MODO DE USO

O Kit contêm todo o material necessário para amplificação em tempo real no RotorGene (Corbett
Research), Mastercycler EP Realplex (Eppendorf) e MX3005P (Stratagene) of Plasminogen
activator inhibitor-1 (PAI-1) da sequencia do gene, que incluem polimorfismos do tipo
inserção/deleção de um G(4G/5G). Esse polimorfismo está na região promotora do gene que
compreende trombose arterial e venose profunda.

Esse produto é compatível com o kit de extração em coluna (cod NLM AA1001, “QIAamp DNA
blood Mini kit” Qiagen) e com o NLM Rápida Extração (cod. NLM AA898 somente para
RotorGene).

1. ESPECIFICIDADE
Especificidade do teste é de 100%.

2. INTRODUÇÃO
Trombose venosa é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, ocorrendo com uma
frequência que chega à 1/1000 casos por ano.
O risco trombótico é devido por fatores ambientais ( idade, gravidez, anticoncepcional oral, etc.) e
também por por predisposição genética.
Um dos fatores envolvidos na avaliação do risco trombótico é o inibidor de ativação do
plasminogênio (PAI-1); sua principal função é a dissolução de coágulos pela inibição da conversão
do plasminogênio no plasmina, a qual tem atividade fibrinolítica. A fibrinólise é um processo
fisiológico que tem como evento terminal a dissolução do rede de fibrina formada durante a
coagulação. A fibrinólise mantêm a integridade do coágulo pelo tempo necessário para parar a
hemorragia e previne a formação de trombose intravascular, devido à ativação espontânea do
caminho da coagulação.
Na região promotora do gene codificante dessa proteína, existe um polimorfismo do tipo
inserção/deleção de um G (4G/5G), que é associado com diferentes níveis de plasminogênio no
plasma consequentemente com risco trombótico.

3. PRINCÍPIO TECNOLÓGICO
O teste é baseado no Real Time PCR, uma tecnologia que permite o monitoramento em tempo real
do processo de amplificação.
O percurso do PCR é seguido através de uma quantificação fluorescente emitida pelas moléculas
ligadas às sondas de hibridização ( específico para a sequência de DNA de interesse) seguido da
transferência de energia de ressonância fluorescente. (FRET)
O DNA extraído é ampliado na presença de duas sondas contíguas e complementares à sequência
que contem a mutação: sondas em 5' são marcadas por um fluoróforo doador, sonda em 3' carrega o
fluoróforo aceitante. Durante a PCR, sondas hibridizam para o DNA alvo e fluoróforos estão muito
perto; na presença de uma fonte de luz há a transferência de energia do doador para o aceitante que
emite um sinal ( com um específico comprimento de onda) que permite o monitoramento do
processo de PCR. Sinais emitidos são proporcionais à acumulação do produto do PCR. Sem um
DNA alvo nenhuma transferência de energia é possível.
As sondas de hibridização permitem a identificação de mutações na sequência alvo durante a
análise da curva de dissociação (melting curve); o produto do PCR é submetido à uma temperatura
crescente com resultante desunião das sondas do DNA.
Na ausência da mutação, hibridização entre sonda ( em 5') e DNA alvo é bem estável a respeito da
hibridização entre a sonda e o DNA quando uma incompatibilidade (single point mismatch) está
presente.
No primeiro caso, o aumento da temperatura orienta para a dissociação entre sonda e DNA em um
valor de temperatura maior que o segundo caso. A análise da curva de dissociação permite tipificar
exemplares através da geração de um pico único ( na temperatura diferente) para tipo selvagem e
mutantes homozigotos simples, e dois picos para exemplares heterozigotos.
 a) Transferência de energia de ressonância (E) está baixa b) Durante o passo da hibridização, fluoróforo doador
quando as sondas estão dissociadas do DNA alvo (D) e fluoróforo aceitante(A) estão próximos com
consequente aumento da transferência de energia de
ressonância
Referências
Filippo Aucella et al. Nephrol Dial Transplant (2003) 18: 1142–1146
M.D.I. Vergouwen et al. Stroke. 2004;35:1280-1283
Markus Nauck et al. Clinical Chemistry 45:8 1141–1147 (1999)
R.J. Pegoraro et al. Cardiovascular Journal Of South Africa Vol 16, No 5, September/October 2005
Argirios E. Tsantes et al. Thromb Haemost 2007; 97: 907–913
T.Buchholz et al. Human Reproduction Vol.18, No.11 pp. 2473±2477, 2003
Per-Gunnar Wiklundet al. Stroke. 2005;36:1661-1665

4. MATERIAL DO KIT
Reagentes Numero de Volume/frasco
frascos
Mix 1 5 X 5testes 100 µl
Mix 2 5 X 5testes 65 µl

Enzima de amplificação designada: tampa verde.

Todos os reagentes devem ser armazenados à -20°C.

TESTE/CORRIDA​: Esse kit é otimizado para o uso em 5 testes/corrida.

Nota: ​O kit contem todos os reagentes necessários requeridos para, pelo menos, 5 testes em 5
experimentos distintos. Use com um número de testes menor que 5 em cada corrida, podendo levar
à impossibilidade de usar todos os testes existentes no kit.

5. AVISO
● Vestir bata de laboratório e luvas descartáveis quando manipulando amostras e kit de reagente
● Usar frascos esterilizados e pontas de pipeta resistente à aerosol para evitar contaminação
cruzada em contaminação da pipeta
● Descartar todo material usado (pontas de pipeta, luvas...) como lixo biológico de risco
● É aconselhável constante e uniforme temperatura no laboratório, evite colocar os
instrumentos próxima à fonte de aquecimento/resfriamento que podem comprometer o
trabalho direito.
6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, PORÉM NÃO FORNECIDO
Real Time PCR instruments.
Vertical down-flow airbox
Conjunto de micropipetas ajustáveis

7. PASSO DE AMPLIFICAÇÃO
Aviso
■ Antes de começar, verificar a modularidade do dispositivo.
■ Evitar repetidos ciclos de congelamento/descongelamento de amostra de sangue e /ou DNA para
evitar maus resultados de análise.
■ Recomenda-se ajustar o perfil no instrumento antes de iniciar, para preparar a mistura de
amplificação
Evitar repetido descongelamento da mistura de amplificação.
Sondas específicas no Mix 2 são fotossensíveis: evitar direta e prolongada exposição à luz.
Usar somente tubos dedicados à PCR​ :
Tubo sem cúpula 0.2 ml (RotorGene)
Tubo 8 Strip 0.2ml ou 96 poços de placas (RealPlex e MX3005P)

Preparar a mistura de amplificação como a seguir:

 Reagentes Volume por amostra

Mix 1 10,75 µl

Mix 2 10 µl

Taq polimerase5 U/µl 0,25 µl

(tampa verde)

Prepare a mistura de amplificação para “n”+1 amostras ( se “n” ​ 10) ou + 2 amostras (se “n”
​10).
Misture suavemente enquanto faz a pipetagem para evitar a formação de espuma
Pipete ​21 µl ​da mistura de amplificação em cada tubo (previamente marcado)
Adicionar ​4 µl ​da amostra de DNA. A concentração do DNA usada nesse teste deve ser ​30-40
ng/​​l​.

ROTORGENE
PERFIL TÉRMICO DO PCR

Coloque tubos no RotorGene e feche a tampa; use a função do software “​Edit Samples​” para inserir
a posição das amostras.
Na seção “​Setting​” ajuste o ​“reaction volume” para 25 µl e selecione o rotor usado (36/72
position). Cheque na janela “​Channels​” se ​fret 1​(Source 470 nm, Detector 610 hp) já está presente,
caso contrário clique em “Create new” para inseri-lo.
No menu “ ​View → gain calibration”​ ajuste a calibração automática de temperatura para 54°C no
canal fret 1 ​(Min reading 15 FI; Max reading 20 FI)​e ative o checkbox ​“Perform calibration
before first acquisition”​.
Na seção “​Profile​” ajustar “thermal-profile” como se segue:
RotorGene 3000
 Cycle Cycle Point
Denature: 95°C, 2 min
Cycling (40 repeats) Step 1: 95°C, 15 sec
Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret
1)
Step 3: 72°C, 10 sec
Hold: 95°C, 15 sec
Hold 2: 45°C, 1 min
Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 10
sec on next steps, acquiring to Melt A (fret 1)
RotorGene 6000/Q
Cycle Cycle Point
Denature: 95°C, 2 min
Cycling (40 repeats) Step 1: 95°C, 15 sec
Step 2: 54°C, 20 sec; acquiring to Cycling A (fret 1)
Step 3: 72°C, 10 sec
Hold: 95°C, 15 sec
Melt: (45-80°C), hold 90 sec on 1st step, hold 10 sec on
next steps, acquiring to Melt A (fret 1)

Selecione a opção “Gain optimization” e insira“90” como valor máximo da fluorescência.

RG3000 e 6000/Q: Na etapa “melt”, manter selecionado 1º como parâmetro de aumento de

temperatura: não mudar o parâmetro pré-selecionado.
Inicie a análise clicando no botão “Start” . O comprimento da análise é de aproximadamente 90
minutos para o RotorGene 3000 e 75 minutes para o RotorGene 6000/Q.

8. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Clique em “​Analysis​” e selecione a opção “​Melt​”: uma janela com o gráfico da análise será exibido.
O gráfico mostra a curva de dissociação de cada amostra que pode ser:
● um único pico à ​56.5°C ​​ 1,5°C​ para amostras 4G homozigotas
● um único ponto à ​63°C ​​ 1,5°C​ para amostras 5G homozigotas
● um duplo pico para amostras heterozigotas
Não considerar picos fora do alcance da temperatura.
Para obter a amostra escrita selecionar “New bin”: no gráfico irá aparecer um cursor que deve ser
colocado em correspondência do primeiro pico (Bin A); repetir a mesma operação para o segundo
pico (Bin B).
Clique no ícone “Genotypes”; uma nova janela será exibida. Ajustar item como se segue: amostras
homozigóticas 4G (Bin A), amostras heterozigóticas (Bin A, Bin B), amostras homozigóticas 5G
(Bin B).
Clique em“Report” para obter o resultado final.
Exemplo da análise realizada: amostra homozigótica 4G, heterozigótica 4G/5G e homozigótica
5G:

No. Cor Nome Genótipo Pico 1 Pico 2

1 1 4G 55,8 (bin A)
2 2 4G/5G 55,7 (bin A) 62,3 (bin B)
3 3 5G 62,3 (bin B)

9. AVISO
● Não usar amostras de sangue ou DNA que tenha sido congelada por mais de um ano, ou que
passaram por vários ciclos de congelamento/descongelamento para evitar baixos picos ou
problemas relacionados ao passo da amplificação. Recomendamos o uso de sangue fresco ou
amostras congeladas descongeladas somente uma vez.
● Se existir uma incompatibilidade entre a digitação no relatório final e os picos do gráfico ajustar
a linha limiar é requerido para excluir sinal de fundo que causa resultados errôneos. Clique na
janela ​“Threshold” : no gráfico irá aparecer um cursos requerido para o ajuste do valor
limiar(linha azul).

Exemplo:
● fig. 1 (limiar = 0)  incorreta digitação (amostra heterozigótica)
● fig. 2 (limiar = 1)  correta digitação (amostra homozigótica 5G)

Fig. 1 Fig. 2

No. Colour Name Type Genotype Peaks No. Colour Name Type Genotype Peaks
14 5G Amostra 4G/5G 51,8 (Bin A), 14 5G Amostra 5G 62,5 (Bin B)
62,5 (Bin B)

Somente para Rotorgene 3000

● Se a “amplitude do pico(s)” não é boa(picos muito baixos), é possível aumentar o “ valor
ganho” e repetir o passo de derretimento no mesmo produto PCR :
a. Selecione o ícone​“New” ​ para realizar uma nova análise
b. Na função “​Profile​” ajuste “thermal-profile” como se segue ( duração de aproximadamente
15 minutos):
Cycle
Denature: 95°C, 1 min
Hold: 45°C, 1 min
Melt: (45-80°C), hold 15 sec on 1st step, hold 10 sec on next steps, acquiring to Melt A
(fret 1)
em “ ​View → gain calibration”​ desmarcar calibração automática
c.
Selecionar o ícone​“Gain”​ e aumentar o valor do fret1 para 1 unidade
d.
Iniciar a análise
e.
● Se o sinal registrado durante a rampa de dissociação (raw-data) levar à saturação (ver fig. da
 esquerda) existe um significante risco de perder picos, com consequente digitações errôneas;
nesse caso repetir a análise como previamente descrito diminuindo o valor ganho ( ver fig. da
direita)
Exemplo:
MASTERCYCLER EP REALPLEX
PERFIL TÉRMICO PCR
Colocar tubos no RealPlex e fechar a tampa;
No menu ​plate layout,​ ​set filter 520 nm FAM and filter 605 nm LC610,​ ajustar ​no reference dye,
sample volume 25 uL, ​ probe ​hy probe​, background ​spectral calibration.
Nomear as amostrar e especificar a tipologia das amostras na placa como “desconhecido”.
No menu ​PCR Program​ ajustar o seguinte perfil térmico:

Ajustar ​lid temperature 105°​ , selecionar ​Ep gradient S,​ ​sim tube,​ ​TSP Heated lid
Modificar percentagem da rampa no perfil térmico​:
Ajustar a rampa para 50% no passo de aquecimento para 95 e 72°C como a seguir:
1 Clicar com o botão direto do mouse no passo único (95 e/ou 72°C) de amplificação;
2 selecionar “​edit step”
3 Ajustar 50 no “ Ramp [%] “
4 confirmar com OK.
Ajustar a rampa para 60% no passo de resfriamento para 54°C como a seguir:
1- Clicar com o botão direito do mouse no passo único (54°C) da amplificação;
2- selecionar “​edit step”
3- ajustar 60 em “ Ramp [%] “
4- confirmar com OK.
Começar o experimento; Duração da análise é de aproximadamente 90 minutos.

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

No menu selecionar ​Analysis​, e em “type of application” ajustar ​melting curve​ e tintura LC610 .
O gráfico mostra a curva de dissociação de cada amostra que pode ser:
● um único pico à ​56.5°C ​​ 1,5°C​ para amostras homozigóticas 4G
● um único pico à ​63°C ​​ 1,5°C​ para amostras homozigóticas 5G
● um duplo pico para amostras heterozigóticas
Exemplo de análise realizada em: amostra numero 4 (homozigótico4G), amostra numero 5
(heterozigótico 4G/5G) e amostra numero 6 (homozigótico 5G):

10.AVISO
■ Não usar amostras de sangue ou DNA que tenha sido congelada por mais de um ano, ou que
passaram por vários ciclos de congelamento/descongelamento para evitar baixos picos ou
problemas relacionados ao passo da amplificação. Recomendamos o uso de sangue fresco ou
amostras congeladas descongeladas somente uma vez.
■ Se as digitações das amostras relatadas no relatório final não correspondem com os picos no
gráfico, mova o limiar acima da base de If samples typing reported in the final report doesn’t
match with the peaks on the graph, move the threshold above the baseline noise to eliminate the
background signal.
■ Para amostras heterozigóticas, o software requer que o limiar cruze os 2 picos para obter o
correto genótipo. É possível ajustar o limiar para único amostra e preparar um relatório
separado.

MX3005P
Baixar as instruções de uso pelo website da NLM:
http://www.nlm.it/downloads.aspx?CID=1876&SORD=1&MID=10180

SEGURANÇA
● Não comer, beber, fumar ou maquilar-se na área de trabalho.
● Usar luvas de látex descartáveis quando manipulando reagentes e amostras. Não pipetar com a
boca.
● Considerar quaisquer amostras biológicas como potencialmente perigosas e infectadas. Limpar
e desinfetar cada superfície onde amostras biológicas foram manuseadas.
1.

Lot
number
Catalogue number
Temperature
limitation

Use by

Consult instruction
for use

European Conformity
In​ ​vitro
diagnostic device
Control