Mol Cell Proteomics Papers en prensa.

Publicado el 13 de septiembre de 2019

como manuscrito RA119.001455

EL EFECTO ANTICANCERÍGENO DEL DDW AGUA

DISMINUIDA EN DEUTERIO:
El Desequilibrio En La Reducción Oxidación Conlleva Al Estrés Oxidativo
Xuepei Zhang, Massimiliano Gaetani, Alexey Chernobrovkin, Roman A. Zubarev
*

División de Química Fisiológica I, Departamento de Bioquímica Médica y

Biofísica, Instituto Karolinska, SE-17 165 Estocolmo, Suecia

* La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a RAZ

(correo electrónico: Roman.Zubarev@ki.se)

Título actual: efecto anticancerígeno del agua agotada de deuterio

ABREVIATURAS

AGC - control automático de ganancia

ACN - acetonitrilo

CAMP - camptotecina

CE - energía de colisión

CV - coeficiente de variación

DCF-DA - 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato

DDW Deuterium Depleted Water - Agua Disminuida en Deuterio - agua agotada

de deuterio

DEME - Medio de rapaza modificado de Dulbecco

DTT - 1,4-ditiotreitol

EDTA - etilendiaminotetraacético

ETC - cadena eletron transpaort

FA - ácido fórmico

FBS - suero bovino fetal

FDR - tasa de descubrimiento falso

FITExP: identificación funcional de objetivos por expresión proteómica

HCD - disociación de colisión de mayor energía

IAA – yodo- acetamida

MTT - bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio

MTX - metotrexato

NAC - N-acetil cisteína

NCE - energía de colisión normalizada

nanoLC -MS / MS - cromatografía líquida de alto rendimiento nanoflujo -

espectrometría de masas en tándem

NO - agua normal

OPLS-DA - Proyecciones ortogonales para análisis discriminante de estructuras

latentes

PCA - análisis de componentes principales

PCTL - paclitaxel

ROS - especies reactivas del oxígeno

RT - temperatura ambiente

SEM - error estándar de la media

TCEP: clorhidrato de tris- (2-carboxietil) fosfina

TPP - perfil de proteoma térmico

UCP: proteínas de desacoplamiento

RESUMEN

A pesar de las evidencias empíricas convincentes de que el (DDW Deuterium

Depleted Water - DDW Agua Disminuida en Deuterio, posee de 25 a 125
partículas por millón de deuterio) tiene un efecto anticancerígeno, el mecanismo
molecular, sigue sin estar claro.

Aquí, la investigación de la proteómica de reducción - oxidación debido a la

acción del DDW Agua Disminuida en Deuterio en las células A549 reveló un
mayor nivel de estrés oxidativo, mientras que la expresión de proteómica en
combinación con el perfil térmico, descubrió un papel crucial en las proteínas
mitocondriales.
En el escenario propuesto, la inversión de la gradiente del deuterio es
normalmente positiva a través de la membrana interna, lo que conduce a una
mayor exportación de protones, desde la matriz hasta el espacio de la
intermembrana, y a un aumento en el potencial de la membrana mitocondrial,
mejorando la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS).

El estrés oxidativo resultante conduce a un crecimiento más lento y puede

inducir a la apoptosis. Sin embargo, una mayor disminución del deuterio en el
agua ambiental, desencadena un mecanismo de retroalimentación, el que
conduce a la restauración del equilibrio reducción oxidación y al crecimiento
reanudado.

El estrés oxidativo inducido por el DDW Agua Disminuida en Deuterio, ha sido

verificado por los ensayos bioquímicos tradicionales, por lo que puede ser útil
como coadyuvante de la terapia anticancerígena inductora de las especies
reactivas al ROS.

Palabras clave: DDW Agua Disminuida en Deuterio, anticancerígeno, proteómica,

desequilibrio reducción – oxidación.

INTRODUCCIÓN

El deuterio fue descubierto en el año de 1931 por Harold C. Urey,

descubrimiento por el que recibió el Premio Nobel de Química (1, 2). Casi
inmediatamente se conoció que los dos isótopos estables del hidrógeno, el protio
(H) y el deuterio (D), difieren no solo en sus parámetros físicos (3), sino que
también son diferentes en sus propiedades químicas (4) y en sus características
biológicas (1).

La concentración de Deuterio en el agua oceánica normal es de unas 150

partículas por millón, pero el contenido de deuterio en el agua terrestre natural
y el hielo varía desde 90 a 160 partículas por millón (2, 5). El agua pesada
(D2O) tiene una temperatura de ebullición más alta que el H2O y, por lo tanto,
las destilaciones múltiples con recolección temprana de fracciones pueden
producir DDW Agua Disminuida en Deuterio, que puede contener tan solo 1
partícula por millón de Deuterio (6).

Un estudio del año 1993 encontró que el DDW Agua Disminuida en Deuterio
suprime significativamente el crecimiento de células L929 de fibroblastos in
vitro, e inhibe el crecimiento tumoral en los xenotransplantes en los ratones (7).

Esta investigación pionera ha sido seguida por muchos estudios que investigan
el potencial del DDW Agua Disminuida en Deuterio en el tratamiento del cáncer
(8-19) (Tabla 1).
Aunque no todos los estudios confirmaron el efecto del DDW Agua Disminuida
en Deuterio en el cáncer (11, 16-17), las evidencias experimentales agregadas
parecen respaldar abrumadoramente la actividad anti proliferación del DDW Agua
Disminuida en Deuterio (Tabla 1).

Pero a pesar de los extensos esfuerzos de investigación durante un cuarto de

siglo, no ha surgido un mecanismo molecular ampliamente aceptado de acción
anticancerígena del DDW Agua Disminuida en Deuterio, aunque todos los
mecanismos tentativos propuestos involucran el efecto isótopo Deuterio /
Hidrógeno que de alguna manera influye en los procesos celulares, tal como el
ciclo celular, y / o induce a la apoptosis (20).

Los efectos del DDW Agua Disminuida en Deuterio sobre el crecimiento celular
no son inviables, ya que el contenido normal de deuterio corresponde a una
concentración de deuterio bastante alta. De hecho, la masa molar de H2O es
de 18 g, y, por lo tanto, 1 Litro contiene 55,6 moles de agua, que corresponde
a una concentración molar de 55,6 M.

Considerando que el D2O es un aditivo de una molécula pequeña, la

concentración molar para 150 partículas por millón de Deuterio es de 8.3 mM.

A modo de comparación, la concentración intracelular de Ca2+ es

aproximadamente de 100 nM, es decir, cinco órdenes de magnitud más baja,
aunque la concentración de Ca2+ puede aumentar 10-100 veces durante varios
eventos celulares (21). La concentración intracelular de otro ion importante, Cl-
, es ≈ 4 mM, es decir, la mitad de la concentración normal de deuterio.

Además, el deuterio no solo es diferente en la masa de los protones, sino que

también lo es, en los términos de ciertas propiedades biológicamente
importantes. El mayor efecto isotópico en biología se encuentra en NADPH, en
el que el ion deuterio se discrimina en comparación con el protón hasta en un
60% (22, 23). Tal nivel de discriminación extrema indica que el equilibrio Deuterio
/ Hidrógeno es biológicamente importante.

De hecho, la supresión del crecimiento de diferentes organismos por un

contenido de deuterio superior al normal está bien documentada. Se ha
establecido que el D2O es tóxico para organismos superiores a una
concentración ≥25%, pero incluso una concentración de <1% el Deuterio puede
tener un efecto medible en el crecimiento bacteriano (24).

Al comienzo de la exploración del DDW Agua Disminuida en Deuterio, surgió un

paradigma de que el deuterio es esencial para la proliferación celular (7). Este
paradigma a veces se repite incluso hoy; Sin embargo, hay varios hechos que
no encajan en él. Uno de estos hechos es que lejos de todas las células
cancerosas, incluidos algunos tipos agresivos, son sensibles al DDW Agua
Disminuida en Deuterio (8, 11).

Otro hecho inexplicable es que la toxicidad del DDW Agua Disminuida en

Deuterio para las células cancerosas no aumenta de forma monótona con el
agotamiento del deuterio, a menudo alcanza el máximo a valores relativamente
modestos entre 50 y 105 partículas por millón en deuterio (11, 15).

Si bien los efectos son variables sobre los diferentes tipos de cáncer, es un
fenómeno común para los medicamentos contra el cáncer convencionales, en
una disminución de la toxicidad con el aumento de la concentración (análogo del
agotamiento del deuterio), esto es algo no solamente extremadamente raro, sino
que es algo dado sin precedentes.

Para arrojar luz sobre estas preguntas intrigantes, decidimos estudiar la función
anticancerígena del DDW Agua Disminuida en Deuterio utilizando estrategias de
proteómica química desarrolladas recientemente. Para este propósito, tratamos
el DDW Agua Disminuida en Deuterio como un agente químico anticancerígeno,
y contrastamos su acción a nivel de proteína con la inducida por varias
moléculas anticancerígenas comunes en concentraciones que suprimen el
crecimiento celular en un grado similar.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Diseño experimental y justificación estadística

El plan de estudio general se muestra en la figura número 1. Después de la

selección basada en los datos de la literatura de un panel celular preliminar
(células MCF7, A549 y HT29), la línea celular más sensible, así como la
concentración de deuterio de la supresión del crecimiento máximo en esta línea
celular debían determinarse (la figura número 1A, B).

Para un grupo de fármacos de control seleccionados (PCTL, MTX, CAMP y

auranofina), se identificó la concentración que inducía la misma supresión del
crecimiento durante 48 horas que el DDW Agua Disminuida en Deuterio (la figura
número 1C).

La comparación de los datos del proteoma en las células sensibles tratadas

con el DDW Agua Disminuida en Deuterio con las mismas células tratadas con
medicamentos con el mismo grado de supresión del crecimiento identificaría
las proteínas específicamente reguladas hacia arriba y hacia abajo por el DDW
Agua Disminuida en Deuterio. Este método se denomina la Identificación
Funcional De Objetivos Por Expresión Proteómica (FITExP) (23-27).
La figura 1D ilustra cómo la OPLS-DA, una variante supervisada de PCA,
identifica las proteínas específicamente reguladas hacia arriba y hacia abajo.
Paralelamente, la proteómica de la reducción - oxidación de las células
tratadas con el DDW Agua Disminuida en Deuterio y auranofina, así como los
controles, descubrirían cambios en los estados oxidativos de los tioles en las
proteínas celulares (la figura número 1E). Se planificó TPP (28, 29) para revelar
qué variaciones observadas por FITExP y la proteómica de reducción -
oxidación fueron acompañadas por cambios en la estabilidad térmica de las
proteínas (la figura número 1F).

La comparación de los resultados de estas tres técnicas proteómicas

complementarias identificaría las proteínas más afectadas (la figura número
1G), lo que podría conducir a la formulación de una hipótesis mecanicista del
DDW Agua Disminuida en Deuterio (la figura número 1H). Esta hipótesis sería
luego probada por experimentos adicionales, incluidos los ensayos bioquímicos
tradicionales (la figura número 1I).

Siguiendo el plan anterior, los datos de proteómica se obtuvieron por nanoLC -

MS / MS en cuatro partes experimentales. Para realizar un análisis estadístico
apropiado, todos los tratamientos se realizaron en réplicas biológicas. El
número de repeticiones se seleccionó en función del poder estadístico deseado
en una parte de análisis particular: 4 para el análisis de abundancia de proteínas
(parte 1), 2 para el análisis del curso temporal (parte 2), 3 para el análisis de
proteómica reducción - oxidación (parte 3) y 2 para Análisis de TPP (parte 4).
Cada conjunto de muestras de etiquetado TMT10 se combinaron y fraccionaron
en 108 fracciones.

En total, se analizaron 113 muestras marcadas con TMT, incluidos 11 conjuntos

de muestras marcadas con TMT10 y 3 conjuntos de muestras marcadas con
iodoTMT6. Los experimentos de NanoLC -MS / MS se realizaron con un
gradiente LC de 120 minutos. En cada parte del experimento, se incluyeron
controles separados tratados con el vehículo. Se analizaron muestras de cada
parte en LC-MS en orden aleatorio para reducir el efecto de “orden de
inyección”.

En la parte 1, las células A549 se trataron con CAMP, MTX, PCTL o se cultivaron
en DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón (20 muestras).
En la parte 2, las células se cultivaron en DDW Agua Disminuida en Deuterio de
80 partículas por millón, o se trataron con MTX y PCTL durante 4-48 horas (5
puntos de tiempo, 40 muestras).
Además, se incluyeron 2 muestras de control tratadas con el vehículo durante
48 horas en cada conjunto de muestras marcadas con TMT10 para la
normalización. En la parte 3, las células se cultivaron en el DDW Agua
Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón o se trataron con auranofina
(3 muestras).

Finalmente, en la parte 4, las células se cultivaron en el DDW Agua Disminuida

en Deuterio de 80 partículas por millón y después se incubaron a 10 puntos de
temperatura de 37 a 67◦ C, seguido de centrifugación y digestión del
sobrenadante (40 muestras). El control de calidad se realizó calculando la
variación (CV) entre las réplicas y construyendo modelos de PCA para verificar
la pequeña distribución de datos entre las réplicas.

Las líneas celulares y la medición de la supervivencia celular se obtuvieron las

líneas celulares MCF7, A549 y HT29 del banco celular en el Instituto Karolinska.
Las células se cultivaron en DEME (11685260, Thermo Fisher Scientific)
suplementado con FBS inactivado por calor al 10% (11560636, Thermo Fisher
Scientific), penicilina / estreptomicina al 1% (15140-122, Gibco) y L-Glutamina
2 mM (17-605E, Fisher Scientific) en una atmósfera humidificada que contiene
5% de CO2 a 37 ℃.

Se prepararon DDW Agua Disminuida en Deuterio de diferentes concentraciones

mezclando 25 partículas por millón de DDW Agua Disminuida en Deuterio
(obtenido de G. Somlyai en HYD LLC, Hungría) y agua Millipore (NW) normal.

Primero, el agua mezclada se agitó durante 48 horas para completar la mezcla.

En segundo lugar, el agua se calentó a 70° C y se mantuvo durante 0,5 hora
seguido de enfriamiento a TA. Después de repetir el segundo paso 4 veces más,
el agua mezclada se usó para preparar el medio de cultivo disolviendo polvo de
glucosa alta en DMEM (D5648,9 Sigma), bicarbonato de sodio 3,7 g / L (S5761,
Sigma), FBS al 10% (v / v) y 1% de penicilina / estreptomicina (v / v).

Las células se lavaron con medio de DDW Agua Disminuida en Deuterio dos
veces antes de implantar. En el fin de evitar el crecimiento excesivo de células,
se seleccionaron los números de inoculaciones de acuerdo con el crecimiento,
el tamaño y el volumen de las diferentes células en la medición supervivencia.

Se sembraron 5.000 células para A549; 10.000 células para MCF7 y HT29 en
cada pocillo de placa de 96 pocillos. Después de 48 horas, se añadieron 5
miligramos sobre mililitro de MTT (M6494, Thermo Fisher Scientific) en tampón
PBS (17-516F, Lonza) en cada pocillo y la placa se incubó a 37° C durante 4
horas.
Luego, las células se incubaron a 37° C durante 14 horas con SDS 0,1 gramo /
mililitro (H5113, Promega) en HCl 0,1 M para disolver el formazán, formado
después de agregar MTT. La absorbancia de formazán en cada pocillo se midió
usando un espectrofotómetro de microplaca Epoch (Biotek) a 570 nm. Se
calculó el porcentaje de supervivencia celular para cada tratamiento y control,
realizándose el análisis de la curva inhibitoria utilizando el software Prism v. 5.02
(GraphPad).

Inhibición del crecimiento celular por drogas de control.

Los medicamentos de control CAMP (C9911, Sigma), MTX (M9929, Sigma),

PCTL (T7191, Sigma) y auranofina (A6733, Sigma) se usaron para tratar células
a diferentes concentraciones. Se sembraron 5.000 células A549 en cada pocillo
de una placa de 96 pocillos durante 48 horas. Después de eso, las curvas
inhibitorias se obtuvieron como se describió anteriormente.

Las concentraciones de IC30 a las que se inhibió la proliferación celular en 30

± 5% se usaron en experimentos adicionales. Para el efecto combinado de
auranofina y de DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón,
las células A549 se lavaron con medio de DDW Agua Disminuida en Deuterio
de 80 partículas por millón y luego se sembraron 5,000 células tanto en DDW
Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón como en medio de
agua NW en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.

Se usaron 5 µM, 4 µM, 3 µM, 2 µM de solución de auranofina y 1% de solución

de DMSO (SULFÓXIDO DE DIMETILO) para tratar las células cultivadas en medio
DDW Agua Disminuida en Deuterio o agua NW durante 48 horas.

Para los experimentos de NAC (A7250, Sigma), se sembraron 5.000 células

tanto en DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón como
en medio de agua NW en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadió
auranofina en cada pocillo de medio agua NO a una concentración de 3 µM.
Posteriormente, se añadió NAC a concentraciones de 2 µM, 1,5 µM, 1 µM, 0,5
µM, 0 µM (NW), y las células se incubaron durante 48 horas, seguido de
recuento celular.

Para la medición de la concentración celular de especies reactivas al oxígeno

ROS Se sembraron 5.000 células A549 en cada pocillo de una placa de 96
pocillos en cuatro réplicas. Después de la incubación durante la noche, las
células se lavaron con agua NW o DDW Agua Disminuida en Deuterio (la misma
concentración de deuterio que en los medios de crecimiento) tres veces. Como
control positivo para el estrés oxidativo, se usó 3 µM de auranofina.
El efecto combinado de la auranofina y del DDW Agua Disminuida en Deuterio
en la producción de especies reactivas al oxígeno ROS se midió tratando las
células con medio de la auranofina 3 µM M y / o por medio del DDW Agua
Disminuida en Deuterio. Después de 24 horas de tratamiento, las células se
lavaron con PBS dos veces y se añadieron 100 µL de DCF-DA 20 µM en PBS a
cada pocillo. Después de 30 minutos de incubación a 37° C en la oscuridad, la
intensidad de fluorescencia se midió con Infinite® M200 PRO (TECAN).

Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 485 nm y 535 nm,

respectivamente. Paralelamente, la supervivencia celular relativa se midió
mediante el ensayo MTT descrito como anteriormente. La intensidad de
fluorescencia en cada pocillo se normalizó a la intensidad promedio de cada
célula viva. El análisis del curso temporal de la producción de especies reactivas
al oxígeno ROS se realizó midiendo el nivel de ROS en células que crecen en
diferentes condiciones de crecimiento en varios puntos de tiempo.

La FITExP de preparación de las muestras

15.000, células A549 se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos

y se cultivaron las células en medio del DDW Agua Disminuida en Deuterio de
80 partículas por millón o a tratarse con, 0,5 µM CAMP, 2 µM PCTL o 0,5 µM
MTX en cuatro repeticiones.

Después de 48 horas de tratamiento, las células se recogieron y se lisaron

usando tampón Tris (741883, Sigma) 50 mM y urea 8 M (U5378, Sigma), SDS
al 1% e inhibidor de la proteasa (5892791001, Sigma) a pH 8,5.

Para el experimento del curso temporal, las células se cultivaron en agua NW o

del DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón y se trataron
con MTX o PCTL durante 4, 15, 26, 38 y 48 horas.

Después de la reducción de proteínas usando DTT 8 mM (10708984001, Sigma)

y alquilación usando IAA 25 mM (I1149, Sigma), las proteínas se precipitaron
usando acetona fría a -20° C durante la noche, seguido de centrifugación y re-
suspensión. Las proteínas fueron luego digeridas por Lys C (125-05061, Wako
Chemicals GmbH) (relación 1:75 enzima a proteína) a 30 ℃ durante 6 horas, y
tripsina (V5111, Promega) (1:50 relación enzima / proteína) a 37° C, durante la
noche.

Después de etiquetar con TMT-10 reactivos (90110, Thermo Fisher Scientific),

desalado en columnas Sep 18 de C18 (WAT054960, Waters) y fraccionamiento
utilizando un fraccionamiento de péptidos de fase inversa de pH alto kit (84868,
Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante, el obtenido se
analizaron 10 fracciones de péptidos en cada muestra mediante la proteómica
de escopeta usando nanoLCMS.

Preparación de muestras de la proteómica de reducción - oxidación

Se sembraron 15,000 células A549 en cada pocillo de una placa de 6 pocillos

y las células se cultivaron en el DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80
partículas por millón o en agua NW, y tratada con un vehículo o auranofina a 3
µM en 3 repeticiones.

Después de 48 horas, las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis

a pH 8,0: HEPES 50 mM (U5378, Sigma) con adición de urea 8 M, EDTA 1 mM
(E9884, Sigma), SDS al 1% y un inhibidor de la proteasa Las muestras se
incubaron con 4,4 mmol / Litro de yodoTMT-126, iodoTMT-127 y iodoTMT-128
(90102, Thermo Fischer Scientific) durante la noche a 37° C.

Los grupos SH y SSH libres fueron bloqueados en esta etapa. Después de la

precipitación usando metanol / cloroformo, las muestras se disolvieron en
tampón HEPES 50 mM incluyendo urea 8M.

Se usó TCEP 10 mM (T2556, Thermo Fischer Scientific) para reducir los

disulfuros a 50° C durante 1 hora. Después de la precipitación seguida de re-
suspensión, las muestras se marcaron con iodoTMT-129, reactivos iodoTMT-
130 y iodoTMT-131 durante la noche a 37° C. Luego, el etiquetado las muestras
se precipitaron y luego se re-suspendieron para la digestión utilizando Lys C
(1:75, enzima para proporción de proteína) a 30° C durante 6 horas y tripsina
(1:50, proporción de enzima a proteína) a 37° C durante la noche.

Después de la desalación, los péptidos marcados con iodo TMT se

enriquecieron usando anti-TMT inmovilizado resina (90076, Thermo Fischer
Scientific) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos enriquecidos se
analizaron mediante proteómica de escopeta utilizando nanoLC -MS / MS.

Preparación de muestras de TPP

Se sembraron 3 millones de células en un matraz T-175 y se cultivaron en el

DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón o en agua NW
medio en 2 repeticiones. Después de 48 horas, las células en cada matraz se
recogieron, se lavaron y se dividieron en diez alícuotas. Estas se incubaron
durante 3 minutos en los siguientes diez puntos de temperatura: 37, 41, 44, 47,
50, 53, 56, 59, 63 y 67 ℃. Después de que las células se mantuvieron a
temperatura ambiente durante 5 minutos para enfriar abajo, las células se
lisaron mediante tres ciclos de congelación / descongelación.
Después de ultra centrifugación a 35,000 revoluciones por minuto / min a 4° C
durante 30 minutos, se recogió el sobrenadante, se redujo con DTT 8 mM y
alquilado con 25 mM IAA. Las muestras se precipitaron usando acetona fría a
-20 ℃ durante la noche, digerido por Lys C (1:75, relación enzima / proteína)
durante 6 ha 30° C, y luego por tripsina (1:50, relación enzima / proteína)
durante la noche. Después de etiquetar con reactivo TMT-10, la desalación con
columnas Sep18 de C18 y fraccionamiento mediante un kit de pH alto como el
anterior, el 10. Las fracciones de péptidos para cada muestra se analizaron por
nanoLC -MS / MS.

Análisis NanoLC -MS / MS

Los análisis NanoLC -MS / MS de las muestras FITExP y TPP se realizaron en

un espectrómetro de masas Q Exactive HF y de las muestras de proteómica
reducción - oxidación: en un espectrómetro de masas Orbitrap Elite (ambos -
Thermo Scientific). El sistema nanoLC era un UltiMate 3000 (Thermo Scientific).

Las muestras FITExP y TPP se pre-concentraron y se desalaron en línea

utilizando un PepMap C18 nano trap columna (longitud, 2 centímetros; un
diámetro interno, 75 μM; el tamaño de partícula, 3 μM; el tamaño de poro,
100Å; Thermo Scientific) a un caudal de 3 μL / minuto durante 5 minutos.

La separación de péptidos fue realizada con una columna nano LC de fase

inversa EASY-Spray C18 (Acclaim PepMap RSLC; longitud, 50 centímetros; el
diámetro interno, 2 μm; el tamaño de partícula, 2 μm; el tamaño de poro, 100
Å; Termo Científico) a 55° C y un caudal de 3 μL / minuto. Los péptidos se
separaron usando un disolvente binario sistema compuesto por 0.1% (v / v) FA,
2% (v / v) ACN (solvente A) y 98% ACN (v / v), 0.1% (v / v) FA (disolvente B).
Se eluyeron con un gradiente de 4–26% B en 120 minutos, 26 a 95% B en 10
minutos.

Posteriormente, la columna analítica se lavó con 95% de B durante 5 minutos

antes de volver al equilibrio con 4% B. El primer paso del gradiente se dividió
en dos partes, 4 a 10% B en 100 minutos. más 10 a 26% B en 20 minutos para
la fracción 3 a 5, y 4 a 14% en 100 minutos más 14 a 26% B en 20 minutos
para las fracciones 6 a 8. Los espectros de masas se adquirieron en un rango
de masa a carga (m / z) de 375 a 1,500 con una resolución de 120,000 a m /
z 200.

El objetivo AGC se estableció en 3 × 106 con un máximo tiempo de inyección

de 100 ms. Los 17 picos peptídicos más intensos se seleccionaron para la
fragmentación de péptidos a través de HCD con el valor NCE establecido en
33. El umbral de abundancia de selección de iones se estableció en 0.1% con
exclusión de carga de z = 1 iones.

Los espectros de MS / MS fueron adquiridos en una resolución de 60,000, con

un valor objetivo de 2 x 105 iones o un tiempo de inyección máximo de 120 Ms.
El primer m / z fijo fue de 100, y la ventana de aislamiento fue de 1,2 m / z.

El instrumento fue operado en el modo de iones positivos para la adquisición

dependiente de datos de espectros MS / MS con un tiempo de exclusión
dinámica de iones precursores previamente seleccionados de 30 s. Para
muestras reducción - oxidación, los péptidos se lavaron y se concentraron
previamente usando una columna nano LC de fase inversa C18 (Columna
Acclaim PepMap RSLC; longitud, 50 centímetros; diámetro interno, 75 μm;
tamaño de partícula, 2 μm; tamaño de poro, 100 Å; Thermo Scientific) a 35 °
C y un caudal de 3 μL / min.

Los péptidos fueron separados usando un sistema solvente binario que consiste
en 0.1% (v / v) FA, 2% (v / v) ACN (solvente A) y 98% de ACN (v / v), 0.1% (v
/ v) de FA (solvente B). Se eluyeron con un gradiente de 2 a 26% B en 120
minutos, 26 a 95% B en 10 minutos, y 95 a 2% B en 10 minutos.
Posteriormente, la columna analítica se lavó con 98% de B durante 5 minutos
antes de reequilibrar con 98% de A.

Los espectros de masas se adquirieron en un rango de masa a carga (m / z)

de 375–1,200 con una resolución de 120,000 a m / z 200. Los 10 picos
peptídicos más intensos fueron seleccionados para experimentos HCD en la
trampa de iones lineal con los siguientes parámetros: CE normalizado, 35%;
tiempo de activación, 10 ms; AGC, 5,000; tiempo de inyección máximo, 150
ms; ancho de aislamiento, m / z 1.6.

La dinámica el tiempo de exclusión de los iones precursores previamente

seleccionados se estableció en 45 s, y solo +2 o más. Los iones cargados se
seleccionaron para MS / MS, registrados con una resolución de 30,000. El
umbral de abundancia de la selección de iones. se estableció en 0.1% con
exclusión de iones de carga individual.

Análisis de datos de MS

Los datos brutos de espectrometría de masas se analizaron con el software

MaxQuant (versión 1.5.6.5). Un FDR de 0.01 para proteínas y péptidos y una
longitud mínima de péptido de 6 amino Se requirieron ácidos. La precisión de
la masa de los iones precursores fue mejorada por el tiempo dependiente
algoritmo de recalibración de MaxQuant.
El motor de búsqueda de Andromeda se utilizó para buscar los espectros MS /
MS en contra de la Uniprot base de datos humana (UP000005640_9606 y
UP000005640_9606_additional, última modificación el 26 de enero de 2019)
combinado con 262 contaminantes comunes y concatenados con las versiones
invertidas de todas las secuencias.

La especificidad de la enzima se estableció en “Trypsin / P específico, Lys / P”.

No más de dos perdidos se permitieron escotes. Otras modificaciones
permitidas fueron cisteína carbamido-metilación (fijo) así como la acetilación
de la proteína N-terminal, la desamidación de asparagina y glutamina y la
oxidación de metionina (variable). Se permitieron un máximo de dos escotes
perdidos.

La identificación del péptido se basó en una búsqueda en la base de datos con

una desviación de masa inicial del ion precursor de hasta 7 partículas por millón.
La tolerancia de masa para los iones precursores fue de 20 partículas por millón
en la escala m / z (búsqueda inicial) y 4,5 partículas por millón (búsqueda
principal) y la tolerancia de masa MS / MS se estableció en 20 partículas por
millón en la escala m / z. Solo las proteínas cuantificadas con al menos dos
péptidos se consideraron para la cuantificación y se ignoraron todos los
contaminantes conocidos.

Para el análisis de datos de proteómica reducción - oxidación, se realizaron

búsquedas en los datos de los experimentos de tratamiento y control con
MaxQuant 1.5.6.5 como se describió anteriormente; sin embargo, no se
estableció ninguna modificación fija y la acetilación de la proteína N-terminal,
la desamidación de asparagina y glutamina y la oxidación de metionina se
seleccionaron como modificaciones variables. La cuantificación se basó en
iones informadores iodo6plexTMT en MS / MS. La opción “Match entre las
carreras” se utilizó en cada experimento.

Para cada conjunto de muestras marcadas con TMT-10, las abundancias de

informador de MS / MS en cada canal se normalizaron a las del canal TMT-
126.

Análisis de componentes principales (PCA) PCA y OPLS-DA se realizaron con

SIMCA 15.0 (Umetrics). Se analizaron las abundancias de los canales TMT-10
normalizados, excepto los datos de proteómica reducción - oxidación, para los
cuales se utilizó el porcentaje de oxidación. El rendimiento del modelo OPLS-
DA se informó como coeficientes de correlación acumulativa para el modelo (R
2 × [cum]), y el rendimiento predictivo se basó en siete veces los cálculos de
validación cruzada (Q 2 [cum]) y el análisis de la varianza de los residuos con
validación cruzada (CV-ANOVA) valores de p.

Red de proteínas y análisis de vías

Se usó STRING v10.5 para mapear proteínas significativamente reguladas en

redes de interacción proteína-proteína. Los nombres de genes
correspondientes a proteínas reguladas hacia arriba y hacia abajo se enviaron
para su análisis en el sitio web de STRING (http://string-db.org). Se usó un
umbral de confianza medio (0,4) para definir las interacciones proteína-
proteína. El análisis de enriquecimiento de conjunto de genes incorporado con
todo el fondo del genoma se usó para identificar términos de ontología de genes
enriquecidos y vías KEGG.

Análisis Estadístico

El análisis de los datos cuantitativos de proteómica para TPP se realizó

utilizando una biblioteca R desarrollada internamente
(https://github.com/snp/CETSA). En resumen, las abundancias de proteínas a
diferentes temperaturas se ajustaron a una curva modelo de fusión de proteína
sigmoidea, y la temperatura de fusión Tm se determinó como un punto medio
de esa curva (25).

RESULTADOS

El DDW Agua Disminuida en Deuterio suprime el crecimiento de células

cancerosas. Se evaluó el efecto del DDW Agua Disminuida en Deuterio sobre la
proliferación de adenocarcinoma de mama humano MCF7, el carcinoma de
pulmón humano A549 y las células HT29 de adenocarcinoma colorrectal
humano.

Cuando las células se cultivaron durante 48 horas en DDW Agua Disminuida en

Deuterio con una concentración de deuterio de 60 partículas por millón, 80
partículas por millón, 100 partículas por millón y 120 partículas por millón y en
agua normal (NW, de 150 partículas por millón en deuterio) como agua de
control, las células MCF7 respondieron débilmente al tratamiento con el DDW
Agua Disminuida en Deuterio, mientras que Las células HT29 mostraron una
reducción de ≈20% en la proliferación a 100 partículas por millón en deuterio.

Las células A549 resultaron ser más sensibles al DDW Agua Disminuida en
Deuterio (la figura número 2A), con el DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80
partículas por millón inhibiendo la proliferación celular en un 32% (p <0.005).

Por lo tanto, las células A549 se seleccionaron para estudios de proteómica

adicionales. Tanto en concentraciones de Deuterio más bajas como más altas
en comparación con la supresión máxima, la proliferación celular se restableció
a niveles normales (figura complementaria S1).

Los efectos del DDW Agua Disminuida en Deuterio sobre la abundancia de

proteínas.

La suposición subyacente en FITExP es que las proteínas más reguladas en la

apoptosis profunda (tratamiento de 24-72 horas) son las más íntimamente
relacionadas con el mecanismo de acción del agente tóxico. Para alcanzar la
especificidad de análisis deseada y diferenciar las proteínas mecanísticas de
las proteínas de respuesta general relacionadas con las vías de muerte y
supervivencia, los medicamentos de control se aplican a concentraciones que
inducen un nivel similar de supresión de la proliferación (26 a 30).

Elegimos agentes antifolatos (MTX), agentes antimitóticos activos con tubulina

(PCTL) e inhibidores TOP1 (CAMP) como medicamentos de control para el DDW
Agua Disminuida en Deuterio porque sus objetivos son bien conocidos y la
estrategia FITExP se ha aplicado a estos medicamentos en nuestro trabajo
anterior (26).

Las células A549 se cultivaron en agua de control NW, así como en el DDW
Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón, CAMP 0.5 µM, MTX 2
nM y PCTL 0.5 µM, que en todos los casos, excepto en el grupo de control,
redujeron el recuento celular en un 30 ± 5% (la figura número 2B).

Los proteomas celulares fueron extraídos y analizados por nanoLC -MS / MS.
Se identificaron y cuantificaron un total de 6910 proteínas, con 6370 proteínas
comunes para todos los tratamientos (Tabla complementaria S1). OPLS-DA (la
figura número 2C) proporcionó una separación clara de los tratamientos, con
las réplicas agrupadas.

Cuando el grupo con el DDW Agua Disminuida en Deuterio se comparó con

todos los otros tratamientos y el control, se identificaron las proteínas reguladas
hacia arriba y hacia abajo más específicamente (la figura número 2D).

Los 50 principales regulados hacia arriba y hacia abajo por las proteínas con el
DDW Agua Disminuida en Deuterio se seleccionaron de acuerdo con el “valor
predictivo VIP” (la figura número 2E, F; Tabla suplementaria S2), y se
clasificaron por términos GO y por rutas KEGG (Tablas suplementarias S3 y S4).

El ciclo celular se encontró como el proceso más enriquecido para las proteínas
reguladas hacia arriba, mientras que, para las proteínas reguladas hacia abajo,
dos funciones moleculares estaban sobrerrepresentadas: ribonucleósido-
difosfato con disulfuro de tio-reducción - oxidaciónina como una actividad
aceptora y oxidorreductasa.

El mapeo de las proteínas reguladas por disminución reveló la señalización de

p53 como la vía más desactivada. p53 es un factor de transcripción tetramérico
multifacético (32), que regula más de 2,500 genes (33) implicados en la
progresión del ciclo celular (34, 35), en la señalización de la muerte celular (36,
37),el metabolismo (38, 39), la reparación del ADN (40) y la angiogénesis (41).

El potente y versátil perfil de actividad anticancerígena de p53, junto con los

análisis genómicos y mutacionales que documentan la inactivación de p53 en
más del 50% de los cánceres humanos, determinaron el papel crítico que juega
p53 en el desarrollo de la terapia contra el cáncer.

Nuestro hallazgo de que la p53 es una de las proteínas más reguladas por
disminución en el tratamiento con el DDW Agua Disminuida en Deuterio, lo que
es consistente con los informes anteriores de que el DDW Agua Disminuida en
Deuterio, suprime la expresión de la p53 en diferentes órganos de animales,
incluidos los pulmones (42).

Otra vía suprimida por el DDW Agua Disminuida en Deuterio fue el metabolismo
del glutatión. El glutatión representa más del 90% de los tioles celulares no
proteicos (43), participa en el establecimiento del equilibrio reducción -
oxidación celular y, por lo tanto, juega un papel importante en el desarrollo y la
terapia del tumor. Del 10 al 15% del glutatión celular total se encuentra en las
mitocondrias. El glutatión es de suma importancia en la protección del orgánulo
de sustancias reactivas al oxígeno ROS producido a través de la ETC
mitocondrial (44).

En varios tipos de tumores, las proporciones de glutatión oxidado a glutatión

reducido se encuentran elevadas, lo que hace que los tejidos neoplásicos sean
más resistentes a la quimioterapia (45). Este resultado insinuó que el DDW Agua
Disminuida en Deuterio puede actuar a través de la inducción del desequilibrio en
el equilibrio de la reducción - oxidación celular.

Para evaluar la dinámica de la regulación de proteínas por el DDW Agua

Disminuida en Deuterio, realizamos un análisis de curso de tiempo, en el que
se analizaron las abundancias de las 50 proteínas reguladas hacia arriba y hacia
abajo (la figura número 2E, F) 4 - 48 horas después del crecimiento en agua
NW o en el DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón, así
como en el agua NW con la adición de medicamentos de control MTX y PCTL
(Tabla complementaria S5-S8).
Al momento, cuando la abundancia de las proteínas reguladas hacia arriba o
hacia abajo cambió en ≥20%, se tomó como un momento característico de
acción del agente respectivo del (DDW Agua Disminuida en Deuterio o el
fármaco de control).

El tiempo característico para MTX fue de 4 horas (figura complementaria S2A),

mientras que el de PCTL fue de 38 horas (figura complementaria S2B). Para el
DDW Agua Disminuida en Deuterio, se usó la regulación de p62 (también
conocida como SQSTM1) para medir el tiempo característico. La regulación de
p62 excedió 1.2 después de 28 horas (figura complementaria S2C).

Como una forma alternativa de evaluar el tiempo característico de inducir

cambios en el proteoma, se calculó el valor entre las regulaciones de las 50
proteínas reguladas por aumento tomadas como un grupo y el grupo de
proteínas reguladas por disminución. La significancia estadística (p <0.05) se
alcanzó a las 4 horas para MTX, 26 horas para PCTL y 15 h para el DDW Agua
Disminuida en Deuterio (figura complementaria 2D). Se sabe que MTX induce la
apoptosis celular al detener la síntesis de ADN, ARN, timidilatos y proteínas (46-
48), y por lo tanto actúa en una escala de tiempo relativamente corta.

Por el contrario, PCTL bloquea la progresión de la mitosis, con la activación

prolongada de los puntos de control mitóticos que desencadenan la apoptosis
y, por lo tanto, el largo tiempo característico de ese medicamento. El tiempo
característico de la acción del DDW Agua Disminuida en Deuterio parece ser
intermedio.

Tenga en cuenta que en el análisis STRING, las proteínas con cambios de

abundancia más significativos se mapean en las rutas KEGG del ciclo celular.
Esto insinuó que el DDW Agua Disminuida en Deuterio puede actuar deteniendo
o prolongando las fases S y G2 tardías en las células A549.

El DDW Agua Disminuida en Deuterio influye en el equilibrio reducción - oxidación

celular.

El estrés oxidativo puede inducir una interrupción severa de las vías de

señalización y afectar la supervivencia, proliferación, invasión, angiogénesis,
apoptosis y otros procesos celulares vitales de las células cancerosas (49, 50).
Varios estudios encontraron que el estrés oxidativo es un factor de riesgo para
desarrollar diferentes tipos de cáncer (51).

El estrés oxidativo también se considera a menudo como una de las

características del cáncer. Sin embargo, el estrés oxidativo mejorado también
es un lugar explorado por algunos agentes anticancerígenos modernos, incluida
la auranofina (52, 53).

Para probar la hipótesis de que el estrés oxidativo está involucrado en la acción

del DDW Agua Disminuida en Deuterio, medimos el efecto reducción -
oxidación del DDW Agua Disminuida en Deuterio en las proteínas celulares
A549. La proteómica reducción - oxidación es un tipo de análisis especial que
típicamente implica la cuantificación de modificaciones de cisteína tiol libres,
como la formación de disulfuro, así como una gran cantidad de otras
modificaciones, por ejemplo, nitrosilación S, sulfhidratación, etc. (54-56).

El flujo de trabajo de la proteómica reducción - oxidación se muestra en la

figura número 3A. El auranofin fue seleccionado como un fármaco de control
positivo, y se determinó su IC30 en A549 células (complementaria. Figura S3).
Dado que la proteómica reducción - oxidación se dirige solo a los péptidos que
contienen C y s, generalmente produce menos identificaciones de proteínas que
el análisis proteómico de expresión convencional.

Aquí, se identificaron 2935 proteínas que contienen tiol en total (tabla

complementaria S9-10). Solo las proteínas con relaciones de oxidación
cuantificadas en las tres réplicas de todas las muestras se consideraron para
su posterior análisis; Esto dio como resultado una lista más corta con 609
proteínas (la figura número 3B).

Sorprendentemente, observamos que el DDW Agua Disminuida en Deuterio

aumentó el nivel de oxidación general incluso más que la auranofina (la figura
número 3C). Los porcentajes de oxidación determinados en las muestras de
control fueron algo más altos de lo que se informó en otros estudios (57). Esto
podría deberse a la oxidación in vitro durante la preparación de la muestra. Sin
embargo, este fenómeno no debería haber afectado las conclusiones de
nuestro estudio, ya que se extrajeron en función de los cambios relativos en los
niveles de oxidación.

En el OPLS-DA mostró una buena agrupación de los datos por tratamientos (la
figura número 3D). Como en el caso de FITExP, comparamos las muestras del
DDW Agua Disminuida en Deuterio con el tratamiento con auranofina agrupadas
en un grupo con control. Las 20 proteínas más oxidadas y reducidas (la figura
número 3E, Tabla suplementaria S11) se seleccionaron de acuerdo con el “valor
predictivo VIP” en OPLS-DA para su posterior análisis. La p62 fue una de las
proteínas más oxidadas; su nivel de oxidación promedio con el DDW Agua
Disminuida en Deuterio fue del 34% en comparación con el 18% para el control
(p <0.005). En OPLS-DA (Figura complementaria 2b, Tabla suplementaria
S14), el péptido p62 [119-139] NMVHPNVICDGCNGPVVGTR fue el péptido más
oxidado (Tabla suplementaria S12), con un 49% de oxidación promedio en el
DDW Agua Disminuida en Deuterio en comparación con un 27% de oxidación
para el agua de control.

También se encontró que otros dos péptidos p62, [23-46]

FSFCCSPEPEAEAEAAAGPGPCER y [151-166] CSVCPDYDLCSVCEGK estaban
oxidados (p <0.005, la figura número 3F, Tabla suplementaria S12). Los
péptidos [119-139] y [151-166] se encuentran en el dominio del dedo de zinc
de p62 que confiere a esta proteína la capacidad de acoplarse con proteínas
interactuantes clave (58).

Como suele ser el caso, mientras que la mayoría de las proteínas aumentaron
su nivel oxidativo, algunas proteínas lo han disminuido (la figura número 3B,
Tabla suplementaria S13). El efecto del DDW Agua Disminuida en Deuterio
sobre la estabilidad térmica del proteoma. Dado que la creación o reducción
de enlaces disulfuro afecta la estabilidad térmica de las proteínas, aplicamos
perfiles de proteoma térmico (25, 31) para evaluar el efecto del DDW Agua
Disminuida en Deuterio.

En resumen, las células cultivadas en medio del DDW Agua Disminuida en

Deuterio y en agua NW se incubaron durante 3 minutos a 10 puntos de
temperatura que oscilaban entre 37 y 67° C y las proteínas que permanecían
solubles se cuantificaron por nanoLC -MS / MS. Para cada proteína, la
temperatura de fusión (Tm) se calculó mediante el ajuste de la curva sigmoidea,
y se determinó el desplazamiento ΔTm debido al DDW Agua Disminuida en
Deuterio.

En total, los valores de ΔTm se obtuvieron en 3768 proteínas (Tabla

suplementaria S15 y S16), de los cuales 234 cambios alcanzaron significación
estadística de p <0.05 (la figura número 4A).

La curva de fusión de p62 se muestra en la figura número 4B. El tratamiento

con el DDW Agua Disminuida en Deuterio aumentó su estabilidad térmica en
ΔTm = 0.7 ° C, de acuerdo con una mejor formación de enlaces disulfuro
revelada en esta proteína por la proteómica reducción - oxidación.

El Resumen de resultados de proteómica.

La visión general de FITExP, la proteómica reducción - oxidación y los

resultados de TPP se dan en la Tabla 2. Las proteínas reguladas hacia arriba y
hacia abajo en FITExP se analizaron por STRING por separado (Tabla
suplementaria S17 y S18). Se descubrió que 24 proteínas reguladas
negativamente estaban relacionadas con la actividad oxidorreductasa (función
molecular) y el metabolismo del glutatión (vías KEGG).

Entre estas moléculas, 6 proteínas se encuentran en las mitocondrias (la figura

número 5A), donde juegan un papel importante en la producción de ROS por el
ETC.

La ALDH4A1 es una deshidrogenasa dependiente de NAD de la matriz

mitocondrial que cataliza el segundo paso de la vía de degradación de la
prolina, convirtiendo pirrolina-5-carboxilato en glutamato (59). El FDXR inicia el
transporte de electrones para los citocromos P450 que reciben electrones de
NADPH (60). La localización casi exclusiva de H6PD en membranas
microsomales también sugiere su participación en ETC microsomales (61).
DHFR es un miembro de la familia de enzimas reductasa que se expresa de
manera ubicua en todos los organismos.

Cataliza la regeneración de tetrahidrofolato mediante la reducción de

dihidrofolato utilizando NADPH como cofactor (62). El GPX4 es miembro de la
familia del glutatión peroxidasa y desempeña un papel clave en la protección
de las células del daño oxidativo al prevenir la peroxidación de lípidos de
membrana (63, 64). Se cree que GPX2, otro glutatión peroxidasa, juega un
papel importante en la protección de los mamíferos de la toxicidad de los
hidroperóxidos orgánicos ingeridos (65).

Validación del mecanismo.

Para probar la hipótesis del desequilibrio reducción - oxidación, se empleó el

indicador fluorescente DCF-DA para medir la producción de sustancias
reactivas al oxígeno ROS en las células que crecen en diferentes condiciones.
La auranofina, que provoca una fuerte citotoxicidad en las células tumorales a
través de la sobreproducción de sustancias reactivas al oxígeno ROS, se utilizó
como fármaco de control. La producción de ROS en las células cultivadas en el
DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón durante 48 horas
fue elevada en comparación con las cultivadas en NW, como se esperaba (la
figura número 5F).

Además, la aplicación de auranofina a 80 partículas por millón de células

cultivadas con el DDW Agua Disminuida en Deuterio aumentó el nivel de las
sustancias reactivas al oxígeno ROS muy significativamente en comparación
con las células tratadas con auranofina o en las células cultivadas en el DDW
Agua Disminuida en Deuterio 80 partículas por millón (la figura número 5E).
En el DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas por millón, los niveles
de sustancias reactivas al oxígeno ROS celular aumentaron en comparación con
en agua NW ya después de 2 horas de crecimiento, tal como lo hizo en el
tratamiento con auronafin, mientras que en las células cultivadas en el DDW
Agua Disminuida en Deuterio estos niveles no cambiaron significativamente (la
figura número 5F).

En adición, hemos intentado contrarrestar el efecto tóxico del DDW Agua

Disminuida en Deuterio por adición simultánea de NAC, un agente antioxidante
tiol reductor.

Tanto para los tratamientos con el DDW Agua Disminuida en Deuterio como con
auranofina, la proliferación celular suprimida se restableció en gran medida a
las concentraciones de NAC más altas (la figura número 5G, la figura número
S4A suplementaria). Este resultado respalda la noción de que el DDW Agua
Disminuida en Deuterio conduce a la sobreproducción de sustancias reactivas al
oxígeno ROS celulares, de manera similar a la auranofina.

En el crecimiento simultáneo en el DDW Agua Disminuida en Deuterio y la

aplicación de auranofina, la mayor supresión sinérgica del crecimiento celular
(-30% en comparación con auranofina solamente) ocurrió a una concentración
de auranofina relativamente baja, correspondiente a ≈0.5 IC50 para auranofina
(la figura número 5H, la figura número S4B suplementaria) Por lo tanto, El Agua
Disminuida en Deuterio puede ser útil como adyuvante para el tratamiento
anticanceroso convencional.

La ingesta simultánea del DDW Agua Disminuida en Deuterio puede incluso

permitir reducir la concentración de quimioterapéuticos administrados a los
pacientes y, por lo tanto, reducir la carga de toxicidad general y los efectos
secundarios concomitantes.

DISCUSIÓN

Mecanismo propuesto.

Con base en los resultados anteriores, planteamos la hipótesis de que el DDW

Agua Disminuida en Deuterio afecta el potencial de membrana mitocondrial y,
por lo tanto, crea un desequilibrio entre la oxidación y la reducción celular. Esto
también es consistente con lo que se ha informado en varios estudios (9, 18,
19).

En condiciones normales, la concentración de deuterio en el agua de la matriz

mitocondrial es menor que en el agua del espacio intermembrana, creando un
gradiente positivo de deuterio a través de la membrana interna (la figura número
5B). Esto se debe al origen principalmente metabólico del agua de la matriz y
al menor contenido de deuterio natural en las principales fuentes de agua
metabólica, las grasas orgánicas (66).

Disminuir la concentración de deuterio en el agua ambiental revierte el gradiente

de deuterio a través de la membrana interna (la figura número 5C). Esto
desencadena un mecanismo aún desconocido que aumenta la exportación de
protones de la matriz al espacio intermembrana y, por lo tanto, aumenta el
potencial de membrana mitocondrial (↑ +). Tal aumento a su vez promueve la
producción de sustancias reactivas al oxígeno ROS a medida que la energía que
transporta los electrones pasa por ETC de NADH y FADH2 a oxígeno, el receptor
de electrones final.

Los resultados del estrés oxidativo mitocondrial y celular, que es parcialmente

contrarrestado por mecanismos antioxidantes enzimáticos intrínsecos, como
los que involucran superóxido dismutasas 1 y 2 o catalasas, pero con un
crecimiento más lento y eventual apoptosis de algunas células como resultado
neto.

Sin embargo, una mayor disminución de la concentración de deuterio (DDW

Agua Disminuida en Deuterio, 17 partículas por millón) en el agua ambiental
causa un aumento demasiado grande en la producción de sustancias reactivas
al oxígeno ROS para ser controlado por mecanismos antioxidantes enzimáticos
intrínsecos.

Anteriormente (67), se ha sugerido un mecanismo antioxidante adicional, en el

que una activación por superóxido (O2 • -) de los UCP combate la producción
mejorada de sustancias reactivas al oxígeno ROS. En un modelo de
retroalimentación similar (la figura número 5D), los UCP activados en la
membrana mitocondrial interna abren una mayor entrada de protones en la
matriz, con una reducción concomitante en el potencial de la membrana
mitocondrial (↓ +), lo que conduce a una producción de O2 • disminuida y
cercana restauración del equilibrio reducción - oxidación mitocondrial y celular.

Este mecanismo hipotético explica tanto la supresión de la proliferación celular

por el agotamiento de deuterio medio (80-100 partículas por millón en deuterio)
como la restauración del crecimiento normal en los agotamientos de deuterio
extremos (<20 partículas por millón).

Conclusiones

Nuestros experimentos confirmaron el efecto del agotamiento del deuterio en el

crecimiento de las células cancerosas. El aspecto novedoso es el mecanismo
molecular sugerido que apoya el efecto anticancerígeno de DDW Agua
Disminuida en Deuterio. Nuestros resultados indican que el DDW Agua
Disminuida en Deuterio inhibe la proliferación celular principalmente al causar
un desequilibrio entre la producción de sustancias reactivas al oxígeno ROS y la
neutralización en las mitocondrias, y así inducir el estrés oxidativo en las células.

El DDW Agua Disminuida en Deuterio también modula la expresión de las

proteínas involucradas en los procesos de toda la célula como el ciclo celular,
la actividad oxidorreductasa, la vía de señalización de p53, el metabolismo del
glutación, etc.

El modelo propuesto que explica el grueso de las observaciones sugiere que,

cuando la concentración de deuterio en los medios se vuelve más bajo que dentro
de las mitocondrias, el potencial de membrana mitocondrial aumenta, lo que
mejora la producción de sustancias reactivas al oxígeno ROS y conduce a la
supresión del crecimiento celular.

Sin embargo, cuando la concentración del DDW Agua Disminuida en Deuterio

se vuelve aún más baja, se activa el circuito de retroalimentación y se restablece
el equilibrio de sustancias reactivas al oxígeno ROS. La escala de tiempo de la
acción del DDW Agua Disminuida en Deuterio también insinuó que el DDW Agua
Disminuida en Deuterio puede detener o prolongar la fase S y G2 tardía en las
células A549; sin embargo, probar esta hipótesis experimentalmente estaba
fuera del alcance del estudio actual.

En resumen, el DDW Agua Disminuida en Deuterio parece tener potencial en la

terapia antitumoral, especialmente en las modalidades que inducen el estrés
oxidativo en las células cancerosas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por la Fundación KAW (subvención 2015.0063).

DISPONIBILIDAD DE DATOS

Los archivos de Excel que contienen los datos analizados se proporcionan en

Materiales complementarios. Los datos de proteómica de espectrometría de
masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange
(http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio
asociado PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD011085.

Referencias

1. Szent-Györgyi, A. (1979), El estado vivo y el cáncer. Biología sub-molecular

y cáncer, 3-18.
2. Gat, J. R. Gonfiantini, R. Hidrología isotópica estable. Deuterio y oxígeno-18
en el ciclo del agua. (Wiley, 1981).

3. Altman, LJ, Laungani, P., Gunnarsson, G., Wennerstrom, H.Forsen , S.

(1978), resonancia magnética nuclear de protón, deuterio y tritio de enlaces de
hidrógeno intramoleculares. Efectos isotópicos y la forma de la función de
energía potencial. Mermel. Chem Soc. 100, 8264-8266.

4. Westheimer, F. (1961), La magnitud del efecto del isótopo cinético primario

para compuestos de hidrógeno y deuterio. Chem Rev. 61, 265-273.

5. Krasnopolsky, VA, Mumma, M. J. Gladstone, GR (1998), Detección de

deuterio atómico en la atmósfera superior de Marte. Science 280, 1576-1580.

6. Alekseev, I., Fedorchenko, O., Kravtsov, P., Vasilyev, A.Vznuzdaev , M.

(2008), Resultados experimentales de la destilación de hidrógeno en la columna
criogénica de baja potencia para la producción de hidrógeno empobrecido en
deuterio. Fusion Sci. Technol. 54, 407-410.

7. Somlyai, G., Jancsó, G., Jákli, G., Vass, K., Barna, B., Lakics, V.Gaál, T.
(1993), el deuterio natural es esencial para la tasa de crecimiento normal de
células. FEBS Lett. 317, 1-4.

8. Somlyai, G., Laskay, G., Berkényi, T., Jákli, G. Jancsó, G. (1998), el deuterio
natural puede tener un papel central en la señalización celular. Síntesis y
aplicaciones de compuestos marcados isotópicamente. Nueva York: John Wiley
and Sons Ltd, 137-141.

9. Pomytkin, I., Kolesova, E. (2006), Relación entre la concentración natural de

isotopólogos de agua pesada y la tasa de generación de H2O2 por las
mitocondrias. Boletín de biología experimental y medicina. 142, 570-572.

10. Krempels, K., Somlyai, I. Somlyai, G. (2008), una evaluación retrospectiva

de los efectos del consumo de agua agotada de deuterio en 4 pacientes con
metástasis cerebrales de cáncer de pulmón. Integr. Cancer Ther. 7, 172-181.

11. Cong, FS, Zhang, YR, Sheng, HC, Ao, ZH, Zhang, S. Y. Wang, JY (2010),
el agua disminuida con deuterio inhibe el crecimiento de células de carcinoma
de pulmón humano por apoptosis. Exp. Ther. Medicina. 1, 277-283.

12. Kovács, A., Guller, I., Krempels, K., Somlyai, I., Jánosi, I., Gyomgyi, Z.,
Szabó, I.Ember, I. (2011), el agotamiento del deuterio puede retrasar la
progresión del cáncer de próstata J. Cancer Ther . 2, 548.

13. Gyöngyi, Z., Budán, F., Szabó, I., Ember, I., Kiss, I., Krempels, K.,
Somlyai, I.Somlyai, G. (2013), Deuterio agotó los efectos del agua sobre la
supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón y expresión de genes Kras ,
Bcl2 y Myc en pulmón de ratón. Nutr. Cáncer 65, 240-246.

14. Krempels, K., Somlyai, I., Gyöngyi, Z., Ember, I., Balog, K., Abonyi,
O.Somlyai , G. (2013), un estudio retrospectivo de supervivencia en pacientes
con cáncer de mama sometidos a deuterio. agotamiento además de las
terapias convencionales. J. Cancer Res. Ther. 1, 194-200.

15. Wang, H., Zhu, B., He, Z., Fu, H., Dai, Z., Huang, G., Li, B., Qin, D.,
Zhang, X., Tian, L., Fang, W.Yang , H. (2013), el agua disminuida con deuterio
(DDW Agua Disminuida en Deuterio) inhibe la proliferación y migración de
células de carcinoma nasofaríngeo in vitro. Biomed. Pharmacother. 67, 489-
496.

16. Soleyman-Jahi, S., Zendehdel , K., Akbarzadeh , K., Haddadi, M.,

Amanpour , S. Muhammadnejad , S. (2014), Evaluación in vitro de los efectos
antineoplásicos del DDW Agua Disminuida en Deuterio. Asian Pac. J. Cáncer
Prev. 15, 2179-2183.

17. Antipova, N.Syroeshkin, A. (2017), el efecto de deuterio agota agua sobre

la apoptosis y la tasa de crecimiento de las células cancerosas. FEBS J. 284,
288-288.

18. Dzhimak, S., Basov, A., Volchenko, N., Samkov, A., Fedulova, L.,
Baryshev, M. (2017), Cambios en la actividad funcional de las mitocondrias
aisladas del hígado de la rata que pasó La pre-adaptación a una concentración
de deuterio ultra-baja. Doklady Biochemistry and Biofysics 476, 323-325.

19. Basov, A., Elkina, A. Samkov, A., Volchenko, N., Moiseev, A., Fedulova,
L., Baryshev, M., Dzhimak, S. (2019), Influencia del DDW Agua Disminuida en
Deuterio en la composición de isótopos D / H del tejido hepático y Desarrollo
morfológico de ratas en diferentes períodos de onogénesis. Iranian Biomedical
Journal 23, 129-141.

20. Somlyai, G., Javaheri, B., Davari, H., Gyöngyi, Z., Somlyai, I., Tamaddon,
K. A.Boros, LG (2016), los datos preclínicos y clínicos confirman el efecto
anticancerígeno del agotamiento del deuterio. Biomacromolecular Journal 2, 1-
7.

21. Merbach, AS La química de los agentes de contraste en la resonancia

magnética médica. (John Wiley & Sons, 2013).
22. Katz, JJ (1971), Efectos de isótopos en sistemas biológicos. Efectos
isotópicos en reacciones químicas, 286-363.

23. Collins, C. J. Bowman, NS (1970), Efectos de isótopos en reacciones

químicas.

24. Xie, X. Zubarev, RA (2014), Efectos del enriquecimiento de deuterio de bajo

nivel en el crecimiento bacteriano. PLoS One 9, e102071.

25. Savitski, MM, Reinhard, FB, Franken, H., Werner, T., Savitski, MF, Eberhard,
D., Molina, DM, Jafari, R., Dovega, R. B.Klaeger, S. (2014), Seguimiento de
medicamentos contra el cáncer en células vivas mediante el perfil térmico del
proteoma. Science 346, 1255784.

26. Chernobrovkin, A., Marin-Vicente, C., Visa, N.Zubarev, RA (2015), la

identificación funcional de la diana por la proteómica de expresión ( FITExP )
revela dianas proteicas y destaca los mecanismos de acción de los fármacos
de moléculas pequeñas. Sci. Rep. 5, 11176.

27. Gaetani, M.Zubarev, RA (2017), Nuevas promesas de la proteómica química

para el desarrollo de fármacos. Nov Appro Drug Des Dev. 2, 1-3.

28. Chernobrovkin, A. L.Zubarev, RA (2016), ¿Qué tan bien puede la morfología

evaluar la modalidad de muerte celular? Un estudio de proteómica. Cell Death
Discov. 2, 16068.

29. Tarasova, NK, Gallud, A., Ytterberg, AJ, Chernobrovkin, A., Aranzaes, JR,
Astruc, D., Antipov, A., Fedutik, Y., Fadeel, B.Zubarev, RA (2017), Efectos
citotóxicos y proinflamatorios de nanopartículas a base de metales sobre
monocitos THP-1 caracterizados por enfoques de proteómica combinada . J.
Proteoma Res. 16, 689-697.

30. Lee, RF, Chernobrovkin, A., Rutishauser, D., Allardyce, CS, Hacker, D.,
Johnsson, K., Zubarev, R. A. Dyson, PJ (2017), Estudio de proteómica de
expresión para determinar objetivos de metalodrug y combinaciones óptimas de
drogas. Sci. Rep. 7, 1590.

31. Franken, H., Mathieson, T., Childs, D., Sweetman, GM, Werner, T., Tögel,
I., Doce, C., Gade, S., Bantscheff, M.Drewes, G. ( 2015), perfil de proteoma
térmico para la identificación imparcial de objetivos farmacológicos directos e
indirectos mediante espectrometría de masas cuantitativa multiplexada. Nat.
Protocol. 10, 1567.

32. Bykov, VJ, Eriksson, SE, Bianchi, J.Wiman , KG (2018), Targeting mutante
p53 para una terapia eficaz contra el cáncer. Nat. Rev. Cancer 18, 89.
33. Stegh, AH (2012), Apuntando a la vía de señalización de p53 en la terapia
contra el cáncer: las promesas, los desafíos y los peligros. Experto Opin. Ther.
Metas 16, 67-83.

34. Engeland, K. (2018), detención del ciclo celular a través de la represión

transcripcional indirecta por p53: Tengo un SUEÑO. La muerte celular difiere.
25, 114.

35. Kaiser, A. M. Attardi, LD (2018), Deconstruyendo redes de supresión

tumoral mediada por p53 in vivo. La muerte celular difiere. 25, 93.

36. Morrison, R.Kinoshita, Y. (2000), El papel de p53 en la muerte celular

neuronal. La muerte celular difiere. 7, 868.

37. Chipuk, J. Green, D. (2006), Disección de la apoptosis dependiente de p53.

La muerte celular difiere. 13, 994.

38. Vousden, K. H. Ryan, KM (2009), p53 y metabolismo. Nat. Rev. Cancer 9,

691-700.

39. Bieging, KT, Mello, S. S. Attardi, LD (2014), Desentrañando mecanismos

de supresión tumoral mediada por p53. Nat. Rev. Cancer 14, 359.

40. Sengupta, S.Harris, CC (2005), p53: policía de tráfico en la encrucijada de

reparación y recombinación de ADN . Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 44.

41. Ghahremani, MF, Goossens, S., Nittner, D., Bisteau, X., Bartunkova, S.,
Zwolinska, A., Hulpiau, P., Haigh, K., Haenebalcke, L.Drogat , B. ( 2013), p53
promueve la expresión de VEGF y la angiogénesis en ausencia de una vía p21-
Rb intacta. La muerte celular difiere. 20, 888.

42. Gyongyi, Z.Somlyai, G. (2000), deuterio agotamiento puede disminuir la

expresión de c- myc , Ha- ras y el gen p53 en ratones tratados con
carcinógenos. En Vivo 14, 437-440.

43. Deneke, S. M.Fanburg, BL (1989), Reglamento de glutatión celular. A.m.

J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol 257, L163-L173.

44. Armstrong, J., Steinauer, K., Hornung, B., irlandés, J., Lecane, P., Birrell,
G., Peehl, D.Knox, S. (2002), Papel del agotamiento del glutatión y reactivo
generación de especies de oxígeno en señalización apoptótica en una línea
celular de linfoma B humano. La muerte celular difiere. 9, 252.

45. Buttke, T. M.Sandstrom , PA (1994), El estrés oxidativo como mediador de

la apoptosis. Immunol Hoy 15, 7-10.
46. Tsurusawa, M., Niwa, M., Katano, N. Fujimoto, T. (1990), citotoxicidad por
metotrexato en relación con la detención irreversible de la fase S en células de
leucemia L1210 de ratón. Cancer Sci. 81, 85-90.

47. Goncharova, S. Frankfurt, O. (1976), Efecto del metotrexato en el ciclo

celular de la leucemia L1210. Cell Prolif. 9, 333-340.

48. Savage, J. R.Prasad, R. (1988), Bloqueo generalizado en fase S por

metotrexato. Mutat. Res.- Fundam . Mol. Mech Mutag. 201, 195-201.

49. Reuter, S., Gupta, SC, Chaturvedi, M. M. Aggarwal, BB (2010), Estrés

oxidativo, inflamación y cáncer: ¿cómo se relacionan? Radic Libre. Biol.
Medicina. 49, 1603-1616.

50. Zhou, D., Shao, L. Spitz, DR (2014), especies reactivas de oxígeno en

células madre normales y tumorales. Avances en la investigación del cáncer
122, 1-67.

51. Block, G., Dietrich, M., Norkus, EP, Morrow, JD, Hudes, M., Caan, B.Packer
, L. (2002), Factores asociados con el estrés oxidativo en las poblaciones
humanas. A.m. J. Epidemiol. 156, 274-285.

52. Usted, B. R. Park, WH (2016), Auranofin induce la muerte celular del

mesotelioma a través del estrés oxidativo y el agotamiento de GSH. Oncol Rep.
35, 546-551.

53. Wang, H., Bouzakoura, S., De Mey, S., Jiang, H., Law, K., Dufait, I.,
Corbet, C., Verovski, V., Gevaert, T. Feron, O. (2017), Auranofin radiosensibiliza
las células tumorales a través de la tiorreducción - oxidaciónina reductasa y la
sobreproducción resultante de especies reactivas de oxígeno. Oncotarget 8,
35728.

54. Leichert, LI, Gehrke, F., Gudiseva, HV, Blackwell, T., Ilbert, M., Walker, AK,
Strahler, JR, Andrews, P. C.Jakob , U. (2008), Cuantificación de cambios en el
proteoma tiol reducción - oxidación sobre el estrés oxidativo in vivo. Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos 105, 8197-8202.

55. Araki, K., Kusano, H., Sasaki, N., Tanaka, R., Hatta, T., Fukui, K. Natsume,
T. (2016), Sensibilidades reducción - oxidación de los residuos de cisteína
celular global bajo efecto reductor y oxidativo estrés. J. Proteoma Res. 15,
2548-2559.

56. Topf, U., Suppanz, I., Samluk, L., Wrobel, L., Böser, A., Sakowska, P.,
Knapp, B., Pietrzyk, MK, Chacinska, A.Warscheid, B. ( 2018), la proteómica
cuantitativa identifica interruptores reducción - oxidación para la modulación de
la traducción global por especies reactivas de oxígeno producidas
mitocondrialmente. Nat. Commun. 9, 324.

57. Knoefler, D., Thamsen, M., Koniczek, M., Niemuth, NJ, Diederich, AK,
Jakob, U. (2012), Los sensores reducción - oxidación cuantitativos in vivo
descubren el estrés oxidativo como un evento temprano en la vida. Mol. Célula.
47, 767-776.

58. Lin, X., Li, S., Zhao, Y., Ma, X., Zhang, K., He, X.Wang, Z. (2013),
Dominios de interacción de p62: un puente entre p62 y selectivo autofagia DNA
Cell Biol. 32, 220-227.

59. Srivastava, D., Singh, RK, Moxley, MA, Henzl, MT, Becker, D. F. Tanner, JJ
(2012), La base estructural tridimensional de la hiperprolinemia tipo II. J. Mol.
Biol. 420, 176-189.

60. Hanukoglu, I. Jefcoate, CR (1980), citocromo mitocondrial P-450sec.

Mecanismo de transporte de electrones por adrenodoxina. J. Biol. Chem 255,
3057-3061.

61. Yoshida, A. Beutler, E. Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. (Elsevier,

2012).

62. Cody, V., Luft, JR, Pangborn, W., Gangjee, A.Queener, SF (2004),
Determinación de la estructura de los antifolatos de tetrahidroquinazolina en
complejo con humanos y Pneumocystis carinii dihidrofolato reductasa:
correlaciones entre la selectividad enzimática y la estereoquímica. Acta
Crystallogr. Secta. D. Biol. Crystallogr. 60, 646-655.

63. Yang, WS, SriRamaratnam, R., Welsch, ME, Shimada, K., Skouta , R.,
Viswanathan, VS, Cheah, JH, Clemons, PA, Shamji , A. F.Clish , CB (2014), La
regulación de ferroptotic de células de cáncer la muerte por GPX4. Celda 156,
317-331.

64. Cole- Ezea, P., Swan, D., Shanley, D.Hesketh , J. (2012), la glutatión
peroxidasa 4 tiene un papel importante en la protección de las mitocondrias del
daño oxidativo y en el mantenimiento de los complejos de fosforilación oxidativa
en las células epiteliales intestinales. Radic Libre. Biol. Medicina. 53, 488-497.

65. Kelner, MJ, Bagnell, RD, Montoya, M. A. Lanham, KA (2000), Organización

estructural del promotor del glutatión peroxidasa gastrointestinal humana
(GPX2) y región 3 'no transcrita: respuesta transcripcional a agentes reducción
- oxidación exógenos. Gene 248, 109-116.
66. Boros, LG, D'Agostino, DP, Katz, HE, Roth, JP, Meuillet, E. J.Somlyai , G.
(2016), Regulación sub-molecular de la transformación celular mediante
reacciones de intercambio de agua que agotan el deuterio en el sustrato de
ácido tricarboxílico ciclo. Medicina. Hipótesis 87, 69-74.

67. Andrews, ZB, Diano S.Horvath, TL (2005), proteínas de desacoplamiento

mitocondrial en el SNC: en apoyo de la función y la supervivencia. Nat. Rev.
Neurosci. 6, 829–840.

Tabla 1. Resumen de referencias bibliográficas relacionadas con el efecto

anticancerígeno de DDW Agua Disminuida en Deuterio.
Rago en
partículas
por millon Efectos de la concentración
Tejido o línea Grupo de
Organismo tipo de cáncer de máxima de Deuterium
celular control
Deuterium Depleted Water
Depleted
Water
20% de decrecimiento en
cédulas con un contenido en 30
fibroplastos partículas por millón 25% de
1929 30-600
normales incremento en cédulas con un
contenido de 600 partículas por
ratones millón
7
humanos 83% de incremento en la
MDA-MB-231 supervivecia de ratones
xenotransplantados
de seno 30
43% de incremento en la
MCF7 supervivencia de ratones
xenotransplantados

15% de decrecimiento en el
PC-3 próstata conteo de células 10% de
90 decrecimiento en el conteo de
células 16% de decrecimiento
MCF 7 seno en el conteo de células
Humanos M 14 melanoma
5% de decrecimiento en el
90-95
volumen del tumor
PC3 próstata 2 veces mayor en apostosis de 8
98 célulad xenotransplantadas en
ratones
42% en decrecimiento en el
A4
tallo conteo de células
Ratones 90
hematopoyético 20% de decrecimiento en el
IL-3-privado A4
conteo de células
675 de disminución del
Perros tejidos seno 90-95
volumen del tumor
 67% de incremento de
Ratones tejidos hígado 52 generación en la mitocondria 9
de H2O2
notable incremento de
Humanos tejidos pulmones 20-105* supervivencia de 4 pacientes 10
con cáncer de pulmón
31% de decrecimiento en el
A549 pulmones conteo de células sobre 105
partículas por millón
30% de decrecimiento en el
crecimiento del tumor
H460 pulmones xenotransplantado en el
Humanos 25-150 11
modelo en ratones en 50
partículas por millón
fibroplastos
embrionicos
HLF-1 no hay efectos significativos
pulmonares
normales
50% en decrecimiento en el
antigen específico (PSA) en la
pr´stata; 59% de decrecimiento
Humanos tejidos próstata 85* 12
en el volumen del tumor; 33%
de incremento de la
supervivencia en pacientes
11% en la supervivencia de los
Humanos tejidos pulmones 25-105*
pacientes
incremento significativo (p < 13
Ratones tejidos pulmones 25 0.05) en la expresión de Kras,
BCl2, Myc
Tiempo de supervivencia medio
(MST) 2-3 veces más largo en
comparación con solo la terapia
convencional; MST 3 veces más
Humanos tejidos seno 65-105* 14
largo de pacientes que tomaron
DDW más de una vez que
aquellos que lo tomaron solo
una vez
40% de decrecimiento en el
CNE-1 nasofaríngeal conteo de células sobre 50
partículas por millón
Humanos 50-150 15
73% de incremento en el
pleoteoblastos
MC3T3-E1 conteo de células sobre 75
normales
partículas por millón

MDA-MB-231 seno

HCT-116 colon
PC-3 próstata
no hubo efectos ya sea con
Humanos gliobastoma 40-50 16
U-87MG tumores o con células normales
multiforme
AGS estómago
fibroplastos
HDF-1
dérmico normal
 A549 pulmones <10% de efectos no
Humanos ZR-75-1 seno <150** significantes en apoptosis de las 17
HT-29 colon células
35% de incremento en la
Ratones tejidos hígado 46 generación de peróxido de 18
hidrógeno en la mitocondria
18% de disminución del peso
en ratas; 15% de incremento en
asparate amino transferasa;
Ratones tejidos hígado 46 43% de incremento en (AST) 19
alamine amino-transferasa en
la generación de peróxido de
hidrógeno en la mitocondria
* en adición con terapias convencionales; ** los autores no mencionan el rando de concentración del
Agua Disminuida en Deuterio DDW
Figuras representativas
Figura. 1. El diseño de la caracterización basada en proteómica del mecanismo
anticancerígeno del DDW Agua Disminuida en Deuterio.

A, se preparó DDW Agua Disminuida en Deuterio con una concentración variable

de deuterio mezclando con agua normal NO (150 partículas por millón en
deuterio) y 25 partículas por millón de DDW Agua Disminuida en Deuterio en
diferentes proporciones. Se cultivaron células MCF 7, A549 y HT29 en un medio
de DDW Agua Disminuida en Deuterio.

B, la medición de las respuestas de las líneas celulares al DDW Agua Disminuida

en Deuterio.

C, La determinación de las concentraciones de los fármacos de control que

inhiben el crecimiento celular en un 30 ± 5% (IC30).

D, La identificación por análisis FITExP de las proteínas más reguladas por el

DDW Agua Disminuida en Deuterio en comparación con las drogas de control y
NW.

E, La medición por proteómica reducción - oxidación del desequilibrio de

oxidación-reducción causada por el DDW Agua Disminuida en Deuterio en
comparación con el control NW y auranofina.

F, La medición por TPP de los cambios de estabilidad del proteoma causados

por el DDW Agua Disminuida en Deuterio.

G, El resumen de los resultados de la proteómica revela que proteínas

probablemente están involucradas en la acción del DDW Agua Disminuida en
Deuterio. Para proponer un mecanismo de acción del DDW Agua Disminuida en
Deuterio

(H) y su validación mediante experimentos adicionales (I).

Figura número 2. Determinación de la línea celular más sensible al DDW Agua

Disminuida en Deuterio y análisis FITExP a la concentración de deuterio de
máxima supresión.

A, supervivencia de líneas celulares MCF7, A549 y HT29 cultivadas en medios

con diferentes concentraciones de deuterio.

B, curvas de inhibición de CAMP, PCTL y MTX, y determinación de IC30.

C, OPLS-DA de abundancias proteicas para diferentes tratamientos en IC30.

D, Cargando gráfico de dispersión de OPLS-DA revela la parte superior 50

proteínas UP- regulados (puntos rojos) y las proteínas de la parte superior 50
hacia abajo regulada (puntos azules) específico para los tratamientos con el
DDW Agua Disminuida en Deuterio.

(E, F) Mapa de calor de las 50 proteínas específicamente reguladas hacia arriba

(E) y reguladas hacia abajo

(F) en el tratamiento con el DDW Agua Disminuida en Deuterio. A y B muestran

la media ± SEM de cuatro experimentos independientes, medición única, ***
- p <0.005 en ANOVA de dos vías con prueba t post hoc.

Figura 3. Análisis de proteómica reducción - oxidación del efecto del DDW Agua
Disminuida en Deuterio.

A, flujo de trabajo de proteómica Reducción - oxidación.

B, diagrama del volcán para células tratadas con DDW Agua Disminuida en
Deuterio en comparación con NW. Las líneas indican diferencias de 2 en las
relaciones medias y el valor de p de 0,05 en la prueba t no pareada de dos
colas.

C, niveles de oxidación promedio de células cultivadas en NW, auranofin y el

DDW Agua Disminuida en Deuterio.

D, OPLS-DA de datos de proteómica reducción - oxidación.

E, mapa de calor de las 20 proteínas más oxidadas (arriba) y reducidas (abajo)

en células cultivadas en el DDW Agua Disminuida en Deuterio.

F, Los niveles de oxidación de los péptidos p62 en el DDW Agua Disminuida en

Deuterio vs control NW.

B muestra la media de tres experimentos independientes. Las columnas en C y

F muestran la media ± SEM en tres experimentos independientes; * - p <0.05,
*** - p <0.005 en la prueba t sin emparejar de dos colas.

Figura 4. Cambios en la estabilidad térmica de las proteínas tras el tratamiento

con el DDW Agua Disminuida en Deuterio.

A, gráfico del volcán de cambios de temperatura de fusión en comparación con

el control NW. Las líneas indican una diferencia en la temperatura de fusión
promedio de ≥ 1.5 ℃ y un valor de p de 0.05 (-Log10 = 1.3) en la prueba t no
pareada de dos colas.

B, Ejemplo de temperaturas de fusión p62. A, B Basado en el promedio de dos

experimentos independientes, medición única.
Figura 5. Mecanismo propuesto de la acción del DDW Agua Disminuida en
Deuterio y su validación.

A, Red de interacción de proteínas más involucradas en el mecanismo de

acción del DDW Agua Disminuida en Deuterio según el resumen del análisis
proteómico. BD, mecanismo propuesto:

B, en condiciones normales, la concentración de deuterio en el agua de la matriz

mitocondrial es menor que en el agua del espacio intermembrana.

C, la disminución de la concentración de deuterio en el agua ambiental invierte

el gradiente de deuterio a través de la membrana interna. Para restablecer el
equilibrio Hidrógeno / Deuterio, las mitocondrias aumentan la exportación de
protones desde la matriz al espacio intermembrana, lo que provoca un aumento
en el potencial de membrana mitocondrial (↑ +).

Esto a su vez promueve la producción de sustancias reactivas al oxígeno ROS

a medida que los electrones que transportan energía son pasados por ETC de
NADH y FADH2 a oxígeno, el aceptor final de electrones.

Los resultados de estrés oxidativo mitocondrial y celular, con un crecimiento

más lento y eventual apoptosis.

D, La disminución adicional de la concentración de deuterio en el agua

ambiental causa un aumento demasiado grande en la producción de sustancias
reactivas al oxígeno ROS para ser controlado por mecanismos antioxidantes
enzimáticos intrínsecos. Se activa un mecanismo antioxidante adicional, en el
que la activación por superóxido (O2 • -) de los UCP combate la producción
mejorada de sustancias reactivas al oxígeno ROS.

En este modelo de retroalimentación, los UCP activados en la membrana

mitocondrial interna abren una mayor entrada de protones en la matriz, con una
reducción concomitante en el potencial de la membrana mitocondrial (↓ +), lo
que conduce a una disminución de la producción de O2 • - y a la restauración
cercana de las células mitocondrial y celular. equilibrio reducción - oxidación,
con daño oxidativo celular reducido.

EH, Validación del mecanismo de desequilibrio reducción - oxidación inducido

por el DDW Agua Disminuida en Deuterio.

E, el efecto combinado del DDW Agua Disminuida en Deuterio de 80 partículas

por millón con la adición de 3 µM de auranofina sobre el nivel de sustancias
reactivas al oxígeno ROS en comparación con el DDW Agua Disminuida en
Deuterio de 80 partículas por millón o 3 µM de auranofina sola.
F, El análisis del curso temporal de la producción relativa de ROS en las células
tratadas con auranofina 3 µM, cultivadas en v el DDW Agua Disminuida en
Deuterio (80 partículas por millón) en comparación con las células no tratadas
cultivadas en NW.

G, El efecto sobre el recuento celular de la adición de NAC a las células que se

trataron con el DDW Agua Disminuida en Deuterio o auranofina.

H, El efecto sobre el recuento celular de la aplicación simultánea del DDW Agua

Disminuida en Deuterio y auranofina en comparación con solo auranfina. GH
muestran la media ± SEM de nueve experimentos independientes con cuatro
repeticiones, * - p <0,05, ** - p <0,01, *** - p <0,005, **** - p <0,0001 en
dos colas dispares t- prueba.