla de Aguacate

Secado, Molido, Análisis de

Humedad

Cada 200g desgrasado de éter

de petróleo (3 x 1L)

Extracto de éter de
petróleo

Residuo

Acetato de Etilo 2L Metanol 2L

Extracto de acetato Extracto de MeOH

de etilo

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS

Inicialmente los frutos se lavaron con agua desionizada para eliminar las impurezas. Se pesó
cada fruto y posteriormente se separó manualmente el epicarpio y la semilla de cada aguacate.
Las muestras se colocaron en un erlenmeyer de 500 ml. Se adicionó la cantidad de metanol/agua
(80:20 v/v) suficiente para cubrir toda la superficie del material vegetal, se selló cada recipiente
con papel celofán y se sometió a un proceso de maceración química durante 24 horas.

El extracto crudo (EC) de las dos partes del fruto se filtró empleando papel filtro Whatman, luego
se rotaevaporó el solvente empleando un rotaevaporador Heidolph a 40°C y finalmente se secó
cada extracto sobre una plancha de calentamiento a una temperatura de 45°C. El mismo proceso

4
(R.Ramos-Jerz, 2013)
se evaluó empleando acetona/agua (70:30 v/v). El proceso de extracción utilizando los dos tipos
de solventes se realizó por triplicado obteniendo finalmente el extracto crudo de semilla (ECS)
y el extracto crudo de epicarpio (ECE).5

PREAPARACIÓN DEL EXTRACTO

Una vez recolectada la pepa de palta se realizó un rayado para obtener finas partículas las cuales
fueron extendidas en papel mantequilla para su secado a temperatura ambiente, fuera del
alcance de la luz solar.

Luego se procedió al pesado.

Luego se procedió a instalar el equipo de percolación, una vez instalado se procedió a depositar
la muestra obtenida en tres diferentes recipientes del percolador aumentando a estos
recipientes alcohol al 96, 50 y 25% esta mezcla se sometió a maceración por 24 horas.

Se pasó a concentrar el extracto etanólico de la muestra conseguido por percolación, en un

rotaevaporador, eliminando todo el solvente utilizado en la extracción, para que este no sea
dañino al momento de su administración.

ESTUDIO FITOQUÍMICO

El estudio fitoquímico en determinaciones cualitativos efectuadas demostró que las saponinas

y alcaloides se encontraron en una mayor cantidad en fracción y los flavonoides y taninos
también estuvieron presentes y la prueba cromatográfica corroboró estos hallazgos, demostró
su presencia, pero en cantidades menores.

Prueba de Flavonoides

La prueba de flavonoides consiste en que 1ml de solución de muestra se introducen en el tubo

de ensayo y luego se agrega un poco de polvo de magnesio y algunas gotas de HCl concentrado
(reactivo de Shinola), por lo que, al reaccionar positivamente, resultará en una solución naranja,
rosa o roja.

Prueba de saponina

Se inserta un total de 2,0ml de solución de muestra en el tubo de ensayo y se agita durante unos
minutos; cuando reacciona positivamente, formará una espuma estable durante 15 minutos.

Prueba de taninos

La prueba de taninos es que 1,0 ml de la solución de muestra se introducen en el tubo de ensayo

y luego se agrega una gota de solución de cloruro férrico al 5%. Cuando reacciona positivamente,
dará como resultado un precipitado marrón y una solución de color azul oscuro.

Prueba de alcaloides

La prueba de alcaloide es de 1,0 ml de muestra que se alimenta al tubo de ensayo y luego se

agregan 2-3 gotas de reactivo de Dragendorff, por lo que, al reaccionar positivamente, dará lugar
a un precipitado de color naranja.

5
(Rosero, 2017)
Prueba de esteroides

La prueba de esteroides es que se agregan 1ml de extracto con 3-5 gotas de cloroformo, luego
se agregan nuevamente con 3-5 gotas de hidruro de ácido acético y 10 gotas de ácido sulfúrico
concentrado. La prueba positiva está marcada por un cambio en el color de la solución azul o
verde.6

Reacción de Metabolitos Extracto

Molish Carbohidratos ++

Antrona Carbohidratos ++

FeCl3 Compuestos fenólicos ++

Gelatina Taninos ++

Shinoda Flavonoides ++

Dragendorff Alcaloides +++

Mayer Alcaloides +++

Hidroxilamina Carbonilo ++

Índice afrosimétrico Saponinas +++

6
(Moran, Efecto del extracto etanólico de la semilla persea americana sobre la fertilidad en ratas , 2016)
 Ilustración 1 Marcha fitoquímica del extracto etanólico de semilla de persea americana

Prueba de actividad oxidante utilizando el método DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo)

Extracto concentrado de la muestra cuya actividad oxidante se determinó, usó el método

espectrofotométrico con reactivo DPPH. El extracto de la muestra se pesó 25 mg y luego se puso
en un matraz de medición de 25ml, luego se ajustó con un disolvente de etanol para obtener
una concentración de la solución de 1000 ppm. Luego se realizaron una serie de diluciones para
obtener una solución de 10, 30, 50, 70 y 90 mg/L. La solución se preparó, se canalizó para 0.2 ml
y se agregó con 3.8ml de solución DPPH 50 µM. La mezcla se homogeniza y se deja durante 30
minutos en la oscuridad. Luego, la captación se mide a una longitud de onda de 517 nm. Las
pruebas también se realizaron en solución DPPH. El valor de absorbancia obtenido se usa para
determinar la inhibición (%) usando la siguiente ecuación.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐷𝑃𝑃𝐻 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒
𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛(%) = ∗ 100%
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐷𝑃𝑃𝐻

Posteriormente, se preparó una curva de inhibición (%) y se determinó la IC50 (concentración

de inhibición) sobre la base de la ecuación de regresión obtenida. El parámetro para interpretar
los resultados de la prueba por el método DPPH es IC50. Cuanto menor sea el valor de IC50,
mayor será la actividad oxidante. El valor de IC50 se obtiene de varias etapas, antes de calcular
el valor de IC50, primero calcule el valor logarítmico de la concentración y el valor probit para
cada porcentaje de actividad de captura de radicales libres. Niveles de poder antioxidante
basados en IC50, los valores son: muy fuerte (<50), fuerte (50-100), medio(100-250), débil(250-
500) e inactivo (>500).

Isoflavonoides

Los estudios médicos han demostrado que los glucósidos isoflavonoides son convertidos por
bacterias en el intestino a sustancias similares a las hormonas que influyen en la proliferación
de células malignas y otros factores de una manera que los hace candidatos fuertes como
agentes naturales protectores contra el cáncer. De hecho, se reconoce que los isoflavonoides
son potentes inhibidores del crecimiento de células tumorales de mama humanas inducidas por
pesticidas o contaminantes ambientales como los alquilfenoles. Varios experimentos con
animales han proporcionado evidencia de que los isoflavonoides pueden prevenir el desarrollo
de cáncer tanto en las etapas de promoción como de iniciación.
Como consecuencia del importante papel desempeñado por los isoflavonoides en la salud
humana, se han utilizado diferentes técnicas analíticas, por ejemplo, cromatografía de gases,
espectrometría de masas para el análisis de estos compuestos después de la derivación. En los
compuestos después de la derivación. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios
métodos de HPLC con espectrometría fluorimétrica UV y detección electroquímica para la
determinación de estos compuestos. Más recientemente, la HPLC combinada con la
espectrometría de masas con pulverización iónica y las interfaces de ionización química a
presión atmosférica se han propuesto para la determinación de isoflavonoides.7

Actividades anticancerígenas de flavonoides (Sanchez, 2009)

Determinación y separación de los compuestos fenólicos

Los extractos crudos de semilla y epicarpio de aguacate con mayor actividad antioxidante se
purificaron utilizando una resina polimérica (Amberlita XAD-7) empacada en una columna
cromatográfica de dimensiones: largo 23,5cm y diámetro interno 2cm. Este proceso se realizó
con el fin de eliminar compuestos co-extraídos durante la maceración como azúcares,
aminoácidos, proteínas entre otros. Como paso preliminar fue necesario activar la resina con
300ml de H20, HCl (0.01%). Posteriormente se cargaron independientemente 2.056g de ECS y

7
(M.Careri, 2001)
ECE realizando lavados con agua hasta completar un volumen de 500 ml. Finalmente se eluyeron
los compuestos fenólicos retenidos con una mezcla de metanol/ácido acético (19:1, v/v).

Fraccionamiento de los extractos purificados

El proceso de separación de los compuestos fenólicos se realizó sobre una resina de Sephadex
LH-20, la cual fue activada inicialmente con 500 ml de H2O: HCl (0.01%) y acondicionada con 1L
de agua. Una vez activada la resina, se disolvieron independientemente 0.25g de los extractos
EPS y ESE en la mínima cantidad de la fase móvil inicial y se cargaron en las columnas de
dimensiones: largo 26cm y diámetro interno 2cm.

Para la elución de los compuestos fenólicos se empleó tres fases móviles diferentes, los
compuestos fenólicos de bajo peso molecular eluyeron con 400 ml de metanol/agua (30:70,
v/v), en este proceso se recolectaron un total de 32 fracciones de 10ml cada una obteniendo las
fracciones F1S ( fracción 1 para la semilla) y F1E (fracción 1 del epicarpio). Los compuestos
fenólicos de tamaño molecular intermedio eluyeron con 450 ml de metanol/agua (60:40 v/v),
recolectando para el caso del EPS la fracción F2S (fracción 2 de la semilla9 y para el EPE la
fracción F2E (fracción 2 del epicarpio).

Finalmente, los compuestos poliméricos ( de mayor peso molecular) eluyeron con 250ml de
acetona/agua (60:40) obteniendo las fracciones F3S (fracción 3 de la semilla) y F3E (fracción 3
del epicarpio). Se realizó un seguimiento por espectroscopía UV-Vis a cada una de las fracciones
obtenidas con el fin de determinar la forma de elución de los compuestos fenólicos y de esta
forma iniciar el cambio de fase móvil.

Finalmente para cada fracción se rotaevaporó el disolvente y se llevó a sequedad a una

temperatura de 45°C obteniéndose en total 6 fracciones.8

Cuantificación de quercetina

Obtención del extracto metanólico

Se utilizaron 10g de capítulos secos, los cuales fueron extraídos en un soxhlet durant 6h
utilizando como solvente de extracción 300 ml de metanol. El extracto fue llevado a sequedad a
presión reducida en rotavapor obteniéndose un rendimiento de 16,25% de residuo metanólico
seco.

Obtención de la fracción acetato de etilo

El residuo metanólico se resuspende con 50ml de agua destilada y se agregan 50ml de HCl 2N.
Luego de mantener en ebullición en baño maría durante 1h se deja enfriar y se extrae con 50ml
de acetato de etilo (x3). Los extractos se juntan y filtran con papel filtro y se llevan a sequedad
en rotavapor obteniéndose un rendimiento de 2,8%.

Cromatografía en capa fina

Se diluyen 70mg del extracto acetato de etilo en 1ml de metanol. Se siembran 25 µl en placas
de sílica gel G 60 F254 Merck de 5x10 cm. Las placas fueron desarrolladas en acetato de etilo-
metanol (10:1, v/v). Luego de secadas al aire se observaron bajo luz UV a 366nm, las bandas con
similares Rfs a los estándares auténticos sintétios de quercetina, fueron removidas y eluidas con

8
(Rosero, 2017)
metanol colocando el solvente de extracción en tubos de ensayo. Los extractos de cada fracción
fueron evaporados bajo una corriente de nitrógeno.

Cromatografía líquida de alta eficacia

Cada fracción fue resuelta por HPLC en las mismas condiciones que las detalladas para la
purificación de los compuestos.

Espectrometría de Masas

Los compuestos obtenidos por HPLC fueron identificados por espectrometría de masas
utilizando un espectrómetro de masas magnético Micromass Model Autospec y un impacto
electrónico de 70 eV.9

Cuantificación del contenido de flavonoides totales

Este método consiste en formar un complejo de aluminio-flavonoides en presencia de medio

básico que presenta una coloración rosa salmón que absorbe a 490 nm. La reacción se lleva a
cabo en presencia de nitrito de sodio, el cual genera inicialmente una reacción de oxidación de
los grupos hidroxilos C2 y C3 en el anillo B del compuesto de flavonoides. Posteriormente en
presencia del cloruro de aluminio se da una reacción de nitrosilación en C5 (anillo B). En esta
etapa el aluminio forma un complejo de coordinación con el grupo carbonilo en C2 y un enlace
con C3 formando un compuesto coloreado amarillo. Finalmente la adición de hidróxido de sodio
permite que el oxígeno del grupo nitrosilo en C5 se reduzca formando el complejo coloreado de
color rosa salmón. Cabe resaltar la capacidad que posee el cloruro de aluminio para formar
complejos con grupos o-hidroxilo y con grupos hidroxil cetona vecinos para formar complejos
lábiles ante la presencia del ácido de tal modo que este desaparece con el agregado de HCl, no
así en el segundo caso en el que el complejo es estable. El contenido de flavonoides totales se
expresa como mg de catequina por cada g de muestra.

9
(Toso, 2002)
Reacción de quelación del ión Al+3 con flavonoides.10

Composición de cáscara y semilla Persea americana.11

10
(Hongbin, 2010)
11
(Alkhalg, 2018)
Bibliografía
Alkhalg, M. I. (2018). Anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activities of avocado
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