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DPPH
Este método se fundamenta en que el electrón desapareado del radical
DPPH (radical libre) se aparea con el electrón donador de un antioxidante,
entonces el DPPH se reduce, dando como resultado decoloración del
DPPH de color purpura a amarillo, siendo su máxima a 517 nm. Los
compuestos antioxidantes son continuamente extraídos de la muestra por el
metanol grado HPLC y en simultaneo reaccionan con el DPPH hasta que la
extracción y reacción sea completa (Plank et al. 2012).
- PREPARACION DE LA MUESTRA
Se midió 2 mL de cerveza previamente desgacificada, para luego
agregarle 2 mL de metanol, se les mantiene en refrigeración por 24
horas para obtener el extracto metanolico de cerveza.
- PREPARACION DE REACTIVOS
Solución de DPPH (40mg/L): Se pesó 40 mg de DPPH en papel
aluminio. Luego se llevó a una fiola de 1 L y se añadió 500 mL de
metanol HPLC. Se cubrió la fiola con papel aluminio y se agito por 20
minutos (agitador magnético). Se retiró el magneto y se añadió 500 mL
de agua destilada. Luego se agito por otros 20 minutos en agitación
magnética.
Se retiró el magneto y se completó el volumen con metanol. Se agito
una tercera vez por 10 minutos y se trasladó a un envase ámbar
cubierto con papel aluminio. Se debe proteger esta solución de la luz en
todas las etapas y se hizo esta solución para cada día, antes del
análisis. Nota: la solución DPPH es color morada, no almacenable.
Estándar de trolox (50 mg/10mL): Se pesó 50.00 ± 0.1 mg de trolox en
papel aluminio. Luego se transfirió el polvo a una fiola de 100 mL y
agregar 50 ml de metanol HPLC. Se cubrió la fiola con papel aluminio y
se agito con magneto por 5 minutos. Luego se agregó 50 mL de agua
destilada. Posteriormente se agito con magneto por 5 minutos y se
completó con metanol HPLC. Luego se transfirió el preparado a un tubo
Falcon de 50 mL de capacidad. Nota: la solución estándar de trolox es
transparente y almacenable a 4 °C por hasta 2 semanas cubierto con
papel aluminio.
Dónde:
Blanco teórico es el intercepto de la curva patrón y la Abs a 517 nm es
la absorbancia promedio de cada muestra.
(𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 − 𝑌 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜)
𝑀𝑎𝑠𝑎 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 (𝑔) =
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Dónde:
Abs blanco: determinado en curva patrón (mitad de blanco teórico)
Y intercepto y pendiente: intercepto y pendiente de la ecuación peso
corregido y absorbancia neta de la muestra
Dónde:
AAT = actividad antioxidante total (µmol ET/100 g muestra)
Factor trolox: 391 546 µmol ET/100 g (Plank et al. 2012)
Pendiente trolox: pendiente de curva patrón.