7/11/2019 Determinación de teobromina, teofilina y cafeína en muestras de cacao mediante un método cromatográfico líquido de alto rendimiento c…

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Comida
Química
Food Chemistry 100 (2007) 459–467
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Determinación de teobromina, teofilina y cafeína en

muestras de cacao por cromatografía líquida de alto rendimiento
método con limpieza de muestra en línea en un sistema de columnas de conmutación
María del Rosario Brunetto a, * , Lubin Gutiérrez a , Yelitza Delgado a , Máximo Gallignani a ,
si si si si
Alexis Zambrano A´lvaro Gómez Gladys Ramos Carlos Romero
a IVAIQUIM (Instituto Venezolano Andino de Investigación Química), Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes,
PO Box 3 Ipostel La Hechicera, Mérida 5101-A, Venezuela
b Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA) Mérida, Venezuela. AV. Urdaneta Edif. Ministerio de Agricultura y Tierras,
PO Box 425 Ipostel, Mérida, 5101-A, Venezuela1

Recibido el 25 de febrero de 2005; recibido en forma revisada el 6 de octubre de 2005; aceptado el 14 de octubre de 2005

Resumen

Se desarrolló un método simple de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa para la determinación de teobromina,
teofilina y cafeína en muestras de cacao. En el paso de limpieza de la muestra, el procedimiento implica una extracción en línea de analitos en fase sólida
desde muestras de cacao a una precolumna casera envasada en seco con ODS-C 18 utilizando un sistema de cambio de columna. La separación fue
realizado en una columna C 18 Nova-Pak (150 mm × 3.9 mm, 4 μm) usando una fase móvil que consiste en una solución de 20% de metanol en agua
en condiciones isocráticas, a un caudal de 1,4 ml / min. El método de validación reveló recuperaciones cuantitativas (> 95.0%) con coeficientes
de variación <3.2% y también proporcionó una buena precisión para la validación de datos. La superposición de la muestra de limpieza, análisis y reacondicionamiento de la
precolumna aumenta el rendimiento de la muestra a 8 muestras / h. Además, el método propuesto se aplicó con éxito al análisis de
Muestras de cacao '' Trinitario '', '' Forastero '' y '' Criollo '' cultivadas en diferentes estaciones del año y fermentadas durante 3 y 7 días, respectivamente.
Los resultados mostraron una ligera reducción en el contenido de teobromina y cafeína de acuerdo con los tiempos de fermentación. Del mismo modo, el
Se evaluó la relación teobromina / cafeína, con el fin de establecer una correlación con el genotipo de las muestras estudiadas.
© 2005 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Cacao; Teobromina, cafeína; Teofilina; HPLC; Extracción de fase sólida; Cambio de columna

1. Introducción Mejorar el cacao de forma competitiva. La medida actual

La calidad de los granos de cacao depende de muchos factores.
como el genotipo, el manejo agronómico, el suelo
factores, las condiciones climáticas y lo más importante
tecnología poscosecha. De esta forma, la calidad del cacao.
el sabor y el aroma de los frijoles dependerán de las habilidades y del buen
cuidado por los técnicos a cargo. Es importante
Los criterios de calidad y de calidad no reflejan objetivamente la multa
atributos de sabor; aumentan los problemas de fabricación
Los vendedores y distribuidores se enfrentan a clasificar y estandarizar sus
productos Debido a esto, es necesario evaluar
Parámetros icos, quimicos y organolépticos, que permiten
nosotros para determinar la calidad del cacao con respecto al genotipo
y el medio ambiente

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mencionar que las comunidades venezolanas e internacionales
han estado implementando medidas de mejor calidad para
1 Proyecto ICCO-CFC-INIA.
* Autor correspondiente. Tel .: +58 274 715 415; Fax: +58 274 271 4223.
Dirección de correo electrónico: brunetto@ula.ve (MR Brunetto).
0308-8146 / $ - ver portada © 2005 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
doi: 10.1016 / j.foodchem.2005.10.007
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desarrollado para la determinación simultánea de estos
tres metilxantinas La cromatografía líquida es cómo
nunca, el método más utilizado en la actualidad. Más
de los procedimientos empleados anteriormente se basaron en
separación cromatográfica de fase inversa con ultravioleta
dejar detección de absorbancia (Bispo et al., 2002; Hurst, Snyder,
& Martin, 1985; Parra, Limon, Ferre, Guix y Jane, 1991;
Pura Naik, 2001; Terada y Sakabe, 1984; Thomas, Yen,
Schantz, Porter y Sharpless, 2004; Vergnes y Alary,
1986; Zambonin, Aresta y Palmisano, 2004), especificación de masa
detección trométrica ( Hieda, Kashimura, Hara y Kageura,
1995 ) y detección amperométrica (Meyer, Ngiruwon-
Sanga y Henze, 1996) La separación de estos compuestos.
también podría lograrse mediante un par iónico o interacción iónica,
o cromatografía iónica junto con detección UV ( Blan-
Chard et al., 1990; Gennaro y Abrigo, 1992; Gennaro
et al., 1992; Lauff, 1987; Qin-Chuan Chen y Jing Wang,
2001; Qin-Chuan Chen, Shi-fen Mou, Xiao-ping Hou y
Zhe-ming Ni, 1998) En la mayoría de los casos, sin embargo, estos métodos
implican pasos de pretratamiento tediosos y laboriosos antes
La determinación cromatográfica. La extracción de
estas metilxantinas se han realizado utilizando líquido
disolventes de extracción como cloruro de dimetilo, cloroformo
y agua (Caudle, Gu y Bell, 2001; Hulbert, Biswal,
Walker, Meher y Collins, 1998 ). Sin embargo, la solución química
Las ventilaciones requieren varias horas para una extracción completa
tener lugar. Agua, aunque es un excelente disolvente de metilo.
xantinas, es altamente no selectivo y su uso puede resultar en
la eliminación de otros componentes valiosos del
producto extraído, que gradualmente conduce al deterioro
de la columna analítica ( Saldana, Zetzl, Mohamed, &
Brunner, 2002) Para resolver este problema, Pura
Naik (2001) propuso el uso del cartucho Seppak C 18
para la purificación del extracto de cacao antes de la inyección en
una columna de HPLC C 18 de fase inversa. De esta manera, el inter-
los pigmentos de cacao se eliminan efectivamente, por lo tanto
aumentando la vida de la columna. Sin embargo, esta limpieza pro-
El procedimiento puede llevar mucho tiempo, ya que debe llevarse
fuera manualmente y también necesita un paso de evaporación de la
solvente (CHCl 3 ) utilizado para eluir los analitos del vehículo
tridge. En las últimas décadas, cambio de columna en línea
dispositivos, combinados con pre-columna repleta de diferentes
Se ha demostrado que los tipos de materiales proporcionan un poderoso
y solución confiable para el tratamiento de muestras en línea de
matrices complejas Por lo tanto, es posible inyectar el sam-
ple directamente en el sistema cromatográfico, evitando el
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Para mejorar nuestra comprensión del cacao, nosotros
Han iniciado un estudio sobre los granos de cacao venezolanos. Eso
Por eso es importante analizar las metilxantinas
(teobromina, teofilina y cafeína), porque su
los niveles dependen del genotipo y afectan el sabor de
los granos de cacao Se han utilizado diferentes técnicas analíticas.
2. Materiales y métodos
2.1. Reactivos y estándares
Todos los solventes y reactivos utilizados fueron HPLC o analíticos.
grado reactivo, a menos que se indique lo contrario. Metanol y
etanol fueron adquiridos de JT Baker (Phillipsburg,
NJ, EE. UU.). El agua fue purificada (18 MX cm À1 calidad) por un
Sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Theobro-
la mía, teofilina y cafeína fueron suministradas por Sigma (St.
Louis, MO, EE. UU.).
Soluciones estándar de stock individuales de teobromina
(400 μg / ml), teofilina (1000 μg / ml) y cafeína
(1000 μg / ml) se prepararon disolviendo apropiadamente
cantidades de estos compuestos en agua y posteriormente
almacenado a 4 ° C. Se prepararon soluciones de trabajo cada
semana diluyendo soluciones estándar concentradas
en agua.
2.2. Instrumentación y condiciones cromatográficas.
El análisis cromatográfico se realizó en un
sistema cromatográfico líquido equipado con un Waters
Módulo Alliance 2690 HPLC (Milford, MA, EE. UU.)
conectado a un detector de matriz de fotodiodos (PDA) Waters 996
y con una bomba adicional, Waters modelo 515 solía
entregar fase móvil para el análisis. Los datos fueron recolectados,
almacenado y analizado utilizando el software MILLENIUM ver-
Sión 3.2 de Waters (Milford, MA, EE. UU.). Las inyecciones fueron
hecho con el inyector automático del módulo Alliance. Columna-
El cambio de columna se realizó mediante un cambio de columna LabPro.
Válvula de seis puertos (Waters) controlada por la estación de trabajo.
La extracción en línea se realizó con un método casero.
precolumna en seco (50 mm × 4,6 mm de diámetro) con Alltech
ODS-C18 (15–40 μm). La separación cromatográfica fue
logrado en una columna NOVAPAK C 18 (150 × 3.9 mm
ID, tamaño de partícula de 4 μm, de Waters) mantenida en la habitación
temperatura (22 ° C). Un diagrama de la columna diferente
Las posiciones de cambio en el sistema HPLC se muestran en la Fig.1 .
Una solución de metanol al 20% en agua (v / v) a un caudal
Se utilizaron 1,4 ml / min como fase móvil para transferir y
Separar los analitos. Las condiciones de elución fueron isocráticas.
Antes de su uso, las fases móviles se filtraron al vacío.
a través de un filtro de nylon de 0,45 μm y desgasificado. El chro-
los matogramas fueron monitoreados por detección UV a una onda
longitud de 274 nm.
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problemas asociados con pretratamientos de muestras fuera de línea,
tales como procedimientos que requieren mucho tiempo, errores y el riesgo
de bajas recuperaciones.
El objetivo de la presente investigación era desarrollar un
método para la determinación de teobromina, teofilina
y cafeína en muestras de granos de cacao utilizando alta resolución
cromatografía líquida de fase inversa con diodo UV
detección de matriz y con limpieza de muestra en línea en una columna
sistema de cambio de columna. El procedimiento propuesto ofrece varias
ventajas generales que incluyen simplicidad y análisis cortos
tiempo, bajo costo y alto rendimiento de muestra.
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Fig. 1. Diagrama de flujo para el sistema de columnas de conmutación. V 1 , válvula de inyección;
V 2 , válvula de conmutación; (a) V 2 en posición de carga; (b) V 2 en posición de inyección.
La dirección del flujo se indica con flechas. Descripción en texto.
amueblado del Cacao Genebank de San Juan de Lagu-
nillas (INIA - Mérida, Venezuela) y Porcelana fueron
obtenido en Cocoa Genebank de la Local Chama Sta-
ción (CORPOZULIA, Venezuela). Las vainas fueron recolectadas en
intervalos de dos ciclos de cultivo al año. Las vainas cosechadas
se almacenaron bajo refrigeración a À20 ° C.
Por otro lado, durante la optimización del desarrollo
procedimiento abierto, una muestra de cacao '' Forastero '' de Ghana
fue utilizado como material de referencia.
Después de la fermentación y el secado, las cáscaras del cacao.
los frijoles fueron removidos manualmente y 100 g de ellos fueron
pesado Los frijoles se molieron en una rotación
molino de cuchillas y el polvo obtenido finalmente se pasó
a través de un tamiz de malla 45. Seis gramos de cacao en polvo fueron
pesado, colocado dentro de un dedal, cubierto de grasa libre
algodón y el dedal se introdujo en un Soxhlet limpio
extractor. Después de esto, se transfirieron 50 ml de éter de petróleo.
ferrado en un matraz de destilación pesado y seco, se con- sideró
conectado al extractor Soxhlet y luego, 100 ml de
el mismo solvente se agregó adicionalmente hasta que comenzó
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2.3. Preparación de granos de cacao
Para aplicar el método propuesto, '' Criollos '',
'' Trinitarios '' y '' Forasteros '' granos de cacao sujetos a varios
Se analizaron las etapas erales de fermentación (1–7 días).
Vainas de cacao de la variedad ICS-1 (Trinitario) e IMC-67
(Forastero) se obtuvieron de árboles identificados genéticamente
cultivado en el Banco de Generación de Cacao de Ocumare de la Costa
(INIA-Aragua, Venezuela). '' Guasare '', '' Criollo Meriden˜o
Zea '' y '' Criollo Meriden˜o San Juan '' (SJN) fueron
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20 minutos. La solución se enfrió luego a temperatura ambiente.
perature, se centrifugó a 3000 rpm, y el sobrenadante
Tant se filtró a través de un filtro Millipore de 45 μm de poro
diámetro. Posteriormente, se inyectaron 20 μl de esta solución
en el sistema cromatográfico para el procedimiento de limpieza
y determinación.
2.5. Análisis de muestra.
Después del procedimiento de extracción, los analitos estaban presentes.
en una mezcla compleja, y se necesitaba una limpieza de muestra en
Para preservar la columna analítica.
La limpieza y separación de teobromina, teofil-
la línea y la cafeína en las muestras de cacao fueron realizadas por un col-
procedimiento de cambio de columna, que se puede subdividir en
Tres pasos diferentes. Paso de carga de muestra : 20 μl de cacao
El extracto de muestra se cargó en la columna previa con el
fase móvil de limpieza compuesta de una solución acuosa
de 1% (v / v) de metanol a una velocidad de flujo de 0.8 ml / min. Dur-
Esta vez, las purinas fueron retenidas mientras que otras endog-
los componentes enosos se pasaron a través de la columna previa a
desperdicio (Figura 1(una)). Paso de transferencia de analitos : luego, 3.0min
más tarde, los analitos fueron expulsados de la precolumna
y dirigido a la columna analítica con el móvil
fase para el análisis: metanol al 20% (v / v) en agua a una
caudal de 1,4 ml / min ( Fig. 1(si)). Continuamente, después
un minuto de tiempo de transferencia, la válvula de conmutación volvió a
la posición de carga y la fase móvil de limpieza fluyeron
a través de la precolumna para equilibrarla antes de
La siguiente inyección. Paso de separación : simultáneamente, el
los analitos continuaron los procesos de separación en el analiti-
columna de cal y se detectaron con UV (274 nm) a la salida.
El tiempo total de ejecución fue de 10 min.
3. Resultados y discusión
3.1. Limpieza de muestras en línea y cromatográfica.
separación
En la actualidad, la HPLC es la mejor herramienta para determinar la purina.
alcaloides en extractos de cacao. Desde el punto de vista de mole-
Lar estructuras (mostradas en la Fig. 2 ), los tres alcaloides pueden ser
separados por cromatografía líquida de fase inversa en un
Columna de fase inversa C 18 utilizando un detector UV. A pesar de que
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Sifón Finalmente, el condensador se unió al extrac- Recientemente se han propuesto varios modos de detección, UV
tor y el sistema completo se colocó en el calentador la detección sigue siendo la primera opción en la cromatografía líquida
Se extrajo grasa y grasa del cacao en polvo durante al menos
4 h. Una extracción completa en blanco (sin cacao en polvo)
se ha realizado regularmente para garantizar que el
el residuo en blanco era inferior a 2,5 mg ( ICCO, 1996 ).

2.4. Procedimiento de extracción

Las muestras de cacao en polvo y reducidas en grasa fueron

extraído mediante el siguiente procedimiento. 0.0100 g
de polvo se extrajo con aproximadamente 10.00 ml de Fig. 2. Estructuras químicas de las metilxantinas determinadas en este
agua caliente (80 ° C) en un baño de circulación caliente durante estudiar. (a) teobromina; (b) cafeína; (c) teofilina.

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Análisis de estos analitos debido a su simplicidad y fiabilidad.

En este trabajo, las longitudes de onda de absorción máximas son
274 nm para los tres compuestos, que facilitan la simulación
Determinación tatanea de todos los analitos. En el otro
Por otro lado, las absorbancias de fondo de los eluyentes eran muy
bajo a 274 nm, por lo tanto, esta medición se eligió para más
estudios.
La solubilidad de teobromina, teofilina y cafeína.
está muy relacionado con la temperatura (Macrane, 1985),
lo que favorece la solubilidad de muchos otros compuestos como
como los pigmentos En este sentido, estos compuestos fueron pres-
ent en el filtrado durante el procedimiento de extracción (Sección
2.4 ) interferir en el análisis de HPLC y poder
reducir la vida útil de la columna analítica si no fuera
eliminado antes de la inyección en el sistema HPLC (Pura
Naik, 1997) Para resolver este problema, un sólido en línea
el procedimiento de extracción de fase se realizó usando una columna
sistema de conmutación Este sistema se caracteriza por cuatro
pasos: limpieza de muestra, transferencia de analito, separación y
reacondicionamiento. De esta manera, el paso de limpieza de muestra fue
realizado en una precolumna casera (50 × 2 mm) en seco
embalado con Alltech ODS-C 18 fase, partícula de 15–40 μm
diámetro. La precolumna fue acondicionada por primera vez por
bombear 10 ml de metanol. Con el objetivo de obtener más selec-
actividad, para obtener recuperaciones cuantitativas de analitos
durante el paso de extracción, la naturaleza y composición de
Se optimizó la fase móvil de extracción. El mejor resultado
se obtuvo con una fase móvil de extracción compuesta por
1% de metanol en agua (v / v) a una velocidad de flujo de 0.8 ml / min
durante 3min. En este momento, la mayoría de la matriz de muestra
había sido eludido de la precolumna; sin embargo, theobro-
mía, teofilina y cafeína aún permanecían. Es importante
Tant para señalar que la adición de una cantidad limitada de
un modificador orgánico, como metanol, para el lavado
el líquido es muy útil para mejorar la extracción
selectividad y para obtener altas recuperaciones de los analitos.
Finalmente, la eficiencia del líquido de lavado seleccionado para lavar
la matriz de muestra se probó inyectando 20 μl de
muestra de cacao de Ghana tratada directamente en la precolumna
conectado al detector UV-DA y monitoreado a
274 nm. La eliminación de la matriz podría considerarse
como completo cuando la señal del detector alcanzó la línea de base.
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Fig. 3. Perfiles de elución precolumna para 20 μl de una muestra de cacao enriquecida con
teobromina, teofilina y cafeína. Condiciones experimentales en tablas
1 y 2.
solventes orgánicos en agua fueron estudiados como analíticos móviles
fase. Una mezcla de 20% de metanol en agua (v / v) bajo
condiciones isocráticas a un caudal de 1,4 ml / min informado
una excelente resolución entre los analitos y un corto
tiempo de análisis Sin embargo, se descubrió que las purinas
adsorbidos en la precolumna de extracción fueron completamente
eluido en 1.0 min por la fase analítica móvil. Después
esta vez, la válvula volvió a la carga
posición (Fig. 1 (a)) para reacondicionar la extracción
pre-columna con la fase móvil de extracción para la siguiente
inyección de muestra Las condiciones optimizadas para el proceso
dure y los tiempos de la válvula de cambio de columna para
línea de limpieza de muestras y separación cromatográfica son
indicado en las tablas 1 y 2. En estas condiciones, theo-
los tiempos de retención de bromo, teofilina y cafeína fueron
5.22, 6.32 y 8.67 min, respectivamente. La figura 4 muestra la representación
cromatogramas resentativos obtenidos cuando el optimizado
El método propuesto se utilizó para el análisis de un estándar
solución acuosa de analitos y de una muestra de cacao enriquecida
con los analitos Comparando estas cifras, puede ser
incluyó que ambos cromatogramas están libres de endoge-
componentes nous y la separación de teobromina,
la teofilina y la cafeína se completaron con una razón:
tiempo de ensayo capaz.
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En estas condiciones, un tiempo de lavado de 3 minutos fue
suficiente para la limpieza de la muestra y no dio lugar a pérdidas
tabla 1
de analitos, ya que su tiempo de avance para el primero eluyó
Condiciones instrumentales óptimas para la determinación de teobromina,
el analito duró más de 4 min (Fig. 3 ). teofilina y cafeína en muestras de cacao utilizando limpieza de muestras en línea
En la etapa de transferencia, los analitos retenidos se transfirieron
Volumen de inyección de muestra 20 μl
desde la precolumna hasta la columna analítica Precolumna de extracción ODS-C 18 hecho en casa
medios de fase analítica móvil. Compresión máxima de (tamaño de partícula: 15–40 μm) 50 × 2 mm
los analitos eluyendo en modo de retrolavado del precol- diámetro interno
Fase móvil de extracción 1% de metanol en agua (v / v)
umn podría lograrse asegurando que el porcentaje
Tasa de flujo 0.8 ml / min
del modificador orgánico utilizado para transferir y separar
Columna analitica NOVAPACK C 18 , 150 × 3.9 mm;
fue mayor que el de la fase móvil de extracción. diámetro interno; tamaño de partícula: 4 μm
La composición de la fase analítica móvil también fue Fase móvil para análisis 20% de metanol en agua (v / v)
elegido de manera que se pueda obtener suficiente selectividad Tasa de flujo 1,4 ml / min
Temperatura Temperatura ambiente (22 ° C)
en la separación final de teobromina, teofilina y
Detección UV-DAD a 274 nm
cafeína en la columna analítica. Diferentes mezclas de

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Tabla 2 Tabla 3
Eventos de tiempo de la válvula de cambio de columna para limpieza de muestras en línea y Recuperaciones de teobromina, teofilina y cafeína de muestras de cacao.
separación cromatográfica
Compuesto Concentración Recuperación CV ( n = 5)
Paso Proceso Traspuesta Acoplamiento de la válvula de conmutación añadido (μg / ml) (%) (%)
tiempo (min)
Teobromina 2,00 102,3 3.20
1 Limpieza de la muestra 0-3 Residuos de precolumna 4.00 102,1 3.12
2 Elución y transferencia 3–4 Analítica Precolumna 8.00 104,0 2,80
columna-DAD UV 12.00 102,9 2,34
detector 20.00 102,2 1,90
3 Equilibrio de la 4–10 Residuos de precolumna
Teofilina 0,50 95,0 2,74
precolumna y analítica
1.00 96,7 1,98
separación de columnas
2,00 97,5 2,54
44 Próxima inyección 77
5.00 97,7 2,38
10.00 99,8 2,85
3.2. Validación del método.
Cafeína 1.00 95,1 2,99
2,00 101,0 1,89
Se evaluó la precisión del procedimiento propuesto. 4.00 98,9 2,90
mediante experimentos de recuperación llevados a cabo a partir de púas 5.00 97,0 2,71
muestras a diferentes niveles de concentración de analito y también un 10.00 97,5 3.10

se analizó el blanco constituido por la muestra no enriquecida.
La concentración estudiada se preparó en cinco repeticiones.
de 2.00 a 20.00, de 0.50 a 10.00 y de 1.00 a
10.00 μg / ml de teobromina, teofilina y cafeína
respectivamente. En todos los casos, los valores de porcentaje de recuperación
osciló entre 95.0% y 104.0% (Tabla 3 ) con un pariente
desviación estándar <3.20% ( n = 5). Estos valores demuestran
estratega una buena eficiencia de extracción de la casera
ODS-C 18 precolumna en el paso de limpieza, al igual que todos los
los analitos estudiados se recuperaron cuantitativamente de la
matriz de cacao.
El intraensayo (intradía) y el interensayo (interdía)
La variabilidad del método se evaluó analizando el
patrones acuosos de teobromina, teofilina y cafeína
muestras de feína y cacao enriquecidas con cantidades conocidas de
CV, coeficiente de variación ( n = 5).
analitos La precisión se evaluó durante el día
y el porcentaje entre días de la desviación estándar relativa por ciento
edad (RSD) para cinco niveles de concentración diferentes
de 2.0 a 20.0, 0.5 a 10.0 y 1.0 a 10.0 μg / ml para
bromo, teofilina y cafeína, respectivamente. Los datos
se enumera en la Tabla 4 . Estos resultados (RSD <2.98% para todos
casos) confirme que se puede lograr una buena precisión con
la limpieza de muestra de cacao en línea descrita anteriormente.
La linealidad del ensayo se realizó con un ocho
curva de calibración de punto preparada diluyendo analitos de stock
soluciones en agua y con cacao en polvo enriquecido con
teobromina, teofilina y cafeína para producir concentración
en el rango de 2.0 a 20.0, de 0.5 a 10.0 y

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Fig. 4. Cromatograma típico obtenido para: (a) solución acuosa estándar de teobromina, teofilina y cafeína a 8.0, 2.0 y 2.0 μg / ml,
respectivamente; (b) muestra de cacao. Condiciones optimizadas Tablas 1 y 2 .

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Tabla 4
Resultados de estudios de precisión para teobromina, teofilina y cafeína.

Compuesto Matriz Dentro del día ( n = 5) Entre días ( n = 5)

Concentración CV% a Concentración CV%

(media ± DE) (μg / ml) (media ± DE) (μg / ml)

Teobromina Estándar acuoso 2.000 ± 0.011 1,50 2.000 ± 0.011 1,73

8.000 ± 0.003 1.20 8.000 ± 0.003 1,31
20.000 ± 0.003 1,90 20.000 ± 0.003 1,95
Matriz de cacao 2.000 ± 0.011 1.10 2.000 ± 0.011 1,82
8.000 ± 0.003 1,30 8.000 ± 0.003 2,00
20.000 ± 0.003 2,60 20.000 ± 0.003 2,80

Teofilina Estándar acuoso 0.500 ± 0.009 1,80 0.500 ± 0.009 1,80

2.000 ± 0.013 1,30 2.000 ± 0.013 1,30
10.000 ± 0.036 1,80 10.000 ± 0.036 1,80
Matriz de cacao 0.500 ± 0.009 1.10 0.500 ± 0.009 1,80
2.000 ± 0.013 2,30 2.000 ± 0.013 2,60
10.000 ± 0.036 2,60 10.000 ± 0.036 2,75

Cafeína Estándar acuoso 1.000 ± 0.006 1.20 1.000 ± 0.006 1,59

4.000 ± 0.015 1,50 4.000 ± 0.015 1,36
10.000 ± 0.023 1,90 10.000 ± 0.023 1,93
Matriz de cacao 1.000 ± 0.006 1.20 1.000 ± 0.006 2,09
4.000 ± 0.015 1,50 4.000 ± 0.015 2,50
10.00 ± 0.023 2,70 10.000 ± 0.023 2,98
un CV, coeficiente de variación ( n = 5).

de 1.0 a 10.0 μg / ml, respectivamente. Cada conjunto de calibración
incluyó siete puntos de datos y cada punto se ejecutó al menos
tres veces. La Tabla 5 muestra el análisis de regresión lineal de
Los datos de la curva de calibración. Se puede concluir que el cal-
Las curvas de ibración fueron lineales en el rango de concentración.
estudiado, lo que indica que no hay desviación significativa de la linealidad
( valores r > 0.9901). En todos los casos, las pendientes de la calibración.
los gráficos para el cacao y las soluciones acuosas estándar no eran
estadísticamente diferente ( P <0.05). Como ninguna matriz interfiere
se detectaron ences, la técnica de calibración estándar
para estándares acuosos podrían usarse para la determinación
de teobromina, teofilina y cafeína en muestras de cacao
investigado en este trabajo.
La concentración más baja que se puede cuantificar (LOQ)
sitive para evaluar los analitos estudiados en el venezolano
Muestras de cacao. Sin embargo, fue posible mejorar
la sensibilidad adicional al inyectar volúmenes más grandes, hasta
200 μl.
Finalmente, el método propuesto también fue validado por
analizando teobromina y cafeína de la misma muestra de cacao
por este procedimiento y con un método de referencia ( Pura
Naik, 2001) La regresión entre los valores encontrados por el
procedimiento desarrollado ( y ) y los valores de referencia ( x ) pro-
vides para todos los analitos las ecuaciones de regresión con el
coeficientes de regresión mostrados en la Tabla 6 . Como se puede ver,
hubo una buena correlación entre las concentraciones de disuasión
minado por los dos métodos.

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7/11/2019 Determinación de teobromina, teofilina y cafeína en muestras de cacao mediante un método cromatográfico líquido de alto rendimiento c…
con exactitud y precisión aceptables fueron 0.50, 0.25 y 3.3. Solicitud
0.50 μg / ml para teobromina, teofilina y cafeína,
respectivamente. Además, el límite de detección (LOD), Usando el método propuesto, los '' Criollos '', '' Trinita-
definido como una relación señal / ruido (S / N)> 3 fueron 0,10 μg rios '' y '' Forasteros '' muestras de cacao cultivadas en diferentes
de teobromina / ml, 0,08 μg de teofilina / ml y estaciones del año y fermentado durante 3 y 7 días,
0,10 μg de cafeína / ml cuando se usaron 20 μl como inyección respectivamente, fueron analizados. Los resultados se informan en
volumen de la muestra. Estos valores de LOQ fueron suficientemente sencillos Fig. 5. Como se puede ver, la teobromina es la xantina

Tabla 5
Correlaciones lineales entre áreas pico y concentraciones de teobromina, teofilina y cafeína, respectivamente.

Compuesto Matriz Ecuaciónuna rsi CV de pendiente (%)C

Teobromina Estándar acuoso A = 43394 C 0.9967 3.12

Matriz de cacao A = 1.0 × 10 6 + 44281 C 0.9904 3.73
Teofilina Estándar acuoso A = 62068 C 0.9992 2,90
Matriz de cacao A = 9611 + 61433 C 0.9999 2,98
Cafeína Estándar acuoso A = 73226 C 0,9928 3,06
Matriz de cacao A = 96188 + 74078 C 0.9901 3,57
una A , área de pico; C , concentración de cada compuesto.
b r , coeficiente de correlación.
c CV, coeficientes de variación de la pendiente ( n = 3).

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Tabla 6
Validación del procedimiento propuesto con un método de referencia.

Compuesto Ecuaciónuna rsi CV de pendiente (%)C

Teobromina y = 1.0503 x 0,9733 3,52

Cafeína y = 1.0155 x 0.9734 2,80
a y , valores de metilxantina por procedimiento desarrollado; x , valores de
metilxantina por procedimiento de referencia.
b r , coeficiente de correlación.

c CV, coeficientes de variación de la pendiente ( n = 3).

Fig. 5. Concentración de teobromina, teofilina y cafeína en

Diferentes variedades de cacao.

presente en mayor proporción en los granos de cacao seguidos

por cafeína, y solo por trazas de teofilina. Nuestros resultados
de acuerdo con los reportados por Pura Naik, 2001 .
Por otro lado, las muestras venezolanas de cacao de
La misma cosecha se analizó en diferentes días de fermentación.
Los resultados obtenidos para teobromina, teofilina y
la cafeína se presenta como una representación gráfica de barras en

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7/11/2019 Determinación de teobromina, teofilina y cafeína en muestras de cacao mediante un método cromatográfico líquido de alto rendimiento c…
Fig. 6 (a) - (c), respectivamente. Estas cifras muestran que el
La tienda para cada metilxantina es, en general, mayor durante
los primeros días de fermentación, disminuyendo gradualmente mientras
El tiempo de fermentación aumenta. es importante resaltar
que un ligero aumento durante el primer día de fermentación
para muestras de cacao '' Criollos '' (Zea, SJN, Guasare), y
durante el segundo día para el "Forastero" (IMC-67) fue
observado. La alta permeabilidad del grano de cacao de sabor fino.
testa durante los primeros dos días de fermentación podría no
tener una influencia significativa en la reducción de teobromina
y los niveles de cafeína en los granos fermentados, porque durante
En este período, la estructura del grano de cacao aún no se ha interrumpido.
y ningún alcaloide puede penetrar a través de la testa todavía ( Lam-
Bert & Aitken, 2000) Sin embargo, ese comportamiento puede ser
explicó dado que durante los primeros días de fermentación,
la pulpa de semillas de cacao aún no se ha extraído. Es importante
para recordar que las metilxantinas se distribuyen
en diferentes partes de la semilla de cacao, frijol, pulpa y cáscara
( Bucheli, Rousseau, Alvarez, Laloi y McCarthy, 2001 ).
Resultados similares reportan Lambert y Aitken, 2000 cuando evalúa
Discutir la posible influencia del carácter de la testa del grano de cacao.
estadísticas sobre la calidad del sabor de los granos de cacao fermentados,
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466 MR Brunetto y col. / Food Chemistry 100 (2007) 459–467
12.000
Exterior
Ghana
10.000
mi
norte
yo
ffe 8.000
una
/C IMC-67 Trinitario
mi
6.000
oin
si 4.000 Cacao venezolano
om
ICS-1
mi
h
Tr
Zea
2.000 SJN
Porcelana
0,000
0,000 0.100 0.200 0.300
Cafeína (%)
Fig. 7. Relación entre el contenido de metilxantinas con el cacao
genotipo.
Esa es la razón por la cual durante los primeros días de fermentación
puede haber una migración de metilxantinas desde la pulpa
al frijol, y un aumento en la concentración puede ser
observado durante el primer día de la fermentación estudiada
hora.
Por otro lado, también es importante resaltar que
estudios realizados por Davrieux, Assemat, Boulanger y
Cros (2004) mostró la existencia de una relación entre
El contenido de metilxantinas con el genotipo del cacao.
Estos estudios se centraron en la relación teobromina / café
feine, permitiendo su clasificación en cacao '' Forastero '',
'' Trinitario '' y '' Criollo ''. En este trabajo, la correlación
entre el cacao analizado y la teobromina / cafeína
La relación ha sido estudiada. Entonces, dependiendo del café
concentración de feína, para cada tipo de cacao la relación
https://translate.googleusercontent.com/translate_f
Fig. 6. Cambios en la concentración de metilxantinas durante la fermentación:
(a) teobromina; (b) teofilina; (c) cafeína.
comparó la permeabilidad para teobromina y cafeína
de un '' Forastero '' y cacao de sabor fino. Los resultados mostraron
ese frijol testa de granos de cacao de sabor fino no fermentado
era muy permeable a la teobromina y la cafeína (95.8
y 94.8, respectivamente). '' Forastero '' mostró menor perme-
capacidad (24.7% para teobromina y 28.3 para cafeína). Ambos
los genotipos mostraron una disminución muy pronunciada de la permeabilidad
después de dos días de fermentación y disminuye aún más hasta
El final de la fermentación. Esta influencia de penetración de
El contenido de teobromina y cafeína se correlaciona con el
nota amarga Además, es bien sabido que uno de los
Las posturas de fermentación de los frijoles son para eliminar la mucosa.
ilague, para evitar la germinación y permitir la
Reacciones bioquímicas de los precursores del aroma de
mal origen Este procedimiento de fermentación se realiza.
en tres días para '' Criollos '' y siete para '' Trinitario ''
y granos de cacao '' Forasteros ''. Una vez que la fermentación es
completado, el recordatorio de la pulpa debe ser eliminado.
papás El uso de sistemas de columnas acopladas permitió
reducir el tiempo de análisis, llegando a realizar la muestra
limpieza, la separación e identificación de analitos en
10 minutos. Sin embargo, el método permite simultáneamente
llevar a cabo el procesamiento de la muestra y el paso de análisis, ya que
la frecuencia de análisis es de 8 muestras / h (una inyección cada
7,0 min). Es importante enfatizar que la columna previa
utilizado demostró tener una larga vida media. Durante el
desarrollo del método, aproximadamente 1000 inyecciones
Guasare de muestras de extractos de cacao se hicieron, sin mostrar signos de
deterioro. Finalmente, la sensibilidad y precisión alcanzadas
en el método propuesto, así como la alta frecuencia de análisis,
0.400 0.500
hacer que este método sea confiable para ser utilizado como método de rutina
para el análisis de metilxantinas de una gran cantidad de cacao
muestras
Reconocimiento
Los autores agradecen a FONACYT Venezuela por
El proyecto financiero S1-2001001146.
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La teobromina / cafeína se muestra en un gráfico. El obtenido
los resultados se presentan en la Fig. 7. Allí podemos ver que el
cacao '' Criollos '' tiene la menor concentración de teobromina
y el mayor contenido de cafeína, diferente del '' Foras-
tero '', que tiene más contenido de teobromina y menos cafeína
concentración de feina. Sin embargo, el '' Trinitario '' es un híbrido
y se distribuye en un nivel intermedio.
Finalmente, es importante señalar que la concentración
La teofilina en todos los casos es muy baja con respecto a
el de teobromina y / o cafeína. Sin embargo, el the-
nivel de ofilina no es un parámetro que permita diferenciar-
ing entre diferentes tipos de cacao. Por otro lado, el
la concentración de teofilina no es un parámetro significativo en
este estudio, porque durante el proceso de fermentación el bit-
El sabor del cacao se determina fundamentalmente por el
concentración de teobromina y cafeína
4. Conclusiones
En este trabajo se utilizó un método rápido, preciso y sensible.
desarrollado, lo que permite la determinación de la metil-
xantinas en muestras de granos de cacao. Se confirmó que
no hay efecto de matriz, por lo que los extractos se pueden evaluar con
una curva de calibración establecida a partir del estándar acuoso de analitos
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MR Brunetto y col. / Food Chemistry 100 (2007) 459–467
El contenido de grasa del cacao en polvo por extracción Soxhlet . IOCCC,
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