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METODOS

 DPPH
Este método se fundamenta en que el electrón desapareado del radical
DPPH (radical libre) se aparea con el electrón donador de un antioxidante,
entonces el DPPH se reduce, dando como resultado decoloración del
DPPH de color purpura a amarillo, siendo su máxima a 517 nm. Los
compuestos antioxidantes son continuamente extraídos de la muestra por el
metanol grado HPLC y en simultaneo reaccionan con el DPPH hasta que la
extracción y reacción sea completa (Plank et al. 2012).

Este método descrito es una adaptación de la metodología original de Plank


et al. (2012).

- PREPARACION DE LA MUESTRA
Se midió 2 mL de cerveza previamente desgacificada, para luego
agregarle 2 mL de metanol, se les mantiene en refrigeración por 24
horas para obtener el extracto metanolico de cerveza.

- PREPARACION DE REACTIVOS
Solución de DPPH (40mg/L): Se pesó 40 mg de DPPH en papel
aluminio. Luego se llevó a una fiola de 1 L y se añadió 500 mL de
metanol HPLC. Se cubrió la fiola con papel aluminio y se agito por 20
minutos (agitador magnético). Se retiró el magneto y se añadió 500 mL
de agua destilada. Luego se agito por otros 20 minutos en agitación
magnética.
Se retiró el magneto y se completó el volumen con metanol. Se agito
una tercera vez por 10 minutos y se trasladó a un envase ámbar
cubierto con papel aluminio. Se debe proteger esta solución de la luz en
todas las etapas y se hizo esta solución para cada día, antes del
análisis. Nota: la solución DPPH es color morada, no almacenable.
Estándar de trolox (50 mg/10mL): Se pesó 50.00 ± 0.1 mg de trolox en
papel aluminio. Luego se transfirió el polvo a una fiola de 100 mL y
agregar 50 ml de metanol HPLC. Se cubrió la fiola con papel aluminio y
se agito con magneto por 5 minutos. Luego se agregó 50 mL de agua
destilada. Posteriormente se agito con magneto por 5 minutos y se
completó con metanol HPLC. Luego se transfirió el preparado a un tubo
Falcon de 50 mL de capacidad. Nota: la solución estándar de trolox es
transparente y almacenable a 4 °C por hasta 2 semanas cubierto con
papel aluminio.

- DETERMINACION DE CURVA PATRÓN


La curva patrón nos permitió encontrar 3 valores que se requirieron para
el cálculo final de actividad antioxidante y son:
 Pendiente trolox: pendiente de la ecuación de curva de patrón,
debe ser negativo.
 Blanco teórico: intercepto de la ecuación de curva patrón
(absorbancia cercana a 1).
 Abs blanco: la mitad del intercepto de curva patrón.

La curva debe tener un R2 > 0.99 ploteando mg trolox/ 100 mL vs


absorbancias y es como sigue:

 Se tomó alícuotas de 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 mL del estándar stock


de trolox (50 mg/100mL) y se verte en tubos de falcon de 50
mL de cap. (cada punto por triplicado).
 Se adiciono 25 mL de solución de DPPH
 Se cerró bien los tubos y se llevó a incubación en baño maria
con agitación a 35 °C por 2 horas.
 Se realizó la lectura a 517 nm previamente utilizando el blanco
de agua destilada.
- DETERMINACION DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Mezclado: se pesó 3 cantidades de muestra (20, 35 y 50 mg) más
almidón de maíz en proporción 1:9 w/w (180, 315 y 450 mg de almidón
respectivamente) en 3 tubos falcon de 50 mL de capacidad, se adiciono
25 mL de solución de DPPH para cada tubo. Se observó un cambio de
color del DPPH (lila a amarillo), mientras más contenido antioxidante
tiene la muestra, más se decolora el DPPH, por lo tanto menos
absorbancia.
Incubación: Para una completa extracción de componentes
antioxidantes se cerró bien los tubos y se llevó a incubación en baño
maría con agitación a 35 °C por 2 horas. Los tubos son fijados con cinta
a la base para evitar que los tubos floten.
Filtrado: Se filtró las muestras con papel filtro, recolectando los
sobrenadantes en tubos de vidrio de 10 mL de capacidad previamente
etiquetados.
Lectura: Se realizó la lectura a 517 nm en espectrofotómetro UV,
realizando primero la lectura del blanco que es agua destilada. Las
muestras se leyeron dentro de los 30 minutos salidos de la incubación.
Cálculos: El presente método es muy particular en comparación a otros
análisis colorimétricos que solo requieren de curva patrón para su
determinación. Se presenta un conjunto de ecuaciones se muestra a
continuación:

Para determinar la actividad antioxidante de la muestra en un µmol


ET/100 g m (bs) se realizan los siguientes cálculos:

𝐴𝑏𝑠 𝑛𝑒𝑡𝑎 = 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝐴𝑏𝑠 𝑎 517 𝑛𝑚

Dónde:
Blanco teórico es el intercepto de la curva patrón y la Abs a 517 nm es
la absorbancia promedio de cada muestra.
(𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝑌 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜)
𝑀𝑎𝑠𝑎 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 (𝑔) =
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

Dónde:
Abs blanco: determinado en curva patrón (mitad de blanco teórico)
Y intercepto y pendiente: intercepto y pendiente de la ecuación peso
corregido y absorbancia neta de la muestra

Finalmente se reemplaza datos en la ecuación expresada en base


húmeda.

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑇𝑟𝑜𝑙𝑜𝑥 ∗ 𝐴𝑏𝑠 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜


𝐴𝐴𝑇 =
𝑀𝑎𝑠𝑎 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 ∗ |𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑇𝑟𝑜𝑙𝑜𝑥|

Dónde:
AAT = actividad antioxidante total (µmol ET/100 g muestra)
Factor trolox: 391 546 µmol ET/100 g (Plank et al. 2012)
Pendiente trolox: pendiente de curva patrón.

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