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Je tiens aussi à exprimer ma gratitude aux Docteur DJABER Abderezak et Docteur BERREBAH -
ALIOUA Amel, qui ont bien voulu consentirà porter leurs appréciations sur ce travail réalisé.
-Aux officiers de la police Scientifique d’Oran qui m’ont bien accueilli et aidé pour mes analyses.
Je dédie ce travail à mes très chers parents qui m ‘ont tout offert pour réussir.
Depuis les temps les plus reculés, la nature a constitué une source intarissable ou l’homme a
puisé nourritures et remèdes pour assurer sa survie. L’offrande la plus précieuse faite par le
monde végétal à l’humanité et constituée par les substances aromatiques telles que les huiles
essentielles, les flavones et les alcaloïdes.
Ces molécules biologiquement actives occupent une place unique et jouent un rôle
irremplaçable dans le courant du grand fleuve de la vie. Elles purifient les tissus et les fluides
de l’organisme, vitalisent toutes ses fonctions pour leurs transferts énergétiques et
euphorisent l’esprit par leur pénétration flagrance (Sommerard, 1990).
Au cours de cette décennie, plusieurs raisons ont mené au retour à l’usage des plantes
médicinales dont les produits sont moins onéreux que les médicaments de synthèse qui ont
plusieurs effets secondaires (Sané, 1991 .,Pendneault et al.,2001).
Dans l’antiquité, certaines plantes étaient révérées pour les vertus qu’on leur avait reconnues.
Aucun ne cherchait à savoir pourquoi et comment elles agissaient, mais c’était un fait
incontesté et qui paraissait magique.
Actuellement la recherche sur les bienfaits des plantes médicinales voit son développement
s’accroître, notamment avec les huiles essentielles dont les domaines d’applications sont
nombreux aussi bien en médecine, en pharmacie ainsi que dans d’autres domaines tels que
l’agroalimentaires, les industries chimiques (Odoul ,2003).
Sous le prolongement de cette approche de la connaissance des plantes en général et de la
valorisation des plantes médicinales,on s’est intéressés à une espèce particulière de la famille
des Lamiacées, comme la plus utilisée au niveau mondiale comme épices ou (et) extraits à
fort pouvoir antimicrobien et pharmacologique.
La plante sur la qu’elle a porté notre choix est le Romarin « Rosmarinus offcinalis ».
Cette étude s’est particulièrement attachée à la plante provenant de trois régions différentes
d’Algérie à savoir : « Ain Defla, -Aflou -Barraki »
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Cette étude a pour objectifs :
-D’extraire l’huile essentielle du Romarin par la technique d’hydrodistillation.
-D’évaluer le rendement d’extraction.
-De faire une analyse qualitative et semi-quantitative de l’huile essentielle du Romarin des
trois régions étudiées par la technique de la Chromatographie phase gazeuse couplé à la
spectrométrie de masse « GC-SM».
-D’étudier l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle du Romarin à savoir :
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
1. Définition
La 8ème édition de la pharmacopée française (1965) a défini une huile essentielle (HE),
appelée également essence ou huile volatile, comme étant un produit de composition
généralement assez complexe renfermant les principes volatils contenus dans les végétaux
sont plus ou moins modifiés au cours de l’extraction. Pour extraire ces principes volatils, il
existe divers procédés, deux seulement sont utilisés pour la récupération des essences
officinales. La distillation dans la vapeur d’eau des plantes à essence ou de certains de leurs
organes, et le procédé par expression. Depuis la 9ème édition en 1972, la pharmacopée n’utilise
plus que le terme huile essentielle (Bruneton., 1993).
Depuis octobre 1987, la norme (AFNOR NF T 75-214) définit une huile essentielle comme
étant un produit obtenu à partir d’une matière première végétale, soit par entrainement à la
vapeur d’eau, soit par des procédés mécaniques à partir de l’épicarpe des citrus, soit par
distillation à sec. L’huile essentielle est ensuite séparée de la phase aqueuse par des procédés
physiques (Bruneton., 1993).
Cette définition par procédé est restrictive ; elle exclut aussi bien les produits par extraction à
l’aide de solvants que ceux obtenus par tout autre procédé (gaz sous pression, enfleurage…).
Cependant, ceux-ci occupent une place considérable sur les marchés de la pharmacie, des
produits d’hygiène, de l’industrie cosmétique, de la parfumerie ainsi que de nombreux
secteurs de l'agro-alimentaire (Bruneton., 1993).
Les HE sont fabriquées à partir des sucres issus de la photosynthèse, par des cellules
spécialisées (ou sécrétrices) situées le plus souvent dans les fleurs et les feuilles. Mais il est
aussi possible d’utiliser le fruit, le bois ou encore la racine du végétal considéré. L’huile
essentielle est un extrait pur et naturel de la partie odoriférante des plantes aromatiques.
(Roulier G., 1990 cités par Jean Michel Lardry.2007).
Les huiles essentielles n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs. Les
genres capables d’élaborer les constituants qui les composent sont répartis dans une
cinquantaine de familles dont beaucoup sont des Lamiales, des Astérales, des Rutales,
mais aussi des Lurales ou des Magnioliales. Seules les Violales (qui peuvent renfermer des
principes odorants) semblent n’élaborer aucun mono ou sesquiterpène (Bruneton., 1993).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Les huiles essentielles peuvent être stockées dans tous les organes végétaux : fleurs
(bergamotier, tubéreuse…), mais aussi feuilles (citronnelle, eucalyptus, laurier…) et, bien que
ce soit moins habituel, dans des écorces (cannelier), des bois (bois de rose, santal…), racines
(vétiver), des rhizomes (curcuma, gingembre…), des fruits (toutes- épices, anis badiane…),
des graines (muscade) (Bruneton., 1993).
Si tous les organes d’une même espèce peuvent renfermer une huile essentielle, la
composition de celle-ci peut varier selon sa localisation. Ainsi, dans le cas de l’oranger amer,
le péricarpe frais du fruit (zeste) fournit l’huile essentielle d’oranger amer, ou essence de
Curaçao ; la fleur fournit l’essence de Néroli et l’hydrodistillation de la feuille, des ramilles et
des petits fruits conduit à l’essence de petits grains bigaradier. La composition de ces trois
huiles essentielles est différente (Bruneton., 1993).
3. Localisation
4. Fonctions
La fonction biologique des terpénoides des huiles essentielles demeure le plus souvent
obscure. Il est toutefois vrai semblable qu’ils ont un rôle écologique. Le rôle de certains
d’entre eux a été établi expérimentalement aussi bien dans le domaine des interactions
végétales (comme agent allélopathiques, notamment inhibiteurs de germination) que dans
celui des interactions végétales-animales : protection contre les prédateurs (insectes
champignons) et attraction des pollinisateurs (Bruneton., 1993).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Selon Bernard et al.., (1988) et Bruneton (1995), on peut résumer les propriétés physico-
chimiques des HE comme suit :
Elles sont généralement liquides à température ambiante.
Elles sont volatiles et très rarement colorées.
Elles n’ont pas le toucher gras et onctueux des huiles fixes.
Leur densité est généralement inférieure à celle de l’eau.
L’indice de réfraction dépend essentiellement de la teneur en monoterpènes et en dérivés
oxygénés. Une forte teneur en monoterprènes donnera un indice élevé, cependant une
teneur élevée en dérives oxygènes produira l’effet inverse .
Elles sont solubles dans les alcools à titre alcoométrique élevé, dans la plupart des
solvants organique et les lipides, mais peu soluble dans l’eau.
Elles sont douées d’un pouvoir rotatoire puisqu’elles sont formées principalement de
composés asymétriques.
Les HE sont stables à température ambiante si elles sont conservées de manière adéquate
à l’abri de l’oxydation et de la polymérisation provoquée par l’air, par la lumière et par
les variations de température.
Leur point d'ébullition varie de 160 à 240°C.
6. Composition chimique
6.1. Généralités
Les composants des HE sont génériquement dits "aromatiques" en raison de leur caractère
odoriférant et non pour indiquer leur structure chimique, ce qui peut prêter à confusion
(Pibiri., 2006).
Le nombre de molécules chimiquement différentes qui constituent une HE est variable. La
plupart sont poly-moléculaires, c’est-à-dire composées d’une grande diversité de composés
(jusqu'à 500 molécules différentes dans l’HE de rose). A coté des composés majoritaires
(entre 2 et 6 généralement), on retrouve des composés minoritaires et un certain nombre de
constituants sous forme de traces (Pibiri., 2006).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Les terpènes doivent leur nom à Kekulé (ter = térébenthine ; pêne = pin). Ce sont des
composés formés de l'assemblage de deux ou plusieurs unités isopréniques (2-méthylbuta-
1,3-diène), unité composée de cinq carbones isoprénique selon l'arrangement suivant
(Capon et al., 1993) :
CH2=C—CH=CH2
|
CH3
Selon Bruneton., (1995), Bruneton.,(1999) seuls les terpènes les plus volatils dont la masse
moléculaire n'est pas trop élevée (monoterpénes et sesquiterpénes) sont rencontrés dans la
composition des HE.
Les monoterpenes C10
Ce sont des hydrocarbures volatils présents dans la quasi-totalité des HE; ils peuvent être
acycliques (Myrcène, Ocimène), monocyclique (ρ-Cyméne, α-Terpinène) ou bicyclique
(Camphêne, Sabinéne, Pinénes, 3-Caréne) (Bruneton., 1995).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Acide unnamique
HE de clou de girofle, de cyprès, de
Acides Acide formique, acide methylique
santal, etc.
Acide salicylique,acid santalique
Acide valirique.
Bornéol HE de coriandre, de lavande, etc.
Farnésol HE de rose, de baume de tolu, etc.
Alcools Géraniol HE de citronnelle, de coriandre, etc.
Linalol HE de thym, de citron, etc.
Nérol HE de neriol, de myrte, etc.
Santanol ; HE de santal.
Terpinéol. HE de geranium, de lime, etc.
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Acetique
Anthranylique HE de bigaradier, de lavande,
Esters Benzoique de niaouli, de styrax, etc.
Butyrique
Phenylacétique,
Valerianique ,geranyle,linalyle benzyle.
Anéthol ; HE d'aneth, d'anis, etc.
Apiol ; HE de persil, d'aneth, etc.
Carvacrol ; HE d'origan, de thym, etc.
Eugénol et isoeugénol ; HE de clou de girofle de poivre, etc.
Phénols Gairacol ; HE de bois de gaiac et de celeri .
Methylehavicol ; HE d'anis vert, de badiane, etc.
Myristicine ; HE de macis, de persil, etc.
Thymol. HE de thym, origan, etc.
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
II arrive souvent que l'on confonde l'activité d'une huile essentielle avec celle de la
plante dont elle est issue. Il faut savoir qu'une telle superposition n'est que rarement possible.
Ainsi, l’huile essentielle du Romarin est antibactérienne alors que l'infusé de la même espèce
est traditionnellement utilisé pour le traitement symptomatique de troubles digestifs divers.
Par ailleurs, si l'on peut étudier et décrire les effets biologiques et/ou pharmacologiques d'un
monoterpéne, d'un sesquiterpéne ou d'un alkylbenzéne purs, il est difficile, parfois impossible
de parler de pharmacologie d'une huile essentielle c'est à dire d'un mélange.
L'éventail des propriétés attribuées aux huiles essentielles est assez large, cependant quelques
propriétés fondamentales se dégagent parmi lesquelles nous pouvons citer : le pouvoir
antiseptique, les propriétés spasmolytiques, sédatives et irritantes (Bruneton., 1993).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
La toxicité chronique des HE essentielles est assez mal connue, on connait par contre
beaucoup mieux le risque de toxicité aigue lié à une ingestion massive, en particulier la
neurotoxicité des huiles essentielles à thuyone (thuya, absinthe, sauge officinale, tanaisie) ou à
pinocamphone (hysope) : ces cétones induisent des crises épileptiformes et tetaniformes, des
troubles psychiques et sensoriels nécessitant l'hospitalisation.
Cette toxicité non négligeable conduit à adopter une attitude prudente face aux pratiques telles
que l'aromathérapie lorsqu'elles utilisent des huiles essentielles pures et à fortes doses, par
voie orale et a fortiori en mélange (Bruneton., 1993).
Différentes méthodes sont mises en œuvre pour l'extraction des essences végétales,
cette diversité est due à la variété des matières premières et à la sensibilité considérable de
certains de leurs constituants qui sont plus ou moins modifiés pendant les processus de
préparation (Bruneton., 1995).
De ce fait, le choix du procédé d'extraction varie selon plusieurs paramètres à savoir :
La nature de la matière première.
La richesse en HE (le rendement).
La fragilité et la sensibilité de certain constituant aux températures élevées.
L'action de l'eau et sa solubilité dans les solvants organiques.
Cette technique a été proposé par Garnier en 1891, c'est la méthode la plus utilisée
pour extraire les HE et pouvoir les séparer à l'état pur, mais aussi de fournir de meilleurs
rendements. Le principe consiste à immerger directement la matière végétale à traiter dans un
ballon rempli d'eau qui est ensuite porté à ébullition, les vapeurs hétérogènes vont se
condenser sur une surface froide et l'HE sera alors séparée par différence de densité
(Bruneton., 1993).
L'extraction qui s'effectue à température élevée, à pH acide peut engendrer des réactions
secondaires au sein de l'HE à savoir : hydrolyse, élimination, cyclisation, réarrangement
(Benhbilles., 1995). La durée de l'hydrodistillation qui par le contact prolongé de l'eau et de la
plante augmente aussi les risques d'artéfacts de distillation.
Ce mode d'extraction utilise l'eau surchauffée sous pression entre 125 et 175 °C. Il
utilise l'eau désoxygénée qui traverse une cellule ou se trouve la matière végétale, cette cellule
est maintenue à une pression d'environ 20 bars et à température constante dans une étuve. Ce
procédé utilisé avec du Romarin donne un rendement plus élève en composés oxygènés que
l'entraînement à la vapeur (Basile et al., 1998).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
L'extraction est souvent menée dans un extracteur de type Soxhlet ou celui de Kumagawa,
appareil conçu pour l'extraction en continu (Chavanne., 1986). Pour la récupération des HE,
on peut procéder à l'extraction liquide — liquide qui est une opération de transfert ou
d'échange de matière entre deux phases liquides : la solution et le solvant. L'extraction
systématique en continu, utilisée pour extraire un constituant particulier ou pour en éliminer
d'autres, en utilisant deux solvants non miscibles à pouvoir dissolvant plus spécifique de
chaque groupe (Moulin et al., 2002).
Les solvants fixes utilisés sont principalement des matières grasses, l'extraction peut
être réalisée à froid « procédé d'enfleurage » ou à chaud « macération ou digestion ».
- Enfleurage
Ce procède met à profit le caractère liposoluble des composants odorants des végétaux
(Bruneton., 1993). Il consiste à mettre en contact la fleur avec un corps gras qui se sature
d'essence puis ce dernier sera épuisé par un solvant évaporé sous vide par la suite.
Cette méthode qui nécessite une importante main d'œuvre n'est utilisée que pour certaines
fleurs très fragiles telle que : le jasmin et la tubéreuse (Grassmann et Elstner., 2003).
- Macération
Ce procède exige que les graisses utilisées soient chaudes (40-60°C), ce qui a pour
effet d'augmenter leur pouvoir adsorbant. Cette technique est rapide et s'applique aux fleurs
dont l'activité physiologique cesse à la cueillette. L'extraction est réalisée par immersion des
fleurs fraichement cueillies et constamment renouvelées dans un bac de graisses chaudes
jusqu'a atteindre la saturation. Un épuisement à l'alcool absolu est généralement appliqué sur
cette graisse (Blakeway et Salnero., 1987).
L'extraction au CO2 liquide ou supercritique est une méthode d'extraction moderne, elle est
basée sur le fait que certains gaz, notamment le CO2, dans des conditions de pression et de
température dites critiques (PC = 73,82 bars et TC = 31,06°C) ou supercritiques, présentent un
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
pouvoir de dissolution accru vis-à-vis de divers composés tels que les HE, les aromes, les
colorants naturels, etc. (Crabas et al., 2003).
Cette méthode fournit un composé dont les qualités naturelles sont reproduites très
fidèlement, et complètement dépourvu de résidus de solvants même à l'état de traces infimes.
Elle est donc utilisée dans l'industrie alimentaire notamment pour l'extraction des produits
anti-oxydants des condiments comme la Sauge et le Romarin (Benhbilles., 1995).
Cette technique consiste à récupérer les composés volatils par des moyens mécaniques
(abrasion, compression, incision, perforation). On obtient ainsi une HE.
Cette technologie est utilisée industriellement pour l'obtention d'HE d'agrumes. En général, on
couple la récupération d'HE avec l'extraction du jus (Richard., 1992).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Depuis plus d'une trentaine d'années la CPG s'est développée irrésistiblement. Elle est
devenue une méthode de choix pour la séparation d'un mélange complexe de produits volatils.
A l'aide de la CPG, les mélanges très complexes de substances volatiles peuvent être séparés,
identifiés et quantifiés dans un temps relativement bref.
11.1.1. Principe
En CPG, l’échantillon est vaporisé et injecté en tète de colonne. L'élution est assuré par un
flux de gaz inerte qui sert de phase mobile. Elle est basée sur le partage de l'analyse entre une
phase gazeuse mobile et une phase (liquide ou solide) immobilisée sur la surface d'un support
inerte (Skoog et al., 2003). Les constituants des mélanges appelés généralement « solutés »
sont inégalement retenus par la phase stationnaire lors du transit dans la colonne. De ce
phénomène appelé « rétention», les solutés injectés se déplacent avec une vitesse inégale entre
eux et inferieure à celle de la phase mobile, ceci les conduit à sortir de la colonne les uns
après les autres. On enregistre d'abord un signal dit ligne de base en présence du gaz vecteur
seul et un pic au passage de chaque soluté séparé (Tranchant et al., 1995).
Le premier appareil commercial de CPG est apparu sur le marché en 1955. Depuis
lors, le développement de cette technique à été phénoménal. Les années 1980 ont vu des
ordinateurs utilisés pour le contrôle automatique de la plupart des paramètres opérationnels,
tels que la température de la colonne, les vitesses d'écoulement et l'injection de l'échantillon
(Skoog et al., 2003). Les composantes de base d'un appareil de CPG sont décrites par Skoog
et al. (2003) comme suit :
Les gaz vecteurs, doivent être chimiquement inertes, comme c'est le cas de l'hélium,
l'argon, l'azote et l'hydrogène. Choix du gaz est souvent dicté par le type de détecteur utilisé.
A l'alimentation en gaz, sont associés des régulateurs de pression, des jauges et des
débitmètres, et souvent un tamis moléculaire qui élimine l'eau et d'autres impuretés.
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
Il existe deux types de colonnes en CPG, les colonnes remplies et les colonnes tubulaires
ouvertes ou capillaires. La longueur des colonnes chromatographiques est comprise entre 2 et
50 m, ou plus. Elles sont en acier inoxydable, en verre, en silice fondue ou en téflon. Pour
pouvoir être mises dans un four thermostatique, elles sont usuellement constituées
d'enroulement de 10 à 30 cm de diamètre.
System de détection
Au cours du développement de la CPG, un grand nombre de détecteurs a été étudié et
utilisé. Le détecteur à ionisation de flamme (FID) est le plus utilisée, il a pour avantages une
sensibilité élevé (10-13 g/s) et un domaine de réponse linéaire étendu.
Principe
L'échantillon à analyser est introduit dans le chromatographe puis séparé et analysé. Les
différents constituants gazeux arrivent dans la chambre d'ionisation du spectromètre de masse
ou ils sont fragmentés. Les ions issus de la fragmentation sont dirigés vers le dispositif de
séparation, ils sont alors triés suivant leur rapport masse/charge, puis leur répartition est
donnée sous la forme d'un spectre de masse (Lahlou., 2004).
L'appareillage de spectrométrie de masse comprend donc trois parties principales :
Une chambre d'ionisation ;
Un système analyseur pour la séparation des ions ;
Un ensemble de détection, amplification et enregistrement.
Par leurs nombreuses et diverses propriétés, les plantes aromatiques et leurs essences
trouvent leurs emploi dans de multiples domaines telles que : l'alimentation, la pharmacie, la
parfumerie, l'aromathérapie et autres.
12.1. Pharmacologie
De nombreuses HE se trouvent dans la formule d'un très grand nombre de produit
pharmaceutique : sirop, gouttes, gélules. Elles rentrent aussi dans la préparation d'infusion
telle que : la verveine, le thym, la menthe, Romarin et-autres.
12.2. Aromathérapie
En stimulant le système nerveux, les aromes des HE lancent un ordre d'autorégulation.
Plus précisément, l'aromathérapie prépare le corps à lutter contre la maladie en stimulant le
reflexe d'auto-guérison et en modifiant la structure chimique des liquides corporels (la salive,
le sang, la lymphe). Les HE ont également une influence sur les sécrétions hormonales, sur
l'équilibre endocrinien et sur les réactions neurovégétatives corporelles (Odoul., 2003).
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CHAPITRE I : LES HUILES ESSENTIELLES
13. Conclusion
Les huiles essentielles sont fabriquées à partir des sucres issus de la photosynthèse, elles
n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs, peuvent être stockées dans tous les
organes végétaux, elles sont volatiles, très rarement colorées, solubles dans les alcools, le
choix du procédé d'extraction varie selon plusieurs paramètres : la nature de la matière
première, la richesse en HE (le rendement), la fragilité et la sensibilité de certain constituant
aux températures élevées.
Les plantes aromatiques et leurs essences trouvent leurs emploi dans de multiples domaines
telles que : l'alimentation, la pharmacie, la parfumerie, l'aromathérapie et autres.
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
1. Description botanique
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
Figure (2):RosmarinusofficinalisL .
Le Romarin appartientà la deuxième série de la famille des Labiées qui en compte six. Cette
famille, l’une des plus importante de la flore d'Algérie, compte plus de 200 genreset 3500
espèces(Pourrat et Le.Men .,1953, Boelens.,1985 , Battandier et Trabut.,1988).
La classification complète du genre Rosmarinus L n’a été achevée qu’au début de ce siècle.
Trois espèces ont été décrites : RosmarinusofficinalisL .,Rosmarinuseriocalyxet
Rosmarinustomentosus.(Maire., 1932, Garcia-Granados., 1987).
L’appellation Rosmarinus, qui signifie rosée de la mer, pourrait s’appliquer au parfum de la
plante, à la couleur de sa fleur ou même à sa prédilection pour le littoral, officinalisrappelle
les propriétés médicinales de la plante (Rolet.,1930).
Le Romarin est une plante spontanée caractéristique du bassin méditerranéen. Il abondedans
tout les pays sauf en Egypte, au Liban et à Chypre où il est plus rare(Trabaud., 1948).
2.Utilisation du Romarin
Depuis très longtemps, le Romarin est utilisé à des fins très diverses. Il est cultivé comme
plante condimentaire et ornemental. Ses feuilles riches en huile essentielle; à la saveur un peu
amère, dégagent une odeur qui rappelle l'encens et le camphre. Il éloigne les mites et les
papillonsautant au jardin que dans la lingerie. Il fleurit de septembre à mai, selon les climats,
période pendant laquelle les fabricants de miel exploitent ses fleurs, tandis que les parfumeurs
préfèrent les cueillir de mai à juillet. En cuisine il est utilisé comme aromate, sa forte teneur
en bornéol lui confère de puissantes propriétés antiseptiques qui font de lui un bactéride
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
de choix en conserverie. Butiné par les abeilles, il donne au miel sa saveur agréable et forte(El
Guedouir,2003).
L’huile essentielle du Romarin est très utilisée en cosmétologie (savons, parfums, crèmes,
etc.), mais dans l’industrie alimentaire pour leur pouvoir aromatique et aussi leur action
régénérante et hydratante(ElGuedouir,2003 ; Viuda-Martoset al.,2010 ;Bozinet al.,2007
cité par Angel Calin-Sanchez etal .,2010).
Cette plante est également employée dans de nombreuses préparations médicinales en raison
de ses propriétés aromatiques, antispasmodiques, toniques, cardiaques, antirhumatismales,
cicatrisantes, détoxiquantes, diurétiques, cardiaques et stimulantes(El Guedouir. 2003), et
aussi antimicrobienne, antivirale et anti-inflammatoire. (Viuda-Martoset al.,2010 ;Bozinet
al.,2007 cité par Angel Calin-Sanchez etal .,2010).
3. Travaux antérieurs
Le Romarin est une plante aromatique et médicinale méditerranéenne, est connu et utilisé
depuis l’Antiquité. Il a été cité par des savants arabes du moyen âge qui l’utilisent en
médecine classique, cependant, il ya à peine un demi-siècle, avec l’avènement des méthodes
d’analyses, que l’identification des extraits du Romarin a commencé et a fait l’objet de
plusieurs études.
En 1989, Fournier et Collmontrèrent que le Romarin de Tunisie contenait plus de
50% de 1,8 –cinéol.En 1992, Flamini et Cionétudièrent la variation de la composition de
l’huile essentielle de Rosmainusofficinalis en fonction de la période de cueillette et de la
coloration de la fleur. Ils constatèrent que l’huile extraite du Romarin à fleurs blanches
contenait plus d’hydrocarbures et de 1,8-cinéol que celle du Romarin à fleurs bleues et cela au
détriment des alcools monotrepèniques et de leurs esters, tandis que les rendements en huiles
semblaient plus élevés au mois de septembre qu’au mois de mars.
Svoboda et Deans.,1992 étudièrent les propriétés antioxydantes de l’huile essentielle
commerciale du Romarin anglais et aboutirent à de bons résultats.En 1997, Arnold et Coll
publièrent les résultats relatifs à une étude comparative des huiles essentielles de
Rosmarinuseriocalyx d’Algérie et de Rosmarinusofficinalis d’Espagne et d’Italie. Ils
constatèrent que les mêmes composés se retrouvaient dans ces huiles mais à des valeurs
différentes.
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
En 1999, Musa Ozcan a montré que les extraits du chloroforme et du méthanol du Romarin
présentent une grande activité antioxydante sur l’huile d’olive et l’huile de sésame.
Les recherches actuelles visent à mettre en œuvre des procédés adéquats permettant la
sélection de substances naturelles antioxydantes capables de remplacer les produits artificiels
utilisés dans l’industrie alimentaire.A travers cette synthèse bibliographique, nous
neconstatons que l’huile essentielle du Romarin a été largement étudiée. Toute fois les
travaux concernant l’huile essentielle du romarin d’Algérie sont moins
nombreux(Boutekdjiret.,1999,Hammoudi.,2002,Makhlouf.,2002).
L’huile essentielle du Romarin est produite par des poils sécréteurs irrégulièrement
ramifiés, abondants à la face inférieure et quelques rares poils unicellulaires courtsà la face
supérieurs des feuilles. Des glandes unis et pluricellulaires sont également signalés à la
surface des feuilles et des tiges(Perrot,1928).
Des observations au microscope photonique de coupes transversales des feuilles ont mis en
évidence la présence de glandes et poils sécréteurs superficiels, la seule différence réside dans
le fait que dans la feuille seule la face inferieure est abondamment recouverte de poils.
Par ailleurs, des taches internes de couleur marron clair pouvant éventuellement correspondre
à des gouttes d’huiles ont étaient signalées(Hammoudi,2002).Voir figure : 03
Figure (3) : Coupe histologique d’un poil sécréteur du Romarin. Agrandissement 40 X 3,2
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
On dénombre plus de 150 variétés de romarin voir Tableau n : 17(Annexe 01). Elles se
différencient par leur taille maximale (d'une dizaine de centimètres à 2 mètres), leur tenue
(vertical ou rampant), la couleur de leurs fleurs (violettes, bleues, blanches, roses) et de leurs
feuilles, leur rusticité.
Le tableau si dessous représente la classification de l’espèce Rosamarinusofficinalis L.
Règne Végétal
Embranchement Spermaphytes
Classe Angiospermes
Sous/Classe Gamopétales
Ordre Lamiales
Famille Labiacées
Genre Rosmarinus
Espèce RosmarinusofficinalisL
Ozenda,,1991
Rosmarinuslavandulaceus
Cette espèce comprend différentes variétésdu littorale, localisée sur la grande falaise
d’Oran.C'est une petite plante de 10 à 30 cm de hauteur, à fleurs très violettes(Rolet., 1930)
Rosmarinuslaxiflorus
Cette espèce est caractérisée par ses tiges courtes, et des rameauxdivariques(Rolet.,1930)
Rosmarinusofficinalis
Le nom vernaculaire utilisé est "AKLIL".Cette espèce pousse à l’état sauvage sur le pourtour
méditerranéen, et peut aussi être cultivée dans les jardins.Elle est répandue sur tous les sols en
manifestant des caractères polymorphiques. En effet, plusieurs formes et variétés ontété
identifiées.
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CHAPITRE II : LE ROMARIN (Rosmarinusofficinalis L)
Plus de 25 cultivars selon la coloration des fleurs et les feuilles avec leurs
utilisations(lazzouni.,2005).Des compositions des essences des plantes fait apparaitre trois
espèces chimiques :
-R.O à camphre ou Romarin à 1,8 cinéol bornéol
-R.Ocinéoliferum ou Romarin à 1,8 cinéol bornéol
-R.O verbénoniferum ou Romarin à verbénome(lazzouni .,2005).
Rosmarinustournefortii
C’est une autre espèce du même genre qu’on rencontre en Algérie, prend le nom commun
"Klil el djbel"; il possède les mêmes caractéristiques que le Romarin officinal, mais il est
riche en HE.A fortes doses, il devient toxique (lazzouni.,2005).
6. Conclusion
Le Romarin est originaire du bassin méditerranéen. On le trouve principalement dans les
terrains arides et ensoleillés, comme les garrigues, les maquis et les rocailles. Il n'apprécie pas
une sécheresse trop importante mais se contente de l'humidité du littoral, d'où il pourrait tenir
son nom « rosée de mer » en latin.Cette plante est également employée dans de nombreuses
préparations médicinales en raison de ses propriétés aromatiques, stimulantes,
antispasmodiques, toniques, cardiaques, antirhumatismales, cicatrisantes, détoxiquantes,
diurétiques, cardiaques et stimulantes.
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
Beaucoup d'études ont été réalisés au sujet de l'activité antimicrobienne des extraits de
plantes et de leurs huiles essentielles (Delaquis et al.,2002).
La mesure, l'essai, et l'évaluation de l'activité antimicrobienne des extraits et des huiles de plantes
peuvent être difficiles en raison de leur volatilité, insolubilité dans l'eau, et de la présence des
multiples composés inhibiteurs. La méthode de test, le milieu de culture, le micro-organisme de
test, et l'extrait de plants, ou son huile essentielle, sont des facteurs importants lors d'un test de
l'activité antimicrobienne (Janssen et al., 1987). Chaque facteur est sujet à beaucoup de variations
(Davidson et Parish, 1989). Cependant, pour évaluer les données rapportées, il est nécessaire de
considérer les méthodes employées pour déterminer l'activité antimicrobienne (Unal et al. 2001).
Maruzzella et al.,(1959) et Maruzzella et Sicurella (1960), ont mis au point une méthode
qui consiste à déposer un disque de papier filtre imprégné d'HE au centre du couvercle d'une boite
de pétri, sans que l'HE entre en contact avec la gélose ensemencée par les micro-organismes.
La boite est hermétiquement fermée. Il se produit une évaporation des substances volatiles dans
l'enceinte de la boite et les cellules sensibles de l'inoculum sont inhibées. La lecture du test porte
donc sur la croissance ou non de l'inoculum (Bendjilali et al.,1984 ).
Cette méthode ne quantifie pas l'activité antimicrobienne réelle des HE, elle montre seulement
l'activité des constituants volatils à la température d'incubation, et comme le disque imprégné d'HE
est prés d'environs 5 mm de la surface de l'agar (Inouye et al.,2001 et Goi et al.,1985), ont
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
considéré que l'espace occupé par l'air est très petit et ne permet pas de mesurer la concentration
des vapeurs de l'HE c'est pour cette raison, ils ont employé une boite en verre hermétiquement clos
d'un volume d'air de 1 litre.
Les techniques par contact direct consistent à mettre en présence l'HE et les micro-
organismes, puis à observer la croissance de ces derniers. Le contact peut avoir lieu en milieu
gélosé ou liquide (Valnet et al., 1978).
1.1.2. a. Aromatogramme
C'est l'un des tests les plus simples et le plus ancien, il a été développé dés les années
1940, l'antibiogramme par diffusion (Cooper., 1963), testant l'action des antibiotiques sur les
micro-organismes en mesurant leurs zones d'inhibition. En 1970, étant plus facile à mettre en
œuvre. Cette technique est adopté par des aromathérapeutes, ces derniers la baptisent :
Aromatogramme (Valnet et al.,1978).
L'aromatogramme est basé sur la diffusion en milieu gélosé. Ce test est réalisé à l'aide de disques de
cellulose imprégnés d'une quantité connus d'HE déposé, à la surface d'un milieu gélosé
préalablement ensemencé avec la suspension bactérienne. Après incubation, chaque disque apparaît
entouré d'une zone d'inhibition de la croissance ( Andrews .,2001).
Méthode proposée par (Cooper et Woodman 1946), repris par (Schroder et Messing 1949),
elle assure une diffusion radial de l'HE à partir d'un puit en donnant une zone d'inhibition claire et
facilement mesurable (Bennett et al.,1966). La méthode consistait à découper un trou circulaire
vertical dans la gélose et à y verser une solution d'HE de concentration connue. L'HE diffusant
radialement créait une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement
ensemencée avec la suspension bactérienne (Dorman et Deans.,2000).
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
Quelle que soit la méthode de contact direct choisie, ces techniques, fiables pour les agents
antimicrobiens hydrosolubles, posent un problème de diffusion et homogénéité de dispersion avec
les HE, en raison de leur très faible solubilité dans les milieux de culture aqueux. Un certain nombre
de solution ont été proposées. La technique de diffusion en gélose peut être améliorée par l'ajout de
détergents qui facilite la diffusion des HE dans la gélose (Deans et Ritchie., 1987).
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
Pour la méthode de contact en milieu liquide, il faut disperser les HE dans une solution de détergent
(Tween 80) ou solubiliser les HE dans l'éthanol avant de les introduire dans le bouillon de culture
ensemencé en micro-organismes (Deans et Ritchie., 1987, Ramadan et al., 1972,Fournier et al.,
1978). Avec des solvants (éthanol) ou des détergents (Tween20 ou 80), la dispersion des HE dans
les milieux liquides est homogène et la diffusion dans les milieux gélosés est meilleure ( Cosentino
et al., 1999, Giamperi et al., 2002), toutefois :
- Il est délicat de déterminer le meilleur détergent ou le meilleur solvant.
- Il est difficile de choisir les bonnes concentrations pour obtenir des CMI et CMB
reproductibles et répétables.
- Les CMI et les CMB obtenues dans ces conditions sont-elles dues aux HE seules,
ou au mélange des HE avec les détergents ou les solvants ? Selon les détergents et les solvants et
selon les concentrations aux quelles ils sont employés, les CMI et les CMB varient (Remmal et al.,
1993).Pour résoudre ces problèmes, (Remmal et al.,1993) ont mis au point une méthode de
dispersion des HE sans détergents ni solvants. Son principe est de rendre le milieu légèrement
visqueux ou colloïdal par une solution d'agar -agar à 2% afin d'empêcher les molécules d'HE
dispersées de se rassembler à nouveau. Ce dispositif est repris par (Mann et Markham., 1998),
dans une micro méthode. Il est ainsi possible d'obtenir des émulsions d'HE parfaitement stables et
homogènes, sans avoir recours à d'autres molécules dont l'effet secondaire serait à craindre.
Néanmoins, le problème de volatilisation des constituants des HE en cours d'étude existe toujours
et doit être pris en compte par la réalisation de témoins adaptés.
Deans et Ritchie 1987 ont étudié l'effet de 50 HE de plantes sur 25 genres de bactéries, à
quatre concentrations différentes, grâce à une méthode de contact direct en milieu solide (puits).
Sous leurs formes non diluées, toutes les HE inhibent au moins un genre bactérien. Les 09 HE
manifestent les propriétés inhibitrices les plus importantes sont les HE de l’angélique, du laurier, de
la cannelle, du clou de girofle, du thym, de l'amande amère, de la marjolaine, du piment et du
géranium. Elles inhibent plus de 20 genres de bactéries testées.
Cette étude, ainsi que beaucoup d'autres, comme celles de (Canillac et Mourey., 1996), confirment
les propriétés antibactériennes de certains HE, mais les HE des plantes sont souvent des mélanges
complexes de différents composés dont certains, sinon tous, sont dotés de propriétés
antimicrobiennes. La composition des HE d'une même espèce varie selon la localisation
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
2.3 Effet de la température sur les propriétés inhibitrices des huiles essentielles
Bowles et al .,1995 ont montré respectivement que la température affecte les propriétés
d'inhibition de l'aldéhyde cinnamique quand la température augmente de 20°c à 30°c ,et, augmente
les propriétés antibactériennes des carbonyles aromatiques et aliphatiques lorsque la température
baisse de 37 à 12°C.
Plusieurs auteurs ont étudié l'effet des HE des herbes et épices sur la croissance des
champignons et leurs toxinogénése (Chao et al., 2000 ,Elgayyar et al., 2001, Giamperi et al.,
2002). Les études de la croissance des champignons en présence d'HE se font principalement en
milieu solide et les études sur la production de mycotoxines sont réalisées en milieu liquide.
Les résultats obtenus par Giamperi et al.,2002 des analyses de l'activité antifongique de 8
huiles examinées sur 03 souches de champignons phytopathogénes : Phytophora cinnamomi.
Rads., Pyrenochaeta lycopersici. Kleb.et Verticillium dahliae Kleb. Ont montré clairement que les
huiles les plus efficaces sont ceux de l'origan, de la menthe poivrée, du thym et de la coriandre. En
fait, ils ont obtenu 100% d'inhibition de chacun des trois organismes phytopathogénes utilisées.
Dans le cas d'huile d'origan, cette inhibition est obtenue à la CMI de 200 ppm, alors que pour l'huile
du thym cet effet est réalisé avec 400 ppm, et lorsqu'il s'agit de la menthe poivrée et des essences de
coriandre, c'est avec 800 ppm. L'huile de Lavandula hybride est complètement active contre chacun
des trois organismes à 1600 ppm, alors que les huiles du Romarin, de la sauge et du laurier sont
moins actives du fait de l'inhibition totale qui n'est atteinte seulement aux concentrations les plus
élevées et pas pour chacun des trois champignons. Tous les composés testés par Pauli et
Knobloch.,1987, possèdent une activité antifongique. Ceux dont le coefficient phénolique est
supérieur ou égal à 0,9, révèlent une activité fongicide, les autres ne sont pas fongistatiques. Les
composées dont les activités antifongiques sont les plus élevées sont l'isoeugénol, le
cinnamaldéhyde, le carvacrol, l'eugénol et le thymol. Parmi les champignons, Pénicillium
verrucosum var. cyclopium semble être le plus résistant et Pénicillium viridicatum le plus sensible.
Le citronellole, le menthol et le terpinéol sont doués d'une activité antifongique envers les
Aspergillus parasiticus, flavus et niger. Le citronellol est le composé le plus actif des trois, suivi
du menthol et du térpinéol. A.niger est plus résistant que les deux autres champignons (Belaich et
al., 1980). L'eugénol et le thymol possèdent une forte activité inhibitrice. A 0,2g/l, le thymol inhibe
complètement la croissance d'A.ochraceus, et à 0,4 g/1, celle d'A.Jlavus et d'A..versicolor
à 0,25g/l (Hitokoto etal., 1980).
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
La production d'aflatoxines par A. parasiticus est inhibée à 96% par : 0,2 g/l de thymol, 0,4
g/l de cumin aldéhyde, 0,4 g/l d'eugénol, 0,6 g/l de carvone, 2 g/l de bornéol, ou thujone (Farag et
al., 1989. Hitokoto et al., 1980) ont mis en évidence l'inhibition complète des ochratoxines
d'A. ochraceus et des stérigmatocystines d'A.versicolor en présence de 0,25 g/l d'eugénol et 0,2 g/l
de thymol. De façon générale, la concentration nécessaire pour inhiber la production de toxines est
inférieure à celle qui inhibe la croissance du mycélium. Les constituants d'HE peuvent servir à
inhiber la production de toxines tout en limitant la croissance des champignons.
Beaucoup d'HE comparées dans les études de (Delaquis et al., 2002, Giamperi et al., 2002)
ne possèdent pas, ou peu, d'effet inhibiteur vis-à-vis des souches de levures. (Conner et Beuchat.,
1984), ont constaté que 08 HE seulement sont fortement inhibitrices à 10% se sont les HE de
poivre, de cannelle, de clou de girofle, d'ail, d'oignon, d'origan, de sarriette et de thym ; seule l'HE
d'ail possède des pouvoirs inhibiteurs à 1%. Huit HE montrant une activité inhibitrice élevée ont été
testés sur la production de biomasse de huit levures et sur la production de pseudomycelium. En ce
qui concerne la production de biomasse,Rhodotorula rubra est la souche la plus sensible,
Torulopsis glabrata la plus résistante. Les HE d'ail et d'oignon possèdent les effets fongicides les
plus marqués sur toutes les souches testées ; même à 0,025 g/l, elles inhibent la production de
biomasse. L'effet de ces deux HE est sûrement du à la présence d'allicine. Un composé qui inhibe
les enzymes à très basse concentration. Les autres HE sont beaucoup moins inhibitrices de la
production de biomasse de levures.
L'activité In vitro d'une gamme d'huiles essentielles y compris l'huile d'arbre de thé, contre la levure
Candida a été examinée par Hammer et al.,1998 de 24 HE examinées par la méthode de dilution
d'agar contre Candida albicans ATCC 10231. Trois n'ont pas empêché C. albicans à la
concentration la plus élevée examinée, qui est 2,0 % (v/v) d'huile. L'essence de bois de santal a eu
la plus basse CML, inhibant C. albicans à 0,06 %. L'huile de Melaleuca, alternifolia (arbre de thé)
a été étudiée pour l'activité contre 81 isolais de C. albicans et 33 isolats de Candida non albicans.
Par la méthode de microdilution du bouillon, la concentration minimale d'huile inhibant 90%
d'isolats pour C. albicans et des espèces de Candida non albicans est de 0,25% (v/v).
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CHAPITRE III : ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
La concentration minimale d'huile tuant 90% d'isolats est 0,25 % pour des C. albicans et
0,5 % pour des espèces de Candida non albicans.Les isolats de Candida ont été examinés pour
la sensibilité à l'huile d'arbre de thé par la méthode de dilution d'agar, la concentration minimale
d'huile inhibant 90 % d'isolats est 0,5 %.Le développement du pseudomycelium se produit quand le
mécanisme contrôlant la division cellulaire commence à être altéré. Dans des conditions
appropriées, Candida.lipolytica, H.ansenula,, Lodderomyces elongisporus, Rhdotorula rubra et
Saccharomyces cerevisae peuvent produire un pseudomycelium. C. lipolytica, souvent présente
sous sa forme filamenteuse, n'est pas affectée par les HE lors de la formation du pseudomycelium.
En présence d'HE de poivre, de cannelle, d'ail, d'origan, de sarriette et de thym, la formation du
pseudomycelium de L. elongisporus est stimulée en conditions normales, la formation du
pseudomycelium est observée en six jours ; en présence de ces HE, le délai observé est de trois
jours. Sur R. rubra, certaines HE (cannelle, origan, sarriette, thym) stimulent la formation du
pseudomycelium, alors que d'autres poivre, ail, origan l'inhibent. On peut en conclure qu'à part
quelques exceptions, les HE n'ont pas d'effet inhibiteur sur la production de pseudomycelium.
4. Conclusion
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
I.MATERIELS ET METHODES
1. Objectif
Ce travail consiste à :
-Réaliser une analyse qualitative et semi quantitative de l’huile essentiel du romarin par
chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse
-Evaluer l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle du romarin, à savoir la zone
d’inhibition; la concentration minimal inhibitrice; la concentration minimale bactéricide et la
concentration minimale fongicide.
-Etudier deux propriétés pharmacologiques de l’huile essentielle du Romarin à savoir :
-L'activité sédative
-L'activité diurétique
2. Lieux du stage
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Cette étude a été réalisée sur des feuilles et des tiges d’une plante appelée Romarin
«Rosmarinus Officinalis», qui a été récolté dans trois régions différentes durant le mois
d'Avril-2012 au niveau de :
-Rosmarinus Officinalis provenant de l’INRA : est caractérisé par des tiges mesurant
moyennement 80cm de longueur, avec des feuilles de 2cm de longs et des fleurs bleues vio-
lacées
-Rosmarinus Officinalis provenant d’Ain Defla : présente des tiges de 75 cm de longueur
avec des feuilles de 1,5 cm de long avec des fleurs bleu pâle.
-Rosmarinus Officinalis provenant d’Aflou : présente des tiges de 60 cm de longueur et des
petites feuilles de 1 cm de long, avec des fleurs bleue pâle.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Les expériences ont portés sur onze souches :09 souches bactériennes et deux levures, pro-
venant de la collection du laboratoire de microbiologie du CRD-SAIDAL, et de l’hôpital
d’Ain-Naadja (laboratoire de parasitologie), la liste des souches est regroupée dans le tableau
suivant :
Tableau 3 : Les différentes souches testées.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
6. Matériel animal
Les expérimentations animales ont été réalisées sur des rats et des souris.
Souris : Albinos
sexe : Male
poids : 20± 22g
nombre : 30
nourriture : granulé d’origine ONAB
Eau de ville ad libitum
● Conditions d’hébergement : - température ambiant 20- 24°C
- Taux d’humidité 50%
-Eclairage : 10h
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Le tableau si dessous illustre tous les matériels non biologiques utilisés au cours de la réali-
sation de ce travail :
Tableau 4: matériels non biologiques utilisé
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
100 à 120 grammes des sommités fleuries et non fleurie, du romarin ; sont broyés et
introduite dans un ballon de 2 litres rempli d’eau jusqu’au 2/ 3 de sa capacité.
Le ballon est chauffé à l’aide d’une calotte chauffante produit de la vapeur qui se charge des
produits volatils.Cette vapeur se condense au contacte du réfrigérant, le condensât est re-
cueilli dans une ampoule à décanter ou l’on sépare la phase aqueuse de la phase organique
(phase supérieure) qui constitue l’huiles essentielle qui serra séché avec du sulfate de so-
dium anhydre afin d’éliminé toute trace d’eau.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
L’huile est séchée est séparée du sulfate de sodium par filtration sur de la laine de verre.
L’huile est ensuite conservée à une température de 0 à +6 °C dans un flacon en verre brun
fermé hermétiquement en vue de son analyse.
9. Le Rendement d'extraction
a. Définition
La densité relative à 20°C est le rapport de la masse d’un certain volume d’une huile
essentielle a 20°C, a la masse d’un volume égal d’eau distillée a 20°C.
Cette grandeur est sans dimension et son symbole est d²º
b. Principe
A l’aide d’un pycnomètre, on effectue des pesées successives de volumes égaux d’huile
essentielle et d’eau, a la température de 20 °C.
c. Appareillage
Constitué de matériel courant de laboratoire et, en particulier ce qui suit :
- pycnomètre en verre, de capacité nominale de 5 ml ;
-bain thermostatique, maintenu à la température de 20°C±0.2°C.
-thermomètre de précision, gradué de +10 °C à +30°C, avec divisions à +0.2°C ou +0.1°C.
-balance analytique, précise à 0.001 g prés.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
d. Mode opératoire
En premier lieu, le pycnomètre doit être nettoyé soigneusement et rincé successivement au
moyen d’éthanol puis d’acétone, et séché a l’intérieur en y faisant passé un courant d’air
sec .l’extérieur du pycnomètre doit être essuyé avec un chiffon sec ou un papier absorbant.
Une fois le nettoyage terminé, on pèse le pycnomètre vide muni de son bouchon à 0,001 g
près. On remplie le Pycnomètre avec d'eau distillée bouillie, puis refroidie à environ 20°C.
L’ensemble est plongé dans un bain thermostatique durant 30min en ajustant si nécessaire le
niveau d’eau au trait repère. S’il y a lieu, on bouche le pycnomètre, et essuie l'extérieur avec
un chiffon sec ou papier absorbant, puis on pèse le pycnomètre plein, muni de son bouchon à
0,001 g près. Enfin, on vide le pycnomètre, on le rince et on le sèche comme au début, puis
on effectue les mêmes opérations, en remplaçant l’eau par l’échantillon d’huile essentielle
d 20 20 = m2-m0
m1-m0
Ou :
m0 : est la masse, en grammes, du pycnomètre vide.
m1 : est la masse, en grammes, du pycnomètre rempli d’eau.
m2 : est la masse, grammes, du pycnomètre rempli d’huile essentielle.
Les mesures ont été effectuée à l’aide d'un réfractomètre, quand à la détermination de
l’indice réfraction, elle à été effectuée à la température différente de 20°c, on effectue la
correction à 20°c par le biais de la formule suivante :
nt20= n td +0,0004(t-20)
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Conditions expérimentales
Résultat
L’identification fait appel à la bibliothèque des spectres de masse. Ce logiciel permet après
comparaison des spectres de masses des composés détectés à ceux de la banque de données
propose des structures validées pour des taux des reconnaissances supérieures à 90%.
a. Principe
Cette méthode consiste à mettre en évidence une éventuelle activité antimicrobienne des
huiles essentielles: du romarin, en les mettant en présence des germes testés, dont la concen-
tration est ajustée à 107-108 germes/ml avec un spectrophotomètre.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Des disques absorbants stériles sont imprégnés d’une quantité d’huile essentielle et déposés
sur une gélose inoculée avec les souches testées. La diffusion de ces huiles essentielles dans la
gélose permet d’avoir comme résultat positif après incubation une zone d’inhibition.
La lecture des résultats après incubation est faite par mesure des diamètres des zones
d’inhibition obtenus pour chacune des souches.
b. Protocole expérimental
- Faire fondre les milieux Muller-Hinton (MH) et Sabouraud (SAB) dans un bain
marie à 95°C.
- Verser aseptiquement une première couche des deux milieux dans des boites de
pétrie à raison de 20ml par boite.
- Laisser refroidir et solidifier sur la paillasse.
*Préparation de l’inoculum
- A partir d’une culture jeune de 18 à 24h pour les bactéries et 48h pour les
Levures.
-Réaliser des suspensions microbiennes troubles en prélevant 3 à 5 colonies bien
isolées, qu’on dépose dans 5 à 6ml d’eau physiologique.
- Agiter au vortex.
- Réaliser une première lecture de la suspension à l’aide d’un spectrophotomètre en
estimant l’absorbance qui doit être comprise entre 0.22 et 0.32 pour les bactéries
et entre 2 et 3 pour les levures et cela à une longueur d’onde de 620nm. Les va-
leurs comprises dans les intervalles cités ci-dessus correspondant à une concen-
tration optimale de 107-108 germes/ml. Si une valeur trouvée à la première lecture
n’est pas comprise dans l’intervalle, on ajuste soit en ajoutant de l’eau physiolo-
gique, si elle est supérieure à la valeur maximale ou en ajoutant des colonies,
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
si elle est inférieure à la valeur minimale. A chaque fois une nouvelle lecture de l’absorbance
est réalisée jusqu’à l’ajustement de la suspension aux valeurs désirées.
N.B : l’inoculum doit être utilisé dans les 15min suivant sa préparation.
*Lecture
-Présence de zone claire autour du disque : présence d’activité inhibitrice.
-Absence de zone claire autour du disque : absence d’activité inhibitrice.
-Selon l’échelle de Meena et Sethi .,1994 et Ela .,1996 :
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
Principe
Les concentrations minimales inhibitrices sont définies comme la dernière ou la plus basse
concentration d’un agent antimicrobien qui peut inhiber visiblement la croissance d’un mi-
croorganisme après 24h d’incubation pour les bactéries et 48h pour les levures.
Protocole expérimental
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
*Protocole expérimental
- Préparer une suspension de10+4 germes à partir d’une culture microbienne de
24h pour les bactéries et 48h pour les levures.
- Faire fondre les milieux MH et SAB à 95°c dans le bain marie.
- Mélanger 100ml de chaque milieu MH et SAB avec0,5 de tween 80
- Préparer une série de dilutions de chaque huile essentielle (des trois régions) al-
lant de 2% jusqu'à 0,03% dans les milieux précis.
- La réalisation des dilutions se fait comme suite :
- 1ml d’huile essentielle est diluée dans 50ml de milieu dans un premier flacon ce
qui donne une dilution de 2%.
- Verser la moitié du premier flacon, dans un deuxième flacon et ajusté avec 25ml
de milieu pour la dilution 1%
- Procéder de la même manière jusqu'à l’obtention de la dernière dilution de 0,03%
- Verser chaque dilution sur une boite de pétrie à raison de 2 boites pour chaque
dilution.
- Faire sécher les boites.
- Ensemencer les boites par spotage à l’aide d’une micro seringue à raison de 1-2µl
de suspensions microbiennes de 10+4 germes/ml.
- Préparer les boites témoin (positif) contenant le milieu MH et SAB avec le tween
80 sans huile essentielle.
- Incuber les boites à 37°c pendant 24h pour bactéries et 48h pour les levures.
Lecture :
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
a. Objet :
L’objet de ce mode opératoire est de déterminer les étapes a suivre pour évaluer l’activité
diurétique du produit à tester, afin de garantir la fiabilité des résultats.
b. Principe
Le principe de cette étude consiste à mesurer l’excrétions urinaire chez les rats mis en
surcharge saline.
c. Matériels
Animaux ; rats : souche Winstar
Réactifs : solution physiologique de Na Cl à 0,9%
Produits : -produits de références : Furosémide.
-produits à tester : huiles essentielles des trois régions étudiées.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
d. Méthode
Constituer (3) lots de 6 rats chacun
- lot témoin (T)
- lot essais (1) (E1) X 3(trois huiles)
- lot essais (2) (E2) (produit de référence)
-Mettre les animaux à jeun de nourriture et de boisson 18h avant le teste.
-Administrer aux trois lots les solutions suivantes :
Témoins : chaque rat reçoit 50 ml de solution physiologique de Na Cl à 0,9% par voie
orale par la technique de gavage voir Annexe 03.
Lots essais (E1) : chaque rat reçoit 50 ml/ kg du produit à tester.
Lot essais (E2) : chaque rat reçoit 50 ml/ kg du produit de référence.
Placer chaque rat dans une cage à métabolisme .voir figure
Mesure la quantité d’urine excrétée toute les heurs pendant 6 h après l’administration du
produit
L’excrétion urinaire volumétrique (EUV) est donnée par la formule suivante :
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
a. Objet
L’objet de ce mode opératoire est de déterminer les étapes à suivre pour démontrer
l’activité sédative du produit à tester afin de garantir la fiabilité des résultats
b. Principe
Consiste à étudier la motilité spontanée par l’actimetre en armoire de Boissier et simon ,
chez les souris préalablement traité par un psychotrope.
c. Méthode
Constituer (3) lots d’animaux de (6) souris :
- lot témoin (t)
- lots essais (E1)*3(trois huiles)
- lot essais (E2) (produit de référence)
-mettre les animaux à jeun, la veille du teste
-administrer aux animaux des différents lots les solutions suivantes :
-administré aux animaux du lot (T) l’eau distillé par voie oral sous un volume de 0,5 ml;
-administrer aux lots (E1) le produit à tester.
-administrer au lot (E2) le produit de référence :Nevrosta, par voie oral sous un volume de
0,5 ml.
Après 30mn :
- brancher l’appareil, les (12) source lumineuse doivent s’allumer.
- placer une souri dans chaque cage a plexiglas pendant une durée de 30 mn.
- Le passage de la souri devant le faisceau lumineux provoque l’enregistrement
d’unité dans le totaliseur correspondant.
- des lectures se font après 30 mn.
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CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
d. Résultats
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
II.RESULTATS ET DISCUSSION
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Après une durée d'extraction de trois heures par hydrodistillation, les rendements en
HE obtenus à partir de la plante étudiée sont reportés dans le tableau 6.
Brésil 20
Turquie 2,3
Algérie 1,15
Espagne 1,1
Hongrie 0,9
Russie 0,3
Egypte 0,1-0,4
La teneur en HE obtenu à partir des parties aériennes (feuilles et tiges) est de 0,73%
pour la région d'Aflou et Ain defla ; et elle est de 0,94% pour le Romarin provenant
de la région de Berraki.
Selon AtikBekkara et al., 2007, le rendement d'extraction des huiles essentielles du
romarin issus de la région de Tlemcen et de la région de Honaine est respectivement
de 0,6% et 0,8%.Le rendement du Romarin provenant du parc national d'El-Hamma
selonDjeddi., 2007; est de 0,82%.
Nos résultats obtenus pour les région d'Ain defla et d'Aflou sont identiques a ceux
rapportés par Atik Bekkara.,2007 et al, et Djeddi; 2007).
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
L'analyse par GC-SM de l'huile essentielle du Romarin des trois régions étudiées (Ain
Defla-Aflou-Berraki) a révélé 64 pics qui sont identifiées pour l'huile essentielle de
chaque région les résultats sont groupés dans le tableau si dessous.
Les profils chromatographiques pour ces trois essences sont représentés par les
chromatogrammes (1-3). Voir(Annexe 4).
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Naphthalene, 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-7-methyl-
35.69 4-methylene-1-(1-methylethyl)-, 0.56 0.28 1.58
(1.alpha.,4a.alpha.,8a.alpha.)-
35.83 Di-epi-.alpha.-cedrene-(I) 0.07 0.11 0.16
36.21 Benzene, 1-(1,5-dimethyl-4-hexenyl)-4-methyl- 0.14 0.38 0.42
Naphthalene, 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-7-methyl-
36.66 4-methylene-1-(1-methylethyl)-, 0.23 0.16 0.54
(1.alpha.,4a.alpha.,8a.alpha.)-
37.07 alpha.-Muurolene 0.24 0.20 0.69
Cyclohexene, 1-methyl-4-(5-methyl-1-methylene-4-
37.72 0.27 1.53 0.00
hexenyl)-, (S)-
Naphthalene, 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-7-methyl-
37.87 4-methylene-1-(1-methylethyl)-, 0.45 0.25 0.79
(1.alpha.,4a.beta.,8a.alpha.)-
Naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-
38.49 1.22 0.83 2.67
1-(1-methylethyl)-, (1S-cis)-
Naphthalene, 1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-
38.98 1-(1-methylethyl)-,[1R- 0.09 0.04 0.16
(1.alpha.,4a.alpha.,8a.alpha.)]-
39.23 Non Identifié 0.19 0.09 0.15
40.84 Caryophyllene oxide 0.65 0.71 0.38
12-Oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene, 1,5,5,8-
41.72 0.14 0.33 0.00
tetramethyl-, [1R-(1R*,3E,7E,11R*)]-
Naphthalene, 1,2,3,4,4a,7-hexahydro-1,6-dimethyl-
42.39 0.25 0.13 0.09
4-(1-methylethyl)-
10,10-Dimethyl-2,6-
42.64 0.13 0.16 0.00
dimethylenebicyclo[7.2.0]undecan-5.beta.-ol
42.81 tau.-Cadinol 0.35 42.8 0.11
42.97 Copaene 0.11 0.04 0.00
43.13 Methyl jasmonate 0.00 0.22 0.00
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau si dessus : la nature des
constituants est la même pour les trois échantillons, Cependant; les teneurs des
composés différent selon la région (Ain Defla- Aflou-Berraki) et donc l'origine de la
plante.
Les composés majoritaires chez le romarin issu de la région d'Aflou sont: le
camphor avec une teneur de (34%), suivie du α-pinéne (11,89%), camphéne (9,47%),
benzéne (8,14%), limonéne (3,97%), β-phellandréne (3,31%) et le bornéol avec une
teneur de (2,71%).
Les composés majoritaires de l'HE du romarin issu de la région de Ain Defla sont:
le camphor (26,70%), suivie de α-pinéne avec (14,36%), camphéne (9,72%),
benzéne(9,44), β-phellandréne (6,15%),limonéne (3,77%),naphtalléne (2,67%),
bornéol (1,96%).
Les composés majoritaires de l'HE du Romarin de la région de Berraki sont: le
cardinol (42,8%), α-pinéne (16,94%), benzéne (6,93%), camphéne (5,48%),
verbénone (4,08%), limonéne (3,23%),et le bornéol(2,61).
La composition chimique de l'HE du romarin des trois régions étudiées; montre des
différences par rapport a certains travaux.
Dans la région de Bibans (Algérie), le composé majoritaire est le 1,8 cinéol (52,4%),
suivie du camphre (12,6%) (Lawrance.,1997), alors qu'un autre échantillon
montreune grande variabilité quantitative en fonction de l'état de la plante ( 1,8 cinéol
= 47,1-16%, camphre = 26,0-9,3%, α-pinéne = 16,9-2,5%) (Boutekdjiret et al.,
1999).
Un échantillon provenant de Bordj Bou Arriridj ne contient que (7,5%) de cinéol a
coté du camphre (12,1%), du bornéol (10,1%), de l'α-terpinéol (9,5%) et surtout de E-
(β)-caryophylléne (13,9%) (Benhbilles., 2001).
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Tableau 8 : Diamètre des zones d'inhibition (mm) dans le cas des bactéries Gram+
Staphylococcus
aureus 21 20,5 22,5
Staphylococcus
SCN 18,5 25 23,5
Bacillus
subtillis 16,5 24 24
Enterococcus
faecalis R R R
R:résistante
Selon l'échelle citée par Meenaet Sethi; 1994 etEla et al; 1996:
L'HE du romarin des trois régions étudiés (Ain Defla, Aflou et Berraki) a une activité
modérément inhibitrice pour les souches:Staphylococcus. aureus, Staphylococcus
SCN ,Bacillussubtilis.
Par contre, la souche Enterococcusfaecalis présente une résistance vis-à-vis l'HE du
romarin des trois régions étudiées.
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Les résultats de l'activité antimicrobienne de l'HE du romarin des trois régions sur
les bactéries Gram- sontillustrés dans le tableau 9.voir (Annexe 5)
Tableau 9: Diamètre des zones d'inhibition (mm) dans le cas des bactéries Gram-
Klebsiella
Pseudomonas.
aeruginosa R R R
Acinetobacterlwoffii 19,5 29 33
Citrobacterfrendii 17 27 24
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Tableau 10: Diamètre des zones d'inhibition (mm) dans le cas des levures
Candida
albicans <10 16,5 20
Saccharomyces
cereviceae 21 19 23,5
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
Nos résultats sont conformes à ceux de Dafeferaet al., 2000 et Brattaet al., 1998 et
Ahmer et al.,1999 et Yesil. Celiktas et al., 2007 et Yang Jiang et al.,2011 qui
rapportent que l'HE du romarin possèdent une forte activité antibactérienne et
antifongique, ceci peut être due aux composés chimiques à savoir: le limonéne, le
camphor, 1,8 Cineol, l'α-pinéne et le bornéol qui sont présent dans nos HE mais a
différents pourcentages.SelonPibiri., 2006, la souche du Pseudomonas
aeruginosas'est montrée résistante aux souches testées.
Cetterésistance est due à la capacité de celle-ci à former un bio film. Ce dernier est
une organisation complexe, composé de différentes strates, dont lesquelles les
bactéries se trouvent dans des états physiologique spécifique à leur situation ainsi,
toute la population bactérienne n'est pas exposée simultanément et similairement au
produit.Ainsi donc et d'après les résultats obtenu, on peut dire que les bactéries
Gram+ sont plus sensibles que les bactéries a Gram-, ce qui est en accord avec les
travaux de (Cosentino et al., 1999,et de Billerbeck.,2000).
La faible sensibilité de ces dernière est a mettre en relation avec la présence d'une
seconde membrane lipopolysaccharidique; qui jouent un rôle de barrière vis-à-vis des
HE (Chao et al.,2000).
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
CMI% CMB%
Souche Ain Aflou Berraki Ain Aflou Berraki
Defla Defla
Staphylococcus 0,25 0,5 0,5 0,5 1 1
aureus
Bacillus subtilis 0,25 0,25 0,06 1 2 0,125
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
6. Activité diurétique
L’expérience menée sur six rats portant sur l’activité diurétique après 6heurs
d’ingestion, n’a pas montré de différence significative (P<0,05) entre les différents
groupes comparativement au témoin
Nos résultats sont conforme à ceux trouvé par (Caseres et al.,2007),ces derniers
rapportent qu’après une durée de 6heures d’accumulation du volume urinaire après
administration d’une solution contenant l’HE du Romarin était non significatifs
comparativement au lot témoin.
Selon ( Haloui et al., 2000) rapportent qu’a partir du 3eme jour de traitement par
l’HE du Romarin il eut une augmentation de l’EUV, et au 5eme jour cette dernière a
atteint son maximum.
La présence de l’activité diurétique de l’HE du Romarin peut être due à
l’accumulation des composés actifs induit par un métabolite actif, ces derniers sont
produits par des constituants inactifs produits par des extraits de plantes.
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CHAPITRE II : RESULTAS ET DISUSSION
8.Conclusion
Enfin pour conclure ce chapitre et après ses expériences nous pouvons dire que l’huile
essentielle du Romarin présente une variabilité dans le rendement ,et les même
composés majoritaires mais à des teneurs différentes d’une région à une autre et
possède une activité antimicrobienne et antifungique modéré sur les différentes
souches testés tous dépend de l’origine de cette huile et sa teneur en composés volatils
,d’autres part il n’avait pas d’activité diurétique chez les rats après 6 heures
d’ingestion, cette huile ne présente pas d’activité sédative chez les souris testées.
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GENERALE
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES
-Par ailleurs, il n’y avait pas d’activité diurétique chez les rats avants 6 H
d’ingestion d’huile du Romarin pour les trois régions.
Et enfin, l’HE du Romarin ne présente pas une activité sédative chez les souris
testées.
Perspectives
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Références bibliographiques
Agrandissement 25 x 3,2.
ANNEXE 3
Summury
Our study concerns about the officinal Rosemary «Rosmarinus officinalis L.» carried out in the places in
Algeria that is to say :«AIN DEFLA,AFLOU,BARAKI»,.The extraction of essentials oils by the studied had
been done by GC-MS analyses which presented the same mains components of the studied samples with value
:The camphor (34-26,66-1,45)%,α-pinene(11,89-14,36-16,94)%
,camphene(9,47-9,72-5,45)%,benzene(8,14-9,44-5,48)%,limonene(3,97-3,77-3,23)%,borneol(2,71-1,96-
2,61)% respectively.
However, the effect of antimicrobial activity shows inhibitory actions towards tested strains.
As conclusion, we observed the absence of the diuretics effects and the end of 6H, sedative as far as the rats
and mousses are concerned. Key words: Rosermary, GC-MS, hydrodistillation.
مهخص
.)ٍ ثشاق، أفهى،ً مىاقع ( عُه انذفه3 ( مه أصمRosmarinus officinalis L. )دساسحىب حىل وجحة األكهُم
ٌ) انزCG-SM( اسحخالص انضَىت األسبسُة كبن ثىاسطة انحقطُش انمبئٍ انزٌ كبن محم وصف ثكشومب جىغشافُب غبص رو مقُبط طُف انكحهة
:)ٍ ثشاق،ً عُه انذفه،ثُه أن انمكىوبت األسبسُة نهعُىبت انمذسوسة مع اخحالف انىست ( أفهى
:نهمىاقع انحبنُة
camphor (34-26,66-1,45 ) %,α-pinene(l1,89-14,36-16,94)%, camphene (9,47- 9,72-5,45)%,
benzene (8,14-9,44-5,48)%, limonene (3,97-3,77-3,23)% , borneol (2,71-1,96- 2,61)%,
. ٍعهً انحىان
. دساسة انفعبنُة ضذ األحُبء انذقُقة ثُىث وجىد فعبنُة مثجطة انخبصة ثبألسومة انمذسوسة،مه جهة أخشي
. عىذ انجشران وانفئشان، وغُبة انخبصُة انمهذئة، سبعبت6 الحظىب غُبة انخبصُة انمجىنة خالل،وأخُشا
. التقطير المائي،CG-SM ، أكليل الجبل:كلمات الرمز