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1.

PRÁCTICA: 12

2. UNIDAD CURRICULAR: UNIDAD 3

3. TÍTULO: Reacciones de precipitación de las proteínas

4. OBJETIVOS:

 Identificar cualitativamente a las proteínas mediante el uso de sus reacciones de


precipitación
 Determinar los factores que favorecen la precipitación de una proteína mediante la
influencia de su estructura química.

5. MÉTODOS Y FUNDAMENTOS:

La precipitación de las proteínas puede ser producto de algunos factores. El más común
corresponde a la desnaturalización de esta, en donde su estructura tridimensional sufre
cambios y transformaciones debido a varios factores, provocando su insolubilización y
posterior precipitación. (Badui, 2006).

Salificación de las proteínas


Al agregarse soluciones salinas con electrolitos, se produce el efecto de salinización
(Chediak, 1983). Este fenómeno se produce cuando los cationes y aniones de la sal
interaccionan electroestáticamente con la molécula de proteína al interactuar con
aminoácidos y zonas cargadas que estabilizan el plegamiento de la proteína. En muchos
casos, la concentración de los iones también influye, (Badui, 2006). Cuando las
concentraciones aumentan (>1M), muchas proteínas como las globulinas se vuelven
insolubles y precipitan (Chediak, 1983). Los mecanismos de acción de precipitación
comprenden de dos factores. El primero, como ya se mencionó, corresponde a la anulación
de la carga de la proteína volviéndola neutra y disminuyendo su estabilidad. El segundo
factor influyente consiste en que los diferentes iones, especialmente iones alcalinos, logran
estructurar en mayor o menor grado las cantidades de agua que existen alrededor de la
proteína, lo que provoca en muchos casos la deshidratación de la envoltura de agua
provocando desestabilidad y posterior precipitación. Además de las altas concentraciones,
la naturaleza de la sal influye, de manera que aquellas sales de amonio o con iones de
metales alcalinos tienen a desestabilizar en mayor grado la estructura de la proteína (Badui,
2006). Las disoluciones de sales de sulfato amónico provocan salificación en casi todas
las proteínas. En el caso de globulinas precipitan en una solución semisaturada de la sal,
mientras que las albúminas se precipitan en una saturación absoluta. Los cloruros de sodio
y potasio, así como sulfato de magnesio, precipitan las globulinas en estado de saturación.
Este proceso es reversible ya que al reducirse la concentración de las sales presentes en
el medio, la proteína vuelve a retomar su estructura original. Esto generalmente se lo hace
aumentando la concentración de agua o por diálisis (Jibaja, 2016).
Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados.
Bajo la influencia de los iones de las sales de metales pesados (Pb, Cu, Ag, Hg, etc.), las
proteínas desde el estado de sal coagulan irreversiblemente en gel. Los iones de las sales
de metales pesados forman con las proteínas compuestos complejos estables. Además,
los metales pesados anulan la carga eléctrica y, por lo visto, cambian profundamente la
estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína. (Jibaja, 2016)
Para la precipitación de las proteínas con sales de metales pesados se necesitan bajas
concentraciones y pequeñas cantidades de estas sales. La capacidad de las proteínas de
enlazar los metales pesados se aprovecha ampliamente en la práctica medicinal y
veterinaria (Jibaja, 2016)

Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.


Los ácidos minerales concentrados (menos el ácido fosfórico) causan precipitación
irreversible de las proteínas desde sus disoluciones. Esta precipitación se explica por el
fenómeno de la deshidratación de las partículas coloidales de proteína, la anulación de su
carga, formación de sales de la proteína y el ácido, etc. (Jibaja, 2016)

Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos.


La precipitación de las proteínas con ayuda de ácido tricloroacético de concentración final
de 2,5 a 5% se usa para eliminar completamente las proteínas desde los líquidos
biológicos u homogeneizados de los tejidos, puesto que el ácido tricloroacético precipita
sólo las proteínas, mientras que los productos de su desintegración (metabolismo), esto
es, la urea, el ácido úrico, las amidas de los aminoácidos, los aminoácidos, los péptidos
de bajo peso molecular etc., se quedan en disolución. Esto tiene importancia para
determinar por separado el nitrógeno proteínico y no proteínico (restante) en los tejidos.
(Jibaja, 2016)

Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona


Ellos desplazan las proteínas de las disoluciones acuosas. El mecanismo de acción del
alcohol y otros disolventes orgánicos puede ser explicado por la deshidratación de las
micelas de proteína, lo que conduce a la merma de su estabilidad en disolución.
Si la precipitación se hace en frío y el precipitado se separa rápidamente del alcohol,
entonces, la proteína puede ser de nuevo disuelta en agua, es decir, sus propiedades no
varían, la desnaturalización no logra realizarse, y la precipitación resulta ser reversible.
Durante una estancia prolongada con alcohol, la proteína se desnaturaliza y se vuelve
insoluble en el disolvente inicial. (Jibaja, 2016).

6. PARTE EXPERIMENTAL

6.1 Instrucciones previas


Es obligatorio el uso de prendas de seguridad: mandil, guantes de nitrilo o látex,
mascarilla en el caso de que los reactivos o las reacciones desprendan gases, y gafas
protectoras.

6.2 Equipos, materiales y reactivos

Materiales y equipos Reactivos Muestra


 Arena de vidrio  Acetato de plomo 0,5%  Disolución de proteína
 Embudo  Acetona  Suero de sangre o
 Mortero con pistilo  Ácido acético 1% disolución de clara de
 Papel filtro  Ácido clorhídrico huevo
 Soporte con tubos de concentrado
ensayo  Ácido nítrico concentrado
 Ácido sulfosalicílico 20%
 Ácido sulfúrico
concentrado
 Ácido tricloroacético 5%
 Agua destilada
 Cloruro de sodio cristales
 Etanol 96°
 Hidróxido de sodio 10%
 Reactivo de Biuret
 Sulfato de amonio
cristales
 Sulfato de amonio
saturada
 Sulfato de cobre 1%
 Sulfato de magnesio
cristales

6.3 Procedimiento

 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico.


En un tubo de ensayo se vierten 2 o 3 mL de suero de la sangre o de disolución diluida de
clara de huevo, se añade igual volumen de disolución saturada de sulfato amónico y se
agita. Se precipitan unas proteínas: las globulinas. Luego de 5 o 7 min, el contenido de los
tubos de ensayo se filtra. En el filtrado quedan las albúminas y sobre el filtro, las globulinas.
Para precipitar las albúminas, al filtrado se le añade sulfato amónico cristalino hasta la
saturación completa, es decir, hasta que quede un polvo no soluble. Se precipitan las
albúminas que se separan por filtración.
Con 2 o 3 mL de filtrado se hace la reacción de Biuret. La reacción negativa indica la
ausencia de proteínas en el filtrado y la plenitud de la precipitación.
El precipitado de albúminas junto con el filtro se traslada a un tubo de ensayo y se disuelve
en 4 o 5 mL de agua, agitando el tubo de ensayo.
La disolución de albúminas se filtra; con ella se hace la reacción de Biuret.

 Precipitación reversible de las proteínas con sulfato amónico


En el tubo de ensayo se vierten 2 o 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida.
Se agregan 2 o 3 mL de disolución saturada de sulfato amónico y se agita. Se precipitan
proteínas. Entonces se añade igual volumen de agua destilada, se mezcla bien y se observa
la desaparición paulatina del precipitado de proteínas.

 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio


En dos tubos de ensayo se vierten 2 o 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida
en cada uno. En uno de los tubos de ensayo se añade, hasta la saturación completa, el
cloruro sódico y en el otro, el sulfato de magnesio. Al cabo de 2 o 3 min en ambos tubos
aparece el precipitado de globulinas. El contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el
filtrado quedan las albúminas que en disoluciones neutras no son precipitadas por dichas
sales incluso con saturación completa.
Al filtrado se le añaden 4 o 6 gotas de disolución de ácido acético al 1 %, entonces, las
albúminas se precipitan. Al pasar 5 min, estas se filtran. Por medio de la reacción del Biuret
se comprueba la ausencia de las proteínas en el filtrado.

 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados.


En tres tubos de ensayo se vierten en cada uno de 1 a 2 mL de disolución de proteína. En
el primer tubo se añade, gota a gota, la disolución de acetato de plomo; en el segundo la
de sulfato cúprico; en el tercero la de nitrato de plata. En los tres tubos se forman
precipitados de proteínas.
En los tubos de ensayo con los precipitado obtenidos con acetato de plomo y sulfato cúprico
se añade el exceso de estas sales, observándose, entonces, la disolución de los
precipitados.

 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.


En 3 tubos de ensayo se vierten con cuidado 1 mL de ácidos en cada uno: ácido clorhídrico
en el primero, ácido sulfúrico en el segundo y el nítrico en el tercero.
En todos los tubos de ensayo se aplica con cuidado sobre el ácido una capa de disolución
de proteína (alrededor de 1 mL). En el contacto de dos líquidos aparece un precipitado de
proteínas en forma de pequeño círculo (anillo) blanco.
Cada tubo de ensayo se agita con cuidado. El precipitado se disuelve en los dos primeros
tubos de ensayo donde hay exceso de ácidos clorhídrico y sulfúrico; en el tercer tubo, que
contiene ácido nítrico, el precipitado no desaparece en el curso de la agitación, ya que las
proteínas no se disuelven en el exceso de ácido nítrico.

 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos.


En dos tubos de ensayo se vierten 1 o 2 mL de disolución de proteína y se añaden al primer
tubo varias gotas de disolución de ácido tricloroacético al 5 % y al segundo, varias gotas de
ácido sulfosalicílico. Los tubos de ensayo se agitan y se observa la precipitación de la
proteína.

 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona


En dos tubos de ensayo se vierten 1 o 2 mL de disolución de proteína, con cucharita se
añade un poco (0.2 o 0.3 g) de cloruro sódico y se agita enérgicamente.
Al primer tubo de ensayo se añaden gradualmente (gota a gota) 2 o 3 mL de alcohol, y al
segundo, 2 o 3 mL de acetona.
Los tubos se agitan enérgicamente y después de 3 o 6 min se observa la formación de un
precipitado fino de proteínas.

7. BIBLIOGRAFÍA
Badui, S (2006). Química de Alimentos (4ta edición). México D.F: Pearson Educational.
Pág. 164 – 175.

Chediak, R (1984). Bioquímica Clínica. Universidad Central del Ecuador. Quito: Editorial
Universitaria. Pág. 171.

Jibaja, G (2016). Guía de Prácticas de Laboratorio Bioquímica I (antigua versión).


Universidad Central del Ecuador. Quito

Práctica 13: R eaccion es de r econ ocimiento d e am inoácid os

1. PRÁCTICA: 13

2. UNIDAD CURRICULAR: UNIDAD 3

3. TÍTULO: Reacciones de reconocimiento de aminoácidos

4. OBJETIVOS:

 Identificar diversos aminoácidos mediante reacciones químicas.


 Conocer las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos.

5. MÉTODOS Y FUNDAMENTOS:

Se conoce como aminoácidos a aquellos ácidos orgánicos, cuyo objetivo principal es


conformar proteínas, todos los aminoácidos componentes de proteínas se conocen como
alfa aminoácidos. (Lehninger, 2000)

Ensayo xantoprotéico
La reacción xantoproteica (del griego <xanthos>, amarillo) permite descubrir la presencia
en la molécula de proteína de los aminoácidos cíclicos (fenilalanina, tirosina y triptófano).
La presencia de estos aminoácidos en la molécula de la proteína, da lugar a la reacción.
Los anillos aromáticos de los aminoácidos se someten a la nitración que lleva a la
formación de los derivados nitro de las proteínas, coloreados de amarillo.
La reacción xantoproteica la dan los compuestos aromáticos sencillos: el benceno y sus
homólogos, le fenol, etc.
La tirosina por nitración se convierte en nitro tirosina, a partir de la cual, bajo la influencia
del álcali, se forma una sal amónica que tiene agrupamiento quinoidal (Jibaja, 2016)
O
OH O ONa
H +HO NO2 OH
N + NaOH N
O O
NH2 -H O -H2O
2
NH2 NH2
CH2 CH COOH CH2 CH COOH
CH2 CH COOH

Tirosina Nitrotirosina

Ensayo de la tirosina
La reacción se debe a la presencia, en la molécula de proteína, de la tirosina que tiene en
su composición un grupo fenólico. Éste por calentamiento con el reactivo Millon (una mezcla
de nitrato y nitrito mercúricos disueltos en ácido nítrico concentrado) proporciona una
coloración roja al coágulo.
El quimismo de la reacción se reduce a la formación de la nitrosa tirosina que, adicionando
el mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.

OH OHg
Hg+2 . HNO3
N O
+ HgNO2 + H2O

CH2 CH2
H2N CH COOH H2N CH COOH

Tirosina Compuesto mecúrico de


nitrotirosina
Casi todas las proteínas dan la reacción de Millon, puesto que en su composición entra el
aminoácido de tirosina que es un fenol. (Pato, 2008)

Ensayo del triptófano


El triptófano es un aminoácido aromático, el grupo R contiene una estructura heterocíclica
denominada indol, el indol es un anillo bencénico fusionado con los enlaces C2-C3 del pirrol.
Es un aminoácido no polar y según su conformación es de esperar que también reaccione
a la prueba xantoproteica.
El Reactivo de Adamkiewick es una disolución de Ácido Glioxilico en agua que al mezclarse
con el triptófano el grupo carbonilo del ácido glioxilico se condensa con el grupo
indol generando un color purpura en presencia de ácido sulfúrico(H2SO4) como agente
deshidratante. Se observó claramente una coloración violeta en la interface del ácido
sulfúrico y la solución debido a una reacción especifica con el grupo -R (indol) del triptófano,
como reacción específica para este aminoácido.
El triptófano puro no da la reacciona menos que contenga indicios de iones férricos o
cúpricos. Los cloratos, nitratos, nitritos y cloruros en exceso impiden la reacción (Enriquez,
2011).

Reacción de los aminoácidos que contienen azufre


En la composición molecular de la mayoría de las proteínas entran aminoácidos que
contienen azufre: la cisteína, cistina y metionina. Al calentarse con álcali, de estos aminoá-
cidos se desprende azufre en forma de sulfuro de hidrógeno que se detecta en la reacción
con el acetato de plomo (Jibaja, 2016):
H2C SH H2C OH
1)
HC NH2 + 2NaOH HC NH2 + Na2S + H2O
H2C COOH H2C COOH

2) Na2S + (CH3COO)2Pb 2CH3COONa + PbS

Reacción de reconocimiento del glutatión


El glutatión es un tripéptido compuesto de los restos del ácido glutámico, la cisteína y la
glicina:
O O
C CH2 NH C CH2 O
CH2 C CH NH C
HO
O H2C OH

SH
En los tejidos y células del organismo animal el glutatión se encuentra en forma reducida
(como tripéptido G—SH) y en forma oxidada (como tripéptido GS—S—S—G). La reducción
del glutatión se realiza a través de la reacción con el DANPH2:

G  S  S  G  DANPH2  2G  SH  DANP

En el organismo el glutatión se oxida, interaccionando con los aminoácidos de proteínas.


La función más importante del glutatión es mantener en el estado reducido los grupos tioles
de la cisteína en las proteínas. Esta reacción se describe con la ecuación siguiente:
- S  S  2G  SH  HS SH  GSSG
R R
Proteína glutatión proteína glutatión
reducido oxidado

El glutatión puede servir de agente de transferencia de hidrógeno intermediario en las


reacciones de oxidación del aldehído fosfoglicérico y de activador de una serie de enzimas
(proteinasas). Sobre la catalasa, fosfatasa y algunas otras enzimas el glutatión ejerce una
acción inhibidora.
Contienen glutatión la sangre, el hígado, los músculos, los riñones, las glándulas
suprarrenales y otros órganos. En la sangre de los animales sanos se contiene de 4,4 a
32,3 mg de glutatión, mientras que por ejemplo en la sangre de las vacas enfermas de
cetosis su contenido alcanza a 22,5-23,2 mg. Estos indicadores reflejan la alteración de los
procesos de oxidación-reducción en los tejidos del animal.
El principio del método. En el medio alcalino del glutatión se desprende el sulfuro sódico
que, al combinarse con el nitro prusiato de sodio, forma un compuesto de color carmesí
(Rodríguez, 2003)

  
2Na FeCN5NO  Na S  2Na FeCN5NO  S
2 2

Nitroprusi ato de sodio Complejo coloreado

Diazorreaccion de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la histidina


Con el diazorreactivo las proteínas dan una coloración roja anaranjada. El color depende
de la formación de los azocompuestos coloreados a partir de los restos de aminoácidos, la
tirosina, el triptófano y la histidina que forman parte de la composición de la molécula
proteínica.
La diazorreacción se emplea para la determinación cuantitativa y cualitativa de la tirosina e
histidina en los hidrolizados proteínicos (Jibaja, 2016).

6. PARTE EXPERIMENTAL

6.1 Instrucciones previas

Es obligatorio el uso de prendas de seguridad: mandil, guantes de nitrilo o látex,


mascarilla en el caso de que los reactivos o las reacciones desprendan gases, y gafas
protectoras.

6.2 Equipos, materiales y reactivos

Materiales y equipos Reactivos Muestra


 Arena de vidrio  Acetato de plomo 0,5%  Disolución de proteína
 Mortero con pistilo  Ácido nítrico concentrado  Clara de huevo
 Soporte con tubos de  Ácido sulfúrico  Tejido (hígado fresco
ensayo concentrado res, pollo)
 Amoníaco concentrado
 Carbonato de sodio 10%
 Fenol 0,1%
 Gelatina 1%
 Hidróxido de sodio 20%
 Nitroprusiato de sodio 2%
 Reactivo de millón
 Reactivo diazo
 Sacarosa 10%
 Sulfato de amonio
saturada

6.3 Procedimiento

 Ensayo xantoprotéico
Primeramente, se efectúa la reacción con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL
de la disolución de fenol y se añaden 1 o 2 mL de ácido nítrico concentrado. Se calienta
con cuidado, manifestándose un color amarillo.
En el otro tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de proteína, aproximadamente, y
se añaden de 6 a 10 gotas de ácido nítrico concentrado. Bajo la influencia del ácido aparece
el precipitado de proteína que al enfriarse adquiere una coloración amarilla. Luego el tubo
de ensayo se deja enfriar y se le añade, con cuidado, un exceso de hidróxido sódico o de
amoniaco. Esto hace que la coloración amarilla se convierte en anaranjada.

 Ensayo de la tirosina
Primeramente, se hace el experimento con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL
de disolución de fenol y 1 mL de reactivo de Millon, calentándose lentamente. Aparece una
coloración rosada. A continuación, se realiza la reacción con proteína. En el otro tubo de
ensayo se vierten 2 mL de disolución de proteína y se añaden 6 a 8 gotas de reactivo Millon.
Al principio aparece un precipitado de proteína que al calentarse toma un color rojo ladrillo.
Debe evitarse el exceso de reactivo Millon, ya que el ácido nítrico puede dar coloración
amarilla (reacción xantoproteica) que enmascara la reacción de la tirosina.
De manera análoga se efectúa la reacción con disolución de gelatina. Como regla, la
reacción de Millon con gelatina es negativa

 Ensayo del triptófano


En el tubo de ensayo se vierte 1 mL de disolución de proteína, aproximadamente, y se
añaden 2 gotas de disolución de sacarosa. Luego mediante la pipeta se deja bajar al fondo
1 mL de ácido sulfúrico concentrado. En el contacto de los líquidos aparece una coloración
guinda roja en forma de un anillo.
La esencia de la reacción se reduce a que bajo la influencia del ácido sulfúrico ocurre la
hidrólisis de la sacarosa hasta monosacáridos que se deshidratan, convirtiéndose en
hidroximetilfurfural. El triptófano, al combinarse con el hidroximetilfurfural, forma un
complejo de color guinda rojo.

 Reacciones de los aminoácidos que contienen azufre


En un tubo de ensayo se vierten 1 o 2 mL de clara de huevo y se añade igual volumen de
disolución de hidróxido sódico, se calienta hasta la ebullición y se agregan 1 o 2 gotas de
acetato de plomo. Se observa un oscurecimiento paulatino de la disolución.

 Reacciones de reconocimiento del glutatión


En el mortero se trituran cerca de 1 g de hígado con una pequeña cantidad de polvo de
vidrio y 3 o 4 mL de disolución saturada de sulfato amónico. El contenido del mortero se
divide en dos porciones iguales que se ponen en dos tubos de ensayo. El tubo de ensayo
1 sirve de control, él se calienta hasta la ebullición para desnaturalizar las proteínas y el
glutatión. En el tubo de ensayo 2 (experimental) el glutatión queda intacto. En ambos
tubos se añaden 2 mL de amoníaco y 1 mL de disolución de nitro prusiato de sodio. En el
tubo de ensayo 2 se observa la aparición de una coloración carmesí.

 Diazoreacción de reconocimiento de la tirosina, triptófano y la histidina


En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de tirosina, 0,5 mL de disolución de
carbonato de sodio al 10% y 1 mL de reactivo diazo. Aparece una coloración roja anaran-
jada.
De manera análoga se efectúa con la proteína utilizando la disolución de proteína en lugar
de la de tirosina. En este caso también aparece una coloración roja anaranjada.

7. BIBLIOGRAFÍA

Enriquez, A. (2011). Pruebas Cualitativas para Aminoácidos y Proteínas. Obtenido de


http://angela-bioqumica.blogspot.com/2011/09/objetivos-1.html

Lehninger. (2000). Principios de bioquimica. Barcelona: Omega.

Pato, P. (2008). Bioquimica II. Buenos Aires: Alfa.

Jibaja, G (2016). Guía de Prácticas de Laboratorio Bioquímica I (antigua versión).


Universidad Central del Ecuador. Quito

Rodríguez-Sotres, R. (2003). La estructura de las proteínas. Venezuela: Adventure works.