Universidad Mayor

Facultad de Medicina
Escuela de Salud Pública

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE

Escherichia coli PRODUCTOR DE SHIGATOXINA DESDE
CARNE DE VACUNO NACIONAL E IMPORTADA,
DISTRIBUIDA EN LOS PRINCIPALES SUPERMERCADOS
DE LA PROVINCIA DE SANTIAGO

TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGÍSTER EN

SALUD PÚBLICA Y SISTEMAS DE SALUD

CAROLINA BEATRIZ BAEZA QUIROZ

Director de tesis: Dr. Roberto Vidal Álvarez

Codirectora de tesis: Dra. Verónica Solari Gallegos

Santiago, Chile
Septiembre, 2013

1
Dedicado a mi esposo Fernando, por su gran apoyo y confianza
puesta en mí y a mis adorables hijos Franco y Santiago.

2
 AGRADECIMIENTOS

Deseo manifestar mi reconocimiento público a las personas que

mencionaré, por cuanto cada una de ellas contribuyó con su conocimiento,
tiempo, buena disposición y paciencia para el buen desarrollo de esta
investigación que tiene como objetivo principal ser un aporte a la Salud Pública
de nuestro país.

Mi gratitud, en forma especial, al Director de ésta tesis, Dr. Roberto Vidal

Álvarez, Doctor en Ciencias Biológicas e investigador de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Chile, por su importante entrega de sus
conocimientos y experiencia.

De igual manera, agradecer a la Dra. Verónica Solari Gallegos, Médico

Veterinario del Subdepartamento de Epidemiología de la SEREMI de Salud
RM, por su permanente cooperación como Codirectora de ésta investigación.

También quiero agradecer a las siguientes personas que colaboraron en las

distintas etapas de la investigación para que ésta fuera posible:

A Claudio Badilla, del Subdepartamento de Alimentos de la SEREMI de

Salud RM.

A Augusto Palma, del Laboratorio de Salud Ambiental de la SEREMI de

Salud RM.

A Mirka Pardo y Paz Orellana, del Laboratorio de Enteropatógenos del

Programa de Microbiología y Micología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Chile.

A Claudia Musalem y Carolina Vidal de la Escuela de Salud Pública de la

Universidad Mayor.

Reitero mis agradecimientos a todas las personas nombradas y a aquellos

que, en forma indirecta, me animaron y ayudaron al desarrollo de esta
investigación.

3
 TABLA DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN 1
1.1. Escherichia coli diarreogénicas 1
1.2. Factores de virulencia de STEC 2
1.3. Shigatoxinas y Patogénesis 3
1.4. Manifestaciones clínicas 4
1.5. Epidemiología de STEC 5
1.6. Epidemiología de STEC en Chile 6
1.7. Reservorios y vías de Transmisión 7

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 9

OBJETIVO GENERAL 9

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 9

METODOLOGÍA 10
1. Diseño del estudio 10
1.1. Tamaño de la muestra 10
1.2. Diseño de la muestra 10
1.3. Criterios de Inclusión 10
1.4. Criterios de exclusión 11
1.5. Variables del estudio 11
2. Procedimientos 12
2.1. Procedimiento de toma de muestra 12
2.2. Identificación de la muestra 12
2.3. Transporte y envío de muestras 13
2.4. Cultivo Microbiológico 13
2.5. Detección genotípica de shigatoxina e intimina por PCR múltiple 13
2.6. Aislamiento de cepas STEC 17

4
2.7. Detección genotípica de las variantes de shigatoxina 17
2.8. Detección genotípica de Escherichia coli O157 19
2.9. Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA (ehxA), iha, lpf
y efa1 no-O157 19
2.10. Serotipificación de STEC 21
2.11. Electroforesis de campo pulsado (PFGE) 24
3. Plan de análisis de la información 25

RESULTADOS 26

DISCUSIÓN 37

CONCLUSIONES 44

RECOMENDACIONES 45

REFERENCIAS 46

LISTA DE ABREVIATURAS 56

ANEXO 1 58
ANEXO 2 59
ANEXO 3 63
ANEXO 4 64
ANEXO 5 66

5
 INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Determinación del antígeno O (Serogrupo) de STEC 23

Figura 2. Porcentaje de muestras de carne con presencia de STEC, según
país de origen 28
Figura 3. Muestras con presencia de STEC según tipo de corte 31
Figura 4. Dendrograma que muestra la relación clonal entre las diferentes
cepas STEC aisladas desde carne bovina 36

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para

shigatoxinas e intimina 15
Tabla 2. Cepas de E. coli utilizadas como controles positivos 16
Tabla 3. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para la
detección de las variantes de shigatoxinas 18
Tabla 4. Partidor y secuencia nucleotídica utilizada para la detección de
E. coli O157 19
Tabla 5. Partidores y secuencias nucleotídicas utilizadas para la detección
de genes de virulencia de STEC 20
Tabla 6. Grupo de sueros polivalentes para la identificación del antígeno
somático O de los aislados de STEC 22
Tabla 7. Distribución de las muestras de carne según procedencia 26
Tabla 8. Distribución de las muestras de carne según supermercado y
país de origen 27
Tabla 9. Presencia de STEC en carne bovina según procedencia 27

6
Tabla 10. Análisis de asociación entre la presencia de STEC en carne y el
país de origen mediante el cálculo de OR (país de referencia Chile) 29
Tabla 11. Distribución de las muestras de carne según corte 30
Tabla 12. Análisis de prueba de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow 31
Tabla 13. Detección de los genes stx1 y stx2 desde carne bovina 32
Tabla 14. Presencia de las variantes de Stx aisladas desde carne bovina 33
Tabla 15. Presencia de los factores de virulencia: hlyA, saa y iha en cepas
STEC aisladas desde carne bovina 34
Tabla 16. Determinación de los serogrupos de STEC en cepas aisladas
desde carne bovina 34

7
 RESUMEN

A nivel mundial, Escherichia coli productor de shigatoxina (STEC) es un

patógeno zoonótico emergente de importancia en salud pública, el cual ha sido
asociado a brotes de infección transmitidos por alimentos (ETA). Clínicamente
STEC puede producir cuadros de diarrea aguda, colitis hemorrágica (CH) y
Síndrome hemolítico urémico (SHU), afectando principalmente a niños menores
de 5 años. El objetivo de éste estudio fue determinar la presencia de STEC en
carnes nacionales e importadas de origen bovino (principal reservorio de STEC),
selladas al vacío y distribuidas en supermercados de Santiago. Se estudiaron 304
muestras de carne (28,6% de origen nacional y 71,4% importada), obtenidas de 32
supermercados, entre los meses de mayo a diciembre de 2012. Mediante PCR
múltiple, se realizó la búsqueda de genes que codifican para las shigatoxinas (stx1
y stx2) e intimina (eae). Del total de muestras analizadas, 20/304 (6,6%) fueron
positivas para STEC, de ellas 17 (7,8%) correspondieron a carne importada y 3
(3,4%) a carne nacional, presentando distinto perfil toxigénico; stx1/stx2 (7/20),
stx1 (2/20), stx2 (11/20). A partir de estas muestras, se logró aislar 20 cepas,
identificando distintos genotipos de stx: stx1a, stx2a, stx2b, stx2c y stx2d y otros
factores de virulencia destacando la presencia de los genes iha, hlyA y saa.
Mediante aglutinación con antisueros específicos, se logró identificar los
serogrupos O113 (6/20), O174 (2/20), O141 (1/20) y O8 (1/20). Debido a que las
cepas de STEC aisladas en este estudio presentan serogrupos y genes de
virulencia descritos en casos clínicos de CH y SHU en humanos, se propone
evaluar y mejorar los procedimientos de las distintas etapas de la producción de
carne bovina y desarrollar campañas de educación relativas al consumo de carnes
bien cocidas, evitando la contaminación cruzada durante su manipulación para
asegurar un producto libre de riesgo para la salud de la población, influyendo con
estas medidas en la reducción de los casos de SHU.

8
 INTRODUCCIÓN

1.1 Escherichia coli

Escherichia coli, es un bacilo Gramnegativo, anaerobio facultativo, que

forma parte de la microbiota del tracto intestinal del hombre y animales. La
mayoría de las cepas son comensales, sin embargo, existen cepas que han
adquirido factores de virulencia específicos codificados por genes transportados
en plásmidos, transposones, bacteriófagos e islas de patogenicidad que les
confiere la capacidad de infectar y producir enfermedades intestinales y
extraintestinales en el hombre. Las cepas que causan infecciones entéricas se
denominan Escherichia coli diarreogénicas (ECD) y se clasifican en seis
categorías: enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva
(EIEC), enteroagregativa (EaggEC), de adherencia difusa (DAEC) y Escherichia
coli productor de shigatoxinas (STEC) (Teng et al, 2004; Fernandez et al, 2003;
Vidal et al, 2005). Todas ellas, se diferencian según sus propiedades de virulencia,
interacción con la mucosa intestinal, cuadro clínico y epidemiología.
De acuerdo a la clasificación de Kauffmann, las cepas de E. coli se pueden
agrupar, en diferentes serogrupos y serotipos (basado en el antígeno O más el
antígeno flagelar H (Nataro y Kaper, 1998; Kaper et al, 2004). Dentro del grupo
STEC, E. coli O157:H7 es el serotipo más frecuentemente aislado y la mayoría de
los estudios están orientados a su detección debido a que se le reconoce como el
principal agente causal de grandes brotes. También se le ha asociado con casos
esporádicos de colitis hemorrágica (CH) y Síndrome hemolítico urémico (SHU). A
pesar de ello, existen más de 150 serotipos distintos al O157:H7 que comparten el
mismo potencial patogénico (Villalobos et al, 2008; INEI-ANLIS y OPS, 2011).

9
1.2 Factores de virulencia de STEC

Shigatoxinas
El principal factor de virulencia que caracteriza a las cepas de STEC es la
producción de dos shigatoxinas (Stx1 y Stx2), codificadas por los genes stx1 y stx2,
respectivamente. Las cepas de STEC de origen humano, animal o de alimentos,
pueden expresar sólo Stx1, Stx2 o ambas (Friedrich et al, 2003). Actualmente para
Stx1, se describen las variantes Stx1a, Stx1b y Stx1c y para Stx2, se han descrito
numerosas variantes, entre ellas Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2g y
Stx2h (Leung et al, 2003; Schmidt et al, 2000; Friedrich et al, 2003; Vidal et al,
2010). La identificación del tipo de shigatoxina, es clínicamente relevante, pues
algunas están significativamente asociadas con una mayor virulencia de la
bacteria causando cuadros graves de colitis hemorrágica y SHU (Sheutz et al,
2012).

Factores de adherencia intestinales

La capacidad de STEC de adherirse en forma específica y estrecha al
enterocito y de responder a señales de quórum sensing de la microbiota intestinal,
permite a la bacteria secretar las toxinas eficientemente (Tarr et al, 2000). El
principal factor de adherencia intestinal de E. coli O157:H7, lo constituye la
proteína denominada intimina, codificada por el gen eae, localizado en la isla de
patogenicidad LEE (locus de borrado del enterocito) junto a otros genes que
facilitan la colonización (Vidal et al, 2002; Prescott et al, 2000; Blanco et al, 2004).
La intimina permite a la bacteria iniciar la colonización del epitelio intestinal por
medio del receptor traslocado de intimina (Tir), además de generar una serie de
cambios en el citoesqueleto celular, produciendo una lesión característica llamada
A/E (adhesión y borrado), caracterizada por una acumulación de actina en el sitio
de contacto con la célula huésped formando una estructura de pedestal (Nataro y
Kaper, 1998). El gen eae está presente en las cepas más virulentas, sin embargo,
la presencia de éste gen no es esencial para la patogénesis, dado que existe un
importante número de cepas STEC eae-negativas (E. coli O104: H21 y O113:

10
H21), que han causado enfermedad severa y ocasionalmente brotes (Paton et al,
1999; Tarr et al, 2000). Por lo tanto, se sugiere la presencia de otros factores de
adherencia intestinales distintos a intimina, que también estarían involucrados en
la patogénesis. Ejemplos de éstos factores de adherencia intestinales son las
adhesinas Iha (IrgA-homologue adhesin) (Tarr et al, 2000); Efa1 (EHEC factor for
adherence) (Nicholls et al, 2000); Lpf (long polar fimbria) (Torres et al, 2002) y Saa
(autoaggutinating adhesin). Este último se ha relacionado exclusivamente con
cepas de serogrupos no-O157 LEE negativas (Paton et al, 2001).

Enterohemolisina
La mayoría de las cepas de STEC O157:H7, contienen un plásmido
altamente conservado, denominado pO157. Este plásmido codifica una toxina
designada hemolisina enterohemorrágica o enterohemolisina (EHEC-HlyA),
codificada por el gen ehxA. Esta hemolisina permite extraer el hierro de los
eritrocitos para ser utilizado por la bacteria (Schmidt et al, 1995).

1.3 Shigatoxinas y Patogénesis

Las shigatoxinas (Stx), tienen la estructura de holotoxina, con una

subunidad central A y cinco unidades periféricas B. A través de la subunidad B, se
establece la unión de la Stx con el receptor celular específico
globotriaosilceramida (Gb3) presente en la superficie epitelial. Lo anterior, permite
la entrada de la subunidad A al citoplasma celular mediante endocitosis,
subunidad que finalmente interfiere con la función ribosomal, provocando una
alteración irreversible en la síntesis de proteínas y posterior muerte de las células
blanco por apoptosis (Prado y Cavagnaro, 2008).
En etapas posteriores, la Stx puede también ser traslocada desde la
membrana apical a la superficie basolateral, con inducción de interleuquina-8 (IL-
8), que contribuye a la acumulación de leucocitos en la pared intestinal. Como
consecuencia de ello, se produce daño en las células endoteliales de los vasos
sanguíneos provocando diarrea sanguinolenta (INEI-ANLIS y OPS, 2011). Stx

11
entra a circulación sanguínea y es transportada a distintos órganos blanco cuyas
células endoteliales poseen el receptor Gb3.
En el riñón existen altos niveles de Gb3, particularmente en la región
cortical, donde se observan las principales lesiones en los pacientes con SHU.
También se encuentran receptores Gb3 en la membrana celular de los eritrocitos,
células cerebrales y páncreas. (INEI-ANLIS y OPS, 2011; Prado y Cavagnaro,
2008).

1.4 Manifestaciones clínicas

La infección por STEC puede causar casos esporádicos o brotes de diarrea

aguda, colitis hemorrágica (CH) y síndrome hemolítico urémico (SHU) (Leotta et
al, 2005). El período de incubación generalmente es de 3 a 4 días y el cuadro
clínico incluye un amplio espectro de manifestaciones clínicas, que inician con
dolor abdominal severo, fiebre baja o ausente, con o sin vómitos, diarrea acuosa,
seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica durante 4 a 6 días. En la
mayoría de los casos la diarrea por STEC es autolimitada, sin embargo alrededor
del 5 al 10% de los niños infectados evoluciona a SHU para el cual no existe
tratamiento específico sino de sostén (Prado y Cavagnaro, 2008; INEI-ANLIS y
OPS, 2011). El SHU está definido por la triada clásica: anemia hemolítica
microangiopática, trombocitopenia y falla renal aguda, precedidas habitualmente
por diarrea con sangre (Varela et al, 2008; Giugno et al, 2007). En 1983, Karmali
et al, describieron la asociación entre STEC y SHU, hecho que representó un
avance significativo en el conocimiento del agente causal, los mecanismos
patogénicos y permitió diferenciar al SHU de otras microangiopatías trombóticas.
Es importante considerar que en el SHU el riñón no es el único órgano afectado,
pues algunos pacientes presentan en el período agudo síntomas neurológicos
(letargia, cefaleas, convulsiones y coma), insuficiencia pancreática, hipertensión
arterial y/o complicaciones digestivas como, prolapso rectal o invaginación
intestinal (Prado y Cavagnaro, 2008; Fernandez-Brando, 2011).

12
Alrededor de 20% de los pacientes presentan secuelas graves, siendo las más
frecuentes la insuficiencia renal, hipertensión arterial, anemia y alteraciones
neurológicas.
El riesgo de desarrollar SHU en una persona que se infecta con STEC,
depende de complejas interacciones entre el ambiente, el huésped y el patógeno,
siendo la variante de Stx, intimina y factores de virulencia adicionales
característicos de algunos serotipos como el O157:H7, O26:H11, los que
determinan de manera importante el curso de la infección (Prado y Cavagnaro,
2008).

1.5 Epidemiología de STEC

Los primeros brotes de intoxicación alimentaria asociados a STEC se

describen en el año 1982 en los Estados de Oregon y Michigan, EE.UU.,
asociados al consumo de hamburguesas en diferentes locales de una cadena de
comida rápida. A partir de entonces se han descrito numerosos brotes de ETA
causadas por este agente a nivel mundial, siendo la carne y sus subproductos los
más importantes en su transmisión (Vidal et al, 2010; Burgos et al, 2003).
Entre los serotipos descritos de STEC, el O157:H7 es el más prevalente en
países como EEUU, Inglaterra, Canadá y Japón y las cepas no O157 son más
prevalentes en Latinoamérica, Europa y Australia (Prado, 2008; Vidal et al, 2010;
Nataro y Kaper, 1998). Los registros de vigilancia de STEC en el Sur de Australia,
indican tasas de notificación anuales que oscilan entre 0,2 a 0,6 casos por cada
100.000 habitantes, siendo la tasa de notificación más alta en la población infantil
con 0,9 casos en 100.000 niños menores de 5 años (Vally et al, 2012).
En Estados Unidos, las infecciones por E.coli O157:H7 continúan siendo un
problema importante de salud a pesar de la implementación de sistemas de
vigilancia de los patógenos asociados a las ETA y un estricto control de la
producción de alimentos. Si bien se han identificado nuevos vehículos de
transmisión como vegetales, jugos de manzana no pasteurizados, aguas de
consumo y recreacionales, los productos a base de carne molida como las

13
hamburguesas son la principal fuente de infección (INEI-ANLIS y OPS, 2011). En
un estudio realizado entre los años 2000 y 2006, en ocho centros de vigilancia de
ese país, se estimó una incidencia de 5,6 casos de STEC O157 en 100.000 niños
menores de 5 años (Gould et al, 2009). En Canadá, en el año 2007, la incidencia
de casos de éste serogrupo fue de 2,9 en 100.000 habitantes por año (Vally et al,
2012).
En Latinoamérica es un problema endémico, siendo Argentina, Uruguay y
Chile los países más afectados. En Uruguay, la tasa de incidencia es de 4 a 5 en
100.000 niños menores de 5 años. Argentina, es el país con las tasas más altas
de SHU en el mundo. Se describen aproximadamente, 400 casos nuevos por año
en niños menores de 5 años, (27 por cada 100.000/año en la provincia de Buenos
Aires) constituyendo la primera causa de insuficiencia renal aguda en la edad
pediátrica y la segunda de insuficiencia renal crónica (Rivas et al, 2006). En Brasil,
la incidencia de SHU no está bien documentada y el diagnóstico puede ser
subestimado. Datos desde el centro de vigilancia epidemiológica en el Estado de
Sao Paulo, muestran una incidencia de SHU entre el período1998 y 2007, que
varía de 0,01 a 0,05 en 100.000 niños (Souza et al, 2011).

1.6 Epidemiología de STEC en Chile

Un estudio retrospectivo realizado en la Región Metropolitana (RM) entre

1992 y 1994, reveló una incidencia anual de SHU de 3,2 casos por 100.000 niños
menores de 5 años de edad (Vizcaya et al, 1996).
Posteriormente, en el año 2000, se planificó un estudio prospectivo de
vigilancia por un período de tres años, con la participación de 14 centros
centinelas, incluyendo hospitales en el norte, en el centro y sur del país en donde
se registró semanalmente la ocurrencia de casos de SHU. Las tasas de incidencia
para cada centro, variaron entre 0,5 y 9,0 casos por 100.000 niños menores de 15
años de edad con una letalidad de 2,7%. Este estudio de vigilancia demostró que
Chile presenta una situación de endemia de infección por STEC y SHU, con casos
durante todo el año y en todo el territorio (Prado y Cavagnaro, 2008).

14
 En dos estudios realizados en Santiago entre los años 2002 y 2005, se
analizaron muestras fecales de niños con diarrea aguda arrojando como resultado
una frecuencia de aislamiento de STEC entre 0.6 a 1.6%. Otro estudio que incluyó
90 aislamientos clínicos de STEC recolectados entre 1997 y 2005, determinó que
el 46.6% de los aislamientos estaban asociados a diarrea aguda leve, 23.3% a
Síndrome disentérico y el 30% a SHU, siendo el serotipo más frecuentemente
aislado de los tres cuadros clínicos el O157:H7 donde alcanzó el 100% de
aislamiento en los casos de SHU, 52.3% de pacientes con diarrea aguda y 62% en
pacientes con Síndrome disentérico (Vidal et al, 2010).
En Chile el Decreto Supremo 158/2004 en su Artículo 9º, establece que
STEC es objeto de vigilancia obligatoria de laboratorio, lo que implica que todos
los laboratorios clínicos, tanto públicos como privados, deben enviar los aislados
para confirmación microbiológica al Instituto de Salud Pública (ISP).
Durante el año 2012, según registros del ISP, se han notificado por
laboratorio 0,4 casos por cada 100.000 habitantes. Del total de cepas confirmadas,
el mayor número de casos se presentó en la Región Metropolitana, en un 67,1%
de los aislados, seguida por la región de La Araucanía con el 12% de las cepas
confirmadas y la región del Bío-Bío con el 9% de los aislados (Minsal, 2012). Esta
distribución refleja un subdiagnóstico importante en nuestro país porque muy
pocos laboratorios incluyen la búsqueda de STEC en el estudio de un coprocultivo
y los que lo hacen, sólo se enfocan en la búsqueda del serotipo O157. Además, no
todos los laboratorios tienen la capacidad de identificar STEC principalmente por
la falta de acceso a métodos de serotipificación y caracterización de genes de
virulencia (Prado y Cavagnaro, 2008).

1.7 Reservorios y vías de Transmisión

STEC se ha aislado desde el contenido intestinal de bovinos, ovinos,

caprinos, cerdos, perros, gatos y pollos, sin embargo, el principal reservorio de
STEC son los bovinos y cerdos. Las frecuencias de aislamiento han sido de 8 a
21% en bovinos y de 7,5% en suinos (Vidal et al, 2010).

15
 Un estudio realizado en Argentina por Blanco et al (2004) en el que se
caracterizó un total de 153 STEC aisladas de las heces de ganado bovino, carne
picada y hamburguesas de vacuno, arrojó que el 84% pertenecieron a serotipos
previamente descritos de STEC en humanos, y el 56% a serotipos asociados a
STEC aislados de pacientes con SHU, lo que confirma que el bovino es un
importante reservorio de STEC para humanos. Estudios realizados en Francia,
Alemania y Estados Unidos, también encontraron que muchas cepas de STEC
aisladas de ganado vacuno pertenecieron a serotipos que se han asociado a
enfermedad en humanos (Blanco et al, 2004.)
La principal vía de transmisión de STEC son los alimentos contaminados,
como por ejemplo carne molida, productos cárnicos crudos, o insuficientemente
cocidos, hamburguesas, leche no pasteurizada, lechuga, agua, entre otros (Rivas
et al, 2006; Gyles, 2007). Un mecanismo de transmisión importante en niños
pequeños y lactantes es la contaminación cruzada durante la preparación de
alimentos y el contacto persona a persona por la ruta fecal-oral. Esta transmisión
directa, se facilita debido a la baja dosis requerida para causar infección, que va
desde 10 a 100 bacterias por gramo de alimento (Rivas et al, 2006; Vidal et al,
2011).
En atención a que el bovino es el reservorio más importante en la
transmisión de STEC, en importante considerar que el consumo de carne
bovina en Chile es alto y actualmente alcanza los 22,4 Kilogramos por
habitante al año. La disponibilidad de carne bovina en nuestro país, se ha
mantenido relativamente estable en los últimos diez años, con una tasa de
crecimiento promedio anual de 0,2%. Se estima que la producción nacional
cubre el 50% del consumo interno y el otro 50% está siendo cubierto por las
importaciones. Durante el año 2012, el volumen de compras de carne bovina
en el exterior creció 3,7%, siendo los países de origen Brasil, Argentina,
Australia, Uruguay y EEUU (Odepa, 2012).
Dada la importancia de STEC, como patógeno emergente transmitido por
los alimentos y en atención a que la forma más común de contraer el SHU es por
la ingesta de carne mal cocida en la población infantil, el interés de éste estudio

16
está orientado a determinar la presencia de STEC en carnes de origen bovino
chilenas e importadas que se distribuyen en los supermercados de la provincia de
Santiago. Lo anterior con el objeto de generar información actualizada en relación
a éste patógeno y su presencia en carnes, entregando con ello un aporte a la
salud pública que sin duda ayudará a determinar futuras estrategias de control y
prevención.

17
 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Existe presencia de Escherichia coli productor de shigatoxina en la carne bovina

que se expende en los supermercados de Santiago?

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de Escherichia coli productor de shigatoxina

(STEC) en carne de vacuno nacional e importada, distribuida en los principales
supermercados de la provincia de Santiago.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislar cepas de E. coli productoras de shigatoxina desde carne de vacuno

nacional e importada, distribuida en los supermercados de la provincia de
Santiago.

2. Determinar la presencia de genes de virulencia de STEC presentes en los

aislados de STEC obtenidos desde carne de vacuno nacional e importada,
distribuida en los principales supermercados de la provincia de Santiago.

3. Determinar los serogrupos más frecuentes asociados con las cepas de

STEC/EHEC aisladas desde carne de vacuno nacional e importada, distribuida en
los supermercados de la provincia de Santiago.

18
 METODOLOGÍA

1. Diseño del estudio

Estudio de tipo descriptivo transversal.

1.1. Tamaño de la muestra

Basándose en antecedentes de un estudio de Alexandre et al (1999) que
detectó 4,2% de shigatoxina stx1 y stx2 en productos cárnicos de origen nacional
y extranjero, se estimó un tamaño muestral de 304 productos cárnicos de origen
bovino, con un 95% de nivel de confianza y con un error de estimación de 2,5%.

1.2. Diseño de la muestra

El muestreo fue de tipo probabilístico o aleatorio estratificado. Se consideró
en el estudio 151 supermercados de Santiago, agrupándose en 5 cadenas
comerciales identificadas con las letras A, B, C, D y E. La selección de la muestra
aleatoria, se llevó a cabo independientemente en cada grupo por afijación
proporcional al volumen de carne que vende cada cadena de supermercado.
A cada supermercado se le asignó un número de identificación correlativo, del 1
al 151. Una vez identificados, se seleccionaron 32 aleatoriamente a través de
números randomizados usando el programa Microsoft Excel 2003.

Se tomaron 10 muestras totales de carne bovina, dependiendo del stock de

cada supermercado, pudiendo ser nacionales, extranjeras o ambas.

1.3. Criterios de Inclusión

Se incluyó en el estudio sólo carne bovina sellada al vacío mantenida a
temperatura de refrigeración (5 °C) que se expendía en los supermercados de
Santiago, durante el período mayo a diciembre del año 2012.

19
1.4. Criterios de exclusión
No se incluyó en el estudio la carne bovina que estaba próxima a vencer y
con una temperatura mayor a 5 °C al momento de la toma de muestra.

1.5. Variables del estudio

Variable nominal dependiente: STEC en carnes
Variable nominal independiente: Procedencia de la carne y tipo de corte.

a) Descripción de la variable dependiente

Presencia de STEC en muestras de carne bovina: Toda muestra de carne bovina
sellada al vacío, cuyos análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
determinen la presencia de los genes stx1 y stx2 que codifican para la producción
de shigatoxinas.

b) Descripción de las variables independientes

Procedencia de la carne: Carne bovina sellada al vació de origen nacional e
importada.
Tipo de corte: Trozo o pieza grande de carne proveniente de una canal bovina
(cuerpo del animal después de haber sido sacrificado y eviscerado).
Se analizaron 26 cortes de carne distintos y para el análisis estadístico, estos se
clasificaron formando dos grupos de acuerdo a su ubicación: 1) cortes del cuarto
anterior (porción craneal de la media res, que se obtiene de la sección transversal
de la columna vertebral a la altura de la 10° costilla), 2) cortes del cuarto posterior
(porción caudal de la media res, que se obtiene de la sección transversal de la
columna vertebral a la altura de la 10° costilla.

20
2. Procedimientos

2.1. Toma de muestra

Cada 2 semanas se recolectaron alrededor de 20 muestras en un mismo
día, 10 de cada supermercado. Este procedimiento se realizó en la sala de
proceso de carnes de cada supermercado, con la supervisión del personal técnico
de la Seremi de Salud RM.
Se asignó un área para la preparación y mantención de materiales de
muestreo y un mesón para realizar la toma de muestra. Una vez preparados los
materiales, el profesional a cargo de la toma de muestras procedió a colocarse
mascarilla, lavado de manos y desinfección del mesón con etanol.
Se seleccionaron cortes de carne envasada al vacío que se disponía en
cámaras de frío a una temperatura de 0 a 5°C. Se tomaron aproximadamente 200
gr. de carne bovina, utilizando guantes de látex y un cuchillo esterilizado (flameado
con etanol 95%) los que se depositaron en una bolsa de plástico esterilizada y
previamente rotulada. Las muestras se mantuvieron en una hielera a una
temperatura de 4 a 8 °C, desde su obtención hasta la recepción en laboratorio.

2.2. Identificación de la muestra

Cada muestra fue identificada y registrada con los siguientes datos:

 Número de muestra
 Número de identificación del supermercado muestreado
 Número de Lote o Trazabilidad de la carne
 Frigorífico
 Condiciones de temperatura
 Fecha de faena, envasado y vencimiento del producto cárnico
 Procedencia de la carne (importada o nacional)
 Tipo de corte
 Fecha y hora de muestreo
 Persona responsable del muestreo
21
  Fecha y hora de inicio de los análisis de la muestra en el laboratorio.
 Observaciones (situaciones presentadas durante la toma de muestras que
pudieran incidir en los resultados analíticos y en general toda observación
que se consideró relevante).

2.3. Transporte y envío de muestras

Concluida la toma de muestras, éstas se transportaron al Laboratorio de
Salud Ambiental de la Seremi de Salud RM para ser procesadas el mismo día que
fueron recolectadas. En todo momento se evitó su exposición al ambiente y
manipulación. Las muestras se enviaron al laboratorio el mismo día que fueron
recolectadas para ser analizadas al día siguiente y procesadas antes de las 24
horas desde la fecha de toma de muestra.

2.4. Cultivo Microbiológico

Se pesaron 25 grs. de cada muestra de carne y se homogenizaron en agua
peptonada tamponada (caldo APT) e incubaron a 37 ºC por 18h. Posteriormente,
se sembró una alícuota del cultivo en agar Mac Conkey por el método de reloj y se
incubó a 37 ºC por 18h. A partir de la zona confluente de crecimiento bacteriano,
se tomó un inóculo y se realizó PCR, para la búsqueda de genes que codifican
para las shigatoxinas (stx1 y stx2) e intimina (eae).

2.5. Detección genotípica de shigatoxinas e intimina por PCR múltiple

El PCR es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño
fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) se duplica varias veces para
obtener múltiples copias. Es un método selectivo y sensible cuyos componentes
básicos son una o más moléculas de DNA, nucleótidos o bases (dNTPs), una fibra
corta de DNA copiado, que se llama cebador oligonucleotídico o partidor y DNA
polimerasa para copiar el DNA. Los cebadores o partidores pueden ser
combinados en una reacción única (PCR múltiple) que puede detectar varios
genes en una sola muestra (Paton y Paton, 1998). Esta reacción ha significado un
considerable avance sobre otros métodos de PCR para identificar STEC y la

22
mayoría de sus genes marcadores de virulencia incluyendo las variantes de
shigatoxinas (Cicuta et al, 2009). En el presente estudio, se utilizó el protocolo de
PCR establecido para trabajar con cepas de E. coli desarrollado en el Laboratorio
de Enteropatógenos del Programa de Microbiología y Micología, de la Facultad de
Medicina de la Universidad de Chile (Vidal et al, 2005).

a) Obtención de DNA bacteriano

Se tomó un inóculo de cultivo correspondiente a la zona de crecimiento
confluente de las placas de Mac Conkey, se resuspendió en 200 μl de buffer Tritón
X-100 al 0,5% y se hirvió por 5 minutos a 100°C dos veces, con un paso
intermedio de agitación por vórtex. Posteriormente se centrifugó a 8.000 rpm,
durante 8 minutos. El DNA obtenido (sobrenadante) se conservó a 4 °C para ser
utilizado en el PCR múltiple.

b) Preparación de la mezcla de PCR

Se rotuló microtubos de 0,2 ml con el número correspondiente a cada
muestra y se preparó la mezcla de reacción en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, con
los siguientes reactivos: Buffer PCR 5X, Cloruro de Magnesio 25 mM, dNTPs 10
mM, GoTaqR Flexi DNA polimerasa (Promega) 5 U/µL y partidores específicos
10uM, para los genes stx1, stx2 y eae (Tabla 1), en un volumen final de 25 µl. Para
cada reactivo, se calculó los volúmenes necesarios en la mezcla de reacción, de
acuerdo al número de determinaciones (Anexo 1).

23
Tabla 1. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para
shigatoxinas e intimina.

Tamaño del
Gen de Secuencias
producto de Referencias
virulencia 5’-3’
PCR (pb)
stx1 348 F: CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG Cebula et al
R: CACCAGACAATGTAACCGCTG (1995)
stx2 584 F: ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG Cebula et al
R: GCGTCATCGTATACACAGGAGC (1995)
eae 482 F: TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT Vidal et al
R: GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG (2004)
F: Partidor directo R: Partidor reverso

c) Programas de amplificación y PCR

Una vez resuspendida la mezcla, a cada microtubo se agregó 1,5 µl del
sobrenadante del lisado obtenido a partir de cada una de las muestras. Como
control positivo se utilizó una cepa de referencia, E. coli EDL933 (Tabla 2). Al
microtubo que se usó como control negativo, se agregó 1,5 µl de agua estéril
desionizada. Posteriormente, se colocó los microtubos en un termociclador ESCO
modelo Swift maxi y se ejecutó el programa de amplificación específico para los
genes stx1, stx2 y eae (Anexo 1).

24
Tabla 2. Cepas de E. coli utilizadas como controles positivos.

Cepa E. coli control positivo* Gen de referencia

EDL933 (O157:H7) stx1,stx2, eae, stx1a,stx2a,lpf, iha y hlyA,
180-02 efa1 no-O157
112 efa1 / ent
EO26 y 472-1 saa
DE 131/3 stx1c
MHI 813 stx1d
EH250 stx2b
F35790 stx2c
1112R15035 stx2d
51191 stx2e
T497 stx2f
7V stx2g

* Cepas obtenidas del Department of Microbiology & Infection Control

Unit of Foodborne Bacteria and Typing. STATENS SERUM INSTITUT

d) Electroforesis y lectura del PCR

Una vez terminadas las amplificaciones se tomaron 8 μL de muestra que
fueron sometidas a electroforesis en un gel de agarosa al 2% preparado en buffer
Tris-ácido acético-EDTA TAE O.5X (Sigma ®). Paralelamente se utilizó 3 µl de un
marcador de tamaño molecular de 100pb (Invitrogen®) como referencia. La corrida
electroforética se realizó a 100 volts por 40 minutos.
Se observó el resultado de la electroforesis mediante la tinción del gel con
bromuro de etidio 0,5 μg/ml por 20 minutos y la exposición del gel a la luz
ultravioleta. La visualización y el análisis de la imagen permitió, de acuerdo al peso
molecular, discriminar las E. coli positivas para la presencia de genes de
shigatoxinas e intimina.

25
2.6. Aislamiento de cepas STEC
De cada placa de agar McConkey donde el lisado bacteriano confluente dio
una señal positiva a la presencia de shigatoxinas por PCR, se seleccionó un
máximo de 10 colonias con fenotipo de E. coli. Estas colonias se sembraron
nuevamente en agar McConkey y se realizó PCR múltiple con el fin de identificar
y aislar la colonia positiva correspondiente. Cuando no se logró identificar la
colonia positiva, se realizó un nuevo aislamiento de colonias desde la zona de
cultivo confluente de la cual se obtuvo señal positiva.
Una vez aislada la colonia positiva a STEC, ésta se sembró en agar LB y
después de 18 horas de incubación a 37 °C, se almacenó en leche a -80 °C para
su posterior serotipificación y determinación de las variantes de shigatoxinas 1 y 2
y de otros factores de virulencia distintos a intimina como los genes efa1, ent, saa,
hlyA, iha. lpf y efa1 no- O157.

2.7. Detección genotípica de las variantes de shigatoxinas

Para cada cepa se determinó por PCR, la presencia o ausencia de las
variantes de Stx1: Stx1a, Stx1b, Stx1c y las variantes de Stx2: Stx2a, Stx2b,
Stx2c, Stx2d, Stx2f y Stx2g. La preparación de la mezcla y programa de PCR que
se utilizaron se basaron en un estudio de subtipificación de shigatoxinas,
desarrollado en el año 2012 por Scheutz et al. (Anexo 2). Las secuencias de los
partidores utilizados se indican en la tabla 3.

26
Tabla 3. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para la
detección de las variantes de shigatoxinas

Temperatura
Tamaño del
Gen de de Secuencias
producto de
virulencia alineamiento 5’-3’
PCR (pb)
(°C)
stx1a 62 478 F1: CCTTTCCAGGTACAACAGCGGTT
R2:GGAAACTCATCAGATGCCATTCTGG
stx1c 62 252 F1: CCTTTCCTGGTACAACTGCGGTT
R1: CAAGTGTTGTACGAAATCCCCTCTGA
stx1d 62 203 F1: CAGTTAATGCGATTGCTAAGGAGTTTACC
R2: CTCTTCCTCTGGTTCTAACCCCATGATA
stx2a 68 349 F2: GCGATACTGRGBACTGTGGCC
347 R3: CCGKCAACCTTCACTGTAAATGTG
R2: GCCACCTTCACTGTGAATGTG
stx2b 65 251 F1: AAATATGAAGAAGATATTTGTAGCGGC
R1: CAGCAAATCCTGAACCTGACG
stx2c 65 177 F1: CGAAAGTCACAGTTTTTATATACAAGGGTA
R2: CCGGCCACYTTTACTGTGAATGTA
stx2d 68 179 F1: AAARTCACAGTCTTTATATACAACGGGTG
235 R1: TTYCCGGCCACTTTTACTGTG
280 O55 R: TCAACCGAGCACTTTGCAGTAG
R2: GCCTGATGCACAGGTACTGGAC
stx2e 68 411 F1: CGGAGTATCGGGGAGAGGC
R2: CTTCCTGACACCTTCACAGTAAAGGT
stx2f 68 424 F1: TGGGCGTCATTCACTGGTTG
R2:TAATGGCCGCCCTGTCTCC
stx2g 68 573 F1:CACCGGGTAGTTATATTTCTGTGGATATC
R1: GATGGCAATTCAGAATAACCGCT

F: Partidor directo R: Partidor reverso

27
2.8. Detección genotípica de E. coli O157
Mediante la misma técnica anteriormente descrita, se hizo la determinación
genotípica del serogrupo O157 a las cepas que resultaron positivas a la presencia
de shigatoxinas, utilizando secuencias de partidores específicos que amplifican el
gen wzx que codifica para proteínas asociadas con la ruta biosintética del antígeno
somático O del lipopolisacárido O157 (Tabla 4). La preparación de la mezcla y
programa de PCR utilizado, se indican en el anexo 3.

Tabla 4. Partidor y secuencia nucleotídica utilizada para la detección de

E. coli O157
Tamaño del producto Secuencias
Partidor Referencias
de PCR (pb) 5’-3’
O157 497 F: AAGATTGCGCTGAAGCCTTTG Desmarchelier et
R: CATTGGCATCGTGTCGACAG al, 1998.

F: Partidor directo R: Partidor reverso

2.9. Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA (ehxA), iha, lpf y efa1 no-
O157
Para la caracterización de genes de virulencia distintos de intimina, se
trabajó con DNA bacteriano purificado utilizando el kit de extracción Wizard
Genomic (Promega). La preparación de la mezcla y programa de PCR para
determinar la presencia de cada gen, se indican en el anexo 4. Las secuencias de
los partidores utilizados se indican en la tabla 5.

28
Tabla 5. Partidores y secuencias nucleotídicas utilizadas para la detección
de genes de virulencia de STEC.

Tamaño Temperatura
del de
Gen de Secuencias
producto Alineamiento Referencias
virulencia 5’-3’
de PCR (°C)
(pb)
efa1 456 60 F: AACTATCCTGCCGCCTCAGA Vidal et al
R: GCCTGCGATAACAGCATCAA (2007)
lpf 276 58 F: CCTTGCGTACTGTCCGTTGA Vidal et al
R: AGCGACCAGGGTATTGCTGT (2007)
saa 119 60 F: CGTGATGAACAGGCTATTGC Paton y
R: ATGGACATGCCTGTGGCAAC Paton
(2002)
hlyA 569 58 F: AGCTGCAAGTGCGGGTCTG Vidal et al
R:TACGGGTTATGCCTGCAAGTTCAC (2007)
iha 792 58 F: TGGTACGGGTAAAACCGGAG Vidal et al
R: CTGCGTACAAGCTCACGACC (2007 )
ent 607 58 F: TCATCCCCTCAATTATTAAGCAA de Saint-
R: AAAGCAACCCAGGAACATTATT Pierre et al
(2006)
efa1 no- 827 60 F: ACGCTGCATACAAAAATCATCT de Saint-
157 R: TCCCTATTTCTGTCTTCTGGAGT Pierre et al
(2006)

F: Partidor directo R: Partidor reverso

29
 2.10. Serotipificación de STEC
La caracterización serológica se llevó a cabo mediante la técnica de
aglutinación en microplacas con antisueros monovalentes elaborados por el
laboratorio de referencia de E. coli de la Universidad de Santiago de Compostela
(LREC-USC), dirigido por el Dr. Jorge Blanco, Lugo, España.
El método empleado para la determinación del antígeno “O”, está basado
en el originalmente descrito por Guinée et al. (1972 y 1981), y modificado por
Blanco et al (1996).

a) Preparación de las suspensiones bacterianas

Las cepas en estudio se cultivaron en agar triptona-soja (TSA) e incubaron
a 37 °C por 18 horas. Posteriormente, el cultivo bacteriano obtenido en TSA, se
suspendió en 2 ml de solución salina (0,85% NaCl, p/v) y se ajustó la
concentración bacteriana (1,8 x 109 bacterias/mL) por comparación con el tubo 6
de la escala McFarland.
Las suspensiones bacterianas se autoclavaron a 121°C, durante 2,5 horas,
para inactivar el antígeno “K” y desenmascarar el antígeno “O”. Una vez enfriadas
las suspensiones, se añadió a cada tubo, 2 mL de solución salina formalinizada
(0,5%, v/v) con violeta de genciana (0,005%, p/v).

b) Preparación de los antisueros O de E.coli

. Todas las diluciones, se prepararon con solución salina estéril (NaCl
0,85%). Se generaron 24 antisueros polivalentes identificados con letras de la A a
la X, con seis a siete antisueros específicos por grupo. Se usaron diluciones para
cada antisuero de 1/80, a excepción de los antisueros marcados con arterisco (*)
que fue de 1/40 (Tabla 6). Las cepas en estudio se enfrentaron en una primera
etapa con los antisueros polivalentes “A” hasta el “O”, ya que en ellos se incluyen
los antisueros que permiten detectar a las cepas de E. coli con los antígenos O
más frecuentes. Aquellas cepas que resultaron negativas frente a ellos, se
enfrentaron en una segunda etapa con los polivalentes restantes, del grupo P
hasta el X.

30
Tabla 6. Grupo de sueros polivalentes para la identificación del
antígeno somático O de los aislados de STEC.

A B C D E
O1 O8 O18 O26 O45
O2 O9 O20 O27 O48
O3 O11 O21 O28 O49
O4 O12 O22 O29 O50
O5 O14 O23 O32* O51
O6 O15 O24 O35 O54
O7 O16 O25 O44 O55

F G H I J
O59* O78 O101 O112 O121
O63 O80 O103 O113 O123
O64 O82 O104 O114 O124
O69 O83 O105 O115 O125
O73 O85* O109 O117 O126
O75 O86 O110 O118* O127
O76 O88 O111 O119 O128

K L M N O
O130 O141* O148 O162 O169
O131 O142 O149 O163 O170
O132 O143 O152 O164* O171
O134* O144 O153 O165 O172
O136 O145 O157* O166 O173
O138 O146 O158 O167 O174
O139 O147 O159 O168 O175

P Q R S T
O10 O36 O46 O61 O79
O13 O37 O52 O62* O81
O17* O39* O53 O66 O84
O19 O40 O56 O70 O87*
O30 O41 O57 O71 O89
O33 O42 O58 O74 O90
O34 O43 O60 O77

U V W X
O91 O100 O133 O161
O92 O102 O140 O176
O95 O107 O150 O177
O96 O108 O151 O178
O97 O116 O154 O179
O98 O120 O156 O180
O99 O129 O160* O181

31
c) Determinación del serogrupo O
Para la determinación del antígeno O se emplearon placas de micro
titulación de 96 pocillos de fondo “V”. En cada pocillo se agregó 50 μL de cada
antisuero y 50 μL de la suspensión bacteriana y se incubó a 37 °C durante 18
horas.

d) Interpretación de los resultados

La interpretación de los resultados se realizó estudiando las reacciones de
aglutinación. Cuando la cepa en estudio resultó reconocida por alguno de los
antisueros O (resultado positivo), se formó una película que impide la
sedimentación de las bacterias. En los pocillos donde no hubo reconocimiento
(negativos), las bacterias sedimentaron visualizándose en forma de botones
azulados (Figura 1). Si la cepa bacteriana aglutinó con uno o varios de los
antisueros polivalentes empleados, se realizó a continuación el mismo proceso
con los antisueros “O” monovalentes incluidos en el o los polivalentes
correspondientes. Si el ensayo resultó negativo con todos los antisueros
polivalentes se consideró no tipificable (NT).

Resultado
negativo

Resultado
positivo

Figura 1. Determinación del antígeno O (Serogrupo) de STEC

32
2.11. Electroforesis de campo pulsado (PFGE)

Para establecer la diversidad genética y la relación clonal entre las cepas

de STEC aisladas en nuestro estudio, se utilizó la técnica de PFGE. Esta es
considerada la técnica gold standard para la realización de estudios
epidemiológicos moleculares para determinar las relaciones clonales entre cepas
bacterianas.

Las cepas en estudio y la cepa control (Samonella Braenderup) fueron

incubadas a 37°C durante 18 horas en agar LB, se preparó una suspensión de las
cepas bacterianas en buffer CSB (Tris 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8), ajustando
su densidad óptica a 0.8 (medida a 420 nm). Se tomaron 400 μl de cada
suspensión bacteriana los que fueron mezclados con 20 μl de proteinasa K (20
mg/ml) y 400 μl de agarosa Seakem Gold 1%: SDS al 1% en buffer TE (Tris
10mM: EDTA 1mM, pH 8). Esta mezcla se dispensó en moldes para preparar los
bloques de agarosa.

La lisis celular in situ fue realizada colocando los bloques de agarosa

solidificados en tubos que contenían 5 ml de buffer de lisis (Tris 50 mM: EDTA
50mM, Sarkosyl 1 %, pH 8) y 25 μl de proteinasa K (20 mg/ml) e incubados en
baño María con agitación a 55°C por 3 horas. A continuación los bloques fueron
lavados con agua miliQ (2 lavados) y buffer TE (3 lavados) por 20 minutos en
agitación a 50 °C, para eliminar los restos celulares y posteriormente ser tratados
con enzimas de restricción.
La digestión del ADN bacteriano presente en cada bloque de agarosa se
realizó utilizando 50 U de la enzima de restricción XbaI (Fermentas) durante 3
horas a 37°C, según describe el fabricante. Los fragmentos de ADN fueron
separados mediante electroforesis, utilizando un gel de agarosa al 1% preparado
con buffer TBE 0,5X. Las condiciones de la electroforesis fueron las siguientes:
tiempo inicial 2,16 segundos, tiempo final 54,17 segundos, temperatura de 14ºC,
voltaje 6 V/cm, con un tiempo total de corrida de 21 horas (equipo CHEF-DR III
System, Bio-Rad).

33
 Los patrones de bandas obtenidos de PFGE, fueron analizados utilizando
el software GelCompar II (Applied Maths). Para visualizar la relación existente
entre las cepas aisladas de STEC desde carne bovina selladas al vació, se
construyó un dendrograma con un parámetro de optimización de 1,0 % y 1,0% de
tolerancia en la posición de las bandas. La cepa de Salmonella Braenderup fue
utilizada como referencia.

3. Plan de análisis de la información

a) Consolidación base de datos: La recolección de los datos, se registró

en Excel 2003 y fueron exportados al software estadístico SPSS 15.0.
b) Análisis descriptivo: Cálculo de porcentajes con intervalo de confianza
(IC) de 95%: Frecuencia de aislamiento de STEC en las muestras de
carne, los serogrupos presentes y la presencia de genes asociados con
virulencia en cepas de STEC.
c) Análisis de regresión logística: Calculo de Odds Ratio (OR) mediante
modelo de regresión logística binaria para analizar asociación entre la
presencia de STEC en carne con el país de origen (categoría de
referencia, Chile) y con el tipo de corte (categoría de referencia, cortes
del cuarto anterior).
d) Prueba estadística de Hosmer-Lemeshow: Este test es un contraste
de distribución, para determinar si el modelo de regresión logística
utilizado, se ajusta bien a los datos usados para estimarlo (H0: El
modelo se ajusta bien). Se consideró significancia estadística los
resultados con p valor < 0,05.

34
 RESULTADOS

Distribución de las muestras de carne: Las muestras de carne bovina selladas

al vacío, recolectadas desde 5 cadenas de supermercados de la provincia de
Santiago, entre mayo y diciembre del año 2012, provenían de Argentina, Australia,
Brasil, Uruguay, EEUU y Chile. La mayor proporción, correspondió a carnes
brasileñas y a carnes nacionales con un 29,3 % y 28,6% respectivamente. En
segundo lugar a carnes de origen argentino y australiano y en menor proporción
de Uruguay y EEUU (Tabla 7).

Tabla 7. Distribución de las muestras de carne según procedencia

Procedencia de la carne N° muestras %

Brasil 89 29,3

Chile 87 28,6

Argentina 55 18,1

Australia 53 17,4

Uruguay 17 5,6

EEUU 3 1,0

Total 304 100,0

De acuerdo al volumen de carne que vende cada cadena de supermercado, la

mayor proporción de muestras recolectadas se obtuvo de los supermercados C y
A en un 33% (100/304) y 28% (86/304) respectivamente, seguida de los
establecimientos D, en un 20% (60/304). En general, en los supermercados
muestreados, se observó una mayor proporción de carne bovina sellada al vacío
de procedencia importada, disponible para la venta (tabla 8).

35
Tabla 8. Distribución de las muestras de carne según supermercado y país
de origen

Supermercado
A B C D E Total %

País de origen

Brasil 30 3 23 17 16 89 29,3

Chile 30 1 40 16 0 87 28,6

Argentina 7 15 11 9 13 55 18,1

Australia 16 0 23 14 0 53 17,4

Uruguay 2 9 1 4 1 17 5,6

EEUU 1 0 2 0 0 3 1,0

TOTAL 86 28 100 60 30 304 100

(28%) (9%) (33%) (20%) (10%) (100%)

Análisis Microbiológico: De un total de 304 muestras de carne bovina

analizadas por PCR, se identificó la presencia de STEC en un 6,6% (20/304), de
las cuales el 3,4% (3/87) correspondieron a carne bovina nacional y 7,8%
(17/217) a carne importada (Tabla 9).

Tabla 9. Presencia de STEC en carne bovina según procedencia

Procedencia de la
N de muestras Presencia de STEC
carne

Cantidad (n) % Cantidad (n) %

Nacional 87 28,6 3 3,4

Importada 217 71,4 17 7,8

Total 304 100,0 20 6,6

36
Al analizar la distribución de muestras de carne con presencia de STEC por país,
se observó una mayor prevalencia en la carne proveniente de Uruguay y
Argentina en un 24% (4/17) y 16% (9/55) respectivamente, mientras que en
Australia, Brasil y Chile la prevalencia no superó el 4%. Respecto a la carne
proveniente de EEUU, sólo se recolectaron 3 muestras y en ninguna se detectó
STEC (Figura 2).

Figura 2. Porcentaje de muestras de carne con presencia de STEC, según

país de origen

El análisis por regresión logística binaria (considerando a Chile como país de

referencia o control), mostró que los países asociados significativamente a la
presencia de STEC en carne fueron en primer lugar Uruguay (OR= 8,6; IC: 1,727 -
42,967; p = 0,009) y en segundo lugar Argentina (OR= 5,5; IC: 1,413 - 21,242; p =
0,014). Por el contrario, al analizar el OR de la carne proveniente de Australia,
Brasil y EEUU, no hubo una asociación significativa con la presencia de STEC
(Tabla 10).

37
Tabla 10. Análisis de asociación entre la presencia de STEC en carne y el
país de origen mediante el cálculo de OR (país de referencia Chile)

País de origen OR 95% IC p

Argentina 5, 478 1,413 – 21,242 0,014

Australia 1,098 O,177- 6,795 0,920

Brasil 0,644 0,105 – 3,949 0,634

EEUU 0,000 0,000 0,999

Uruguay 8,615 1,727- 42,967 0,009

En relación a la distribución de las muestras de carne según tipo de corte,

cabe destacar que en ambos grupos se analizó un número similar de muestras. El
porcentaje de muestras asociadas a cada corte perteneciente al cuarto anterior,
varió de 0,6 a 17,2%, siendo más frecuentemente analizados, los cortes choclillo,
tapapecho y asado carnicero. En el caso de los cortes pertenecientes al cuarto
posterior, el porcentaje de muestras analizadas varió de 0,7 a 15,6 %, siendo los
cortes pollo ganso, abastero y punta picana, los más frecuentes (tabla 11). El
análisis por regresión logística binaria (considerando al grupo cuarto anterior como
referencia), mostró que los cortes del cuarto posterior están asociados
significativamente con la presencia de STEC en carne (OR= 6,7; IC: 1,924 –
23,416; p = 0,003), destacando los cortes ganso (29%, 4/14), abastero (18%, 4/22)
y pollo ganso (17%, 4/23) (Fig. 3).

38
Tabla 11. Distribución de las muestras de carne según corte.

A. Cuarto anterior B. Cuarto posterior

N° Tipo de N°
Tipo de corte % %
muestras corte muestras
Pollo ganso 23 15,6
Choclillo 27 17,2
Abastero 22 14,9
Tapapecho 21 13,4
Punta picana 16 10,9
Asado carnicero 20 12,7
Ganso 14 9,5
Punta paleta 19 12,1 Asiento 13 8,8
Huachalomo 17 10,8 Lomo liso 9 6,1
Posta paleta 16 10,2 Palanca 9 6,1

Plateada 15 9,6 Filete 8 5,4

Tapabarriga 7 4,8
Sobrecostilla 13 8,3
Posta rosada 7 4,8
Lomo vetado 6 3,8
Posta negra 7 4,8
Asado americano 1 0,6 Entraña 6 4,1
Carnicero 1 0,6 Punta ganso 5 3,4
Malaya 1 0,6 Asiento picana 1 0,7

Total 157 100 Total 147 100

39
Figura 3. Muestras con presencia de STEC según tipo de corte

Al ajustar por las dos variables independientes, mediante la prueba de

Hosmer-Lemeshow, persisten las diferencias encontradas en el modelo de
regresión logística binaria y éstas aumentan su riesgo (Tabla 12).

40
Tabla 12. Modelo de regresión logística para la presencia de STEC ajustado
por el tipo de corte y país de origen.

País de origen OR 95% IC p

Cuarto Posterior 7,738 2,291 -26,141 0,001

Argentina 7,628 1,885 -30,864 0,004

Australia 1,252 0,198 -7,899 0,811

Brasil 0,899 0,144 -5,633 0,910

EEUU 0,000 0,000 -0,000 0,999

Uruguay 18,245 3,117 -106,809 0,001

Prueba de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow (p=0,395)

Detección genotípica de shigatoxinas e intimina por PCR múltiple: Al realizar

el PCR desde la zona de confluente de crecimiento bacteriano, se observó que de
las 20 muestras de carne bovina con presencia de STEC, el 55% presentó sólo el
gen stx2, seguido por un 35% que presentó los genes stx1/stx2 y un 10% sólo el
gen stx1. Una vez aisladas las cepas, ninguna presentó el gen eae, que codifica
para la producción de la proteína intimina (Tabla 13).

Tabla 13. Detección de los genes stx1 y stx2 desde carne bovina

Gen N° de muestras con STEC

stx1 – stx2 7/20(35%)

stx1 2/20(10%)

stx2 11/20 (55%)

41
Caracterización genotípica de las cepas aisladas de STEC: A partir de las 20
muestras positivas a shigatoxina por PCR múltiple, se logró aislar 20 cepas de
STEC con distinto perfil toxigénico, a las cuales se les caracterizó
genotípicamente, de acuerdo a los factores de virulencia.

Detección genotípica de las variantes de shigatoxinas: Los genotipos de Stxs

detectados en las cepas aisladas de carne, fueron: Stx1a, Stx2a, Stx2b, Stx2c, y
Stx2d. Estas variantes se presentaron solas o en combinación de dos o más genes
(Tabla 14).

Tabla 14. Presencia de las variantes de Stx aisladas desde carne bovina

Variantes de Stx Cepas STEC aisladas de carne bovina

stx1a stx2a stx2c 1/20 (5%)

stx1 a stx2a 6/20 (30%)
stx1a stx2a stx2d 1/20 (5%)
stx1a stx2a stx2c stx2d 6/20 (30%)
stx1a stx2c stx2d 1/20 (5%)
stx1a stx2c 1/20 (5%)
stx2b stx2c 1/20 (5%)
stx2c 3/20 (15%)

Detección genotípica de E. coli O157: Los resultados arrojados por el PCR

específico para el serogrupo O157 mostraron que el 100% de las cepas fueron
no-O157.

42
Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA, iha, lpf y efa1 no-O157: Del total
de cepas aisladas, en el 65% se detectó por PCR los genes hlyA y saa, y en el
60% el gen iha. No hubo presencia del resto de los genes de virulencia (Tabla
15).

Tabla 15. Presencia de los factores de virulencia: hlya, saa y iha en cepas
STEC aisladas desde carne bovina

Factores de virulencia Cepas STEC aisladas de carne bovina

hlyA 13/20 (65%)

saa 13/20 (65%)

iha 12/20 (60%)

Determinación de serogrupos de STEC: El 50% de las cepas fueron

consideradas no tipificables (NT). De los serogrupos que se logró identificar, el
más prevalente fue el O113, correspondiendo al 30% del total de las cepas
aisladas. Con una frecuencia más baja fueron identificados los serogrupos O174,
O141 y O8 correspondiendo al 10 y 5% respectivamente. (Tabla 16).

Tabla 16. Determinación de los serogrupos de STEC en cepas aisladas desde

carne bovina

Serogrupo Número de cepas Porcentajes

O113 6/20 30%

O174 2/20 10%

O141 1/20 5%

O8 1/20 5%

NT 10/20 50% 43
Electroforesis de campo pulsado: El análisis de los productos de restricción
obtenidos al digerir el genoma de las cepas STEC aisladas desde carne bovina,
permitió identificar dieciocho patrones de bandas diferentes. El grado de
semejanza entre las cepas se representó gráficamente como un dendrograma de
homología (Fig. 4), donde se puede observar que las cepas con códigos 194-8 y
1-10, quedan separadas del resto (<40% de similitud). En los recuadros
destacados, se observa la presencia de 2 grupos mayoritarios (A y B) con bajo
porcentaje de similitud (alrededor de 50%). El grupo A contiene 3 subgrupos, que
tampoco tienen una relación muy estrecha (< 60% de similitud). Las cepas que
presentaron patrones con un alto porcentaje de similitud (> 90 %), fueron
aislados de la misma muestra de carne y del mismo país de oirigen.

El PFGE, permitió determinar que el grado de similitud genética que existe entre
las cepas de STEC aisladas desde carne bovina, es bajo, lo que sugiere que
presentan una alta diversidad genética y no es posible establecer asociaciones
entre ellas, con el país de origen, frigorífico y supermercado.

44
 N° Perfil País de
cepa Serogrupo toxigénico Local Frig. origen

Figura 4. Dendrograma que muestra la relación clonal entre las diferentes cepas STEC
aisladas desde carne bovina.

Las muestras de carne bovina, positivas para la detección por PCR de genes stx,
fueron tomadas en distintos establecimientos de comercialización en Santiago y
provenían de diversos frigoríficos, de variadas localidades y países de origen en
donde la carne se faena, se envasa al vació y se certifica.
Cabe destacar que de una muestra de carne fue posible aislar más de una cepa y
cada una de ellas con serogrupos y perfil toxigénico distintos (Anexo 5).

45
 DISCUSION

En el presente estudio se logró detectar STEC en muestras de carne bovina

selladas al vacío de procedencia nacional e importada que expenden las
principales cadenas de supermercados de Santiago de Chile. El porcentaje de
muestras de carne con presencia de STEC fue de 6,6% (20/304), lo que pone de
manifiesto que el consumo de carne en Chile es un potencial riesgo para la salud
de la población infantil. Otros resultados obtenidos a partir del análisis de muestras
de hamburguesas crudas y productos carnicos de origen bovino nacionales e
importados, describieron una frecuencia de aislamiento de 4,2% (9/213) de STEC
(Alexandre et al, 1999). Es importante destacar que a pesar de haber utilizado
técnicas diagnósticas distintas en ambos trabajos, mostraron resultados similares.
Alexandre et al detectó la presencia de shigatoxinas utilizando anticuerpos
monoclonales específicos para Stx1 y Stx2 mediante la técnica de ELISA y en
nuestro estudio, se detectaron los genes específicos de los factores de virulencia
stx1, stx2 y eae, mediante PCR múltiple.
Esta tesis tuvo como objetivo no sólo detectar y aislar STEC O157 si no también
determinar la presencia de STEC no-O157, evitando la utilización de inhibidores
del crecimiento tales como novobiocina, telurito y cefixime.

Diversos estudios, en distintos países, han aislado éste patógeno desde carne,
describiendo una prevalencia de STEC O157 que fluctúa entre 0,4 a 3,7% y de
STEC no-O157 que fluctúa entre 2,4 a 30% (Hussein, 2007). Lo anterior, difiere de
nuestros resultados, debido a que del total de muestras analizadas, sólo se logró
aislar e identificar cepas no-O157. Sin embargo, Vidal et al (2010) mostraron que
de un total de 385 muestras obtenidas de heces bovinas faenadas en la Región
Metropolitana, sólo una presentó O157:H7 en su contenido intestinal. En este
sentido, un mayor número de muestras analizadas por país, probablemente
permitirían detectar O157. A pesar de ello nuestros resultados pueden deberse
también al hecho de no haber utilizado la metodología epecífica para enriquecer
aislados de STEC O157, fundamentalmente en lo referido al uso de agar
MacConkey Sorbitol (SMAC) y el enriquecimiento del medio para lograr mayor
46
sensibilidad y especificidad en el aislamiento de éste serotipo (INEI-ANLIS y OPS,
2011). Sumado a lo anterior es importante considerar que el aislamiento de STEC
desde carne es complicado debido a que éstas bacterias se encuentran en bajo
número y compitiendo con otras bacterias de la microbiota de la carne (Brusa et al,
2013).

Al analizar las muestras de carne de Chile, se logró detectar 3,4% de STEC,

similar a lo descrito por Burgos et al en el año 2003, que detectaron la presencia
de genes de shigatoxinas en el 0,89% (2/226) de las muestras de canales bovinas
nacionales faenadas en la Región Metropolitana. El menor porcentaje de
aislamiento en carnes nacionales selladas al vació, se puede explicar por la baja
colonización de STEC en bovinos de nuestro país. Esto podría estar directamente
relacionado con mejoras en la producción animal, lo que se traduce también en un
buen manejo sanitario y por lo tanto, en una disminución en la presencia de esta
bacteria (Vidal et al, 2010). Además, la mayor parte de la carne bovina que se
produce en Chile se exporta y el mercado en el cual está enfocado Chile son
principalmente países desarrollados (UE, Japón, EEUU) que tienen altos
estándares de calidad, debido a lo cual los planteles nacionales deben cumplir con
estos requisitos. Sin embargo, a pesar de la baja prevalencia de STEC en las
carnes bovinas de nuestro país, es necesario la incorporación de medidas de
control más efectivas sobre todo en las etapas críticas de producción (sacrificio y
evisceración) para disminuir el riesgo de contaminación con STEC a lo largo de la
cadena agroalimentaria y de ésta manera poder asegurar la calidad e inocuidad de
la carne nacional.

En el caso de la carne de origen importada, los resultados de los análisis

estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se asociaron
significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al vacío (OR: 5,4;
OR: 8,6 respectivamente), siendo Chile el país de comparación o de referencia.
De lo anterior se puede inferir que la posibilidad de encontrar STEC en carne
importada desde Argentina es cinco veces más que en la carne de Chile, y a su
vez, la carne proveniente de Uruguay tendría 8 veces más posibilidades de

47
presentar STEC que la carne de nuestro país. Estos resultados se pueden asociar
con un estudio realizado en Argentina por Padola et al en el año 2004, donde se
describió una alta prevalencia de STEC (63%) en bovinos de ese país lo que
podría explicar el mayor porcentaje de STEC en carnes. Además, estudios
previos realizados en Argentina reportaron un alto nivel de contaminación con
STEC en carne molida (15,3%, 11/72) donde se aislaron cepas con perfiles
altamente virulentos (Miccio et al, 2011). Otro estudio realizado en Argentina,
donde se analizó por PCR 95 muestras de hamburguesas de carne bovina
congelada, también mostraron una prevalencia de STEC significativa (8,4%)
(Gómez et al, 2002). Lo anteriormente expuesto, es relevante debido a que en
Argentina el SHU ha sido descrito desde el año 1964, siendo actualmente el país
donde se registra la mayor incidencia mundial, con más de 400 casos nuevos por
año (Miccio et al, 2011; Masana et al, 2011). En relación a Uruguay, un estudio
realizado por Varela et al en el año 2008, describió una prevalencia de 1,8%
(4/220) de STEC del serotipo O157:H7 en muestras de carne picada.
Lamentablemente no existen referencias en Uruguay que describan la presencia
de STEC no-O157, a pesar de ello, nuestros resultados muestran una prevalencia
de STEC significativamente mayor (24%, 4/17, Fig. 1).
Un estudio reciente realizado en EE.UU. mostró que el 7,3% (300/4133) de las
muestras de carne molida fueron positivas para STEC no-O157 (Bosilevac y
Koohmaraie, 2011), mientras que en Australia la tasa de positivos fue del 16%
(46/285) (Barlow et al, 2006). Estos reportes indican prevalencias mucho más
altas que las encontradas en nuestro estudio donde las muestras de carne
provenientes de Australia presentaron una baja prevalencia de STEC (4%, 2/53).
En el caso de las muestras provenientes de EEUU, en ninguna de ellas se detectó
presencia de STEC, sin embargo éste resultado no es representativo debido a la
baja cantidad de muestras recolectadas (0/3).

Por otro lado, en Brasil se ha descrito una prevalencia de STEC de 3,5% (4/114)
en muestras de carne molida (Bergamini et al 2007), porcentaje similar a lo
obtenido en este estudio en carnes provenientes de ese país (2%, 2/89). La baja
prevalencia de STEC en carne bovina podría explicar la incidencia relativamente
48
baja de SHU en Brasil (Souza et al, 2011). Sin embargo, es muy difícil comparar
las tasas de infección por STEC en los distintos países debido a las diferencias en
los métodos de detección de STEC de cada estudio, en los procedimientos de
muestreo, en el número de muestras analizadas y la técnica de aislamiento de la
bacteria, pudiendo afectar los datos de prevalencia.
Varios autores señalan que el mayor riesgo de contaminación de las
canales bovinas ocurre durante el proceso de faena, cuando el contenido intestinal
o heces tienen contacto con la superficie de la carne (Arthur et al, 2010; Edwards y
Fung, 2006). Es así como se ha descrito que la contaminación con STEC en los
cuartos posteriores de la canal bovina es significativamente mayor que en los
cuartos anteriores (Etcheverría et al, 2010). Estos datos coinciden con los
resultados de nuestro estudio pues la mayor prevalencia de STEC se observó en
los cortes pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina como por ejemplo,
ganso (29%, 4/14), abastero (18%, 4/22) y pollo ganso (17%, 4/23), determinando
que estos tipos de cortes de carne, se asociacian significativamente con la
presencia de STEC (OR= 6,7).
Nuestro estudio, realizó la búsqueda de los genes stx1 y stx2 en las
muestras de carne, detectando en un 90% el gen stx2. Este antecedente es muy
importante, debido a que la proteína Stx2 codificada en éste gen, es el principal
responsable de la falla renal en el SHU y tiene una actividad citotóxica de 100 a
1000 veces superior a Stx1 (Paton y Paton, 2002; INEI-ANLIS y OPS, 2011). Por
lo tanto, la mayor prevalencia de stx2 en aislados de STEC en carne, podría
relacionarse a un mayor riesgo de incidencia de casos clínicos más graves de esta
patología. Si bien las Stx muestran similitud en su estructura y función, cada una
de las variantes (Stx1 y Stx2) presenta grandes diferencias en su toxicidad en
tejidos celulares y especies animales. Las cepas aisladas en este estudio,
presentaron distintos genotipos de stx, predominando los genes stx1a, stx2a, stx2c y
stx2d . Estos resultados son muy relevantes debido a que éstos genes se han
asociado a cuadros clínicos severos en humanos (Friedrich et al, 2003; Jelacic et
al, 2003). En relación al gen stx2b, sólo se detectó en una de las cepas y se ha

49
asociado principalmente a cuadros diarreicos no complicados (Friedrich et al,
2003).
Por otro lado, el gen eae, que codifica para la producción de la proteína
intimina, no se logró identificar en ninguna de las cepas analizadas . Aunque la
presencia de este gen está mayormente asociada con la capacidad de las cepas
de STEC para causar cuadros graves de SHU, la síntesis de intimina no es
esencial para la patogénesis, dado que existen cepas negativas para el gen eae
que se han aislado en pacientes con SHU (Paton et al 1999). Además de la
capacidad de producir Stx e intimina, STEC puede tener otros factores de
virulencia, codificados por distintos genes que les confiere la capacidad de
adherirse a las células del epitelio intestinal. Entre estos genes de virulencia, los
más estudiados y caracterizados son ent, efa1, hlyA, iha, saa y lpf (Vidal et al,
2007).
El gen saa, fue descrito por primera vez por Paton et al en el año 2001 y
detectado en cepas STEC que carecían del gen eae. Estas cepas negativas para
la presencia de intimina igual fueron capaces de generar cuadros de SHU,
pudiendo ser la fimbria Saa un importante mecanismo de adherencia ante la
ausencia de intimina. En esta tesis, el gen saa fue detectado en el 65% de las
cepas (13/20), las cuales no poseían el gen eae, concordando con lo descrito por
Paton (2001). Además, un estudio reciente describió que gran parte de las STEC
aisladas desde carne bovina picada presentaban el gen saa (73%) y estaba
presente sólo en ausencia del gen eae (Bosilevac y Koohmaraie, 2011), resultado
similar a lo obtenido en nuestro estudio. Por otra parte, estudios realizados en
Chile han descrito al gen saa como la adhesina más frecuentemente aislada
desde productos alimenticios (Vidal et al, 2007).
Respecto al gen hlyA, también se detectó con una alta frecuencia (65%). Esta
hemolisina estaría presente en la mayoría de las STEC, tanto eae positivas como
eae negativas, pero su patogenia en cuadros de SHU es aún incierta (Nataro y
Kaper, 1998). Recientemente, se ha descrito que hlyA, está presente en el 96%
de las cepas STEC aisladas de pacientes con diarrea aguda, síndrome disentérico
y SHU, lo que sugiere que la hemolisina codificada por éste gen tiene un rol

50
importante en las cepas STEC para producir infección en humanos (Vidal et al,
2010). Además, estudios llevados a cabo en Chile y Argentina demostraron que la
mayoría de los aislados de STEC desde heces de bovino presentaron éste gen
(67,3% y 46% respectivamente) (Blanco et al, 2004; Vidal et al, 2012).

En relación al gen iha, éste se detectó en un 60% de los aislados. Sin embargo, a
pesar de estar ampliamente distribuido entre las STEC (Tarr et al, 2000), aún no
existe claridad de su importancia en la virulencia de éste patógeno (Vidal et al,
2010).
Por otro lado, si bien el gen lpf junto a stx2 han sido los factores de virulencia con
mayor asociación a cuadros graves de SHU, (Torres et al, 2009) en nuestro
estudio, ninguna de las cepas aisladas fue positiva para su detección.

Respecto a los serogrupos obtenidos en este trabajo, el 100% correspondió a

cepas STEC no-O157. En orden de mayor a menor frecuencia se identificó los
serogrupos O113, O174, O141 y O8 representando el 50% del total de cepas
aisladas. El 50% restante correspondió a serogrupos O no tipificables (NT), lo que
sugiere que podrían ser otros serogrupos que no están incluidos dentro del
esquema de tipificación serológica utilizado. Informes publicados en los últimos
25 años, sobre contaminación de carne bovina con STEC revelan que existe
alrededor de 98 serogrupos O y más de 160 serotipos diferentes (O:H). De éstos,
se han descrito 40 serotipos aislados desde pacientes con SHU (Hussein, 2007),
incluyendo las STEC O113, O174, O141 y O8 caracterizadas en nuestro estudio.
Otros resultados indican que STEC O8 y O113 también han sido aislados desde
carne picada (Bosilevac y Koohmaraie, 2011) y son serotipos que se han asociado
a casos de SHU y colitis hemorrágica a nivel mundial (Brusa et al, 2013).
En base a los resultados obtenidos en este estudio y considerando que en nuestro
país STEC es endémico y su principal mecanismo de transmisión es el consumo
de carne bovina, es importante establecer programas de control que sean
frecuentes y periódicos para mejorar la bioseguridad a nivel de predio, de
matadero y en las distintas etapas de producción. Medidas como reducir la
densidad de animales durante el transporte y en el predio, podrían evitar la

51
transmisión de cepas entre animales y hacia el ambiente. Por otro lado, evitar la
contaminación cruzada en las plantas de faenamiento, sobre todo durante la etapa
de evisceración, debiera ser una preocupación constante. A su vez, es
fundamental, la aplicación de medidas educativas y preventivas relativas al
consumo de carne bien cocida, evitar la contaminación cruzada durante la
manipulación de los alimentos y promover el consumo de productos cárnicos
frescos y procesados, que involucren conceptos de calidad e inocuidad y con ello
influir en la reducción de los casos de SHU.

Los resultados de este estudio, se pueden extrapolar al resto de las regiones

del país, pues se analizó un adecuado número de muestras de carne bovina,
la técnica que se utilizó para la detección de STEC en carne es altamente
sensible y específica, las muestras se recolectaron desde los
supermercados de Santiago, que es donde se realiza la mayor parte de las
ventas de carne en Chile, debido a que geográficamente, el mercado
agroalimentario se encuentra concentrado en aquellas zonas donde habita la
mayor parte de la población chilena.

52
 CONCLUSIONES

• Existe presencia de STEC en muestras de carnes bovinas selladas al

vacío (6,6 %) de procedencia nacional e importada que están a la venta en
los supermercados de Santiago.

• Las muestras de carne bovina chilena presentan un bajo porcentaje de

STEC.

• Los análisis estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se

asociaron significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al
vacío, independiente del tipo de corte (p< 0,05).

• Los cortes de carne pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina,

se asocian significativamente con la presencia de STEC, independiente del
país de origen (p<0,05).

• Las cepas aisladas en este estudio, presentan serogrupos y genes de

virulencia (toxinas y adhesinas) previamente descritos en cepas de STEC
aisladas de casos clínicos de CH y SHU en humanos.

• Los resultados obtenidos en este estudio, ponen de manifiesto que el

consumo de carne mal cocida es un potencial riesgo para la salud de la
población infantil y adulto mayor.

53
 RECOMENDACIONES

 Incluir STEC en el Reglamento Sanitario Chileno de Alimentos orientado a

la búsqueda de los genes de shigatoxinas.

 Realizar controles a la carne bovina importada y nacional, para detectar la

presencia de STEC.

 Se sugiere exigir, a los proveedores de carne bovina nacionales y

extranjeros, el muestreo y análisis de STEC durante la faena en los
establecimientos de origen.

 Informar a personal de frigoríficos sobre los riesgos que implica la infección

por STEC.

 Evitar la contaminación cruzada en las plantas de faenamiento, sobre todo

durante el proceso de desosado y evisceración

 Fomentar campañas de prevención y educación en jardines infantiles,

colegios y consultas pediátricas, relativas al consumo de carne bien cocida,
evitar contaminación cruzada durante la manipulación de alimentos, con el
fin de disminuir el riesgo de SHU.

54
 REFERENCIAS

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65
 LISTA DE ABREVIATURAS

APT: Agua Peptonada Tamponada

CSB: Cell Suspension Buffer

CH: Colitis hemorrágica

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato

DAEC: Escherichia coli de adherencia difusa

ECD: Escherichia coli diarreogénica

EaggEC : Escherichia coli enteroagregativa

EDTA: Acido etilendiaminotetraacético

EIEC: Escherichia coli enteroinvasiva

EPEC: Escherichia coli enteropatógena

ETEC: Escherichia coli entoretoxigénica

LB: Agar Luria-Bertani

mM: milimolar

mg: Miligramos

ml: Mililitro

nm: Nanomolar

NaCl: Cloruro de Sodio

pb: Pares de bases nucleotídicas

P/V: Peso/Volumen

66
PFGE: Pulsed field gel electrophoresis (Elecroforesis en gel de campo
pulsado)

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

rpm: Revoluciones por minuto

SHU: Síndrome hemolítico urémico

SDS: Sodium Lauryl Sulfate

STEC: Escherichia coli productor de shigatoixina

TBE: Tris Borato EDTA

TSA: Agar Triptona-Soja

U: Unidad

V/cm: Volts por centímetro

V/V: Volumen/Volumen

µM: Micromolar

µl: Microlitro

µg: Microgramo

67
 ANEXO 1

Tabla 1. Mezcla de PCR múltiple para detección de los genes stx1/stx2/eae

Reactivo Concentracion de Volumen del reactivo por

trabajo del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5
MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor Stx1 R 10µM 0,4
Partidor Stx1 Fw 10µM 0,4
Partidor Stx2 Rw 10µM 0,2
Partidor Stx2 Fw 10µM 0,2
Partidor eae Rw 10µM 0,2
Partidor eae Fw 10µM 0,2
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 13,275
DNA 1,5
Volumen final 25

Tabla 2. Programa de PCR múltiple stx1/stx2/eae

Temperatura Ir al paso N°de

Paso N° Etapa °C Tiempo N° ciclos
1 Denaturación inicial 94 3 min
2 Denaturación 94 1,30 seg
3 Alineamiento 58 1,15 seg
4 Extensión 72 1 min 2 35
5 Extensión final 72 7 min
6 Pausa 4

68
 ANEXO 2

Tabla 1. Mezcla de PCR múltiple para la detección de las variantes de stx1

Reactivo Concentración de Volumen del reactivo

trabajo del reactivo por reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor Stx1a F1 5µM 1
Partidor Stx1a R2 5µM 1
Partidor Stx1c F1 5µM 0,5
Partidor Stx1c R1 5µM 0,5
Partidor Stx1d F1 5µM 0,25
Partidor Stx1d R2 5µM O,25
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 11,875
DNA 1
Volumen final 25

69
Tabla 2. Mezcla de PCR para la detección del gen stx2a

Reactivo Concentracion de Volumen del reactivo por

trabajo del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor Stx2a F1 5µM 0,625
Partidor Stx2a R3 5µM 0,625
Partidor Stx2a R2 5µM 0,625
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 13,5
DNA 1
Volumen final 25

Tabla 3. Mezcla de PCR simple para la detección de las variantes stx2b, stx2c,
stx2e, stx2f y stx2g

Reactivo Concentracion de Volumen del reactivo por

trabajo del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5
MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor F 5µM 0,625
Partidor R 5µM 0,625
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 14,125
DNA 1
Volumen final 25

70
Tabla 4. Mezcla de PCR para la detección del gen stx2d

Reactivo Concentracion de Volumen del reactivo por

trabajo del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor Stx2d F1 5µM 0,625
Partidor Stx2d R1 5µM 0,625
Partidor Stx2d R2 5µM 0,625
Partidor Stx2d 055-R 5µM 0,625
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 12,875
DNA 1
Volumen final 25

71
Tabla 5. Programa de PCR múltiple para la detección de las variantes
stx1a/stx1c/stx1d

Paso Ir al paso N°de

N° Etapa Temperatura °C Tiempo N° ciclos
Denaturación
1 inicial 95 4 min
2 Denaturación 94 50 seg
3 Alineamiento 62 40 seg
4 Extensión 72 1 min 2 35
5 Extensión final 72 3 min
6 Pausa 4

Tabla 6. Programa de PCR múltiple para la detección de las variantes del

gen stx2

Paso Temperatura Ir al paso N°de

N° Etapa °C Tiempo N° ciclos
Denaturación
1 inicial 95 4 min
2 Denaturación 94 50 seg
Ver Tabla 3
3 Alineamiento Metodología 40 seg
4 Extensión 72 1 min 2 35
5 Extensión final 72 3 min
6 Pausa 4

72
 ANEXO 3

Tabla 1. Mezcla de PCR para detección de E. coli O157

Reactivo Concentracion de trabajo Volumen del reactivo por

del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor O157 R 10µM 0,5
Partidor O157 F 10µM 0,5
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 13,875
DNA 1,5
Volumen final 25

Tabla 2. Programa de PCR para la detección de E. coli O157

Temperatura N°de
Paso N° Etapa °C Tiempo Ir al paso N° ciclos
1 Denaturación inicial 95 5 min
2 Denaturación 94 30 seg
Alineamiento o unión de
3 partidores 66 30 seg
4 Extensión 72 30 seg 2 35
5 Extensión final 72 5 min
6 Pausa 4

73
 ANEXO 4

Tabla 1. Mezcla de PCR para la detección de los genes efa1 no-O157 y ent

Reactivo Concentración de trabajo Volumen del reactivo por

del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor R 10µM 0,5
Partidor F 10µM 0,5
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 14,375
DNA 1
Volumen final 25

Tabla 2. Mezcla de PCR para la detección del gen saa

Reactivo Concentración de trabajo Volumen del reactivo por

del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 1,5
dNTPs 10 mM 1
Partidor R 10µM 1
Partidor F 10µM 1
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 14,375
DNA 1
Volumen final 25

74
 Tabla 3. Mezcla de PCR para la detección de los genes hlyA, iha, efa1 y lpf.

Reactivo Concentración de trabajo Volumen del reactivo por

del reactivo reacción (µL)
Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 1,5
dNTPs 10 mM 0,5
Partidor R 10µM 0,5
Partidor F 10µM 0,5
Taq polimerasa 5 U/µL 0,125
Agua sin nucleasa 15,875
DNA 1
Volumen final 25

Tabla 4. Programa de PCR para la detección de los genes efa1, lpf, saa, hlyA,
iha, ent y efa1 no-O157.

Paso Temperatura Ir al paso N°de

N° Etapa °C Tiempo N° ciclos
Denaturación
1 inicial 94 3 min
1,30
2 Denaturación 94 seg
Ver tabla 5 1,15
3 Alineamiento Metodología seg
4 Extensión 72 1 min 2 35
5 Extensión final 72 7 min
6 Pausa 4

75
 ANEXO 5

Tabla 1. Trazabilidad de las muestras de carne bovina con precencia de

STEC

País de origen Frigorífico Supermercado Comuna Perfil toxigénico Serogrupo

Argentina F1 A Santiago stx1a, stx2a, saa, hlyA. O174

stx1a, stx2a, stx2c, NT

hlyA, iha

Argentina F1 B Santiago stx1a, stx2a, saa, hlyA, O113

iha.
Chile F2 A Providencia stx1a, stx2a NT

stx1a, stx2a NT
Australia F3 A Providencia stx2 *
Uruguay F4 B Santiago stx2 *
Uruguay F4 B Santiago stx1a, stx2a, stx2c, O174
stx2d, saa, hlyA, iha

stx1a, stx2c, stx2d, O113

saa, iha

stx1a, stx2a,stx2c,
NT
stx2d, saa
Uruguay F5 B El Bosque stx2 *
Chile F6 A La Reina stx1a, stx2a, NT
stx2c,stx2d, saa, hlyA

stx1a, stx2a, stx2c, O113

stx2d, saa, hlyA, iha

Brasil F7 C Las Condes stx2 *

* Cepa no aislada
NT: No tipificable

76
Continuación Tabla 1. Trazabilidad de las muestras de carne bovina con
presencia de STEC.

País de origen Frigorífico Supermercado Comuna Perfil toxigénico Serogrupo

Australia F8 C Las stx1a, stx2a, stx2c, O141
Condes stx2d, saa, hlyA, iha

stx1a, stx2c, saa, NT

hlyA, iha

stx1a, stx2a, stx2c,

O113
stx2d, saa, hlyA, iha
Argentina F9 D Las stx2 *
Condes
Argentina F10 E Maipú stx2b, stx2c, iha NT
Argentina F10 E Maipú stx1 *
Brasil F7 E Las stx2 *
Condes
Argentina F11 E Las stx2 *
Condes
Argentina F12 D San stx2c, hlyA O113
Miguel
Argentina F12 D San stx2c, iha NT
Miguel
Uruguay F13 D San stx2c, iha NT
Miguel
Chile F14 A La Pintana stx1 *
Argentina F1 C La Reina stx1a, stx2a, stx2d, O8
saa, hlyA

stx1a, stx2a, saa, O113

hlyA, iha

stx1a, stx2a, saa,

NT
hlyA

* Cepa no aislada
NT: No tipificable

77