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RESUMEN - FORMACION Y ORIENTACION LABORAL (FOL)
RESUMEN - HEMATOLOGÍA Y CITOLOGÍA (dedicado a Mire...
Resumen - Análisis BIOQUÍMICO (fundamentos y técni...
MICROBIOLOGIA - Bacteriologia, Medios de cultivo y...
APUNTES - MUESTRAS BIOLOGICAS
Microbiología medica:
- Microbiología general => se estudia conocimientos históricos, clasificación, estructura
y fisiología de los microorganismos.
- Microbiología especial => se estudia 4 grupos de agentes infecciosos
(bacteriología, virología, micología y parasitología) + recientemente los viroides
(moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta proteica) y
los priones (proteínas codificadas por genes celulares y actúan como señales reguladoras,
responsables de algunas enfermedades neurológicas graves - Creutzfeldt-Jacob y el Kuru)
- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningún reino y se discute si son o
no seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un huésped que les
proporcione el mecanismo de la replicación y síntesis de macromoléculas); una vez que han
conseguido esto, salen de la célula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan
a celulas animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define como => un
bloque de material genético rodeado por una cubierta proteica que le sirve
como vehículo de transmisión; algunos pueden llevar una envoltura circundante compuesta
de lípidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes infecciosos (de menor
complejidad genética y estructural conocida) que solo afectan a plantas superiores;
constituidos por 1 cadena de ARN cíclica corta que no codifica proteínas; tamaño 10 veces
menor que los virus (parecen ser una etapa primitiva de los virus); los priones
(proteinceous infectious particle) => partículas patógenas de naturaleza proteica sin acido
nucleico; identificados en 1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su
existencia; las enfermedades "prion" en el hombre (encefalopatías espongiformes
transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree que también a los musculos.
Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y comprende las
normas de los niveles 1 y 2 y ademas:
- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patógenos se
realizaran en cabinas de seguridad; ningún trabajo se realizara en las mesas de trabajo.
- se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio;
utilizar guantes cuando se trabaja con material contaminado o animales que se
desinfectaran antes de desecharlos; en las habitaciones donde se tienen los animales se
utilizaran mascarillas rígidas.
- en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo.
- el laboratorio debe estar aislado de la circulación general, existiendo una doble puerta de
entrada con una habitación para cambiarse de ropa y con ducha.
- las superficies y los muebles deben ser de fácil limpieza; las ventanas deben cerrar
hermeticamente; las puertas se cerraran automáticamente.
- cerca de las puerta de salida existirán lavabos que pueden accionar con el pie, codo o
rodilla.
- existirá un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio
- existirá un sistema de extracción de aire con circulación del mismo de la puerta de entrada
hacia el interior del laboratorio; regulación de la entrada y salida del aire acondicionado; el
aire de salida de las cabinas de seguridad tipo III saldrá directamente al exterior; el de las
cabinas tipo I y II se elimina directamente al exterior o al sistema general del edificio
pasando previamente por filtros de alta eficacia (HEPA).
Tema 3 - Técnicas de
descontaminación, desinfección y esterilización
En todo laboratorio de microbiologia se debe tener en cuenta:
- todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado
- todo material para la realización de las pruebas debe estar estéril
- antes de cualquier esterilización, el material debe estar limpio y/o desinfectado
- conviene utilizar material desechable
- el material de uso aséptico debe guardarse separadamente del uso séptico
- la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se realiza
mediante desinfección periódica
- destreza y formación por parte del personal sanitario de laboratorio (deben trabajar en
condiciones de total asepsia)
- la manipulación de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas
cautelares para la prevención de accidentes laborales.
- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio => se utilizan en casos específicos y tienen
mas resistencia que los anteriores.
- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y
menos utilizados.
- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y
sale estéril; utilizados como mecanismo de esterilización en campanas de flujo laminar, en
quirófanos y recinto que pretende crear o mantener un ambiente estéril; flujo => vertical u
horizontal.
Metodos químicos de esterilización - los mas empleados son "Oxido de etileno" => en
forma de gas (10ºC) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante y podría explosionar
al mezclarse con O2; presenta un gran poder de penetración y es muy efectivo y duradero;
la esterilización se produce a => temperaturas bajas (40ºC) con humedad relativa alta (40-
60%) durante un tiempo de 3-8 horas (media de 5); se
requiere cámaras o instalaciones especificas para ello, son muy caras; el oxido de etileno se
aplica a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros metodos
(p.ej. endoscopia, plásticos termo-lábiles, cauchos, material eléctrico); el material esta listo
para ser utilizado a las 48 horas después de la esterilización; deberá conservarse estéril en el
interior de una bolsa de plástico cerrada por procedimientos termoeléctricos y dura 6 meses.
Recogida de orina - el frasco estéril no debe abrirse antes de la recogida; las partes
genitales se lava solo con agua; se recoge a primera hora de mañana para
estudio microbiológico, de forma aséptica, se echa el primer chorro, se recoge la segunda
mitad unos 20-30 ml.
Sondaje vesical (puncion de sonda) y puncion suprapubica - se realiza por el personal de
enfermeria
Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a
los que debe expulsarse todo el aire.
Transporte de muestras:
- Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos de plástico que llevan
incorporados diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH
regulado, carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para
prolongar la viabilidad de los microorganismos cuando exista demora entre la recogida y su
cultivo; los mas utilizados => (1) Medio de Stuart (los exudados faríngeos, conjuntivales,
nasales y heridas) que mantiene un pH favorable e impide la deshidratación de las
secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción enzimática de
los patógenos presentes (2) Medio de Cary y Blair (muestras fecales) donde las salmonellas
y las shigelas pueden recuperarse hasta 49 días después de la toma de muestras y Vibrio
cholerae hasta 22 días después.
Envió de muestras (las medidas especiales para un envió por correo a un laboratorio de
referencia):
- Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una
caja con unidades comerciales refrigerantes
- La sangre no se envía entera, se separa el suero y se envía en un tubo estéril
- La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermético irrompible con
espacio suficiente entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro de
otro envase para el envió; el envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco para
Agentes biológicos /Material bio-medico.
Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras para
estudio bacteriológico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse en la
nevera a excepción de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uñas para el
aislamiento de hongos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante
varios días antes de ser inoculados (protegidos del polvo).
Tema 5 - Procesamiento de las muestras en
microbiologia clínica
(protocolos de siembra)
Normas básicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra):
1. Volante de petición debe estar bien cumplimentada (filiación y datos administrativos del
paciente, datos clínicos, datos de la muestra, terapéutica seguida, determinación solicitada)
2. Tener constancia de que la obtención de la muestra ha sido realizada correctamente,
siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, así como su recogida,
transporte y conservación.
3. La siembra de dicha muestra se hará en los medios idóneos para cada caso, bien en placa,
por agotamiento y/o método cuantitativo, o bien en tubo.
[b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en
cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a
la identificación de E.coli (sensible a colistina - común en orinas); crecen bacilos Gram-
=> Enterobacterias y también Pseudomonas; observaremos las características de lactosa
(+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.
[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra en la lengüeta del
tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras de citrato (+) => vira a azul y
las que no, permanece verde; se usa para la diferenciación de Enterobacterias (para
diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces
de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de
nitrógeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella
enteritidis podían utilizar el citrato en este medio dando una reacción alcalina) en base a
su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa)
Los gérmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies):
- E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol
(+)
- Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-).
- Proteus spp (todas) => bacilo móvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa (-
), Triptófano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardío.
- Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemolítico, oxidasa(-
).
- Candidas spp (todas) => morfología de levaduras (parece como hematíes)
- Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmóvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias
mucosas, lactosa (+), tardío.
- Pseudomonas spp => bacilo Gram-, móvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+)
[b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia
pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa
(+), sensible a Colistina y bacilos Gram- e móviles, fermentador de manitol. La inhibición
selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal
violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sódico (inhibidor de Gam+) y los agentes
antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de
S.epidermidis).
[c] Agar Campylosel => crecerá Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como
colonias pequeñas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni)
resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+)
catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (-); P. hipurato =>
un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar
enzimáticamente (hipuricasa) el hipurato sódico que da lugar a acido benzoico y glicina un
compuesto de color morado.
[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los géneros Salmonella y Shigella. el
selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella
spp.
[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecerán como
colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario???
[f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen
colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomórficos; el
extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato
sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos
Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayoría de las entero-bacterias),
favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los
entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae
que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es
halofílica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el
crecimiento. El tiosulfato sódico es una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como
indicador para detectar la producción de ácido sulfhídrico/SH2. El azul de bromotimol y el
azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).
3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra
por agotamiento en cuadrantes).
[a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B
(S.agalactiae), que aparecerán como colonias pequeñas translucidas con un halo de B
hemólisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio
facultativo, prueba de látex (+).
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeñas
grisáceas que crecen bien por ser gérmenes exigentes en su crecimiento que requieren
factor X y/o V (proceden de la degradación de la Hb); también podemos colocar discos de
factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmóviles, Gram-;
oxidasa y catalasa variable.
[c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que
aparecerán como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+)
que fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares.
[d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolíticas y
al fresco como bacilo pequeño, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa
(-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya
que producen ß-hemólisis alrededor de las colonias. La ß-hemólisis en agar con sangre
humana es altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibióticos incluidos en el
medio inhiben la mayoría de los contaminantes Gram- y de las levaduras.
[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => crecen levaduras (Candidas spp) y Trichomonas
(protozoo unicelular flagelado).
[f] Agar Sabouraud (se puede incluir para detectar Candidas spp)
[b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes
translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar
chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de la
degradación de Hb)
[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos Gram-.
[e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram-
(en realidad, se tiñe muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los
azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo
para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimáticamente (hipuricasa) el
hipurato sódico; necesita L-cisteina para crecer y también iones férricos Fe. La inhibición
del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayoría de las bacterias Gram-, levaduras y
mohos, a través de una combinación optimizada de 3 antibióticos. Las colonias que crecen
en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta
probabilidad, colonias de Legionella.
6. Cepillado bronquial (la muestra vendrá en el cepillo y se conservara a 4ºC < de 24H); se
siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) añadiendo ademas: agar
sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivo
para bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto).
7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en
cuadrante).
[a] Agar sangre => crecera todo tipo de gérmenes (medio general enriquecido)
[b] Agar chocolate => crecera todo tipo de gérmenes
[c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/
inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y
Staphylococcus??
[e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp.
8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La
muestra ha de llegar en tubo estéril y se conservara a 4ºC menos de 24H.
[a] Agar sangre => crecerá todo tipo de gérmenes
[b] Agar chocolate => idem
[c] Agar Mac Conkey => crecerán las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco
exigentes.
[d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/
inhibidor Gram- => crecerán bien los Steptococcus B-hemolíticos.
[e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque también puede utilizarse agar AKV,
agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gram-
anaerobios (estrictos) y Bacteroides.
[f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite
el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente
exigentes. Además, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte
superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las
profundidades del medio.
10. Otros líquidos estériles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento;
la muestra ha de llegar en tubo estéril y su conservación no se ha de demorar mas de 24H a
4ºC.
[a] Agar sangre => crecerán casi todo tipo de microorganismos, con características
hemolíticas de algunos de ellos.
[b] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, sobre todo exigentes.
[c] Agar McConkey => crecerán Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes.
[d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para
Gram (+)
[e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios y
Bacteroides.
11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la técnica de Maki (rodamiento del cateter)
[a] Agar chocolate => crecerán casi todo tipo de gérmenes, y podrán crecer bien algunos
exigentes como el Haemophillus.
[b] Agar sangre => crecerán bien casi todo tipo de gérmenes y podrá verse sus
características hemolíticas si las tuvieran.
[c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se hará un pase por Agar chocolate.
[d] También puede ponerse en una placa de agar MacConkey.
3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de
muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria);
Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminoácidos) +
VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram-,
anfotericina => antifúngico, trimetropinsulfametroxazol => antibiótico de amplio espectro).
4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayoría de
bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y
aminoácidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina
dinucleótido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.
5. Medio base Christensen (líquidos y sólidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de
rojo => rosa; gérmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory
6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energía)
para la investigación de bacilos Gram- (la diferenciación entre coliformes y coliformes
fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente
de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrógeno. Los coliformes no fecales
como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podían utilizar el citrato en este
medio dando una reacción alcalina); Comp: citrato sódico, azul de bromotimol (indicador
pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); gérmenes con citrato
permeasa => Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.
7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias mediante
prueba de Voges-Proskauer (producción de acetoína/ acetil metil carbinol => por reducción
a 2,3 butanodiol o por oxidación a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo (acidificación del
medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); gérmenes con VP+ => Klebsiella
pneumoniae y Enterobacter aerogenes; gérmenes con RM+ => Proteus, E.coli y
Salmonella.
8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e
identificación de gérmenes en las vías urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de
bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente
=> E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+),
Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus
aereus (amarilla L+).
9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar) =>
investigación de microorganismos hemolíticos (consume hematíes); es un medio general
enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estériles y
desfibrinadas; alfa hemólisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la
colonia; beta hemólisis/ Streptococcus B-hemolítico y Staphylococcus aureus que causan
anginas (total) => halo transparente; gamma hemólisis/ Pseudomona causa gastro
intestinales (no hemolizar) => sin halo.
10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para
aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus,
Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de
metileno (indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).
12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo);
muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado
para la identificación de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp:
lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato férrico amoniacal y tiosulfato sódico
(componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los gérmenes productor de
SH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella
y Citrobacter y E.coli.
13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificación de entero-bacterias
Gram-/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+),
cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor
de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella,
Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.
14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el método
de Bauer-Kirby
15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificación de
la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina
(orinitina descarboxilasa /está dada por un color púrpura/ alcalinidad del medio y la
producción de indol (al añadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de
inoculación; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.
16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el
aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sódico (inhibidor de flora Gram+ y Gram-
excepto Salmonella); después también se hace cultivo con agar SS.
17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patógenas importantes
Salmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato sódico y
citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor bacillos
Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o
rosadas; L- y SH2- => incoloras (típico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitación de
hierro => negro (típico de Salmonella).
18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y
diferenciación de bacilos entéricos Gram-, especialmente del género Salmonella y
especialmente Shigella (entero-bacterias patógenas); Comp.: xilosa (la fermentan
los entéricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+);
se puede utilizar para la identificación de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonella
que alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sódico + citrato de hierro amoniacal).
19. Medio caldo Columbia => caldos para hemocultivos.
20. Medio Castañeda (caldo y solido) => búsqueda de gérmenes Brucella, Vibrios y
Pasteurella en sangre (hemocultivos).
Pared celular - es el limite externo de la célula con estructura rígida, parecida a la pared
celular de las células vegetales; funciones => protegerse de cambios externos adversos,
mantener la morfología de la célula, proporciona la resistencia a los antibióticos, dar un
paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de tipo
(clasificación), implicada en la patogenicidad; dar el color en la tinción de Gram, violeta
oscuro => Gram+ y color rosa => Gram-.
Membrana plasmática - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared celular,
encerrando al citoplasma; funciones => actúa como barrera selectiva, interviene en la
degradación de nutrientes y producción de energía, en algunas se encuentran pigmentos y
enzimas para la fotosíntesis; estructura y composición => fosfolípidos, proteínas y
glicolípidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la membrana plasmática,
irregulares (no existen en las celulas eucarióticas), se encargan de dirigir la duplicación del
ADN bacteriano y realizar la respiración.
Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmática; función =>
engloba los orgánulos celulares (región nuclear, ribosomas, inclusiones/depósitos de
reserva, vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retículo endotelial plasmática, ni
mitocondria; composicion => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos.
Región nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido
nucleico; funciones => el acido nucleico transmite la información genética de la célula
sobre estructuras y funciones celulares; estructura y composicion => es un núcleo difuso
que contiene 1 molécula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada en forma
de anillo); plásmidos => estructuras que pueden existir ademas de ADN cromosómico
(formadas por moleculares de ADN extra-cromosómico bicatenario, pueden estar libres o
unidos al ADN cromosómico /episomas), se replican independientemente, se transmite por
conjugación, portan genes muy importantes que determinan la resistencia a antibióticos,
tolerancia a metales tóxicos y síntesis de enzima.
Flagelos - largos apéndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es
rara); funciones => responsable de la movilidad (elementos patogénico: facilitar la difusión
de las bacterias a traves de las
membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y corpúsculo basal); tipos =>
monótricas (1 solo flagelo en un extremo), lofótricas (2 o mas en un extremo), anfítricos
(un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro extremo), perítricos (flagelos
distribuidos en toda la superficie de la bacteria);
Pelos /pilis o fimbrias - elementos rígidos constituidos por una proteína (pilina); cortos,
muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que en Gram+;
funciones => capacidad de fijación a superficies (pelos comunes), proporcionan pelos
comunes y sexuales (son morfológicamente iguales), sistema de intercambio de
información genética por conjugación (pelos sexuales).
Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tinción negativa (tinta
china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve como almacén
externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas fagocíticas (elemento
virulencia), protege de la desecación (contiene agua), formación de colonias (habitualmente
engloba mas de una bacteria); estructura y composición => polisacáridos y proteínas.
2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan
patologia humana (la mayoria).
Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus
Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio)
Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria
Bacilos irregulares no esporulados:
- Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium)
Micobacterias:
- Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium)
3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30); dentro de este
grupo, los que provocan patología humana => genero Mycoplasma/ Mycoplasma
pneumoniae y Ureaplasma.
4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan
patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ termogenas)
Para la asignación de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el código
internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por
el Int´l Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas
en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus números; una especie bacteriana,
viene definida por un nombre genérico de un nombre especifico latinizado o helenizado y
concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra mayúsculas y el de especie
con minúsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o
en su defecto, subrayado; en la denominación de un especie, la palabra que define genero
puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de
las bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej.
Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un
autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, también puede dar referencia a un acontecimiento
p.ej. Legionella; el nombre generico es único; para referirse a un especie o varios especies
no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categorías taxonomia superiores, se
forman añadiendo las palabras que las asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el
orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categorías taxonomía se expresa en
cursiva o itálica.
FLORAS BACTERIANAS
Flora Normal de la especie humana => la población de microorganismos comensales que
normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la
piel y las mucosas colonizadas por microorganismos dinámicos => cambios cualitativos y
cuantitativos constantemente; 2 poblaciones:
1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de
microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen
alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones
fisiológicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente
beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorción de nutrientes y
impide la colonización de microorganismos potencialmente patógenos.
2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patógenos o potencialmente
patógenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca
importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse y
producir infecciones.
La supresión de FR => vació ecológico => ocupación de microorganismos ambientales o
de otras zonas de cuerpo => infecciones.
FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estériles; algunos ejemplos:
- Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si
alcanza el torrente sanguíneo => si válvula cardíaca dañada => posible endocarditis;
- Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible
peritonitis o bacteriémia.
- Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cáncer, leucemias,
linfomas, SIDA)
- E.coli es comensal del colon => lugar estéril (o no habitual) a traves de uretra =>
infección urinaria
Las causas de las interpretaciones erróneas => no se toma en cuenta al microorganismo
como patógeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisión o inclusión de una
especie en una de las categorías no implica que no pueda ser aislada en otra zona del cuerpo
o que en condiciones especiales, pueda producir enfermedad.
Numero de campo – diámetro de la imagen observada a través del ocular (en mm).
Profundidad de foco – el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo
>< aumento y AN (apertura numérica) de la lente.
Tipos de microscopios:
Microscopio de campo oscuro – si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con
un indice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide
sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observación de seres microscópicos
transparentes y no teñidos (Treponema pallidum – preparación en fresco).
Microscopio de fluorescencia – consta de una fuente de luz muy intensa (lámpara de Hg a
alta presión), emite una radiación que puede incidir en la muestra desde abajo, tras
atravesar un condensador de campo oscuro (iluminación transmitida); se emplea un tipo
especial de liquido de inmersión (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria
- fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina;
Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del
bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar Gardnerella vaginalis en los
exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijación del fluorocromo
(colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado).
Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz
fluorescente
de exitacion (UV) Observador
Coloración vital - es una técnica intermedia entre los exámenes en fresco y las técnicas de
tinción después de fijación previa???; consiste en teñir las muestras bacterianas con
colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular parcialmente dichos
colorantes; la dilución debe ser muy altas para que no resulten toxicas para las bacterias,
evitando la muerte de tales gérmenes; material => microscopio, asa de siembra estéril,
portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de filtro, una suspensión de muestra problema,
aceite de inmersión, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro
en solución acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solución acuosa al
1:1.000 o 1:500).
Técnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos limpio y
desengrasado una gota de suspensión muestra junto con otra gota del colorante diluido
utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos con
cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al microscopio con objetivo de
inmersión; resultados => los microorganismos se visualizaran vivos y ligeramente
coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro o de color
azul si se utiliza el azul de metileno.
Tema 12 - Las tinciones en bacteriología
La morfología bacteriana (es incolora) puede ser estudiada por visualización de los
microorganismos => vivos sin teñir (observar su posible movilidad) y teñidos mediante
colorantes con una concentración que matan la bacteria y no permiten observar su
movilidad, pero mejora notablemente la visualización de su morfología y estructuras.
(2) Tinción negativa => es un tinción simple (1 solo colorante => tinta china o solución
acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijación previa (no mata las
bacterias), permite observar características estructurales de la bacteria ademas de su
morfología sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej. los neumococos;
se basa en => colorante acido cargado negativamente, los microorganismos no se tiñen (se
quedan claros y brillantes sobre un fondo teñido oscuro); para obtener una capa fina (para
dejar pasar el paso de luz del microscopio y evitar a formarse grietas al secarse el colorante)
se puede hacer una extensión con el borde de otro portaobjetos; resultado => se observan
las capsulas (si las tienen) en forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.
(3) Tinciones diferenciales => fijación previa (en general por calor), se utiliza 2 colorantes
(el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfología y características estructurales
(composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloración ácida (t.Gram y
t.ZhielNeelsen).
(4) Tinciones estructurales => fijación previa (en general por calor), se utiliza al menos 2
colorantes, nos permite observar su morfología y características estructurales como esporas,
flagelos, cilios, capsulas, corpúsculos metacromáticos (utiliza 1 solo colorante???).
Tinción diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando
trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tinción diferencial; es
mas empleado en bacteriología, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-); distinto
comportamiento debido a la distinta composicion de la pared de las celulas bacterianas; se
emplea como el primer colorante básico (cristal violeta o violeta de genciana) que teñirá de
color azul violeta todas las bacterias, posteriormente un mordiente el lugol que aumenta la
afinidad del primer colorante a las celulas (lo fijara), finalmente un agente decolorante que
decolora solamente un tipo de bacterias (Gram-) que serán teñidas con el colorante de
contraste o segundo colorante (la safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color
azul violeta serán Gram+.
Material de la tinción Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra, mechero
de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tinción (punte), frasco lavador, muestra problema, aceite
de inmersión, colorantes para la tinción de Gram.
Técnica:
- realizar la preparación de frotis => extender 1 gota de agua destilada estéril + una colonia
de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto
- fijación por el calor, pero no quemar las bacterias
- aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2
minutos
- lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante
- añadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solución iodoiodura de potasio con OH de
96º o con acetona a 5/1 o con OH 50%)
- vuelve a lavar con agua el exceso
- decolorar con solución decolorante (alcohol 90º)
- lavar abundantemente con agua
- cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto
- lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire
- observar con objetivo de inmersión (100x).
1º vía glucolítico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto por Pasteur
=> se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilación por cada molécula de glucosa
que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la
formación de acido pirúvico, las bacterias que usan esta vía, normalmente utilizan la vía
fermentativa para acabar transformando este acido pirúvico en ácidos mixtos; degradación/
hidrólisis de glucosa (6C) => acido pirúvico + 2 ATP (fosforilación) => ácidos mixtos
(fermentacion); son 9-10 reacciones químicas con un enzima diferente en cada una;
utilizados por las bacterias fermentadoras que poseen deshidrogenasas (Clostridium,
Enterobacter, Salmonella)
2º vía de las pentosas fosfato /vía fosfoglucónica (vía HMP) - es una ruta mixta y vía
alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas y también glucosa,
mediante sucesivas reacciones y produce => pentosas intermedias (precursores de síntesis
de ácidos nucleicos y ciertos aminoácidos) de gran utilidad para las celulas; ademas de la
glucólisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP como una vía alternativa para la
oxidación de la glucosa => produce acido láctico o acido mixto + 1ATP (p.ej.
Enterobacterias/ E.coli); esta vía es un híbrido de la vía ED y la EMP, ya que en las
primeras etapas, la oxidación de la glucosa es similar a la via ED y en las etapas posteriores
es similar a la vía EMP, es decir: proporcionan a las bacterias no oxidativas un medio de
oxidar la glucosa a acido pirúvico puro, porque no tienen las enzimas necesarios para
comenzar la vía EMP, apareciendo en los sistemas analíticos como fermentadoras.
3º vía de Entner-Doudoroff (vía ED/ vía aerobia => requiere O2) - es otra vía por la
cual la glucosa se oxida a acido pirúvico; por cada molécula de glucosa se producen 1
molécula de ATP para ser utilizada por la célula en reacciones bio-sintéticas; esta vía
requiere enzimas específicos y solo los microorganismos que las poseen pueden utilizarla
sin seguir la vía de las pentosas fosfato ni la glucólisis; los microorganismos que la utilizan
son Pseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las deshidrogenasas
necesarias para oxidar el acido pirúvico al acido láctico u otros ácidos; los hidrogeniones se
transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidación de glucosa => acido
pirúvico + 1ATP (no producen acido láctico ni acido mixto)
Producción de acido sulfhídrico - técnica con indicador incorporado al tubo/a la placa =>
algunos microorganismos actúan metabolizando proteínas con aminoácidos
azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhídrico SH2; el gas
es detectado a traves del medio que contiene fuente de hidrógeno (azucar) fuente de azufre
(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro /citrato férrico
amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberación del gas SH2 por algunos
microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de la
glucosa => acidifica/produce ácidos/baja el pH) que actúan sobre los aminoácidos
azufrados; la temperatura de incubación (estufa) tiene que oscilar entre 35-36ºC (superior a
37º se inhibiría la producción de SH2).
Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas de
siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen
y SS);
Técnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara
una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en
cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la técnica se realiza con Brucella
(microaerofila), se debe incubar con una atmósfera de CO2.
Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de
inoculación ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se
ennegrece el medio.
Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentación de azucar) + indicador de
pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro
insoluble/ puntos negros (FeS)
Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actúan sobre el grupo carbóxilo de los
aminoácidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende
CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba
(API - buscar el código en el libro); estas pruebas se aplican para la identificación de
Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinización del medio inicialmente de color purpura,
se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado
supondrá la alcalinización del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada pocillo
contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada
descarboxilasa actúa sobre un aminoácido especifico; en cada reacción se desprende CO2 y
se alcaliniza el medio:
- L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2
- L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2
- L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilación) =>
Putrescina +CO2
Material => pruebas de API, pipeta Pasteur.
Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequeña cantidad en su
composicion una pequeña cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y
purpura de bromo cresol, pH6); aminoácidos ensayados en forma L, muestra de problema y
papel parafina.
Técnica => se añade una gota del inoculo (suspensión microbiana) en cada pocillo de la
prueba de API; se incuba a 35ºC durante 18-24 horas.
Resultados => durante las primeras horas de incubación, el caldo vira a amarillo, por la
fermentación de glucosa que lleva el medio; pero si el aminoácido es descarboxilado, el pH
vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+);
si se queda amarillo sera descarboxilasa-; gérmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no es
100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y Ornitina):
- Lisina => Klebsiella, Serratia, Salmonella
- Ornitina => Serratia, Proteus, Salmonella
- Arginina => Salmonella, Pseudomonas
Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plástico, papel de filtro,
porta, reactivo oxidasa de Kovacs.
Técnica => mezclar una pequeña muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se
sitúa por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de
color; otra manera: se añade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias
de la placa Petri con agar sangre y también en otro medio; si son oxidasa positivo toman un
color marrón y en seguida pasan a negro parduzco.
Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a
los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, después de 60" es negativo; oxidasa- no
se produce color.
Pruebas de catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios
y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que actúa
sobre el peróxido de hidrógeno /H2O2 (es un producto final de la degradación aerobica
oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos gérmenes morirían;
fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2
=> se descompone en H2O + O2; aplicación => diferenciación de Streptococcus (-) de
Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);
Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plástico (las de platino
catalizará la reacción)
Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema
Técnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto,
simultáneamente, con una asa se añade una colonia del cultivo del microorganismo de 12-
24 horas, homogeneizar y observar.
Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen
burbujas; se podrán observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangre
o otros que lleven hematíes (los hematíes contiene catalasa).
Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo,
microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es
productor de H2S (acido sulfhídrico) este impide la formación de color; técnica =>
hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el
medio; incubar a 37ºC durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B,
observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rápido, ya que el color
puede desaparecer); si no se forma color, se añade al tubo un poco de polvo de Zinc;
resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y Branhamella
Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al añadir el reactivo A y B que
indica la reducción de nitratos a nitritos; [2] al añadir polvo de zink no se desarrolla color
indica formación de otros productos nitrogenados; Nitratasa- => cuando se forma color rojo
o rosado al añadir polvo de zinc en menos de 30 segundos.
Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la
ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinización de un medio liquido; la
ureasa cataliza la hidrólisis de la urea => carbonato amónico, que sube el pH, con lo que el
medio se alcaliniza; aplicación => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas /
E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;
Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o baño maría.
Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color ámbar) y microorganismo de
problema
Técnica => con el asa estéril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas;
inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37ºC; la
reacción se produce entre 1-4 horas
Resultados => en ureasa (+) el caldo de color ámbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de
reacción (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella,
Enterobacter, Brucella, requieren 6 días de incubación.
Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) -
observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitación al ponerse en
contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la
coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en plasma;
aplicación => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+, beta hemolítico
+ y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es coco
Gram+, catalasa+, beta hemolítico +; técnica => (usando el kit comercial /prueba de látex)
seguir la instrucción de la casa comercial que hacen el reactivo; resultados => coagulasa+
se observa en forma de grumos (si se utiliza un plasma como reactivo => se observara la
formación de un hilo de fibrina en la reacción) y en coagulasa- no se forma grumos.
Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentación solo de la glucosa => K/A zona
superficial roja (reacción alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccion ácida);
después de la fermentación de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es amarillo
entero, pero posteriormente la parte del pico se alcalina/rojo (había poca cantidad de
glucosa) por la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos (que forman la peptona) que
se produce mejor en aerobiosis; la fermentación de glucosa en el pico es inicialmente
mediante la vía EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio
clave (acido pirúvico), que a su vez el acido pirúvico es degradado mediante el ciclo de
Krebs por los aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio,
en el fondo, el acido pirúvico es degradado hacia acido láctico y acido mixtos que mantiene
el pH acido de manera estable.; son características de Morganella, Providencia y
Shigella; también P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri.
[b] en la fermentación de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son
amarillas (características de E.coli y K.pneumoniae);
[c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de
color rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de
color naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa)
[d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo
(gérmenes inertes).
Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clínica (E.coli,
Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Sighella,
Vibrio) son anaerobios facultativos, que para tener energía para sus reacciones metabólicas,
utilizan la fermentación acido-mixta de los hidratos de carbono produciéndose => acido
succínico, acido acético, alcohol etílico (ácidos mixtos); en RM positivo, aparecen un color
rojo fuerte en la superficie y en RM negativo, no hay cambio en la superficie del medio.
Material => igual que anterior
Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solución de rojo de metilo y
microorganismo
Técnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema
(b) actualmente se utiliza la modificación de Barry que es poner un inoculo abundante en
0,5 ml de reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le
añaden unas 5 gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el
medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la
superficie del medio
(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de
ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infección sin
llegar a dosis que produzcan efectos tóxicos, puede eliminar el germen.
Factores a tener en cuenta => (1) características tintoriales del germen (Gram+o-) (2)
lugar de la infección (especialmente las vías urinarias y meningitis); es importante porque
es necesario que la CMI sea alcanzable en los líquidos corporales para que sea efectivo (3)
bacteria investigada.
2. Derivados de betalactámicos:
* Aztreonam - se utiliza comúnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas
aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como
p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus.
6. Otros
* Fosfomicina - es un ATB de origen español de un amplio espectro que actúa sobre la
pared celular (se usa en infección urinaria)
* Acido fucsidico - actúa sobre la síntesis proteica y destaca su acción sobre
Staphylococcus aureus.
d. Prueba de difusión en medio solido (antibiograma clásico) => estandarizado desde los
años 50 (se hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos sus pasos y
es mas utilizado actualmente en forma manual; fundamento => depositar discos
impregnados de ATB sobre cultivos de microorganismos en placa; la difusión del ATB a
traves del medio produce un halo de inhibición del crecimiento cuyo diámetro sera
proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de resistencia,
sensibilidad o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas
metálicas estériles o dispensador automático, pie de rey o regla milimetrada, medio
Mueller-Hinton, discos de ATB, suspensión microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10
elevado 8 u.f.c./ml; escala Mc Farland => el 0,5 se prepara añadiendo 0,5 ml de Cl2Ba 0,04
M a 99,5 ml de acido sulfúrico 0,36M); una placa llena => mas de 10 elevado 6.
Elección de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en
los casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o resistencia;
los aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las
características tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infección (orina, meningitis)
y la bacteria investigada.
Concentración de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada siguéndose las
normas de la Federación de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar
entre 65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control
para controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una
concentración que producen un halo de inhibición entre 20 y 30 mm para organismos
tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes.
Implantación de los discos (papel de filtro grueso de un diámetro 6mm que van
impregnados con una concentración determinada de ATB); Manual => se saca el disco de
ATB con unas pinzas estériles y se deposita en la placa, la distancia mínima entre los discos
es de 24 mm para evitar la superposición de los halos, deben estar situados a 15 mm del
borde como mínimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona
ligeramente con la punta de pinzas; Automática => se utilizan dispensadores automáticos
que son unos dispositivos de plástico del tamaño de una placa de Petri con unos orificios
guía que permiten la colocación simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con
una pinza se presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir la placa no se
caigan los discos.
Incubación => 18-24 horas a 35-37ºC (máximo 48 horas)
Lectura e interpretación del antibiograma => los resultados se expresan según el halo de
inhibición que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o
pie de rey midiendo los diámetros, y según cual sea clasificaremos al germen como sensible
(la dosis habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin
llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz);
Observación al método:
1. preservar la estandarización en todos sus pasos
2. puesto que la difusión del ATB es casi instantánea no debe moverse ningún disco una
vez que se ha puesto en contacto con la superficie del agar
3. los discos se tienen que conservar en la nevera
4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitándose el exceso de incubación
5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos
como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para gérmenes exigentes
6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad
7. cuando el germen sea anaerobio el método es diferente
Nefronas - son unidades funcionales básicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro
de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular.
El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red
vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia);
se filtra agua, urea, creatinina, aminoácidos, ácido úrico, glucosa, proteínas de bajo pm.
Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido);
normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de
la concentración de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la
glucemia por encima de umbral renal (2) alteración renal (tubulopatía)
Urobilinógeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por acción de la
flora bacteriana se transforma en urobilinógeno o estercobilinógeno (se elimina
en mayoría con las heces y la orina en menor concentración); la cantidad de urobilinógeno
aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolíticas; la determinación de
urobilinógeno debe realizarse rápidamente en orina, ya que se transforma en urobilina + O2
(falso negativo).
Estructuras organizadas
- Hematíes: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran numero
indica infección, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 1-2/campo o
como una contaminación menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de
oxalato cálcico monohidratado; con tinción Gram se diferenciar => los hematíes son
teñidos de rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir
entre macro-hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y micro-
hematuria (únicamente se detecta al microscopio), también si el color rojo
observado macroscópicamente procede de hematíes o Hb (al centrifugar el sedimento, el
color rojizo de Hb permanece).
- Leucocitos (neutrófilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de
ellos se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de
1-2/campo (varón) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria
(>5 leucocitos/campo indica => infección renal en cualquier nivel);
Celulas epiteliales: el árbol urinario esta revestido por 3 tipos de epitelio => (1) columnar
/tubular /renales /cuboideo (capsula de Bowman, túbulos distal, proximal y colector) (2)
transicional o urotelio (pelvis renal, uréteres, vejiga y uretra) y (3) escamoso (uretra y
vejiga); una escasa descamación es normal, pero se puede aumentar por causas =>
microorganismos, productos químicos, cuerpos extraños, procesos degenerativos, procesos
invasivos-destructivos.
- Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamaño 1/3 mayores que los leucocitos; su
forma normal es redonda con núcleo grande y céntrico; un sedimento normal 0-1/campo;
aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.
- Cilindros céreos: son muy refringentes, rígidos, de apariencia dura, superficie rugosa y
brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran
tamaño; su presencia es un síntoma claro de una alteración renal importante; suelen estar
inmersos en una cilindruria (presencia de la mayoría de los diversos tipos de cilindros).
Estructuras no organizadas
Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas
cristalinas según la condiciones físico-químicas de la orina (la pH sobretodo, densidad,
temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos:
(1) Cristales endogénos normales - no corresponden a alteraciones metabólicas ni
funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recién emitidas.
(2) Cristales endogénos patológicos - reflejan trastornos metabólicos o afectación grave
de algún órgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina.
(3) Cristales exógenos - aparecen en la orina tras la introducción en el organismo
(vía enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiológicos/ contraste
radiopaco vía endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)
- Cristales de acido úrico: en orinas ácidas; son birrefringentes; de formas variadas (p.ej.
agujas); color entre marrón rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica
una situación patológica o concentraciones elevadas de acido úrico; un sedimento normal 0-
2/campo.
- Leucina y tirosina: en orinas ácidas; raramente se observan; son productos finales del
metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en situaciones clínicas graves
=> destrucción o necrosis tisular importante, fundamentalmente de
tejido hepático (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina forman manojos de agujas
finas y los de leucina son como gránulos esféricos de estrías radiales y concéntricas, de
aspecto oleoso o graso y muy refringentes; ambas son de color amarillo o marrón.
- Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color
blanquecino.
Informe del sedimento urinario
1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad
y características patológicas)
2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos.
3. debe proporcionar una visión del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido en
todos los campos observados.
4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante)
5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citológico,
segundo el de químico y por ultimo el de microbiológico.
Examen citológico:
- celulas hematológicas => se redactan con números y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C =
no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acúmulos.
- celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) -
abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las
de transición; las celulas escamosas (de las vías bajas), se informan cuando son abundantes.
- cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el
informe el tipo de cilindro.
Examen químico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el
informe):
- cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis".
- compuestos amorfos => se redactan con adjetivos
Examen microbiológico:
- bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su
movilidad
- levaduras => se informa con adjetivos.
Staphylococcus => cocos Gram+ inmóviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamaño +/-
1 um; en forma de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas
azucares (via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios
con alto contenido de NaCl (halófilo); resistentes a agentes externos, distribuidas
ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la
intoxicaciones alimentarias, heridas, etc.
Clasificacion
A. según el tipo de hemolisis (capacidad de romper hematíes -
produce hemólisis alrededor de sus colonias en AS) => gamma hemolítico,
alfa hemolíticos/ hemólisis parcial (decoloración parda verdosa - S.viridans);
beta hemolíticos/ hemólisis total (halos de transparencia grandes entorno a su colonia) -
grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolíticos - grupo D,
S.viridans y S.pneumoniae (alfa y gamma)
(4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolíticos; resistentes a agentes
externos y ATB;
- los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen
bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina; son
alfa-beta-gamma hemolíticos; resistente a la bacitracina; puede producir infección urinaria
e herida.
- los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y caballos);
hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina;
(5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e
intestino en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a
la bacitracina; son alfa y beta-hemolíticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%)
(6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen alfa y
gamma hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries);
resistente a la optoquina;
Aislamiento:
- toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estéril, una muestra del
pus (si hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos);
- un frotis para la tinción de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza
una tinción negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula);
se produce una reacción de Quellung cuando un Acs tipo específico se une al polisacárido
capsular del neumococo y causa un cambio en el índice refractivo de la cápsula haciéndola
aparecer “hinchada” y más visible.
- la siembra en AS-CNA (posibles hemólisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que
inhibe el crecimiento de otros gérmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis
o sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeños; medios selectivo
y diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D.
Pruebas bioquímicas:
- pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina;
hidrolisis de hipurato (positivo en el grupo B), utilización de bilis esculina.
- identificar los grupos antigénicos según el tipo de sustancia polisacárido C
(clasificación de Lancefield) por metodo serológicos => prueba de látex (romper la capsula
para sacar la sustancia; reacción inmuno-complejo Ag-Ac).
- los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+,
catalasa- que no son estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina).
Pruebas serologícas / inmunologicas:
- la búsqueda en el suero (dilución seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas
de estreptococos (sobre todo grupo A) => títulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para
saber si la infección es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumáticas con títulos de
ASLO negativos, se determinan los títulos de Acs antiestreptoquinasas (ASK),
antihialuronidasas (ASH); pruebas de hinchamiento capsular con suero antineumococico
polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para determinar S.pneumonia => se añaden
Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinación es signo de que esta estreptococo.
Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de café), aerobios; son
saprofitos de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los
animales; citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y
fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a
medios externos.
Características antigénicas:
- Ag somático / Ag O => es lipo-polisacárido, termo-estables, se encuentra en la pared
bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacárido es muy antigénico y la parte lipídica es
inactiva bioquímica-mente).
- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacárido, es anti-
fagocitarías (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y
Salmonella thyphi).
- Ag flagelar /Ag H => es característico de las cepas móviles, es proteico y responsable de
la acción patógena de la bacteria.
Cuadros clínicos
1. Infecciones entéricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - para-tifoideas);
Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre vía oral (alimentos crudos, poco hechos,
mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la acidez gástrica, pasa
al intestino delgado (íleon), penetra por endocitosis destruyendo parte de las celulas de la
mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas son fagocitadas por macrófagos y
transportadas por diferentes vías y provoca bacteriémia => todo sucede en el periodo
de incubación (8-15 días); comienzo brusco de signos y sintomas => los macrófagos les
transportan hacia el bazo, higado y MO, produciendo multiplicación de nuevas salmonellas,
volver al intestino generando placas ulceradas, necrosación de placas de Peyer y en casos
mas graves originar perforación y hemorragias.
Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubación de entre 7-10
dias con bacteriémia y estado febril que dura varias semanas; no hay perforación intestinal
ni hemorragias ni invasión de salmonellas a otros órganos; cuadros clínicos => dolores de
cabeza, fiebres altas, anorexia, astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-
10 días.
Acción patógena e interés clínico - los cuadros clínicos son variables según el tipo de
toxina que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitarías y
resistencia a bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas,
causante de cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo
de acción análogo al de Shigella con menor gravedad; a veces la entero-toxina que
producen es parecida a la de Vibrio cholerae que causa perdida masiva de agua y
electrolitos.
- si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotóxica parecida a Shigella => cuadros
diarreicos en brotes epidémicos que afectan a niños y lactantes (E.coli entero-patógena)
- si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en niños,
adultos, originándose esporádica-mente brotes epidémicos (diarrea del viajero - E.coli
entero-toxígena)
- si forma una entero-toxina citotóxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos
graves, hemorragico esporádicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica)
- si presenta ciertos plásmidos que incrementan su capacidad de invasión => cuadros
diarreicos graves que afectan a niños, adultos con brotes epidémicos en casos aislados
(E.coli entero-invasiva)
Las cepas de E.coli se distingue con sueros antigénicos; E.coli también puede provocar
infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges
(meningitis en neonatos).
6. Hafnia => móviles a 22ºC y inmóviles a 37ºC, fermentadora lenta de lactosa (ONPG+),
citrato+, utiliza glucosa y produce acetoína (VP+); provoca infecciones hospitalarias.
Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella pneumophila (el
agente etiológico de la legionelosis / neumónia atípica por Legionella); un coco-bacilo o
bacilo Gram-, aerobio estricto, requiere medios muy específicos para crecer (agar
legionella), catalasa+, oxidasa+, en ocasiones puede presentarse de forma filamentosa; en
general son móviles, pero algunas cepas son inmóviles.
Acción patógena e interés clínico - se transmite vía aérea a partir de aerosoles procedentes
de aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores contaminados
con Legionella; tras el periodo de incubación (+/- 1 semana) se produce fiebres altas,
astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un
cuadro típico de una neumónia atípica); se conoce como la enfermedad de los legionarios;
el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el tratamiento
preciso suele remitir sin problema.
Para que se produzca el tétanos es necesario una serie de condiciones tales como que el
microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida
profunda (cortante, punzante, mordeduras, arañazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras
por decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que
facilita la infección anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas de
Clostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo
de incubación (5-7 días), se origina su acción patógena; es rara que se produzca de forma
local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es
importante la detección precoz y medidas profilácticas (vacunación se renueva cada 10
años).
Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, móviles por
su flagelación y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes
sobre las personas que originan parálisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas
ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las
condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patógena sobre el
organismo sera neuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su
toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que solo
se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30ºC, pH
neutro o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son
de carácter proteico y termolábiles (se destruyen a temperatura 100ºC durante 5 minutos o
70ºC de 30-60 minutos).
Genero Treponema - son espiroquetas pequeñas, finas con un numero de espiras entre 5-
20 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tiñe difícilmente con Gram y se
tiñe mejor con Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro
y de contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de
cultivo in vivo para crecer (testículo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial
oxido-reductor (microaerofila), presentando en ocasiones una respiración anaerobia y un
metabolismo fermentativo; el especie patógena para el hombre es Treponema pallidum que
transmite la sífilis por contacto directo; existen dentro del genero Treponema especies
comensales de las mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo digestivo, etc. que no
son patógenos para el hombre y se pueden cultivar.
Resumen de la evolución de sífilis => Incubación 10-90 días (termino medio 21 días) -
Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 años) - Periodo
secundario/ sífilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 años) - Periodo terciario/
Neuro-sífilis forma muy grave con mal pronostico.
Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamaño con espiras mas amplias e irregulares
con extremos afilados y son móviles; las especies patógenas para el hombre y los animales,
originan fiebres recurrentes endémicas y epidémicas; es microaerofílica con un
metabolismo fermentativo; se tiñen con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro,
pero requiere medios muy específicos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se
transmiten por piojos y por garrapatas.
Acción patógena e interés clínico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy
cosmopolita, en ocasiones endémica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura
del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del huésped, ayudadas
por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dará lugar a micro-
traumas en la piel y facilitan el paso de dichas borrelias; después de unos
7 días de incubación se originan fiebres, dolores musculares, cefalea, etc; clínica que dura
unos 10 días y luego desaparecer, produciendo posteriormente recurrencias; no es una
enfermedad grave y es fácil de tratar, especialmente con tetraciclinas.
Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y
apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y móviles; se tiñen débilmente con
Gram, también se pueden teñir con Giemsa; su metabolismo es oxidativo (crecimiento
aerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parásitas; puede originar de forma
casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el reservorio son animales,
consideradas como zoonosis.
(2) Tifus murino o endémico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga,
garrapatas y ácaros; tras el periodo de incubación de 4-15 días, se produce fiebres altas,
cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clínico leve sin complicaciones
ni recidivas como el tifus exantemático.
(3) Fiebres manchadas de las montañas rocosas - producida por R.rickettsii trasmitidas
por las garrapatas; tras el periodo de incubación de 3-6 días, aparecen fiebres altas, mialgias
generalizadas y una mancha negra en la zona de la picadura; en España la especie mas
extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre botonosa o exantemática mediterránea,
transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del perro); tras el periodo
de incubación de 2-6 días provoca una mancha negra a modo de botón en el lugar de la
picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se
suelen complicar y responden bien al tratamiento.
(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalación de esta u otras
(presencia de artrópodos), la vía de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el periodo
de incubación de 3 semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas y
cuadro clínico leve.
Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de
gaviota (en cultivos jóvenes); son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar; no
fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de
muchos animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada
oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extra-
intestinales (meningitis, endocarditis, artritis séptica), especialmente en pacientes con
SIDA.
Metodos indirectos:
- Prueba de la urea rápida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio
con alta concentración de urea y un indicador de pH.
- Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de
tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se
detecta con un espectrofotómetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un
contador de centelleo (un método diagnostico rápido y no invasivo, pero requiere un equipo
especial par al lectura).
- Prueba serología => para detectar Acs utilizando la técnica de ELISA.
Tema 26 -
VIROLOGÍA CLÍNICA (características generales de los
virus)
Introducción - virus es un parásito intracelular estricto que requiere infestar
una célula para sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy
pequeños tamaños (filtrables) y se caracteriza por su mecanismo
de replicación, organización y composicion;
composici virología clínica se remonta al siglo XX y la
composicion de un virus fue determinada por Schlesinger en 1933; en los últimos años se
han descubierto otros agentes infecciosos mas simples como los viroides y los priones;
- los viroides => moleculas circulares
circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que causan
enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales;
- los priones => son proteínas que parecen estar codificadas por genes celulares
y actúan como señales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los
procesos físico-químicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o
inflamatoria en el huésped;; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras
(scrapie), encefalopatía espongiforme en las vacas y enfermedades neuro-degenerativas
degenerativas
transmisibles en el hombre (p.ej. Creutzfeldt-Jacob /encefalopatía espongiforme progresiva
y síndrome de Gerstman-Straussler
Straussler-Streinker y el kuru);
); la patogenia (de todas) se
caracterizan por desordenes progresivos como ataxia (dificultad motórica),
motórica), demencia,
deterioro cognitivo y motor; tras un periodo de incubación largo (meses o
años), aparecerá los sintomas clínicos; el tropismo de la infectividad es SNC,, seguido por el
bazo y nódulos linfáticos; en el cerebro se detecta acumulación anormal de proteína
proteína-prion
en el genoma del huésped; los priones son resistentes a las proteasas e induce
una degeneración neuronal.
Concepto de virus - es un bloque de material genético (ADN o ARN) rodeado de una
cubierta proteína (cápside) que le sirve como vehículo para su transmisión; algunos
presenta membrana lipídica (envuelta) que se adquieren de la membrana citoplasmática de
la célula infectada durante el proceso de salida; los virus envueltos tienen un matriz
proteica que sirve como puente entre la nucleocápside y la envoltura; carecen de organelas
citoplasmáticas para crecer y multiplicarse, por lo que necesitan la maquinaria de
una célula huésped, pero si poseen algunos enzimas (nucleasas, transcriptasas, etc.); virión
es la partícula viral completa (genoma + nucleocápside); se clasifican por el tipo
de huésped que parasitan (virus animales, vegetales, bacteriófagos)
Estructura y morfología de los virus - son de tamaño entre 20-25 nm hasta 200-300 nm;
su observación requiere un microscopio electrónico.
- Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayoría de
virus ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los
virus ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core
o núcleo) pueden ser moleculas lineales o circulares únicas o segmentadas en varios
fragmentos.
- Estructura de la cápside => su función es de proteger el genoma del medio extracelular y
facilitar la entrada al interior de la célula; están compuestas de subunidades proteicas
repetidas (capsómeros) que a su vez están compuestas de moleculas proteicas
(protómeros); según la disposición que adopten los capsómeros /la cápside, se clasifican en
virus de simetría helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20 caras
triangulares y 12 vértices) y compleja.
- Estructura de la envoltura => los lípidos de la envoltura es lipoprotéica y procede de la
membrana célula infectada, pero las proteínas suelen ser virales desplazados a
las proteínas celulares originales; en algunos casos, las proteínas incluyen una matriz
(proteína M) que contacta/ engancha con la nucleocápside; los virus envueltos tienen
estructuras glucoprotéicas (espículas) importantes para los procesos
de adsorción y penetración al interior de la célula.
Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicación varían dependiendo de la estructura
del virus y de su material genómico, pero en general conlleva pasos de => adsorción/
adherirse - penetración - decapsidación - replicación - ensamblaje - liberación.
- Adsorción => la unión de la partícula viral a la superficie de la célula; no
requiere energía y no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la
superficie del virión (proteínas de unión) y proteínas de la superficie de la membrana de
la célula diana (proteínas receptoras); en los virus envueltos, la proteína de adherencia viral
son las espículas de la capa externa de la envoltura.
- Penetración => tras ser adherido, se penetra el virión completo o solo el genoma y las
polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3
mecanismos: penetración directa, endocitosis o fusión; penetración directa => la membrana
solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej. fagos);
endocitosis => los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la
membrana citoplasmática de
la célula huésped formándose una vesícula endosómica (mecanismo mas utilizados de los
virus sin envuelta); fusión => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras de fusión:
en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la membrana citoplasmática directamente
y la nucleocápside se libera al interior del citoplasma; en el resto de virus envueltos, la
envoltura viral se fusiona con la membrana celular formándose una vesícula endosómica
que posteriormente libera la partícula viral hacia el citoplasma.
- Decapsidación => se degrada la cápside viral para que el genoma viral pueda liberarse e
iniciar la transcripción y la traducción; en la mayoría la penetración y la decapsidación se
produce a la vez.
c. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN viral penetrado en
el citoplasma de la célula huésped es reconocida de inmediato como ARNm por los
ribosomas, los cuales la captan e inician su traducción a proteínas virales y también un
enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA polimerasa producida + ARN viral (se utiliza
como molde) => replicación del ARN viral (todo ocurre en el citoplasma independientes
del ADN del huésped).
d. Replicación de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-)
complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas
sintetizara el ARNm que después le servirá de molde para la síntesis de nuevo ARN de
polaridad (-) y también para la traducción de sus proteínas utilizando la maquinaria celular.
e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+) que
poseen un enzima transcriptasa de reversión (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa); su
genoma ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma)
retrotranscriptasa => origina ADN bicatenario que se integran al ADN celular y permanece
alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN integrado se reactiva y es
transcrito a ARNm vírico por la polimerasa del huésped y entonces, se completa el ciclo
replicativo.
Taxonomía vírica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y según su
forma del genoma, tamaño, forma, estructura, sintomatología clínica que producen,
tropismo celular, etc; según el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica
en virus ARN y virus ADN.
Virus ARN
1. De simetría cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+)
que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la
célula huésped ya que no se necesita transcribir ARNm) con la excepción de Reoviridae
(bicatenarios) que utilizan su propia ARN polimerasa para transcribir ARNm; todos se
ensamblan en el citoplasma de la célula huésped y son resistentes al éter.
- Familia Reo-viridae => tamaño intermedio (60-80 nm de diámetro),
los únicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca
problemas diarreicos), tiene forma redonda.
- Familia Calici-viridae => son pequeños (35-39 nm), tienen poca importancia en
microbiología clínica; el mas importante /patógeno para el hombre es el virus de Norwalk
(productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusión no es definitiva)
- Familia Picorna-viridae => son pequeños (20-30 nm); los géneros mas importantes son los
Enterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el
virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).
3. De simetría helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza
su propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en
el citoplasma y son sensibles al éter.
- Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastón; el diámetro del cilindro +/- 70nm con
longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmática; el genero mas
importante es virus de la rabia.
- Familia Parvo-viridae => de tamaño muy pequeño 18-26nm con genoma ADN mono-
catenario; la mayoría no tienen importancia clínica, excepto parvovirus B19, pertenece al
genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.
- Familia Papova-viridae => son de tamaño pequeños 45-55nm con ADN de tira circular; el
genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos de
papilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades
latentes y crónicas y algunos son oncogénicos.
b. De simetría cubica o icosaedrica con envuelta - son bicatenarios y todos se ensamblan
en el núcleo con excepción de Irido-viridae que se ensamblan en el citoplasma.
- Familia Herpes-viridae => de tamaño medio +/-100nm, adquieren su envoltura en la
membrana nuclear y son sensibles al eter; de los 80 virus que existen, solo 8
tienen interés clínico para el hombre y se divide en 3 subfamilias: (1) Alphaherpesviridae
con géneros importantes el virus Herpes simples tipo 1 y 2 y el virus Varicella-zoster; (2)
Betaherpesviridae con géneros Citomegalovirus al citomegalovirus humano (Herpesvirus
humano tipo 5) y al Herpesvirus humano tipo6, y al genero Roseolovirus con el
herpesvirus humano tipo 7; (3) Gammaherpesvirus que incluyen virus de Epstein-Barr
(herpesvirus humano tipo 4) que provoca enfermedad de Beso, pertenece al genero
Limphocriptovirus.
c. De simetría compleja
- Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o
ovoide; se caracteriza como la única familia de virus ADN que se replica y ensambla en el
citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina
nuclear), de hecho su replicación es posible en celulas a-nucleadas (sin núcleo); son
resistentes al éter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la
otra en la membrana citoplasmática; los mas importante son virus de la viruela, virus de la
vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.
1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeños 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta -
de polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus
presenta, destacando 2 géneros Enterovirus y Rhinovirus.
- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo).
Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de
faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clínico, y deben
descartarse otras causas; por el contrario si se trata de LCR.
Rhinovirus - agentes etiológicos mas frecuentes del resfriado común (rinitis agudas);
existen >100 tipos
Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 años;
consta la importancia como agente causal de malformaciones congénitas desde la epidemia
de 1940 en Australia (un oftalmólogo australiano constato un elevado numero de
cataratas congénitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infección suele ser benigna
y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios superiores leves, erupción eritematosa
y linfadenopatía sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se puede complicar con artritis
transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o purpura trombocitopénica; muy
importante la infección en gestantes por posibles aparición de sordera neuro-sensitiva,
alteraciones cardíacas, cataratas, retraso del crecimiento y sintomas encefalíticos;
la incubación dura 14-21 días; diagnostico por método serológico (técnica de ELISA) para
detectar IgG y sobre todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo
indica inmunización frente al virus; actualmente es poco frecuente debido a la vacuna
obligatoria que se incluye en la triple vírica (paperas, sarampión y rubeola) que se pone a
los niños de15 meses (suele dar inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6
años (solo las niñas); a los 11 años solo se dan vacuna de varicela.
Clínica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un
eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampión; dura +/- 3 días y puede
haber enantema palatino.
1.5. Familia Retro-viridae (de tamaño grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de
polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retro-
transcriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIH que se
estudia aparte.
Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen
infecciones del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringo-
traqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumónia en niños (segundo agente después del
VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clínico.
Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante
de neumónia y bronquiolitis en niños y recién nacidos; produce un amplio espectro de
infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado común con abundante rinorrea; VRS es
muy contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la inmunidad no es completa
por lo que se dan las re-infecciones (mas suaves); Es importante que la excreción de virus
se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los inmunodeprimidos), por lo que al
ingresar un niño en el hospital durante 1 o 2 semanas, puede ser contagioso todavía (es el
agente mas frecuente de infección nosocomial en pediatría); las infecciones graves se trata
con la ribavirina (inhibe la síntesis del ARN viral); el diagnostico rápido es la
inmunofluorescencia en secreciones respiratorias.
Virus del Sarampión - causa una enfermedad aguda, febril, exantemática, de gravedad
variable que afecta a niños de 5-9 años, se contagia por vía respiratoria y conjuntival;
sintomas clínico => los primeros días como un catarro naso-oculo-faringo-laringeo, luego
aparece fiebre, cara rubicunda, congestión de mucosa y a los 3-4 días aparece "manchas
Koplik" (manchas blanquecinas diminutas delante del 1º y 2º molar) dura un par
de días; empieza aparecer exantema, primero retro-auricularmente, despues se extiende a
todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en zonas distales, sube a la
fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 días mejora bruscamente y
desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento (dará inmunidad permanente); el
diagnostico es por metodos serológicos.
Virus de la parotiditis - es una enfermedad endémica con incidencia todo el año; es rara en
niños < 1 año, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a niños de 5-14 años, se transmite
por vía aérea y por objetos introducidos a la boca (dará inmunidad permanente); clínica =>
tras 24horas de clínica inespecifica, aparecerán dolor y tumefacción de retro-parotidia
y oído, aumento de fiebre, puede haber afectación de nervio facial leve y
bilateral; complicación => meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis; diagnostico es
por vía serológico; el diagnostico es por metodos serológicos.
1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamaño grande en forma de bastón, diámetro 70nm y
longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el
citoplasma) => característica típica de su morfología es forma de "bala"; el mas importante
es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua).
Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema infeccioso
en 1983; es benigna y afecta niños en edad escolar; presentan una erupción eritematosa en
las mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades y tronco (respeta a las
palmas, las plantas y los labios); los adultos son propensos a artropatía asociada, que se
resuelve en 2-4 semanas; diagnostico por método serológico y metodos de ELISA.
2.2. Familia Papova-viridae (de tamaño pequeño 45-55nm - ADN de tira circular -
icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => son unos
viruses oncogénicos (efecto cancerígeno), producen enfermedades latentes
y crónicas, causantes verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de cérvix) y
papilomas (Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de
tipo clínico y serológico; prevención => se vacunan a las niñas de < 14 años.
2.3. Familia Adeno-viridae (de tamaño mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se
ensamblan en el núcleo - resistente al éter) => producen principalmente patología al tracto
respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en
niños <6 años; el diagnostico se realiza mediante clínicas y técnicas serologícas.
Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin
lesiones que sirven de fuente de infección para individuos susceptibles (los virus de Herpes
no se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por
lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en
los genitales, transmitiéndose por vía venérea); cada individuo tiene un tropismo estable;
suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesículas, costra y desaparece
en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secreción oral, infección a nivel peri-
oral, también otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente daran infección genital y se
contrae por vía sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venérea mas
frecuente; en mujer gestante se puede transmitir al bebe vía placenta o canal de parto o en
los primeros días de vida; en general estos virus tienen capacidad oncogénicos como VEB
(virus Epstein-Barr), puede producir cáncer cervical; el diagnostico se realiza mediante
la tinción de Giemsa de celulas raspadas de lesiones herpéticas, para observar
las características de las celulas gigantes multi-nucleadas; también se cultivan en SHELL-
VIAL.
Virus de Epstein-Barr (VEB) - es uno de los virus humanos mas ubicuos, linfotrópico y
oncogénico; la infección primaria suele pasar en la infancia, aumentando su sero-
prevalencia 60-70% en jóvenes y 80-90% en adultos; el síndrome clínico mas frecuente es
la mononucleosis infecciosa (enfermedad de beso) que presenta fiebre, adenopatias,
faringitis y linfocitosis con linfocitos atípicos; VEB también se ha asociado a carcinoma
naso-faríngeo y al linfoma de Burkitt; diagnostico => la prueba de Paul Bunnell es
la detección de Acs heterofilos y también por método de ELISA.
Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) - es un virus de muy reciente aparición, se ha aislado
en síndromes linfo-proliferativos y se ha vinculado al exantema súbito (elevación brusca de
la temperatura hasta 40ºC de 2-4 días, seguida de un descenso rápido que coincide con
la aparición de un exantema maculo-papular que persiste 1-2 días; el diagnostico
sera clínico y serológico.
Herpesvirus Humano 7 - se descubrió en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos
T, provocando exantema súbito; se investiga si tiene relacion con síndrome de
fatiga crónica (que lo padecen sobre todo mujeres mayores).
2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamaño grande
230-400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el
citoplasma; el mas importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y
virus de la Vaccinia;
- Viruela se contagia por inhalación y tras 15 días aparece fiebre, mialgias
y erupción pápula vesicular dura y luego evoluciona a pústulas y a la curación; a veces
puede provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infección bacteriana.
Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospechó mucho antes; virus
ARN de la familia Picornaviridae (de pequeño tamaño 20-30nm, icosaédrica, sin envuelta,
polaridad+) dentro del género Enterovirus, el tipo 72; la mayoría de infecciones son aguda
sin cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de
incubación (hasta 2 semanas).
Sintomatología clínica – suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infección
es asintomática y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubación 20-45 días, a
continuación suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o
dolor en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia.
Prevención – las medidas más importantes son la higiene personal, lavado y desinfección
de manos y objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente
mientras se mantiene las medidas de desinfección-esterilización, cloración y nivel
higiénico-sanitarias; inmunización pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto
para profilaxis pre-exposición (se estudia la relación coste-eficacia antes de utilizarla/ solo
si viajan a zonas endémicas) como post-exposición; inmunización activa => existe una
vacuna con buenos resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al año (3x).
Virus de la Hepatitis B (VHB) – es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae (ADN
parcialmente bicatenario, icosaédrica con envuelta, resistentes al éter), de gran importancia
socio-sanitaria y distribución mundial (250 millones portadores asintomático – 1%
desarrollan cirrosis hepática o carcinoma hepato-celular que son complicaciones más
importantes); primeros casos se describieron en 1833 en Bremen (Alemania), por la
administración de la vacuna de la viruela que contiene suero humano, pero hasta los años
40-50 no se distinguió de la hepatitis A; en 1965 Blumberg descubrió el Ag Australia y se
identificó el virus.
Estructura – se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores
serológicos:
-Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el
gen S) que induce a la formación de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad.
-Ag del core o nucleo-cápside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en
sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiológico que se mantiene de por vida); IgM-
HBcAc se detecta como marcador más fiable de hepatitis B aguda.
-Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronóstico de la
enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicación del virus; HBeAc es un
marcador de buena evolución).
-Además se distinguen su genoma ADN y una polimerasa.
- El virión completo se denomina partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en
sangre (como p.ej. HBsAg).
Tipos de infección:
1-Coinfección => infección simultáneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso
natural de VHB no se modifica; al resolverse la infección de VHB, re resuelve también la
de VHD;; clínicamente la hepatitis es más grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor
(hasta 20%).
2-Sobreinfección => cuando el VHD sobre infecta a portadores crónicos de VHB VHB; aquí si se
modifica el curso natural de VHB y la mayoría de laslas sobreinfecciones (70%) desembocan
en hepatitis crónica y acaban en cirrosis entre 15-20
15 años.
El pronóstico de VHD depende de marcadores de replicación del virus (anti-HBe) HBe) => puede
acabar en hepatitis crónica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicación
icación => puede
evolucionar a la curación.
Infección por VHC – se diseminan fundamentalmente por la vía parenteral;; es la causa más
frecuente de hepatitis post-transfusional,
transfusional, hepatitis esporádica y ampliamente distribuido
entre ADVP (adicto a la droga de vía parenteral), pacientes en diálisis y hemofílicos
hemofílicos; se
puede transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor importancia que
Hep.B); la clínica es similar a la de la hepatitis B;
B 25% cursan con ictericia y la tasa de
mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado;; el inicio no es muy brusco, es
frecuente las recurrencias, 50--70% tienden a cronificar y 20-25%
25% acaban desarrollando
cirrosis.
Prevención – tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todavía no
se dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece,
porque la sensibilidad de las técnicas más utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un
accidente en el laboratorio o en la práctica clínica con sangre anti-VHC+, se debe realizar
un protocolo de seguimiento serológico de la persona; existen evidencias de que VHC
puede estar implicada en cáncer hepático.
Virus de la Hepatitis G (VHG) – se transmite por vía parenteral; esta relacionado con
virus de la familia Flaviviridae (virus ARN icosaédrica de tamaño pequeño 40-50nm, con
envuelta de polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una
coinfección con el VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad.
-Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito;
debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y
puede ser detectada durante el periodo de incubación (es el 1º marcador que aparece,
incluso 2-6 semanas antes de que aparezca los síntomas, aunque pueda haber de 5-10% de
hepatitis aguda sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio
crónico; si la evolución es favorable desaparecerá a los 3-6 meses de la enfermedad; por el
contrario, si se mantiene más de 6-8 semanas después o si no existe una disminución
significativa de su título, es indicio de mal pronóstico y de evolución a la cronicidad.
-Ac anti-HBs => es el indicador de recuperación de la enfermedad y el ultimo en aparecer
(+/- a los 3 meses de su evolución); persiste durante mucho tiempo neutralizando al virus y
confiriendo protección; en los individuos vacunados es el único marcador presente.
- Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cápside y no se detecta serológicamente, ya que
no se encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1º Ac que
aparece en la enfermedad, detectable con los primeros síntomas de la enfermedad en la fase
aguda y en la crónica (entre 3-5 semanas después de Ag Australia y es el 4º marcador en
hacerse positiva); puede significar una infección pasada o curada dada la larga persistencia
de estos Acs en el suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la protección
frente a la enfermedad).
-Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolíticamente degradado y antigénicamente
diferente; es el 2º marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad
crónica en las que histológicamente se corresponde con hepatitis crónica activa (HCA); su
valor clínico se funda en su excelente correlación con la presencia de replicación viral y
viremia; la sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su estudio es
obligatorio en todos los sueros de HBsAg (+).
-Ac anti-HBe => es el 5º marcador; su aparición indica buena evolución y una baja
infectividad del paciente; en la mayoría de los casos es detectable poco antes de que
desaparezca HBsAg, pudiendo encontrarlo (+) durante varios años después de la infección.
-DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3º marcador; su detección en el suero mediante la
hibridación no es una técnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible
tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo
en un elevado número de pacientes HBeAg (+).
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION
A-Hepatitis Aguda
Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio):
VHA => anti-VHA IgM
VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM
VHC => anti-VHC (totales)
VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP)
Criterios generales de interpretación:
-La presencia de anti-VHA IgM => es diagnostica de infección aguda por VHA.
-La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM => es diagnostica de infección aguda por VHB;
-La presencia simultánea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda =>
se considera diagnostica de coinfección aguda por ambos VHB y VHD; la presencia de
anti-VHD IgM y HBsAg en ausencia de anti-HBc IgM => indica sobre infección por VHD
en un portador crónico de VHB. En cualquier caso, dada la situación epidemiológica actual
en España, no parece recomendable la búsqueda rutinaria de la infección delta en pacientes
ADVP.
-La seroconversión de anti-VHC es un criterio fiable para un diagnóstico de infección
aguda por VHC (cambio de negativo a positivo); la seroconversión suele retrasarse mas de
3 meses desde el comienzo de los síntomas, por lo que requiere el estudio de muestras de
seguimiento al menos hasta el 6º mes; no se ha demostrado que la detección de anti-HVC
IgM sea de utilidad en el diagnóstico de la hepatitis C aguda.
B-Hepatitis Crónica
Marcadores de rutina:
VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG)
VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg)
VHC => anti-VHC
Criterios de interpretación:
-La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crónica => es diagnostica de
hepatitis B crónica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infección
crónica por ambos VHB y VHD.
-La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crónica => es altamente indicativa de
hepatitis C crónica, aunque no es un diagnostico seguro; la detección de ARN viral en suero
mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo
descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de métodos
de confirmación de anti-VHC, se considera que una re comprobación del resultado positivo
mediante un segundo método de cribado (método screening con técnica de ELISA) que
utilice Ags obtenidos por tecnología diferente, es suficiente para establecer la presencia de
anti-VHC en pacientes con hepatitis crónica.
VIH o SIDA
b) Reguladores => genes que regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no está
completamente dilucidado
Patogenia – en la infección aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4 gracias
a gp41 y gp120; por lo tanto, sus células diana fundamentalmente son los linfocitos T4
(aunque también se unirá a los linfocitos B que tiene CD4, a los macrófagos, a las células
cerebral, y a los precursores de hematíes); este episodio se manifiesta como un cuadro
pseudogripal; es importante saber que la respuesta inmunitaria en forma de Acs frente al
virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3 semanas); a continuación el
ARN se copia a ADN por acción de la transcriptasa inversa, se pone en circulación y se
integra en el ADN de la célula (periodo de latencia); latencia o crecimiento es clave de la
patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga durante periodos
largos de tiempo (2-8 años incluso más), pero en un momento dado puede progresar la
enfermedad con un progresivo deterioro de la inmunidad hasta desarrollar el SIDA; el ciclo
biológico se resumen =>
Entrada de virus – transcripción de ARN al ADN – integración en la genoma de T4 –
formación de nuevos viriones tras periodo de latencia (al salir, el virión tomara en su salida
parte de la membrana celular para utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye los
T4, se paraliza el sistema inmunológica y acaba provocando el SIDA.
Epidemiologia – las vías de transmisión del virus => por sangre, sexual y vertical-
perinatal; en España la tasa de transmisión por sangre es importante (el principal grupo
afectado son los UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los
mas afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan
15-50%, cobrando una especial importancia en África; la transmisión al personal sanitario o
similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso
(o también de líquidos donde se haya cultivado al virus).
Sintomatología clínica de SIDA – desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle
la enfermedad, suele transcurrir 6-10 años; el estudio de la evolución de SIDA puede
realizarse por las manifestaciones clínico que van apareciendo o por marcadores
bioquímicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinación de
la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha
convertido en principal marcador de la evolución de la enfermedad.
Fases de la enfermedad
(1) fase de la infección aguda => la mayoría de los pacientes experimentan al cabo de unas
3 semanas de haber infectado con el virus una serie de síntomas pseudogripales como
fiebre, cefalea, eritema, adenopatías y sensación de mal estar, desaparecen después de 1-2
semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento se
produce un descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras
normales en respuesta de una activación del sistema inmunológico; los individuos son
altamente contagiosos durante esta fase;
(2) fase asintomática que puede durar 10 años o incluso mas; durante este periodo, el virus
continua replicándose, causando destrucción progresiva del sistema inmune; durante esta
fase, el recuento de los linfocitos es normal;
(3) fase sintomática precoz, se suele iniciar el desarrollo del síntoma clínico característica
de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carácter leve p.ej. de tipo viral
=> CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestación de
parásitos => Pneumocystis carinii, Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus y
Cándida;
(4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA (sarcoma
de Kaposi) que además, puede complicarse con un cuadro neurológico (demencia del
SIDA) con alteraciones motoras y del área cognitiva, debido a la acción directa del virus
sobre SNC; la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser
18-125 semanas, dependiendo del tipo de infección que tenga; en ningún caso habrá
supervivencia cuando están en esta fase.
**) El Western Blot es más utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas
proteínas del virus; tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados (OMS,
CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en:
-Positivos => lo más aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y
además bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos.
-Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del
virus (solo algunas proteínas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide).
-Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas
personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos
negativos).
La técnica de WB consiste básicamente en la incubación de unas tiras de nitrocelulosa en
los que sean transferido las proteínas de los virus, básicamente las estructuras con el suero
del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela
la presencia de Acs frente a diferente proteínas del virus mediante diferentes técnicas
inmuno-enzimáticas dependiendo del fabricante; el resultado será la aparición de bandas
coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde están situadas las
proteínas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede
hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera
automatizada por densitometría; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500
linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3
de sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de
sangre, será indicativo de SIDA.
*) Los métodos de cribado (ELISA) son más sensibles y más específicos, siendo lo más
novedoso los de 3ª generación con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo
de ventana.
*) Las técnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una técnica con
mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no están al
alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicación de estas técnicas
es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH.
*) De todos modos, el que más se utiliza para un diagnóstico de SIDA es el recuento celular
de los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN VIROLOGÍA CLÍNICA
b) Microscópia => con la Microscópia óptica solo se puede identificar los cambios
celulares (efecto citopático) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscópia
electrónica se puede visualizar el virus (en laboratorios de experimentación).
c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por
ello debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in vitro
mediante siguientes técnicas:
- cultivo de órganos => las secciones de algunos órganos pueden ser viables varias semanas
y nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante
secciones de tejido respiratorio.
- cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensión (cultivar adenovirus en un tejido
adenoideo)
- cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociación mecánica y con
enzimas proteolíticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un
frasco de cristal o de plástico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren
con medios nutritivos para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se
multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre las
que se podrán replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares:
*) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo
vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero
de cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad
de virus (p.ej. celulas del riñon de conejo y mono, embrión de pollo).
*) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somáticas) que se pueden cultivar
durante un tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de que
se mantiene durante mas tiempo que cultivo primario.
*) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo
heteroploide (numero menor que las celulas somáticas); se originan de tejido maligno o
por mutación de una célula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen
presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a -
70ºC o -90ºC indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero).
*) Shell-vial => es una técnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los últimos años
y que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto
periodo de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml
de medio de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la muestra problema;
el método se basa en la centrifugación (suave) de la muestra sobre la mono capa, y tras un
corto periodo de incubación se pone de manifiesto la expresión de los Ags virales en la
mono capa mediante tinción inmunológica; la ventaja => la rapidez de obtención de
resultados en 24-48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infección;
tiene una sensibilidad superior al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de
muestra en un área mas pequeña y mas fácil la observación al microscopio de
fluorescencia.
Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no después de
los 3-7 primeros días del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4ºC durante 24
horas y si no, se deben congelar a -70ºC porque muchos virus son lábiles a -20ºC; las
muestras que se utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis faríngeo,
exudado conjuntival, líquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc.
d) Detección de los componentes estructurales virales - las técnicas mas usadas que
permiten detectar Ags en suero y líquidos orgánicos (cuando existe una
alta concentración viral, sera fácil detectarlos) son:
- Aglutinación en látex => a las moleculas de látex se les une varias moléculas de Acs
conocidos y cuando se pone en contacto con una solución que contiene el Ag (la muestra
problema) se origina una aglutinación que puede visualizarse; es una técnica sencilla,
sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad dependerá de la pureza del Ac utilizado.
- Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir un
enzima al Ac, se le une un radioisótopo, y lo que se mide en ultima instancia es
la radiactividad que estará en proporción directa a la cantidad de Ag que había en la
muestra problema; es una técnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas
costosa y se necesita trabajar con material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto
al personal y las instalaciones; esta técnica se utilizo por primera vez para detectar el Ag de
superficie del virus de la hepatitis B.
- Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un
portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej.
isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un periodo de incubación, se lava
para eliminar el exceso de Acs y se observa al microscopio de luz ultravioleta;
esta técnica nos permite demostrar no solo la reacción Ag-Ac,
sino también la localización exacta donde se produce (superficie celular,
citoplasma, núcleo...).
MICROSCOPIO TUBOS -
ÓPTICO EXTRACCIÓN DE
SANGRE
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