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RÓLOGO
P

Este libro es el resultado de uno aventura emprendida por un puñado de locos decididos a contribuir al rescate paro España e Iberoa-
mérica de ese espacio cultural llamado ciencia. Se gestó juntándonos, por primera vez, y uniendo nuestro acervo intelectual desperdigado por
el mundo en el área de la biofísica y de la fisiología celular. Su desarrollo, ciertamente complicado, se ve ahora recompensado con el alum-
bramiento de la obra. En los orígenes, el libro se concibió como una colección de capítulos o monografías escritos par investigadores con expe-
riencia en los diferentes temas; con el curso del tiempo fue adoptando un formato más similar al de libro de texto o de consulta. Es impor-
tante explicar esta evolución por varias razones; entre los más importantes el que se entiendo mejor el resultado final. Aunque los capítulos

u 5e agrupan en secciones y se ha intentado evitar repeticiones y el favorecer en ellos las referencias cruzadas, somos conscientes de que muchos
temas se tratan de forma asimétrica y de que existen áreas importantes de la biofísica o lo fisiología celular que no se abordan en el libro.
Todavía.más importante paro una obro con vocación regeneracionista y unificadora es la ausencia en ello de muchos notables investigadores

u españoles e iberoamericanos. Esperamos que estos defectos, se acojan con comprensión y benevolencia. En esto ocasión, la necesidad de sacar
adelante el proyecto ha primado sobre el deseo, siempre presente, de acercamiento a la perfección.

El motor que nos mantuvo a todos, autores y editores, unidos estos años, manteniendo viva esta aventura, es el convencimiento de la
necesidad de poner en español una síntesis de los aspectos esenciales de la biofisica de membranas. Un libro al alcance de los estudiantes his-
pano parlantes que muestre a través de sus varios capítulos la importancia de la membrana celular; la estructuro que, al ponernos en con-
tacto con el mundo externo, nos permite movernos, ver, oír, oler y degustar. Es increíble que esta cubierta celular aparentemente tan frágil,
con solo una película bimolecular de lípidos, sea tan resistente al maltrato y participe en tontas funciones fisiológicas diferentes. Sobemos ahwa
que estas funciones están o cargo de proteínas y en particular de unas proteínas fuertemente ancladas en los lípidos: las proteínas intrínsecos.
La topología de estas moléculas es única en lo célula, un extremo sirve de antena que capto las señales del medio ambiente y el Otro los comu-
nica con el citoplasma. Es por esto que pueden actuar como receptores, trasportadores y amplificadores de señales. Junto a la evolución de la
biofísica de membranas, en estos últimos años hemos sido espectadores del extraordinario desarrollo de la biología molecular. La biofísica y lo
fisiología celular no han sido ajenas o estos avances y lo introducción de las técnicas de donado de genes, mutagénesis y otras han permitido,
como nunca antes, relacionar la estructura y la función de la proteínas de la membrana con un exquisito detalle. Recordemos que cada uno
de los avances en el campo de la biofísica y de la fisiología celular han estado relacionados bien a cambios conceptuales o bien o innovacio-
nes tecnológicas. Los primeros electro fisiólogos hicieron uso de los conceptos aportados por lo electroquímica, lo que permitió, por ejemplo, la
formulación de la hipótesis de la membrana por Bernstein, sustentada sobre el concepto de potencial de difusión enunciado por Nernst y
Planck. El desarrollo de lo teoría de control, y en particular del radar, durante la-segunda guerra mundial, hizo posible lo electrónica que per-
mitió la invención del "voltage-clarnp" por Cole, herramienta que en manos de Hodgkin y Huxley abrió el mundo de la electrofisiología moder-
no. En los últimos años, lo invención del "patch dlamp" por Neher y Sakmonn ha multiplicado enormemente las potencialidades y aplicacio-
nes de la electrofisiología, permitiendo preguntar a casi todas las células, por pequeñas que sean, acerca de las intimidades de su actividad
eléctrica. Es claro que esta no es toda la historia y que nuestro conocimiento es todavía muy fragmentario. Hacia lo más complejo, como la
comunicación entre las células o las redes neuronales o hacia lo más elemental, como la estructuro de las proteínas de membrana, existen
grandes vacíos en nuestro conocimiento. En ambos campos se prevé una evolución muy importante en el futuro más o menos inmediato con
el desarrollo de nuevos conceptos y técnicas.

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Los capítulos que componen el libro están agrupados en siete secciones que, en general, están ordenadas comenzando con los temas
que tratan aspectos más moleculares o subcelulares y continuando con los de mayor nivel de integración. La primera sección presenta uno
visión global de cómo están organizadas las membranas biológicas empezando con una reseña histórica que, o través de los diferentes mode-
los de membrana, refleja los prejuicios de cada época. Estos modelos tienen como colofón el de mosaico fluido elaborado por Singer y Nicol-
son. Uno vez que se conocen los componentes, lípidos y proteínas, también se estudia en esto sección cómo interaccionan.

En lo segunda sección se discuten los conceptos básicos sobre biofísica de membranas necesarios para entender los temas que siguen.
Aquí se presentan o los actores de la biofisicade membranas, canales, bombas y transportadores, y las fuerzas que definen el movimiento de
iones o moléculas a través de ellos. Todos estos conceptos se emplean en un gran final que nos relata como las células evitan la explosión o
el encogimiento cuando se enfrentan o condiciones osmóticas adversas.
1
Con la tercera sección se entra de lleno en la electrofisiología, comenzándose con uno introducción histórico. Recuérdese que la elec- i
trofisiolagio nació como una subdivisión de lo física. tino de los libros más populares de física del siglo XIX, Los Elementos de la Físico de Ganot
acredito el descubrimiento de lo electricidad dinámico o Galvoni:
4
"El experimento fundamental que condujo al descubrimiento de la electricidad dinámica se debe a Galvani, Profesor de Anatomía en
Boloño... quien observó que cuando los nervios lumbares de un sapo muerto se conectaban a los músculos crurales a través de un conductor
metálico, estos sufrían una fuerte contracción." 1
Se nos hace difícil pensar actualmente que un libro de física comience un capitulo de esta manera y aun más difícil es imaginarnos
que el trabajo citado fuese realizado por un profesor de anatomía clásica. En los capítulos que siguen se define la naturaleza ¡único del •1
potencial de acción, las componentes moleculares que permiten que este se origine y las propiedades de las proteínas que se comportan
como sensores del potencial eléctrico. El impacto de la biología molecular en el estudio de los canales jónicos se discute en uno de los capí-
tulos, en el que se explican también algunas estrategias a seguir paro el donado de genes, se presenta la estructuro de los canales jóni-
u
cos más representativos y se dan ejemplos en los que el uso de la mutagénesis dirigido ha permitido entender las relaciones entre la estruc-
tura y lo función. En esta sección también se discuten las propiedades de los canales de calcio y de los activadas por ligandos. Las carac-
terísticas de estos y otros canales se integran en los capítulos que tratan lo electrobiologio de las neuronas del sistema nervioso central y
u
M tejido cardiaco.

La cuarto sección la componen tres capítulos en ¡os que se discuten los mecanismos que permiten a las células comunicarse entre
1
si. Se destaca lo importancia de las uniones "nexus" o en hendidura. Estas no solo son importantes en lo comunicación eléctrica entre
células (como por ejemplo las cardiacas) sino que también desempeñan un papel importante en la comunicación metabólico. La trans-
misión de señales en el sistema nervioso se ejemplifica en esta sección usando la sinopsis química en sus aspectos generales que van
'u
desde la generación del potencial de acción, pasando por los mecanismos que originan la secreción del neurotransmisor, hasta la pro-
ducción del potencial postsinóptico. Todos estos fenómenos se presentan en detalle utilizando el modelo clásico de la sinopsis gigante del
calamar.
u
La quinta sección analizo los fenómenos subyacentes a la transducción de señales. Empezando por destacar la importancia de las
proteínas G, se Continúo con la transducción en señales fisiológicas de los estímulos luminosos, olfativos y gustativos. Además de los receptores
de luz, olfato y gusto, que reciben señales del mundo externo, se discuten brevemente los fenómenos de transducción mediados por cambios
en el medio interno del organismo. Como casa particular se estudian los quimiorreceptores arteriales: los sensores de los que nos valemos para
detectar lo presión parcial de oxígeno de la sangre.
u
Tomando como ejemplo las células musculares esqueléticas, que son las mejor conocidas, en la sexto sección se estudio el fenómeno
general de la contractilidad celular. Las células musculares esqueléticas son las que muestran mayor grado de especialización morfológica y
1
funcional. Se presenta en primer lugar una visión general sobre el proceso de acoplamiento estímulo-contracción y posteriormente se anali-
zan en detalle las propiedades eléctricas y mecánicas de la fibra muscular esquelética. u
La séptima y último sección está dedicada al estudio del fenómeno de la secreción celular y al del transporte de macromoléculas dentro
y fuera de la célula mediante exocitosis y endocitosis, respectivamente. Se analizan, entre otros, los fenómenos moleculares que participan en
la fusión de vesículas y las vías especializadas que determinan la endocitosis mediada por receptor. Como modelo del fenómeno de acopla-
u
miento entre el estímulo y la secreción se utiliza el caso particular de las células beta del páncreas.

La biofísica y la fisiología celular tienen uno tradición cuantitativa, claramente expresada en este libro, que creemos es fundamental e
u
importante mantenery transmitir. Esta idea está bellamente expresado en el prólogo del libro de Van Holde Physical Biochemistr1' quien llama
lo atención que en 1917 D'Arq Thom pson nos dijo: u
u
u "Las células y los tejidos, las conchas y los huesos, hoja y flor son parte integral de la materia y es en obediencia de las leyes de
ca que sus partículas se mueven se moldean y se conforman."

1 A través de estas palabras poéticas que asumimos queremos animar o los alumnos y enseñantes de lo biofísica y la fisiología celi
como a los investigadores que se inician en el campo que relata este libro, a que:

u "aprendan profundamente los fundamentos de los matemáticas de la física y de lo química, solo entonces serán capaces de den
de manera preciso cómo las partículas de la vida se mueven, se moldean y se conforman."
u Este libro debe, no poco, a grandes amigos que estuvieron acompañándonos desde el comienzo en nuestra aventura; guióndo en n

u
ocasiones nuestras ideas por el buen camino. Queremos agradecer la entrego y apoyo incondicional de los autores de los diferentes co
y dar las gradas a la comunidad de bio físicos españoles y lotinamericanos, representados por la SBE y lo SO&LA, que desde los inicio
prendieron la importancia del libro. En la labor editorial han participado varios personas de entre las que querriomos destacar a Conch
cos y Ana María Novia a las que agradecemos su dedicación y esmero. Queremos también expresar de forma explícita nuestro cariño
1 nacimiento a las instituciones que apoyan y permiten nuestro trabajo, las Universidades de Chile y de Sevilla y el Centro de Estudios C
cos de Santiago. La edición y producción de esta obro no hubiese sido posible sin la generosa ayuda de la Universidad de Sevilla, que al

u lo suya demuestra una vez más su apoyo decidido a la vocación iberoamericana que históricamente ha ejercido la ciudad de Sevilla. 1
mas, por lo tanta, expresar nuestro agradecimiento sincero y profundo o! Equipo de Gobierno de la Universidad de Sevilla y especialm
fa Dirección del Servicio de Publicaciones y al Vicerrectorado de Investigación que conjuntamente han cubierto los gastos de edición.

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Ramón La

1 José López-B
Julio,

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 APÍTULO 1

ORGANIZACIÓN MOLECULAR DE LAS MEMBRANAS BIOLÓGICAS

CECILIA HIDALGO, ROSA DEVÉS Y NÉSTOR LAGOS

1 CONTENIDO

1.1. Introducción

1
1.2. Aspectos históricos (1839- 1972)
1.2.1. Naturaleza de la membrana
u 1.2.2. La organización de los componentes de la membrana
1.2.2a. El modelo paucimolecular de Danielli
1.2.2b. La membrana unitaria de Robertson
ie 1.2.2c. La gran síntesis: El modelo del mosaico fluido
l(

1 1.3. Lípidos de membranas

II
1.3.1. Naturaleza de los lípidos .
II
1.11 a. Fosfolípidos

Ii 1.3.lb. Glicolípidos
1.3. ¡c. Colesterol
1'
1.3.2. Estructuras de lípidos en solución acuosa
1
E 1.3.2a. La bicapa como estructura de membranas biológicas
1.3.2b. Estructuras alternativas a la bicapa
15
1
1.3.3. Fluidez de membranas y movimientos de los lípidos en las bicapas
17
1 1.3.4. Transiciones de fases
1.3.4a. Transiciones de estado gel a liquido-cristalino
2C
2C
1.3.4b. Transiciones de fase líquido-cristalina a hexagonal invertida 23
I.3.4c. Relación entre orden y movimiento de los lípidos constituyentes y fluidez de una bicapa 24

1.4. Proteínas de membranas

24
I 1 .4. 1. Proteínas integrales o intrínsecas
1.4.la. El efecto hidrófobo y la identificación de cx hélices no polares en proteínas de membranas
25
26
1.4.2. Proteínas periféricas o extrínsecas
28
1.4.3. Dinámica de proteínas de membrana
28
1.4.3a. Lateralidad, localización y difusión lateral de las proteínas de membrana 28
1.4.3b. Movimientos rotacionales de proteínas de membrana 28
1.4.4. Criofractura de membranas y microscopia electrónica 29
1.4.5. Estructura tridimensional de proteínas de membranas
30

1 Apéndice 1.1. Efecto hidrofóbo, propiedades de detergente y purificación de proteínas

de membrana
33
A.I.l.l. El efecto hidrófobo
1 A. 1.1.2. Propiedades de los detergentes
33
35
A. 1.1.3. Aislamiento y purificación de proteínas de membrana 38

ut Apéndice 1.2. Calorimetría diferencial de barrido

39

Apéndice 1.3. Resonancia paramagnética del electrón 43

JI .4
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Li
1 1.1.

1 I NTRODUCCIÓN (6,26)

Todas las células, procariots y eucariotas, están delimitadas por una membrana lipidica que actúa como una barrera de per-
1 meabilidad selectiva. En los procariotas la estructura de membrana está confinada solamente a la barrera externa que rodea las célu-
las, en cambio en los eucariotas esta estructura es también responsable de la compartimentalización interna. Así, por ejemplo, en
los eucariotas se encuentra el núcleo rodeado de una membrana que lo separa del citoplasma, la membrana nuclear, y existe tam-
1 bién un complejo sistema de membranas distribuido a través de todo el citoplasma denominado retículo endoplasmático. Otros
ejemplos de membranas internas lo constituyen las membranas de orgánulos celulares como las mitocondrias, los lisosomas, el apa-
rato de Golgi y los cloroplastos en células vegetales.
1
Las membranas biológicas cumplen funciones especializadas. Ejemplos de estas son las membranas que forma la mielina alre-

u dedor de los axones neuronales, el retículo sarcoplásmico en las fibras musculares y las membranas que forman los discos en los
segmentos externos de los bastones en la retina. En relación a esta variedad de funciones, las membranas biológicas contienen una
gran diversidad de lípidos y proteínas y describirlos todos no seria posible. El propósito de este capitulo consiste en poner énfasis

u en aquellos aspectos que son comunes a todas ellas.

Independientemente que la estructura básica de las membranas biológicas esté dada por los lípidos, éstas son más complejas

1• que una simple vesícula de fosfolipidos, ya que además de las proteínas poseen otros componentes: agua, iones e hidratos de car-
bono. Estos últimos, que pueden constituir hasta alrededor del 10% de la masa total de la membrana, se encuentran siempre uni-
dos en forma covalent a moléculas de lípidos y proteínas, dando origen a los glicolipidos y a las glicoproteinas, respectivamente.

u Los hidratos de carbono se encuentran principalmente en la superficie externa de las membranas. También existe asociada a mem-
branas una importante cantidad de agua (aproximadamente un 20%), además de iones calcio y magnesio.

1 Las proteínas de una membrana son las macromoléculas que determinan esencialmente el grado de especialización de esta. Es
la composición de proteínas de una membrana determinada la que le confiere el carácter único a un orgánulo o célula, mediando
procesos de intercambio específicos de gran diversidad en las funciones celulares y originando la química de la vida. Las proteínas

1 que forman parte de la membrana participan en los procesos que median las interacciones entre células, en los intercambios con el
medio extracelular y en los procesos de intercambio con el citosol a través de las membranas que forman los compartimientos
intracelulares. Ejemplos de algunos de estos procesos son:

1 • Transporte activo de iones y mebóítC

- - 2 , -
kcCe., c._c:\e OYL) •fl5..o L.' i',.'CC .'.lOtL r.j-._,ç.

u
• Comunicación intercelular mediante formación de uniones especializadas entre células adyacentes.
• Comunicación con el medio mediante canales iónicos altamente selectivos.
• Transmisión de señales a través de receptores a hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento.
• Generación de segundos mensajeros que regulan vías metabólicas claves de la función celular.
1 • Reconocimiento intercelular e histocompatibilidad determinada por la presencia de proteiqas altamente antiénicas.
• Traducción de energía. Tp 7 . '« ''

• Formación de complejos capaces de realizar fosforilación oxidativa y proveer a las células de los compuestos macroenergé-
1 ticos necesarios para todas las funciones celulares.

Las membranas biológicas están constituidas fundamentalmente por lípidos y proteínas, pero la proporción entre ellos varia
en un amplio intervalo en diferentes sistemas biológicos de acuerdo a su origen. A modo de ejemplo se presenta en la Tabla 1.1 el
contenido de proteínas, lípidos e hidratos de carbono, expresados como porcentajes del contenido total, en diferentes membranas
biológicas.

Según se desprende de los valores ilustrados en la Tabla 1 1, en membranas biológicas la razón proteína/lípido varia en un
-

amplio rango, y en algunos casos refleja las características funcionales de ellas. Así por ejemplo, la mielina que fundamentalmente
desempeña un papel de aislante en la conducción nerviosa, presenta una razón de 0,23 indicando un alto contenido de lípidos rela-
tivo al de proteína. Por otro lado la membrana interna de la mitocondria presenta una razón de 3,2; la mayor proporción de
proteínas es consistente con la gran diversidad de funciones metabólicas y de transporte que realiza esta membrana. Un caso extre-
mo corresponde a la membrana púrpura del Ha!obocterio, cuya razón de 3,0 corresponde a la presencia de una sola proteína, la bac-
teriorodopsina, que se encuentra prácticamente cristalizada en la membrana. El'Halobocterio utiliza esta proteína para la captación

Ii de luz como fuente de energía.

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TABLA 1. 1. Composición de Membranas Biológicas
(*)
1
Hidratos de ProteinaiLipidO
Proteínas % Lípidos % II
Carbono %
79 3 0.23
18

1
Mielina -

42 4 1,30
Ameba 54
25 - 3.00
Membrana púrpura Ha!obocterio 75
58-5I 75 0.70
Plaquetas 33-42
1,10

1
49 43 8
EritrocitoS
54 2-4 0.85
Hepatocitos de ratón 46
42 5-10 1.40
HepatoCicoS de raca 58
40 5.10 1.50
Células L 60
Células HeLa

Membranas intracelulares
60 40 2.4 1.50

320
1
76 24 1-2

u
Interna Mitocondrial
2-4 1,10
Externa Mitocondrial 52 48
49 4.0 1.00
Bastoncitos retinales SI
2.9 1.60
Nuclear, Hepatocito de rata . 59 35
- 2.00
Retículo Sarcoplásmico
Cloroplasto (M. Laminar, espinaca)

[X valores obtenidos de reí. (26)]

67
70
33
30 6 2.30
u
•1
1.2.

A SPECTOS
HISTÓRICOS (18391972) u
El concepto de membrana plasmática comenzó a discutirse en forma simultánea con la formulación de la teoría celular a
mediados del siglo pasado. La primera mención de la existencia de una membrana celular se atribuye generalmente a Schwann,,
1
quien en su obra clásica sobre la teoría celular en 1839 asigna a la membrana celular no sólo la capacidad de separar los conteni-
dos celulares de¡ medio externo, sino también "el poder de alterar químicamente las Sustancias
con ¡as cuales entra en contacto" [cita-

dcenKepner,(32)].
-\ ........ ''T'1

En los años siguientes el desarrollo de este concepto se apoya fundamentalmente en el estudio de células vegetales, las cuales al
poseer 'una paied celular se prestan mejor a la observación microscópica en condiciones experimentales [véase Smith, (53)]. Las pri-
1
meras descripciones detalladas de células vegetales se hacen alrededor de 1840. Nágeli titula su obra mayor sobre fisiología vegetal
"Primordialschlauch" o saco primordial (45) y es en este trabajo donde el término membrana
plasmática aparece por primera vez.

Experimentando con algas, hongos, plantas unicelulares y plantas que producen flores, Nágeli descubre que al dañar el protoplasma la
u
célula es capaz de autorreparar la herida, generando una nueva superficie con propiedades idénticas a la superficie original. Demues-
tra, además, que la envoltura celular es permeable al agua pero impermeable a los pigmentos celulares. A diferencia de otros botáni-
cos contemporáneos que imaginaron una membrana plasmática sólida, Nágeli la describe como una capa de fluido que rodea una gota
de otro fluido. Como veremos más adelante, el concepto de fluidez de membrana está hoy muy bien documentado y es notable encon-
-

.1
trar una mención tan temprana de esta propiedad de las membranas biológicas. u
u
Aun cuando la mayor parte del trabajo de Nágeli dice relación con las propiedades de la membrana, en los próximos lOO años
ésta aparecerá sólo ocasionalmente. Incluso, hacia fines del siglo XIX, Verworn,(63) quien es reconocido como el fundador de la
Fisiología Celular, desestima la idea de la membrana plasmática como un constituyente común a todas las células. Sin embargo, en
un terreno ajeno a la fisiología celular, el de la fisica, la preocupación sobre la naturaleza de la membrana continúa.
u
1.2.1. Naturaleza de la membrana

Según Kepner la naturaleza lipidica de la membrana celular fue inicalmente propuesta por el físico alemán Georg Quincke.
u
quien en 1888 publicó los resultados de una extensa investigación sobre sistemas aceite-agua. En las palabras de Quincke: "la super-
ficie plasmática consiste de una membrana fluida muy delgada que envuelve el contenido mucoso y acuoso de la célula en una superficie cerrada,
as¡ como una burbuja de jabón encierra el aire. La sustancia de esta membrana es un fluido, que forma gotas en agua y no es miscible con agua.
muestran esta propiedad, la superficie plasmática debe consis-
Puesto que, de todas las sustancias de origen orgánico conocidas, sólo los aceites
tir de aceite graso" [citado en Kepner. (32)].
 Pocos de sus contemporáneos parecieron darse cuenta que las ideas de Quincke apuntaban en el sentido correcto o que
modelo experimental era relevante a la estructura de la membrana plasmática. En su interesante trabajo titulado "From oil ¡ayer i

1 bilayer", Kepner reproduce la discusión en torno a la naturaleza de la membrana que se originé a fines del siglo pasado entre Quin
ke y el fisiólogo vegetal Pfeiffer. Este último al revisar el tema de la estructura de la membrana plasmática en 1890 comenta: "Quin
ke sin una base aceptable que esté sostenida por experimentos con el organismo y basado únicamente en experimentos físicos, ha sugerido
necesidad de una capa de aceite para el protoplasto". En respuesta Quincke escribe: "Yo sé muy bien que en Alemania hay muchos representar
tes de las ciencias naturales descriptivas que no están de acuerdo con mi visión de la estructura y el movimiento del protoplasma: sin embargc
los hechos observados y las conclusiones físicas deducidas, que pueden parecer no muy inteligibles a otra ciencia, son correctas y útiles. La cier
cia biológica debe, para bien o para mal, tomar en cuenta el hecho que el desarrollo de la célula y la vida de la naturaleza orgánica depende d
masas y capas que no pueden ser percibidas por el microscopio únicamente." Quincke se adelanta también al proponer la existencia d
proteínas como constituyentes de la membrana plasmática.

1 Algunos años más tarde Oyerton (46) describe la naturaleza lipidica de la membrana celular al comprobar en experimentos d
/
permeabilidad, con algas unicelulares y glóbulos rojos, una-relación directa entre la liposolubilidad de los solutos
peabilidac
• , Estos experimentos lo llevan a proponer la hipótesis del "lipoide" donde postula que: "Las propiedades osmóticas generales de 1;
i' \\ célula se deben a la impregnación de las capas límites del protoplasto por una sustancia cuyas propiedades de solvente par
varios compuestos corresponde a los de un aceite". Overton, sugiere además que esta sustancia puede ser colesterol o lecitina.
1
1.2.2. La organización de los componentes de la membrana
1•
1.2.2a. El modelo poucimolecu!ar de Danielli

u
La existencia de la membrana como una estructura organizada y distinta del protoplasma estaba establecida hacia 1925. E
siguiente paso, la comprensión de la organización cíe sus componentes, requirió del desarrollo de la teoría de películas lipidicas er
la superficie aire-agua y la orientación de lípidos en disposición multimolecular.
1
En 1925 Leathes y Raper (35) determinan el área por molécula de lecitina en películas monocapas4e este ¡¡pido hechas en Iz
•.interfase aire/aguay calculan. que la cantidad de lecitina del glóbulo rojo alcanzaría para una membrana doble o bicapa. Gor-ter
u
Grendel (24) miden directamente el área que ocupan los lípidos extraídos de eritrocitos y a través de una comparación con el árez
ocupada por un número equivalente de células, sugieren que la organización en forma de una bicapa es la más probable. Por último
Fricke (21) basándose en estudios de capacitancia eléctrica señala que la membrana tiene un grosor probable de 3,3 nm.
u

El estudio sistemático de la estructura de las membranas biológicas, se inició con los trabajos de Daniel¡¡ y Davson (II) y la

t proposición de la teoría paucimo1eçular.Según este modelo (Fig. 1.1) las membranas biológicas están formadas por lipidos/anfi-
fílico orientados de manera tal que sus regiones polares quedan expuestas al agua, en tanto que las regiones hidrofóbas forman el
interior de las membranas. El arreglo de' los lípidos propuesto por Davson y Daniel¡¡ había sido postulado en trabajos anteriores y
se derivaba del estudio ya mencionado de monocapas lípídicas hechas en la interfase aire-agua. La proposición de la disposición de
las proteínas, sin embargo, era novedosa y buscaba compatibilizar dos observaciones: la baja tensión superficial de la interfase mem-
brana-agua, en comparación a la interfase aceite-agua y la adsorción tdeproteínas a superficies lipidicas. En este primer modelo no
se precisaba el grosor de la membrana y se suponía que la interacción entre lípidos y proteínas era de carácter polar.

EXTERIOR

)1'
Figura 1,1.
LINDOS El primer modelo "paucimolecular" propuesto para la membrana biológica (1935)
(Daniel[¡ y Davson).

'
u
INTERIOR

4
 Al tiempo de elaborar su primera proposición sobre la organización de los componentes de la membrana Danielli desconocía
el trabajo de Gorter y Grendel [véase Danielli, (13)]. A partir de 1936, fecha en la cual toma conocimiento de estos resultados.
Danielli incorpora la idea de la bicapa lipídica a su modelo. Ese año publica un interesante trabajo en el cual calcula energías libres
de superficie para lípidos y proteínas dispuestos en formas distintas (Fig. 1.2) y concluye que las dos estructuras más probables son
una bicapa de lípidos (Fig. 1.2b) y una doble capa de proteínas anfifílicas (Fig. 1.2h). Vale la pena destacar que el modelo actualmen-

te vigente es una síntesis de estas dos proposiciones

JÇR 1
.o)
o b

Figura 1.2.
Modelos alternativos para la organización de lípidos y proteínas en
membranas biológicas (1936). Las proteínas se muestran como esferas
o bien como móleculas anfifílicas (h) (Danielli. 1936).

Q
(_I
1- tC
cc
q h

Hacia el año 1936 se aceptaba ya que los lípidos formaban una bicapa, pero existían dudas respecto a la disposición de las
proteínas. Al estudiar la adsorción de proteínas solubles a superficies lipídicas Danielli concluye que existe una contribución impor-
adsorción. Dado que las proteínas solubles orientan sus aminoácidos hidrófobos al interior, esta
tante de fuerzas hidrófobas en la-
de estos resultados, Danielli introduce una nueva modi-
observación indicaba que las proteínas se desenrollaban al adsorberse. A raíz
ficación al modelo que contempla dos capas de proteínas en la superficie de la membrana, la primera constituida por proteínas exten-
didas, que interactuarian a través de restos apolares con los lípidos y la segunda formada por proteínas globulares de superficie polar

(Fig. 1.3).

Grupos polares Estero¡ Acido graso Triglicérido

cH,
- Proteína
-J CH CH CH a CH
L
globular / / \, Figura 1.3.
-
CH CH2 CH
u \2
Segundo modelo "pau-
/ CH ci o CH CH 2
o. / a cimolecular" (1938). La
CH " CH
«o CH CH

*
/ a figura muestra la orga-
CH 2 CH CH. Cii
o. / / 2 / \ 2 nización de una mitad
I. 'e CH 2 CH, CH CH CHJ
L) N2 de la membrana.
CH, C CH 2 CH, CH a .CH,-
CH5 I 1 /C CH? oi 0C_0 110.0 0
, CH \\
CH. CH
/ OCHFCHCH0 ,CH
-'
O O Ci'
CO—NH— CH2 CO—Ni4 C CO—Ni-l--Cll CONH

'e NH2 /' Co;

Proteína
Hidrocarburo extendida Proteína

Una nueva revisión se hace necesaria para dar cuenta de las propiedades de permeabilidad de la membrana. Desde el punto
de vista de la permeabilidad la membrana parecía tener dos naturalezas, una lipidica, que explicaba la dependencia directa entre lipo-
solubilidad y permeabilidad observada por Overton, (46) y otra polar que daba cuenta del transporte de algunas moléculas polares
con alta especificidad y eficiencia como lo había descrito LeFevre (36). Se introduce, entonces, la idea de poros proteicos como una
forma de explicar la alta permeabilidad de ciertos solutos polares y iones. Harvey y Danielli (27) pensaron inicialmente que estos
tarían formados por entrecruzamiento de proteínas extendidas sobre la superficie, pero luego se favoreció la hipótesis de
poros es
Stein y Danielli. (55) (Fig. 1.4) que postulaba la idea de canales proteicos.
1
Lípido

1 Qe
o.
o. Proteína

1 e
e

Figura 1.41

1 - Poro polar
Tercer modelo "paucimo!ecular" con proteínas que atraviesan la membrana (1956;

1
1
1 Es importante enfatizar que los modelos de membrana de Daniel¡¡ son conceptuales y que se desarrollaron antes que se pro
pusieran las distintas formas de plegamiento de las proteínas. Sus postulados pueden resumirse en los siguientes cinco puntos: 1
La membrana está constituida por lípidos y proteínas. 2) Los lípidos son anfifílicos y están organizados formando una bicapa; a ener

11 gía libre de superficie es mínima si las regiones polares de los lípidos se orientan al agua y las no polares al interior. 3) La ma
riá mantiene su estructura a través de interacciones hidrófobas; estas interacciones son relevantes tanto a la organización de los lipi

u dos como a la interacción entre lípidos y proteínas. 4) Existen interacciones proteína-proteína. 5) Las proteínas que participan er
el transporte de solutos atraviesan la membrana. Es frecuente que en textos y revisiones del tema se mencione sólo el primer mode.
lo de Danielli (Fig. 1.1) desdibujándose en consecuencia la importante contribución de este notable investigador.

1
1
1
1 Figura 1.5.
Microfotografia electrónica de una sección

U fina de un eritrocito

1L

1.2.2b. La membrana unitario de Robertson (48)

Con el desarrollo de las técnicas de microscopía electrónica el modelo "paucimolecular" parece encontrar una corrobo-
ración morfológica. La observación de la membrana al microscopio electrónico (Fig. 1.5) en secciones finas fijadas con 'giutaral-
debido y tetróxido de osm)revela la existencia de unatestrictura trila inide aproximadamente 6 nm de grosor, rodeando
tanto la celula como los distintos orgánulos intracelulares. La determinación precisa del grosor de la membrana por esta técni-
ca representó un avance considerable. Sin embargo, la imagen trilaminar fue errónearrinintet-
pretada como un reflejo fiel y
directo de la organización de lípidos y proteínas en la membrana, dando origen al modelo de la membrana Unitaria de Robert-
son (Fig. 1.6). De acuerdo a este modelo todas las membranas biológicas estaban constituidas por una bicapa lipidica con
proteínas extendidas sobre la superficie énnfjuración de lámina B. Iroteínas y lípidos se asociaban a través de interacciones
-. — —
polares. Evidencias más recientes han demostrado que la apariencia de la membrana en estas preparaciones depende de las pro-
porciones relativas de tetróxido de osmio y glutaraldehido y en ciertas condiciones la estructura trilaminar desaparece [véase
Luftig y Mc Millan, (39)].

•1

flíl IíI•íIíÍ.ÍíÍ 111 Figura 1.6.

Esquema del modelo de "membrana unitaria" de Robertson (1957).
1

II,JIiIII!'IIII-II 1
u
En la década de los sesenta surgen proposiciones alternativas al modelo de unidad de membrana que ponen énfasis en dos
pu —
doptar configuta nes~cas.jJabicapa, por ejemplo
•1
aspectos: a) en condiciones apropiadas los lípidos de membrana
ordenamientos micelares, y tales ordenamientos podrian coexistir con la bicapa y b) las proteínas de membrana se encuentran fuer-
temente asociadas a los lípidos como si la unidad estructural fuesen partículas de lipoproteinas. La primera proposición se funda- u
menta en la observación de Lucy (38) al microscopio electrónico de diversos ordenamientos moleculares de lípidos aislados. La
segunda se origina del estudio de Green y Pardue (25) sobre la función de membranas mitocondriales. Estmmbr-anas pueden
disociarseipediante el uso de detergentes en complejos lipoproteicos funcionales estabilizados por interacciones hidrofobas Mas
u
aún, la imagen trilaminar observada al microscopio electrónico no desaparece al extraer los lípidos. Como resultado de estas obser-
vaciones Green postuló que la matriz proteica seria la base estructural de la membrana.
u
1.2.2c. La gran síntesis: el modelo del mosaico fluido

Después de una serie de proposiciones más o menos especulativas, dos trabajos publicados en I966-
por Wallach y Zahler (64) u
y por Lenard y Singer (37) establecen el marco definitivo en que se desenvolverá la discusión de la estructura de las membranas
biológicas hasta nuestros días. Utilizando técnicas dedcroismo1circular yespectrpscopi ..
las proteínas de membranas contienen una alta proporc
infrarrOjo. ambos grupos demuestran que
ión de hélice cz y que, a diferencia de lo propuesto por el modelo de uni-
1
dad de membrana, el contenido de lámina 13 es bajo. De esta sola observación, deducen que las proteínas de membrana deben
encontrarse insertas en la bicapa. La hélice a es una estructura particularmente estable en medio hidrófobo. Como una forma de
ilustrar la lucidez con que estos autores se adelantaron a la concepción moderna de la organización de lípidos y proteínas en mem- •I
branas biológicas reproducimos a continuación la hipótesis de Wallach y Zahler. Sugerimos que hay importantes clases de proteínas de
membrana -tanto estructurales como funcionales- cuya secuencia de aminoácidos determina estructuras terciarias y secundarias, en las cuales dos
zonas hidrofilicas descansan sobre ambas superficies de la membrana y se conectan por varillas hidrófobas que penetran la membrana en forma
u
normal a su superficie. El largo de las unidades hidrófobas es equivalente al grosor de la matriz no polar de la membrana. Nos imaginamos que las
unidades hidrófobas consisten de segmentos peptidicos helicoidales insertos entre los grupos hidrocarbonados de los lípidos en por lo menos dos
tipos de disposiciones: a) unidades aisladas que poseen exclusivamente cadenas laterales hidrófobas y b) agregados (posiblemente reversibles) que
1
dependiendo de la secuencia primaria. podrían tener un interior polar. (Especulamos que el transporte de membrana ocurre fundamentalmente a
través de estas estructuras, controlado por el estado conformacional de las subunidades de proteínas y/o por la agregación). Los péptidos hidro-
filicos localizados en las superficies hidratadas de las membranas establecerían interacciones polares con otras cadenas peptidicas (incluyendo aque-
u
llas no penetrantes) así como con las cabezas polares de los fosfolipidos.
1
Esta proposición es consistente con una gran cantidad de evidencia experimental obtenida en los años siguientes la que, suma-
modelo del Mosaico Fluido de Sin-
da a nuevas observaciones de la dinámica de proteínas y lípidos, conduce a la proposición del
ger y Nicolson (52) (Fig. 1.7). De acuerdo a este modelo la membrana es una solución bidimensional de lipidos en eLcual se encuen- 1
tran sumergidas las proteínas globulares. La organización sugerida para lípidos y proteínas es la misma que aquella postulada en los
modelos de 1966, la diferencia es que ahora los componentes adquieren movimiento. Una visión actualizada del modelo del mosai-
co fluido se encuentra en la ref. (30b).
1
1
.1
1
1
t
Figura 1.7.

1 Modelo del mosaico fluido de Singer y Nicolson (1972)

a
1
1
1.3.

1• L ÍPIDOS DE MEMBRANAS

El marco estructural básico de las membranas biológicas está conformado por lípidos, siendo los componentes mayoritarios
los lípidos anfifilicos conocidos con el nombre de fosfolípidos, moléculas que presentan una cabeza polar y una porción no polar
formada por ñcidos'grasos de cadena larga. Ellos son los responsables de la formación de la bicapa la que a su vez permite la for-

1 mación de vesículas lipidicas. La tendencia de esta doble cadena anfifilica de formar una bicapa en soluciones acuosas es la propie-
dad fisica crucial que determina que se forme una membrana y que permite de esa manera separar los componentes que quedan
encapsulados de los que quedan fuera de la vesícula. El esquema de una vesícula lipidica que se ilustra en la figura 1.8 corresponde

1 a una hermosa- ilustración que incluye Mark S. Bretscher (5) en un articulo publicado en í985.

Figura 1.8.
Estructura molecular de una vesícula de fosfolipidos en medio
acuoso: la ilustración muestra la mitad de una vesícula esférica
seccionada ecuatorialmente. (M. S. Bretscher).

-p
-

1.3.1. Naturaleza de los lípidos

Las membranas biológicas poseen una gran diversidad de lípidos de los cuales los componentes principales son los fosfolipi-
aL dos, los glicolípidos y el colesterol. Según el modelo del mosaico fluido, los lipids de la membrana suministran un medio fluido que
permite los movimientos de las proteínas de membrana. Sin embargo, si este fuera el único papel fisiológico de los lípidos, bastaría
con unas pocas especies moleculares para asegurar un medio fluido y no seria necesaria la existencia de la gran variedad de espe-

1 .._-'
cies que se encuentran en las membranas biológicas, ya que se han identificado en membranas naturales hasta 1000 moléculas dis-
tintas de lípidos. Por lo tanto, es posible suponer que ellas cumplen otras funciones adicionales, aunque no se conocen las funcio-
nes especificas que desempeñan las distintas clases de lípidos, ni se sabe bien porqué y cómo las células mantienen su contenido y
composición lipídica relativamente constante. Un ejemplo importante del avance en el conocimiento de la función de lípidos indivi-

12
lata
 duales lo constituye el descubrimiento de que el fosfatidilinositol y sus derivados fosforilados juegan un papel crucial como precur-
sores del inositol 1 ,4,5-trisfosfato, un segundo mensajero que induce liberación de calcio de reservorios intracelulares y que se pro-
duce en respuesta a una gran variedad de estímulos externos.

o— Figura 1.9.
o—
Estructura de los glicerofosfolipidos con ácidos grasos uni-
P -O X CkÇ»— CH 2 -0—P0 —x dos por enlaces éster (A) o éter (8) (plasmalógenos). Los
CH - O - -

11 residuos R1 y R2 corresponden a cadenas hidrocarbonadas

(/ oo\ que fluctúan en el número de carbones y que pueden ser

\O=C
,
C - O!
completamente saturadas o poseer varios enlaces dobles cm
(ver Tabla 1.2). En el plasmalógeno, el ácido graso de la
1
1 - R
fi RZ posición sn-1 esta unido por enlace éter, formando un 1-

A
B
alquil, 2 -acil-fosfolipido.
Dependiendo de la composición del grupo X tenemos los dife- 1
rentes glicerofosfolipidos que se encuentran en las células.

-x Especie Carga neta del fosfolipido

a pH neutro
u
-H
cH3.CH(N1-13')C00
Ácido fosfatidico

fosfatidilserina
-1
.1
1
fosfatilinositol -I
-C6H6(OH)5
fosfatidilglicerol
•I
-
.CH2CHOHCH20H
fosfatidiletenolarsina .0
.CH2CH2rslH3
O

u
-CI-12CH,N(CH3)4 fosfatidilcolins

1.3.1 a. Fosfolipidos

Los fosfolipidos más comunes son derivados del glicerol, por ello se denominan glicerofosfolípidos o fosfoglicéridos. La estruc-
tura general de un glicerofosfolipido (Figura 1.9) se caracteriza por tener esterificados con ácidos grasos los hidroxilos de los car-
a
Los ácidos graos preseñies en. membranas biológicas pue-
bones 1 y 2 de la molécula de glicerol, (llamadas posiciones sn-! y sn-2).
den tener cadenas di 12 a 26 ¿eñes de largo, con hasta 6 enlaces dobles cis. Sin embargo, los fosfolípidos que se encuentran más 1
frecuentemente en membranas biológicas poseen ácidos grasos de 14 a 24 carbones y hasta seis enlaces dobles os (Tabla 1.2). En
El hidroxilo en la posición sn-3 de la molécula de glicerol establece un
los lípidos naturales no se encuentran enlaces dobles trons.
enlace covalente con un fosfato, lo que le confiere una carga negativa. El fosfato a su vez forma una unión covalente con una base .1
resultante de la molécu-
(Fig. 1.9), la que puede aportar cargas a la molécula o puede tener carga neta cero, de tal modo que lo cargo
lo cargo neta de la base. Los glicerofosfolipidos mayoritarios
la de fosfolipido será ¡o suma algebraico entre la carga negativa del fosfato y
de las membranas biológicas son fosfatidilcolina y fosfatidíletanolamina; en menores cantidades se encuentran cardiolipina, 1
fosfatidilserina y fosfatidilinositol (Tabla 1.3).

1
TABLA 1.2. Ácidos grasos comunes presentes en membranas vegetales y
animales

Smbolo numérico (*) Estructura: H3C-[R] - COOH Nombre Sistemático Nombre Común u
u
tetradecanoico rniiristico
4-0 -[CH2]12-
hexadecanoico palrnitiCo
16:0 -[CH2]14-
.[CH1]5CH=CH[CH2]7. 9-hexadecanoco palmiroleico
16:1(9)
octadecanoico esteárico
.[CH1]14-

a
18:0
9-octadecenoico oleico
18:1 (9): (18:1 ((ú-9)) 4CH2]7CHCH(Cl41]7-
9,12-octadecadienoico linoléico
18:2 (9,12): (18:2(cn-6)) .[CH7]3[CH2CH=CH]2[CH2]7-
9.12.1 5-octadecatrienoico a-ljnolénico
18:3(9,12.15): (I8:3(n-3)) .(CH2CH=CH]3[CH2]7-
docosanoico behénico
20:0 4CHz12r
1
..
5.8,1 l,14-eicosatetraenoico araquidónico
20:4(5.8.11,14): (20:4(w-6)) .[CH2]3[CH2CH=CH]4(CH2]3-
13-docosoenoico erúcico
22:1(13) -(CH1]7 CHCH[CH2]1 1-
4,7,10,13,16,I9-docosaheXa- cervónico
22:6(4.7.10,13.16.19): (22:6(0-3)) -[CH2 CHCH]6 [CH2]2-
erloiCo

24:0
-[CH1]7 CH=CH[CH21u-
tetracosanoico
15.cetracoserioico
lignocérico
nervónico
1
24:1(15): (24:1 (oa-9))
* El sirnbolo numérico está representado de modo tal que el primer número corresponde al número de átomos de carbono, lo sigue el número de enlaces dobles,
entre paréntesis se indican las posiciones de éstos. En el caso de ácidos grasos insaturados, se indica además la nomenclatura alternativa que señala la posición del
primer enlace doble a partir del grupo metilo terminal de la cadena.
u
1
1
 IT

TABLA 1.3. Composición Lipídica de algunas membranas biológicas (mal %)

II Fosfati. Fosfati.
dilcolina diletano-
Esfingo. Fosfati- Fosfatidil. Ácido. Cardio. Glicolipidos Coles-
mielina dilserina inositol fosfati- lipina (% del peso terol
lamina dico total)
Eritrocitos de perro 24.4 1 1 ,7 (35%) 5.6 8.0 1.1 0.2 0 22,7 47,9
Í Eritrocitos de oveja
Mielina
-

11.7
1 4.4(35%)
18.9(83%)
28,0
8.5
7,7 1.6 <0.2 - 10,2 45.1
8,0 0.6 - 0.3 29,7 52,2
Linfocitos 27.2 17.9 (13%) 6,3 8.4 2,0 2
- 37,5

1 M. intestinal, microvellosidades de rata

Hepatocicos, rata
PIauetas
9.1
24,5
17.5
9.1
2,3
13,1
6,2
2.1
-

3,7
-

-
-

-
54
26
55.8
43,2
27,2 17,3 (60,1%) 11,2 5,4 2.7 - 0,2 - 34.6
E. Col¡* - 65 - - - - 12.0
1
- -

Sinaptosomas 29.0 23.8(11.8%) 3.6 9,2 2.4 0,2 12.5

- 30.3
Gránulos Cromafunes de médula adrenal 16.6 23.1 7.0 5.9 0.4
- - 36,1
Gránulos pancreáticos de zirrsógeno 19,7 20,3 15.2 3.2 3,9 - - 353

1
Golgi 36,5 13.7 9.9 3,4 7 - - 24.7
Núcleo 55.6 20.6 2.9 3,3 7.8 «1 - 9,4
Retículo Endoplásmico liso 42.3 17.2 4,9 3,9 6.2 1.9
- - 22.3
Retículo Endoplásmico rugoso 53,8 17,7 2.2 3.5 9,1 - 1,1 - 9.7

1 Mitocondria, rs. interna

Mitocorudrjs, m. externa
44,1
38.2
31.2
36,6
1.9
2.0
<0.9
<0,9
1.6
8.2
-

3.8
16.0
3.8
- 5,7
10,7

Las membranas de E. Colu contienen 18% de fosfacidilglicerol. En el caso de fosfatidileranolamina, los % entre paréntesis corresponden al % de piasmalógenos.

lj A 8
OH-CH-CH-CH 2 --

i. CH NH 2 HO-CH CH-CH2 -v`-O-CH2 CH 2 N (CH 3 ) 3

11 1 1 II Figura 1.10.
CH
1 uc NH o Estructura de la esfingo-
II 1 sina (A) y de la esfingo-
(cH2) 12 HC c o mielina (B).

(CH 2 ) 12
1 CH 3

CH 3

Además de existir glicerofosfolipidos se encuentran-en las membranas biológicas fosfolipidos que utilizan la esfingosina en lugar
M glicerol como base estructural (Fig. 1. 10). El esfingofosfolípido más abundante en las membranas de células animales es la esfin-
gomielina, que posee como base esterificada en la posición sn-3 la fosfocolina y cuya carga neta es cero (Fig. 1.10). La esfingo-
mielina se encuentra preferentemente en la superficie externa de las membranas plasmáticas.

Es frecuente encontrar en los fosfolipidos naturales que el ácido graso esterificado en la posición sn-1 es saturado y de
cadena más corta que el ácido graso esterificado en la posición sn-2, que generalmente es insaturado. Entre los ácidos grasos
ui. poli-insaturados presentes en membranas biológicas se encuentran el ácido araquidónico, precursor de prostaglandinas y leuco-
trienos, y el ácido cervónico, que está enriquecido en los segmentos externos de fotoreceptores de la retina, donde se ha pos-

ti tulado que tendría un papel en los procesos de visión, y en sinaptosomas. En ciertas membranas biológicas, por ejemplo en la
mielina y en la membrana plasmática de las plaquetas, el ácido graso en la posición sn-I se encuentra unido por una unión 5,r
y no ésteri en tanto que bacterias halofilicas que crecen a temperaturas extremadamente altas contienen ambos ácidos grasos

1 -ur1i5r enlaces éter. Los fosfolipidos que contienen uno o sus dos ácidos grasos unidos con enlaces éter se denominan pIas-
malógenos (Fig. 1.9). El enlace éter es más resistente a la acción de la fosfolipasa A2 que el enlace éster.

E 1.3.lb. Glicolipidos

Podemos definir otra familia de lípidos de membrana, los glicolipidos, que se clasifican como tales por poseer rupos-glicosila-
. ?.
doJy que en general se encuentran presentes en menor cantidad en las membranas biológicas que ¡os fosfolípidos. Los glicólípidos
.-Eesentan una distribución altamente asimétrica en membranas biológicas, ya que sólo se encuentran en la superficie extda de las
membranas plasmáticas. En tanto los glicolípidos de bacterias y plantas son casi todos gliceroglicolípidos, vale decir poseen como base
estructural la molécula de glicerol, la mayoría de los glicolipidos presentes en las membranas de células animales son esfingoglicolipi-
dos, ya que en ellos la base estructural es la molécula de esfingosina. Entre los esfingoglicolipidos más comunes se encuentran los
cerebrosidos, que contienen una hexosa neutra como base (por ejemplo, los esfingoglicotipidos de la mielina poseen galactosa) y los
gangliosidos, con carga neta negativa, en los cuales la base es un oligosacárido complejo que contiene una o más moléculas de ácido

~lb el
siálico (Fig. 1.11). Los gangliosidos son especialmente abundantes en la superficie celular de las neuronas; su función celular no se cono-
ce exactamente, aunque numerosos estudios indican que están involucrados en diferenciación celular y morfogénesis. Más aún, se han
identificado como sitios de unión para virus, bacterias y toxinas, y parecen estar implicados en la adhesión celular tipo-específica.

HO—CH—CH—CH2 -0—X H Figura 1.11.

Estructura de esfingoglicolípidos y de ácido siálico.
CH NH Los residuos R1 y R2 del glicolipido corresponden a
II
HC CO cadenas de ácidos grasos. Si el grupo X es una hexosa,
el glicolipido resultante es un cerebrosido; si es una
R 1 R2 azúcar sulfatada, se tiene un sulfatido. La presencia
OH H de una o más móleculas de ácido siálico (ácido N-
acetilneuraminico) en la cabeza polar X da origen a
EsfingoglicolipidOs A cido si o lico
los gangliósidos
1
1.3.1c. Colesterol

El tercer componente más abundante en membranas biológicas, además de fosfolipidos y glicolípidos, es el colesterol (Fig.
a
1.12). Este compuesto, aunque no se encuentra en bacterias y es poco frecuente en membranas intracelulares tales como las de
mitocondrias, núcleo, y retículo endoplasmático, es un componente importante de las membranas plasmáticas de las células anima-
les (Tabla 1.3).
a
CH 3

C
/
CH3
Figura 1.12.
Estructura de la molécula de colesterol. El carácter
II
CH Z _CH2_CHZ — CH polar de un extremo de la molécula lo confiere el grupo

H
OH; el resto de la molécula es no-polar y tiene una
configuración plana dada por los cuatro anillos 1
hidrocarbonados.

HO 1
.3.2. Estructura de lípidos en solución acuosa (57)

Todos los lípidos de las membranas biológicas se caracterizan por poseer una estructura anfifilica; parte de la molécula con-
a
tiene grupos que le confieren carácter polar y el resto de la molécula es no polar. Esta característica de los lípidos los hace muy
poco solubles en agua, de tal modo que al superar una concentración que se conoce como concentración micelar critico, o c.m.c., los
lípidos se asocian en estructuras que exponen los grupos polares al medio acuoso, y que permiten las interacciones de los grupos
1
no polares entre sí, evitando su interacción con el agua. Se conoce este fenómeno con el nombre de efecto hidrófobo (ver Apéndi-
ce 1 1 para una discusión más detallada de este proceso).
.

Forma mojecu lar Ejemplos

a
1
Micelo Como - Iisofosfoilpldos
.1
invert ido
- dstsrg.fltes

f1YJfff1
-

-
tO5falldi!colina
.iflngor.I.Iino
Figura 1.13.
Estructuras que adoptan los
1
- fosfa tidlls . rina
diversos tipos de lipidos en
soluciones acuosas a con-
8 ¡copo Cilindro
centraciones mayores que
la concentración micelar
1

u
,
1
1
1

¡
critica, c.m.c.

suxk,'as
recI.jlevc
qu-e
en-ev
('O a
-

-
fosfotidil.ta.oi—
omiso
coi..t.rol
1
-V I
- cardlollpina Co 2
Cono -

mOnogoiacto.11

Fas. hexa g onal ( H1 )

-

dillcsrldo
-

1
 1.3.2a. La bicapa como estructura de membranas biológicas (4,28)

E: Las diversas estructuras que adoptan los conjuntos de moléculas de lípidos en solución acuosa se ilustran en la figura 1.13. Se
aprecia en todas ellas que el conjunto expone hacia el medio acuoso las cabezas polares y esconde las regiones no polares de los
lipidos en una fase diferente. El tipo de estructura que adoptan las moléculas de fosfolípidos en solución acuosa está determinado
1 por la conformación geométrica de la molécula, tal como se ilustra en la figura 1. 13, y como veremos más adelante por la tempe-
ratura. Las membranas biológicas tienen sus lipidos organizados en la estructura de bicapa y se supone que diferentes estructuras
moleculares se complementan para conferir mayor estabilidad al sistema. Por ejemplo, moléculas con forma de cono podrían com-
1 plementarse con otras con forma de cono invertido, como se ilustra en la Figura 1.14.

1
1
Mice la

1 AVAVM Figura 1.14.

vvv La combinación de lípidos con forma de cono y de cono

invertido produce una estructura de bicapa. Modificada de
reí. (lo).
Bicopa
ló
1• H.xoQonol l'4fl

1 Estudios de cristales hidratados de fosfolipidos-,saturados, utilizando la técnica de difracción de rayos X, indican que la cade-
na Sn-! está extendida en la configuración todo trans
tomo se ilustra en la Figura 1.15 y que la región inicial de la cadena sn-2 es
paralela a la superficie de la bicapa, luego la cadena se dobla en el segundo segmento y se hace paralela a la cadena sr?-1 con un des-
1 plazamientode aproximadamente 3 grupos metileno. Esta estructura de los fosfolípidos, que también fue predicha por estudios de
resonancia nuclear magnética de deuterio y por difracción de neutrones, existe también en membranas biológicas, lo que trae como
consecuencia que las cadenas de la posición sn-2 tengan un recorrido más largo que las en posición sn-I. En general, los fosfolipi-
Ii dos de las membranas biológicas poseen cadenas más largas y mas insaturadas en la posición sn-2, lo que tiende a disminuir la dife-
,
rencia en largo efectivo de las cadenas. Con base en experimentos hechos usando lípidos que contienen sondas paramagnéticas
(véase Apéndice 1.3), se ha propuesto que para compensar los distintos largos de cadenas los fosfolípidos se interdigitan en el seno
de bicapa.

Región Polar

Región Hidrófoba

1
Figura 1.15.
I Estructura de dilauroilfosfatidiletanolamina, que ilustra como se dobla la
cadena en la posición sn-2 en la estructura de bicapa.

1ki
'u
 11 o
ir II.
"o CH 2'C 11 2 N - U
0 CH 2 CH 2 N 11
-
0- - T°
C 1 o ti

0
CH2 CHCHe CH 2-cm 'CH 2
- 0- 1 1 -O-R
?
p
o
u
11=0
02C C0
CH 2-CH - CH 2

II 00
0( C0 10

o
II
Fos f 01id ileto noto mino

00
C P4
1 1
O
II
00
C Pi
1
II Figura 1.16.
Formación de enlaces de H entre
distintas moléculas de fosfolipidos,
y entre fosfolípidos y colesterol. 1
_O _p_ 0 _CH 2_CH_N_'1 .,0_0_C11 2 1 ' H

CH 5 CH2 CHaCHUe Colesterol 1

c=o 0=C C=0
0=c

1
11
Fo,fotidiltoriflo
1 •'
Como se ilustra en la Figura 1.15 las cabezas polares de fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, a su vez, tienen una orientación
que en promedio es paralela a la superficie de la bicapa tanto en ci estado gel como en el líquido cristalino. En cambio, los galactoce-
rebrósidos tienen su cabeza polar perpendicular a la superficie de la bicapa y se proyectan hacia la fase acuosa. Como lo han indicado
1
estudios de resonancia nuclear magnética de deuterio, usando fosfolípidos marcados con ?H en la cabeza polar, la rotación interna de
las cabezas polares está restringida y es relativamente independiente de la composición de las colas hidrófobas. Las cabezas polares car-
gadas o con carga neta cero tienen la potencialidad de establecer enlaces de H entre ellas, ya que poseen grupos dadores tales como
1
los grupos amino y grupos aceptores como los grupos fosfato. La figura 1.16 ilustra para los casos de la fosfatidíletanolamina y la fos-
fatidilserina la manera en que se forman las enlaces de H entre las cabezas polares de estos tipos de lípidos. También el colesterol
puede establecer enlaces de H entre su grupo OH y el grupo C0 de la cadena sn-2 de los fosfolípidos. Es importante destacar que
u
la cabeza polar del fosfolipido más abundante, la fosfatidilcolina, carece de potencialidad de establecer enlaces de H con otras cabezas
polares, aunque con el colesterol es'posible que establezcan este tipo de enlaces, por el mecanismo ya descrito (fig. 1.16). 1
1.3.2b. Estructuras alternativas a lo bicapa

La existencia de moléculas con diferentes geometrías en las membranas biológicas les confiere la capacidad de realizar una
1
serie de procesos que involucran un cambio en la geometría de la bicapa. Se ha propuesto 'la existenia transitoria de otras estruc-
turas, tales como fases hexagonales invertidas (véase Fig. 1. 13), para dar cuenta de las propiedades dinámicas del proceso de fusión 1
de dos membranas para producir vesículas endociticas o exociticas (Figura 1.17). Una discusión más detallada del posible papel de
la fase 1-4v en la función de las membranas se verá más adelante

1 31 Figura 1.17.
u
u
Modelo de mosaico metamórfico de una membrana bioló-
14] gica en que se ilustran variadas estructuras y procesos

qt= - q y fl jI derivados de la capacidad de los lípidos de adoptar confi-

guraciones alternativas a la bicapa. En (1) el transporte de
iones a través de la bicapa (p. ej. cationes divalentes) se
( si facilita por la formación transitoria de micelas invertidas.
En (2) se indica la continuidad entre dos compartimientos 1
g limitados por membranas. En (3) se ilustra un proceso de
'.0 exocitosis. En (4) la proteína puede adoptar una configu-
121 ración rransirembranaria sin requerir una secuencia de
aminoácidos no polares ya que la proteina cruza la mem-
1
brana por un corto cilindro lipidico. En (5) se muestra la
cornpartirrientalización dentro de un sistema continuo de

[e)
dí
membranas. En (6) se indica la posibilidad de realizar trans-
porte a través de un poro acuoso formado por fosfolipi-
1
dos en fase H11, los que serian a su vez estabilizados en la
conformación H11 perpendicular al plano de la membrana
por las regiones hidrófobas e hidrofilicas de proteínas peri- 1
féricas. Figura reproducida con modificaciones de ref (lo).

u
.1
1.3.3. Fluidez de membranas y movimientos de los lípidos en bicapas (4 1)

Los lípidos presentes en las membrana biológicas tienen la capacidad de experimentar movimientos traslacionales y rotacio-
nales en el plano de la bicapa (figura 1.18) lo que hace que la bicapa constituya un fluido bidimensional. La disipación de la energía
cinética de una molécula hacia el medio que la rodea es función de la fluidez del medio. Podemos en este contexto definir la flui-
dez de una membrana como la propiedad que indica con qué facilidad es posible el movimiento (traslacional, rotacional y vibrado-
nal) dentro de ella. Es importante destacar que el concepto de fluidez se refiere específicamente a las propiedades de la región
hidrófoba de la membrana. Por lo tanto, una descripción cuantitativa de la fluidez debe comprender los movimientos de los lípidos
en cuanto a velocidad de movimiento de las cadenas y la orientación de ellas con respecto al plano de la bicapa, sin considerar el
movimiento de las cabezas polares. Una membrana muy fluida permite mayor movimiento dentro de ella. Lo fluidez .de una mem-
brana es una propiedad macroscópica resultante de la suma de las propiedades individuales de sus componentes y se podría considerar que
tiene una relación inverso a su viscosidad, con la salvedad de que se trata de un líquido anisotrópico.

Figura 1.18.
Modelos posibles de movimientos de los lípidos en una bicapa. Una
molécula de lípido puede, como un todo, moverse lateralmente en el
plano de cada monocapa con un coeficiente de difusión traslacional, DT,
del orden de 10-7 cm2/s y con una frecuencia de salto y entre
posiciones adyacentes de 108 s-I. También puede rotar en torno a su
eje mayor con un coeficiente de difusión rotacional DRIl y puede
efectuar rotaciones limitadas en torno a un eje perpendicular al plano
de la bicapa, con un coeficiente de rotación perpendicular DRI Ambos
.

coeficientes de difusión rotacional alcanzan valores de 109 s-1 en

una bicapa fluida. Las moléculas de lípidos también pueden
experimentar movimientos de flip-flop de una monocapa a la otra con
una frecuencia de eventos, t', extremadamente baja, que alcanza
valores de 10-5 sI. Los movimientos intramoleculares corresponden a
¡somerizaciones transigauche en torno a enlaces individuales C.0 con
una frecuencia media r-' de 1010 s-,. (Figura adaptada de ref (41)

CONCEPTOS GENERALES. Durante la última década se han estudiado los movimientos de los lípidos tanto en modelos de
membrana (p. ej. liposomas, ver figura 1.8) como en membranas naturales. Estos estudios se han realizado mediante el empleo de téc-
nicas tales como la resonancia paramagnética del electrón, la resonancia nuclear magnética, la espectroscopía Raman y la fluorescencia.
Aunque aún hay alguna controversia acerca de la interpretación de los resultados obtenidos con estas técnicas, no hay ninguna duda que
ellas han contribuido de manera fundamental al entendimiento de la estructura y dinámica de las bicapas de lípidos.

Figura 1.19.
Rotaciones del n-butano. A: ano (an); B:
gauche-más (g); C: gauche-menos (g-).

A B c
Estos estudios distinguen dos tipos de movimientos de los lípidos. El primero concierne a los movimientos intramoleculares
de una parte de la molécula con respecto a otra, como por ejemplo rotaciones en torno a enlaces simples y el movimiento pen-
dular de las cadenas de hidrocarburos. El otro tipo de movimiento es aquel que involucra a la molécula de lípido corno un todo y
que pueden ser movimientos de traslación o de rotación. Las moléculas de lípidos se pueden trasladar de un punto a otro en una
misma monocapa, fenómeno que puede considerarse como una difusión en un plano. El lípido también puede moverse de una mono-
capa a otra. En este caso el movimiento involucra traslación y rotación en torno a un eje ya que no podemos dejar la cabeza polar
del lípido en el interior de la bicapa. Este movimiento ha recibido el nombre de flip-flop.

Organización Molecular de las Membranas Biológicas J.7

 MOVIMIENTOS INTRAMOLECULARES (50). Estos movimientos incluyen rotaciones en torno a un enlace carbono-
carbono simple en un n-alcano. Tomemos el caso del n-butano como se ilustra en la Fig. 1.19. Existen tres conformaciones posibles
1
que difieren entre sí en 120 y que poseen aproximadamente la misma energía potencial; sin embargo las rotaciones no se hacen
libremente, necesitándose aproximadamente 3.5 kcal/mol para la interconversión entre una conformación y otra. Estas tres confi-
guraciones alternadas se denominan: anti (an) o trans (t); gauche más (g o izquierda más), y gauche -menos (g- o
- -
1
izquierda menos). Debido a que la energía de interconversíón entre estas tres conformaciones no es muy alta, la energía tér-

1
-

mica es suficiente para causar rápidas rotaciones en la molécula de manera tal que en cualquier momento podremos encontrar cual-
quiera de ellas en forma alternada.

-
9
8
o
c
9
Figura 1.20.
(A). Una molécula de ácido graso en la
conformación todo trans (B). Una
1
4 8 12 16
transformación del carbono 9 de anti
12
(an) a gauche más (g) produce un
movimiento pendular de la cadena de
hidrocarburo. (C). Sin embargo si se
1
produce en forma consecutiva primero
una transformación de an a g seguida
por una rotación g-, la molécula de
lípido toma la estructura indicada. (D).
1
La inserción de un enlace doble cis
produce una distorsión en la
conformación de la molécula; la figura
ilustra el caso para un ácido graso con
1
un enlace doble cis entre los carbones 9
D E y lO. (E). Si el carbono que sigue en la
posición siguiente, en este caso el
carbono II, rota a su vez se produce
u
un quiebre Atg, lo que trae como
HH
500
consecuencia que la molécula ocupe un
volumen menor. 1
En la figura 1.20 se observa como los cambios conformacionales descritos anteriormente se traducen en movimiento de las
cadenas de hidrocarburos de los lípidos. Para un ácido graso saturado en la conformación todo trans (Fig. 1.20A), una transforma-
ción del carbono 9 de anti (an) a gauche más (gF) produce un movimiento pendular de la cadena de hidrocarburo (Fig. 1.2013). Sin
-
1
embargo si se produce en forma consecutiva primero una transformación de an a g seguida por una rotación g, la molécula de lípi-
do toma la estructura que se muestra en la Fig. I.20C. Este tipo de cambio conformacional trae como consecuencia un acortamiento
de la cadena en un CH2, lo que equivale a una distancia de 0. 127 nm. En promedio, en una bicapa el número de "distorsiones" de
1
1
este tipo por cadena varía entre dos y siete, dependiendo de la fluidez de la bicapa.

Es interesante hacer notar aquí que rotaciones como las descritas anteriormente no ocurren en torno a un enlace doble.
Sin embargo la presencia de un enlace doble en la cadena disminuye la energía necesaria para la rotación del enlace simple
contiguo a solo 2 kcal/mol. La inserción de un enlace doble produce una distorsión en la conformación de la molécula, como
se indica en la figura 1.20D para un ácido graso con un enlace doble cis entre los carbones 9 y lO. Si el carbono que sigue en
1
la posición siguiente, en este caso el carbono II, rota a su vez se produce un quiebre denominado Atg, Fig. 1.20E, esto trae
como consecuencia que la molécula ocupe un volumen menor, lo que incide directamente en un mayor empaquetamiento de
la bicapa. u
Se incluyen también entre los movimientos intramoleculares aquellos que comprometen varios átomos de carbono a la vez.
Los estudios efectuados mediante el empleo de la técnica de resonancia magnética nuclear indican que los segmentos de la cadena
cercanos al grupo polar están altamente restringidos en sus movimientos, pero que a medida que avanzamos hacia el interior de la
1
membrana la posibilidad de movimientos pendulares que comprometen varios átomos de carbono a la vez se hacen cada vez más
frecuentes. En otras palabras, a medida que nos vamos acercando al centro de la bicapa esta se va haciendo más y más fluida. Se
desprende de estas observaciones que, la bicapa se puede homologar a un líquido en dos dimensiones, que además es anisotró pico y presen-
1
ta uno fluidez Creciente desde ¡a superficie hacia el centro de la bicapa.

MOVIMIENTOS TRASLACIONALES (54). Los movimientos traslacionales de las moléculas de lípidos pueden ser de
It
dos clases: (a) Movimientos en el piano de ¡a membrana y (b) Paso de lípidos de uno monocapa a otra (flip-pop). Es claro que en el segun-
do caso la cabeza polar del lípido debe atravesar la parte hidrófoba de la membrana, lo que determina que el proceso de flip-flop
conlleva un gasto de energía mucho mayor que el movimiento de los lípidos en el plano de la bicapa. E
18 Bioft.ica y Fisiología Celular 1
 La difusión lateral de los lípidos se ha estudiado mediante el empleo de las técnicas de resonancia paramagnetica del electrón,
resonancia magnética nuclear y fluorescencia. Se ha determinado experimentalmente que el valor dei coeficiente de difusión lateral

(Dr)de los lípidos está en el intervalo de 10-8 cm2/s a 10 cm2/5, dependiendo de la composición de la membrana, como por ejem-
plo de la presencia de colesterol, que tiende a disminuir su valor. La Tabla 1.4 ilustra una serie de valores de DT determinados expe-
rimentalmente en distintas membranas.

Ji TABLA 1.4. Coeficientes de difusión translacional (D') para fosfolípidos en membranas modelo y en membranas biológicas

Método de detección T, ,C DT (cm2 s.I)

Membrana

FI Fosfatidilcolina de huevo
Fosfatídilcolina de huevo
Fosfatidilcolifla de huevo
ESR; esteroide
ESP.; ácido graso
ESR; ácido graso
50
20
25
10.8
10-9
10-8

rl
FosfadidílcOlina + colesterol (4:1) NMR; 'H 30 10-9
DipalmitilfosfatidilCOlifla NMR; 'H 60 10-8
Vesículas de retículo sarcoplásmico ESR; fosfolipido 40 6X 10.8
Lípido extraído de retículo sarcoplásmico ESP. fosfolipido 40 l0-

fl
Microsomas de hígado de rata ESR; ácido graso 40 l0-
Membrana plasmática de linfocitos Fluorescencia, análogo de fosfolipido 20 lo-e
flectroplaca de Torpedo NMR; 'H 33 I0-
Nervio ciático de rana NMR; 'H; ESR. ácido graso 31 10.8
Escheñchia coli NMR; 'H; ESR ácido graso 40 10-8

E' Un método interesante para determinar el coeficiente de difusión lateral de los lípidos es el de "fotoblanqueado". En este caso
la membrana se marca uniformemente con un colorante fluorescente. La fluorescencia de una pequeña área de membrana (~:2 pm
de diámetro) se destruye ("se blanquea") con un rayo láser y luego se mide como se recupera la fluorescencia en esa área. Si el

II
blanqueo es irreversible el retorno de la fluorescencia al área en cuestión se deberá a la difusión de moléculas fluorescentes desde
aquellas zonas de la membrana que no han sido afectadas por el rayo láser.

Para una esfera de un radio r la relación Stokes-Einstein nos dice que el coeficiente de difusión traslacional D-- en función de

n ¡a viscosidad del medio il está dado por la ecuación

D=kT/67n1r (1. l.)

g donde Y es la temperatura absoluta y k la constante de Boltzmann.

1 Veamos ahora qué significa en términos de tiempos y distancias difusionales un valor de D = 10.8 cm2/s. Los tiempos y las dis-
tancias se pueden calcular usando la ecuación de Einstein-Smoluchowki, que nos dice que la distancia media al cuadrado ((x>2) que
recorre una molécula en un tiempo t está dada por (véase Capítulo 3 para más detalles).

1 <x>2 = 2Dt (1.2)

Por lo tanto, la molécula de lípido viaja una distancia igual a 1 pm (10-4 cm) en:

1 t = 10-8 (cm 2)/2 x 10-8 (cm2/s) = 0,5 s.

1 Si el diámetro de la cabeza polar de un lípido es de aproximadamente 1 nm en medio segundo la molécula de lípido se habrá
movido una distancia 1000 veces superior a su diámetro. En otras palabras, la molécula puede recorrer toda la longitud de una bac-
teri a típica en medio segundo.

j MIGRACIÓN DE LIPIDOS A TRAVÉS DE LA BICAPA (FLIP/FLOP). ASIMETRIA DE MEMBRANAS

BIOLÓGICAS (17). La difusión de las moléculas de lípidos de una mitad de la bicapa a la otra es extremadamente lenta o sim-
plemente no ocurre en forma espontánea. En las membranas biológicas estos movimientos de los lípidos se realizan utilizando sis-

11 temas enzimáticos específicos. El proceso de flip-flop de lípidos ha recibido considerable atención debido a las asimetrías en la com-
posición lipídica que muestran varios tipos diferentes de membranas naturales (Tabla 1.5). En la monocapa externa de las membra-

d
nas plasmáticas de eucariotas se encuentra un mayor porcentaje de fosftidilcolina y esfingomielina, mientras que la fosfatidiletano-
lamina y fosfatidilserina se encuentran preferencialmente en la monocapa interna. Esta asimetría ha llamado la atención porque se

1 Organización Molecular de las Membranas Bwlgicas

podría esperar que desapareciera con el tiempo, especialmente en aquellas células que son incompetentes desde un punto de vista
de la biosíntesis como los eritrocitos. Una explicación posible para el mantenimiento de la distribución asimétrica de lípidos en la
membrana celular podría ser que este proceso fuera lento. Esta hipótesis parece cumplirse en modelos de membrana ya que en ellas
1
estos movimientos son extremadamente infrecuentes. Sin embargo en membranas naturales el proceso de flip-flop puede tener una
vida media del orden de minutos. En aquellos sistemas en donde la migración de los lípidos a través de la bicapa es un proceso rápi-
do, se ha postulado que el mantenimiento de la asimetría se lleva a cabo en forma enzimática. Las enzimas responsables de este pro-
1
ceso sólo se han descrito en algunos sistemas celulares, particularmente en eritrocitos. La asimetría de los lípidos le confiere a las
membranas biológicas un carácter vectorial que puede tener importancia funcional para establecer contactos entre membranas,
como los que ocurren en procesos de fusión.
1
TABLA 1.5. Asimetría de fosfolípidos en membranas plasmátidas de eucarionetes (% en la monocapa externa)
1
u
Tipo de célula Fosfati- Esfingo- Fosfatidile- Fosfati- Fosfati-
dilcolina mielina tanolamina dilserina dilinositol
Glóbulo rojo humano 76-78 82.79 20-21 0
Glóbulo rolo de rata 62 lOO 20 6
Plaquetas humanas 61; 45 93 54; 20 6; 9 34, 16
Plaquetas de cerdo 40 91 34 6
Vellosidades renales, conejo 34 80 23 15
Vellosidades intestinales, conejo 26 28
Sarcolenia cardiaco, rata
Fibroblastos, embrión de polio
Sinaptosomas de cerebro, ratón
43 93 25
34
10.15
0
17
20
1
Fibroblastos LM, ratón 4-6 5
Células ascicicas Krebs II, ratón
* Datos tomados de reí. (17).
51 46 45 20 30
u
MOVIMIENTOS ROTACIONALES. Las moléculas de lípidos pueden efectuar rotaciones en torno a su eje mayor con un
u
coeficiente de difusión rotacional paralelo, y pueden efectuar rotaciones limitadas en torno a un eje perpendicular al plano de la
superficie de la bicapa, con un coeficiente de difusión de rotación perpendicular, como se ilustra en la Figura 1.18. Ambos coefi-
cientes de difusión rotacional alcanzan valores de IO- s-1 en bicapas fluidas. Para una esfera a un volumen V el coeficiente de difu-
sión rotacional Dg se relaciona con la viscosidad del medio ri a través de la ecuación
uy
DRkT/611V = l/tR (1.3) 1
El tiempo de correlación rotacional tp está dado por el inverso del coeficiente DR y se expresa en segundos. De los valores
experimentales obtenidos para los coeficientes de rotación difusional de lO s se pueden calcular valores de tiempos de correla-
ción rotacional para los lípidos de 10-9s.
1
1.3.4. Transiciones de fases (42) 1
Las moléculas de un fosfolípido puro presentan distintas estructuras que dependen del contenido de agua (mesomorfismo
liotrópico) y de la temperatura (mesomorfismo termotrópico). En presencia de un exceso de agua, como ocurre en las célu-
las, los lípidos puros pueden adoptar distintas configuraciones en función de la temperatura, ya que la composición del sistema en
1
términos de contenido de agua está fija.

I.34a. Transiciones de estados gel a líquido-cristalino (3,3449)

1
La configuración de bicapa, que nos interesa por ser la que adoptan los lípidos en las membranas biológicas, se caracteriza
por poseer transiciones de fase, entendiendo como fase a un agregado hidratado de fosfolípidos cuya formación está dirigida por
1
el efecto hidrófobo. La mayor parte de los estudios que han permitido caracterizar las transiciones de fase se han realizado con
la técnica de calorimetría diferencial de barrido, (ver Apéndice 1.2), aunque se han usado también otras técnicas, tales como reso-
nancia magnética nuclear y del electrón, rayos X, microscopia electrónica, espectroscopia infrarrojo con transformadas de Fou-
rier y fluorescencia. La calorimetría diferencial de barrido es un método termodinámico que permite medir parámetros tales como
temperatura de transición, entalpía y entropía de transición, en tanto la difracción de rayos X y la microscopía electrónica permi-
1
20 Bioflswa y Fisiologüe Ceiuhir
1
 ten estudiar la estructura y las dimensiones de las fases. Las técnicas espectroscópicas, y en particular la resonancia magnética
nuclear, permite estudiar los cambios de la orientación y la dinámica de los lípidos que experimentan un transición de fase. La téc-
nica de espectroscopia infrarrojo con transformada de Fourier es sensible a movimientos más rápidos que la resonancia magnéti-
ca nuclear y la resonancia paramagnética del electrón, tales como las rotaciones trons/gauche, y permite también detectar cambios
de fase.

fl$IIáSF

o Figura 1.21.
(.1

E Diagrama que ilustra la transición de fases de una bicapa de

1 -w
o
0
dihexadecilfosfatidiletanolamina para pasar luego a la fase H11,
determinada mediante calorimetría diferencial de barrido. La
c temperatura T1 indica fa temperatura de transición de la fase gel

1
w a la fase liquido-cristalina, en tanto Th indica la temperatura de
transición de la fase liquido-cristalina a la fase hexagonal invertida
H11. (Figura modificada de referencia 49).

1•
.
11111 ti iii iii II II iii 11111 ¡It 111111 111
60 70 800 90'
1 Temperatura 1

1 Mediante estos métodos aplicados fundamentalmente al análisis de la bicapa de fosfolípidos, también denominada fase
lamelar, se ha determinado que existen dos fases principales. La fase gel, que ocurre a bajas temperaturas y la fase líquido-
cristalina, que se observa por sobre una temperatura denominada temperatura de transición, T1, que es característica
1 para cada especie molecular. Como se puede apreciar en la Figura 1.2 1, a mayores temperaturas, y dependiendo de la estruc-
tura de la molécula, es posible pasar de la fase líquido-cristalina a la fase hexagonal invertida H11, cuya estructura se ilustra
en la figura 1.13.
i La transición de la fase gel a la líquido cristalina se debe a la ganancia de entropía configuracional de las cadenas hidrocarbo-
nadas que tiene lugar en el proceso de calentamiento; las cadenas de los lípidos poseen la tendencia a pasar de un estado ordena-
do, en que están en la configuración todo trans formando un arreglo hexagonal, a uno desordenado como resultado de la ganancia
de entropía que resulta del isomerismo rotacional de las cadenas. En cambio la transición de la fase líquido cristalina a la fase H11 es
consecuencia de la tendencia a la curvatura espontánea de la fase lamelar o de bicapa. Además de la temperatura, cambios en la
fuerza iónica o el pH del medio pueden inducir transiciones de fase debido a la presencia de grupos ionizables en las cabezas pola-
res que son muy sensibles a estos cambios del entorno acuoso.

La transición de una bicapa de la fase gel a la fase líquido cristalina se acompaña de un aumento de la distancia entre las
moléculas, lo que incide en que el empaquetamiento, o número de moléculas por unidad de volumen, disminuye sobre la tem-
peratura de transición. Esto trae como consecuencia que el grosor de la bicapa también disminuya en un 15% aproximadamen-
te en una transición de fase gel a líquido cristalino. La probabilidad de encontrar configuraciones gauche, que como ya se indicó
se derivan de la configuración trans por rotaciones de 1 20', varia en una transición de fase. En la fase líquido cristalina la proba-
bilidad de encontrar en un instante dado configuraciones gauche es de 0.2 hasta aproximadamente la mitad de la cadena, y luego
aumenta hasta alcanzar un valor de 0.5 al final de la cadena, que se encuentra en el centro de la bicapa. Este aumento de confi-
guraciones gauche se refleja en que el tiempo de correlación rotacional paralelo, en una bicapa en estado líquido cristalino alcan-
ji za valores de 1-5 x 10- s. en tanto el tiempo de correlación perpendicular (ver Figura 1.18) alcanza valores que corresponden
a 2 a 5 veces los del paralelo. En contraste, en una bicapa en estado gel la probabilidad de encontrar conformaciones gauche es
de O a 0. 1, y los tiempos de correlación rotacional son lOO veces menores que en la fase liquido-cristalina. Otra manera de visua-

'u
lizar las diferencias entre ambos estados consiste en caracterizar la frecuencia de las isomerizaciones tronslgauche. Si definimos
un tiempo de vida ti como el tiempo promedio entre saltos conformacionales, tenemos que en una bicapa fluida t1 tiene valores
de lo-lOsen la parte superior de la cadena y de 10.11 s cerca del residuo metilo terminal, en tanto que para una bicapa en esta-

'u
do gel los valores de tj son 5 a lO veces mayores.

'u
 5-)
o

+60
1)

+40 Figura 1.22.

o Temperatura de transición de 1,2-diatadec.as-enoilfosfatidilcoliflas en
función de la posición del enlace doble en las cadenas. Para igual largo
+20
de cadena, si el enlace doble se encuentra en el centro de la cadena
o
o
se produce ia transición a menor temperatura que si se encuentra
cerca de cualquiera de los dos extremos. I,2-diatadec-cis- • 1
o enoilfosfatidilcolinas. (Figura modificada de referencia 1)
e
o-
E
u,
-20

2 6 10 14
u
Posicion del doble enlace
1
Los siguientes parámetros estructurales inciden directamente en la temperatura de transición de una bicapa formada por una
sola especie molecular de fosfolipido: a. El grado de saturación. A una misma cabeza polar, los fosfolipidos saturados presentan
1
mayor temperatura de transición que los insaturados. Un enlace doble en la cadena sn-2 tiene un efecto mayor que un enlace doble
en la misma posición en la cadena Sn-!, y un enlace doble cis. como los que presentan los fosfotípidos naturales, influye más que uno
trans. Como ya se indicó, la presencia de un enlace doble enla cadena disminuye la energía necesaria para la rotación del enlace sim-
SI
ple contiguo a sólo 2 kcal/mol. Esto explica por qué un enlace doble trans, que no desvía la cadena, tiene una temperatura de transi-
ción menor que su homólogo saturado, aunque produce un menor efecto en la fluidez de la bicapa que el correspondiente ácido graso
insaturado cis, que produce un mayor defecto, en el empaquetamiento de la bicapa. Los defectos de empaquetamiento explicarían en
u
parte por qué las membranas que contienen una gran cantidad de lípidos no saturados son más fluidas que aquellas que tienen un alto
porcentaje de lipidos saturados. Dentro de los insaturados, influye el número de enlaces dobles y la posición de estos. Tal es así que 1
cuando se comparan cadenas con el mismo número de átomos de carbono un enlace doble en el centro de la cadena produce la tran-
sición a menor temperatura que si se encuentra cerca de cualquiera de los dos extremos (Figura. 1.22). Al aumentar el número de
enlaces dobles la posición en qui2 estos se encuentren es tanto o más importante que el número de enlaces dobles. Por ejemplo, se 1
obtiene una T5 semejante para dos enlaces dobles situados cerca de la mitad de la cadena que para tres enlaces dobles con similares
ubicaciones. Inclusa, la presencia de fosfolipidos con ácidos grasos insaturados con muchos enlaces dobles no aumenta más la fluidez
de la bicapa y es posible que incluso la disminuyan debido al particular empaquetamiento de éstos. Los fosfolípidos que tienen una
cadena no saturada y la otra saturada tienen una T5 intermedia entre las T5 para el mismo fosfolipido con ambas cadenas saturadas o
no saturadas. En general, podemos concluir que la presencia de un enlace doble destruye la cooperatividad de las interacciones del
conjunto en el seno de la bicapa, lo que perturba el empaquetamiento de las cadenas y produce un descenso significativo en la T 5 con
respecto a la misma molécula conteniendo sólo cadenas saturadas. De esto se desprende que la presencio de un enlace doble perturbo el
u
empaquetamiento de ¡as cadenas, con lo que aumentan las posibilidades de movimiento y disminuye el orden del sistema, lo que incide en una
menor T1. b. El largo de la cadena hidrocarbonada Para fosfolipidos saturados cuanto mayor sea el largo de sus cadenas hidro-
carbonadas, mayor será la temperatura de transición y la entalpia y entropía de la transición. Esto se debe a que las fuerzas atractivas áil
de van der Waals entre las cadenas aumentan con el número de grupos metilenos. En el caso de los fosfolípidos con ácidos grasos no
saturados el efecto del largo de la cadena alifática es menor, ya que se empaquetan con menor proximidad que los saturados. c. La u
naturaleza de la cabeza polar. Si la composición de ácidos grasos saturados es la misma, las T5 siguen el orden fosfatidiletanola-
minas » fosfatidilserinas ~ fosfatidilcolinas, Para los mismos grupos polares formando parte de fosfolipidos con dos cadenas de ácido
oleico (18:1, cis 9-lo) la diferencias en T5 son menores, pero el orden se mantiene. Se ha atribuido este efecto a que la etanolamina
1
es mas pequeña que la colina, lo que permitiría un mejor empacamiento de las moléculas. Sin embargo, estudios más recientes indi-
can que el factor determinante en la mayor temperatura de transición parece ser la capacidad de la fosfatidiletanolamina de formar
enlaces de H (véase Fig. 1.16). La estabilización de la superficie de la bicapa mediante la formación de puentes de H, hace que las molé-
u
i
culas de fosfatidiletanolamina presenten una menor afinidad por el agua que las de fosfatidilcolina y restringe sus movimientos. La pre-
sencia de carga neta en la cabeza polar disminuye la T1 ya que estas se repelen electrostáticamente, lo que en el caso de fosfatidilseri-
na puede modularse por la presencia de cationes divalentes como calcio que ejercen un efecto pantalla sobre las cargas electrostáti-
cas y aumentan la T. En contraste con el gran cambio en T, se ha encontrado que los valores de las entalpias y entropías de transi-
ción para un mismo largo de cadena son casi independientes de la composición de los grupos polares (ver apéndice A. 1.2).
u
Entre otros factores que inciden en la T1, es interesante destacar que la presencia del enlace éter en plasmalógenos de fosfa-
tidilcolina y de fosfatidiletanolamina no afecta significativamente la fluidez ni el grosor de la bicapa, aunque se ha encontrado que la 1
1
.1
 es 2 a 5 C mayor para un dieter de fosfadiletanolamina que para el correspondiente diester (49), lo que sugiere un mejor empa-
camiento del dieter. Esto podría tener relevancia en el caso de las bacterias halofílicas extremas, que presentan sólo lípidos con
enlaces dieter. y que mantienen a elevadas temperaturas un grado de fluidez comparable al que presentan otras membranas a tem-
peraturas menores. También podría ser relevante en este contexto que peces que crecen a bajas temperaturas tienen un menor
contenido de plasmalógenos y mayor contenido de ácidos grasos poli-insaturados, tales como ácido cervónico que los que pre-

1 sentan los mismos peces cuando crecen a mayores temperaturas.

La presencia de colesterol también afectalaTde una bicapa, ya que regula su fluidez y aumenta la estabilidad mecánica de una
1 membrana fluida. El jipo OH de la molécula de colesterol se orienta en la interfase con el medio acuoso de la bicapa y posee la
capacidad de formar enlaces H con el oxígeno que participa en el enlace ester sn-2
del glicerol (Figura 1. 16). A su vez, la cadena ah-
fática de la molécula se inserta en el seno de la bicapa y puede contribuir a aumentar su fluidez, ya que perturba las interacciones
1 entre las cadenas ahifáticas de los fosfolipidos (48a). La adición de cantidades crecientes de colesterol a un fosfohípido puro ensan-
cha la transición de fase, reduce la entalpia de la transición y eventualmente la elimina a concentraciones más altas. El colesterol,
por ser una molécula plana con un esqueleto molecular rígido formado por sus cuatro anillos, restringe las isomericjones
1 translgauche y los movimientos angulares de las cadenas de los fosfolipidos en una bicapa fluida y perturba el empacamiento de las
cadenas en la configuración todo trans de una bicapa en estado de gel. Esto trae como consecuencia que el colesterol aumenta la'
probabilidad de encontrar conformaciones gauche bajo T y la disminuye sobre T.
1.. En contraste con este efecto perturbador de la
región hidrófoba de la bicapa, el colesterol afecta poco las cabezas polares ya que primordialmente actúa como un espaciador. Se
ha encontrado que los distintos fosfolípidos tienen distintas capacidades de acomodar al colesterol; su forma se adapta mejor a la
de moléculas tales como fosfatidilcolina, esfingomielina y fosfatidilserina que a la fosfatidiletanolamina Esto que podría explicar por

1ó qué en membranas biológicas se encuentra el colesterol asociado con fosfatidilcolina y esfingomiehina en la cara externa de las mem-
branas plasmáticas y es poco frecuente su presencia en membranas internas ricas en fosfatidiletanolamina De hecho, el colesterol
baja la Tt de bicapas de fosfatidiletanolamina presumiblemente por ruptura de enlaces de H.
1
El contenido de colesterol es muy alto en membranas que tienen bajos contenidos de fosfatidiletanolamina tales como las
membranas plasmáticas, y es bajo en membranas que tienen alto contenido de fosfatidiietano1amjoa,.ta[çomo la membrana mito-
condrial y la de retículo sarcoplásmico. Mas aún, el colesterol se encuentra siempre en la monocapa opuesta a aquella en que se
encuentra-la fsfatidiletanólamtna, lo que podría deberse a la preferencia del colesterol por asociarse con la fosfatidilcohina y la esfin-
gomielina sobre la fosfatidiletanolamina. Sin embargo, en algunas membranas, tales como las de gránulos de zimógeno, gránulos cro-
mafines y sinaptosomas, el contenido de colesterol y fosfatidiletanolamina es alto, lo que podría contribuir a hacerlas más inesta-
bles, lo que a su vez podría ser un requisito necesario para su función.

1 1.3.4b. Transiciones de fase líquido-cristalina a hexagonal invertido (lO)

Entre los lípidos que se encuentran más frecuentemente en membranas biológicas, la fosfatidiletanolamina con cadenas no
saturadas tiene la capacidad de formar fase H11 a temperaturas de lO a 20 °
C sobre la temperatura de tra,isición de fase gel a liqui-
do-cristalina. A medida que aumenta la temperatura, las cadenas no saturadas ocupan cada vez más volumen pero las cabezas pola-
Iu res permanecen unidas, lo que trae como consecuencia que cambie la estructura a la fase H11
. En el caso de fosfatidiletanojaminas
que contienen cadenas saturadas, estas no se expanden en igual forma al subir la temperatura, lo que permite que la fase lamelar
sea más estable. Es importante destacar que las fosfatidiletanolaminas extraídas de membranas naturales, tales como eritrocitos,
'u retículo sarcoplásmico y yema de huevo experimentan transiciones a la fase H11 por debajo de 37C, de tal modo que debieran
existir en la fase H11 en condiciones fisiológicas. Ya que fosfatidiletanolamina es uno de los lípidos más abundantes en membranas

'u naturales y se encuentra concentrado en la cara interna de la membrana plasmática y en la cara citoplasmática de orgánulos intra-
celulares, es posible especular que su capacidad de adoptar la estructura H11 juega un papel funcional. Se ha propuesto que la for-
mación de fase H11 está involucrada en procesos como la fusión, la exocitosis y la endocitosis (ver Figura 1.17). La entalpia de la
transición de fase lamelar a fase H11 es baja y la fluidez de los lípidos es similar en ambas fases de tal modo que es posible que ocu-

1 rran transiciones entre ellas en respuesta a perturbaciones pequeñas. Sin embargo, incluso membranas que tienen un alto conte-
nido de fosfatidiletanolamina y de cardiohipina, otro fosfohípido que tiene el potencial de adoptar la configuración H1, se encuen-
tran normalmente en la fase lamelar, lo que indica que los otros lípidos y las proteínas de la membrana contribuyen a estabilizar
'u
'u
la bicapa. Esto trae como consecuencia que en membranas la fase lamelar es sólo un poco más estable que la fase hexagonal, de
tal modo que cambios locales en pH o en [Ca 2] pueden causar transiciones ya sea a la fase H11
o a la formación de mice las inver-
tidas atrapadas entre dos monocapas (Figura 1.17). Es interesante destacar una vez más en este nuevo contexto que el conteni-
do total de fosfatidiletanolamina es bajo en membranas plasmáticas, en membranas nucleares, del sistema de Golgi y del retículo
endoplasmático, y es alto en sinaptosomas, gránulos cromafines y de zimógeno, estas últimas membranas que participan en pro.

'u cesos de fusión o de exocitosis. También es elevado en la membrana interna de la mitocondria, que también tiene un alto conte-

'u
.i1
nido de cardiolipina, otro fosfolipidO que adopta fácilmente la estructura H11, lo que podría incidir en que las transiciones a la fase
ti
H11
jueguen un papel en la función mitocondrial. 1
una membrana biológica (2,30,40)
1.3.4c. Relación entre orden y movimiento de los lípidos constituyentes y fluidez de

Las transiciones de fases están bien caracterizadas y son bien definidas para especies moleculares únicas, pero no ocurren en
ti
membranas biológicas. De hecho, se ha demostrado que las mezclas de dos fosfolipidOs no poseen un comportamiento ideal ya que

experimentan separaciones de
fases si sus T son muy diferentes. Por lo tanto, si bien el estudio de sistemas simples ha permitido
comprender las propiedades físicas de las bicapas las membranas más complejas no presentan esta clase de transiciones de fases. Es
i
importante destacar, sin embargo. que todos los estudios realizados en membranas biológicas indican que a las temperaturas en que
operan fisiológicamente todas presentan una bicapa fluida. Más aún, en el caso de la Ca2+ATPasa de retículo sarcoplámico se ha
demostrado que una membrana fluida es requisito para la función de la enzima Sin embargo, no todas la membranas biológicas pre-
u
sentan el mismo grado de fluidez ya que existe un rango de fluidez incluso en membranas de una misma célula.
1
il
En una bicapa fluida las cadenas alifáticas pueden moverse másrápid0 que en una bicapa en estado gel, y además es posi-
de las cadenas alifáticaS. Distintas técnicas, entre ellas la resonancia magnética
ble encontrar un conjunto de orientaciones trón, permiten medir tanto en membranas artificiales como naturales ambos tipos
1
.
nuclear y la resonancia paramagnétita del elec
de variables: parámetros de orientación y parámetros dinámicos, entre ellos la velocidad de movimiento de los segmentos y los
tiempos de correlación rotacional. Entre las técnicas que permiten medir rapidez de movimientos se encuentra, como ya se de
indicó, la resonancia magnética nuclear, que a través de la medición de tiempos de relajación da información sobre tiempos
correlación para movimientos moleculares. Con respecto a la caracterización de la orientación, se usa el parámetro de orden,

definido a continuación.
Podemos definirlo como un parámetro estructural promediado en el tiempo. Es posible carac-
1
PARÁMETRO DE ORDEN. superficie (Fig. 1 1 8). El
.

terizar la posición de una molécula en una bicapa por el ángulo O que forma con la normal al plano de la
grado de orden de una bicapa está dado por el promedio en el tiempo del valor de O para todas las moléculas que la componen. 1
por si mismo no es una forma particularmente conveniente de describir el orden de la bicapa. Una des-
Sin embargo, el ángulo e
cripción más conveniente sería usar el
pa, el promedio sería igual a cero ya que se
lor de cose pero como existe un número similar de moléculas en ambos lados de la bica-

anularían los valores po

sitivos y negativos de cosO a ambos lados de la bicapa. Para evi-
9 y el promedio se define como <coszO>. De esta definición sigue que si todas las molé-
1
tar este problema, se usa el valor de c0s2 0> = 1. Si por otra parte todas las
culas de una bicapa están alineadas perfectamente paralelas entre ellas, entonces

moléculas están orientadas al azar, son pos

e O y <co52
ibles todos los valores de O en las tres dimensiones, Y en ese c
5 según la expresión:
aso <cos2O> = 113. Para
1
parámetro de orden
simplificar la notación. se ha definido un
S = 1/2 (3<cos2e> - 1) 1
Sigue sin más de esta definición que para un sistema perfectamente ordenado en que O = O el valor de 5 = l Y para un siste-
ma totalmente desordenado, en que O pueda adoptar todos los valores y <cos20> = 1/3, el valor de S = 0. .1
Usando una variedad de técnicas e5pectr05CóPica5
. tales como la resonancia magnética nuclear, la resonancia paramagnética

del electrón y la fluorescencia, es posible determinar el valor de para bicapas de lípidos (ver el Apéndice 1.3). Tanto en membra-
1
nas modelo como en sistemas biológicos se ha encontrado que en bicapas fluidas el valor de S se mantiene prácticamente constan-
te desde C2 hasta C9, y aumenta desde C9 hasta el fin de la cadena alifática. El parámetro de orden alcanza un valor de hasta 0.5

en el seno de una bicapa liquido cristalina y puede alcanzar un valor de 0.9 a 1 en el estado gel.
1
En conclusión, las membranas biológicas se caracterizan por poseer una composición compleja de lípidos organizados en la
estructura de bicapa fluida, que permite un intervalo significativo de orientaciones y movimientos de las cadenas alifaticas.
1
1
1.4.

P ROTEÍNAS DE MEMBRANAS (52)

1
Las proteínas le confieren a la membrana su funcionalidad, la hacen selectiva al paso de iones y moléculas polares y participan
en la transducciófl de energía y de información a este nivel. Se debe a esto que la composición de la membrana respecto al tipo de
proteínas que en ella se encuentran sea tan variable como variables son las funciones que en ella residen.
1
u Las membranas biológicas más simples son aquellas que contienen una o pocas proteínas predominantes. La rodopsina, po
ejemplo, es la única proteína presente en alta proporción en los segmentos externos de los bastones de la retina, y la Ca2 -ATPa

1 sa constituye la proteína mayoritaria de extensas regiones de la membrana del retículo sarcoplásniico. La simplicidad de la compc

u! it
rS
sición proteica de estas membranas concuerda con su especialización funcional. La mayoría de las membranas, sin embargo, pose
en numerosas proteínas que ¡es permite llevar a cabo una multiplicidad de funciones.

La presencia de áreas hidrófobas e hidrofilicas en la misma molécula es característica de las proteínas de membrana. Esta par
ticularidad hace que estas proteínas en general no sean solubles en las soluciones acuosas, haciendo necesaria la presencia de deter
1 gentes para su solubilización y posterior estabilidad en soluciones polares.

El tipo de asociación de una proteína con la bicapa lipídica depende directamente de la estructura de la proteína. De acuerdc
1 al modelo del mosaico de Singer y Nicolson y utilizando como criterio el método bioquímico para solubilizarlas, es posible clasifi
car las proteínas de membrana en dos grandes grupos: proteínas integrales o intrínsecas y proteínas periféricas o extrín
secas (Fig. 1.23).
1 Tronsmembr ano
Integral

1 Cona¡

u.
1
Figura 1.23. Estructura d€
proteínas de membrana.

Periférico

$ 1.4.1. Proteínas integrales o intrínsecas (19,31,56)

t En generai, las proteínas intrínsecas poseen un mayor contenido de regiones hidrófobas que las proteínas extrínsecas, y son
más difíciles de extraer desde la membrana. Su solubilización requiere la ruptura de la bicapa (ver Apéndice 1.1) y sólo es posible
con el uso de detergentes en alta concentración (varias veces la c.m.c. del detergente) o con solventes orgánicos. Estas proteínas

1 al solubilizarse retienen moléculas de fosfolipidos asociados a ellas por interacciones hidrófobas. En ausencia de fosfolípidos ydeter-
gente tienden a agregarse y a precipitar debido a su alta hidrofobicidad. Las proteínas intrínsecas pueden tener segmentos polares
a uno ¿a ambos lados de la membrana y presentar uno o varios segmentos que atraviesan la bicapa, denominados segmentos trans-
1 membranosos. Otras proteínas integrales están ancladas a la bicapa a través de una cola hidrófoba pero mantienen la mayor por-
ción de su masa fuera de ella. Por acción de enzimas proteolíticas es posible separar la región hidrofílica de la membrana, la que una
vez en solución acuosa se comporta en forma similar a cualquier proteína hidrosoluble ya que es totalmente hidrofilica y estable en
soluciones acuosas.
11,

Las proteínas integrales muestran una composición de aminoácidos muy variable. Por ejemplo, bacteriorodopsina de la bac-
teria salina Ha!obacterium ho!obium está constituida por un 68% de amino ácidos no polares, la rodopsina tiene 49 % y la glicofori-
na del glóbulo rojo sólo un 28 %. Esta diferencia sugiere distintas formas de asociación de las proteínas con la membrana, según
atraviesen la bicapa una sola vez o varias veces. Entre las primeras se encuentra la glicoforina y entre las segundas, la bacterioro-
1 dopsina.

1L Conociendo la estructura primaria de una proteína (secuencia aminoacidica) y usando métodos como el descrito por
Kyte y Doolittle (véase la revisión de M. Jennings, reí 31, en que se discuten otros métodos de predicción) es posible hacer
un diagrama de hidropaticidad de la proteína y detectar los presuntos segmentos hidrófobos e hidrofilicos y así postular un
modelo de la estructura secundaria de la proteína. Como se verá a continuación la estructura más favorable para un poli-
péptido en la membrana es la hélice a. Como ejemplo, se ilustra la estructura secundaria propuesta para la bomba de calcio
presente como componente mayoritario en las membranas de retículo sarcoplásmico (Fig. 1.24), y como se asocia esta
1L
'u
estructura con la estructura tridimensional de la misma proteína, determinada por crio-raicroscopía electrónica.
 a
a
Figura 1.24.
Estructura secundaria propuesta
para la Ca .2 -ATPasa presente
en la membrana de retículo sar-
• 1
b
coplásmico (modificada de refe-
rencia 59). El esquema ilustra la
estructura tridimensional de la
enzima (a) y la predicción de
1
a
Oorn.nlos cl0pIo5nóC0S-.
0cminC luminol estructura secundaria basada en
(M7-M8) la secuencia de aminoácidos (b),
que predice lO hélices trans-
membranarias (Ml -M fo) con 5

—Tollo
X C
80Ç832 916 928 980 Clioplosmo
tallos (SI -SS).
1
307 760

.1
c -

M6 M7 M9 MIO
° - Lumen

1
78 87 280 288 783 790 897 950 961
59
\J \J \J a \j
•

1.4.1 a. EJ efecto hidrófobo y ¡o identificación de a hélices no polares en proteínas de

membranas (20)
a
En los últimos años, gracias a los extraordinarios avances de la biología molecular, se ha podido determinar la estructura prima-
ria (secuencia de aminoácidos) de un gran número de proteínas integrales de membrana. Por lo tanto, es de importancia especial el
poder predecir cuáles segmentos de la proteína se encuentran en el interior hidrófobo de la bicapa de lípidos. Estos segmentos toman.
1
en general,ia estructura de una hélice a que cubre una extensión de aproximadamente 20 residuos aminoacídicos. Este no es un núme-
ro mágico, sino que resulta de considerar un grosor para la bicapa de 3 nm y un intervalo entre residuos a lo largo del eje de la héli- .1
ce de 0.15 nm. Cuando se considera la estabilidad de un segmento proteico en la bicapa, una hélice a tiene una serie de ventajas fren-
te a las otras estructuras posibles que pueden adquirir las proteínas (ovillos al azar, estructuras en forma de hoja plegada 13). Una héli-
ce a formada por residuos aminoacidicos no polares expondrá sus cadenas laterales hacia el exterior y los grupos polares ubicados
hacia el interior quedarán estabilizados mediante la formación, de enlaces de hidrógeno (fig. 1.25).
a
.1
1
1
Figura 1.25. Estructura de una hélice a
(A) Corte transversal (8).
1
1
1
B a
II En el proceso de identificación de un segmento capaz de atravesar la bicapa de lípidos, el investigador se ve obligado a
encontrar una escala adecuada de polarJ ad para cada uno de los residuos aminoacídicos. Engelman y col. (20) construyeron
,
una tabla (Tabla 1.6) que nos da la energía de transferencia de los grupos laterales de los aminoácidos desde el agua al acei-
te (constante dieléctrica cercana a 2). El componente hidrófobo de cada aminoácido que se muestra en la Tabla 1.6 se obtu-
vo a partir de las superficies que ocupa cada uno de ellos en una hélice ci ya que, como se estableció en el apéndice A. 1. 1,
1 existe una correlación lineal entre la energía de transferencia y la superficie de una molécula hidrófoba. La contribución a la
energía total de transferencia de la porción hidrofílica incluye aquellas que surgen de la formación de enlaces de hidrógeno
entre el grupo polar y el agua y también la energía requerida para convertir una cadena lateral cargada en una neutra a pH
neutro. Como ejemplo podemos calcular la energía de trasferencia de una hélice a formada por 20 residuos de alanina. La
energía de transferencia de la cadena lateral de la alanina de acuerdo a la Tabla 1.6 es de 1.6 kcallmol y por lo tanto la ener-
-

Ii gía requerida para la inserción de la hélice en la bicapa es de -32 kcal/rnol. Conclusión: La inserción de hélices ci hidrófobas en
la bicapa es altamente favorecida.

TABLA 1 .6. Energías de transferencia para cadenas latera/es de aminoácidos en polipétidos con estructuro de hélice a (Kcol/mol)

u Fenilalamina
Metionina
Hidrófobo
.37
-3.4
Hidrofihico Agua-aceite
.37
-3,4
Isoleucina -3.1 .3,1
Leucina -2.8 -2.8
Valina -2.6 -2.6
Cisteina -2.0 -.20
Triptofano -4.9 3,0 -1.9
Alanina -1.6 .1.6
Treonina -2.2 1,0 -1.2
Glicina lo -1,0
Seria .1,6 1.0 -0,6
Prolina -1.8 2.0 0,2
Tirosina -3.7 4.0 0,7
Histidina -3.0 6,0 3.0
1 Ácido glutámico
Ácido aspártico
-2.2
-2,2
7,0
7,0
4,8
4.8
Glutamina -2,6 10.8 8,2
Lisina -3,7 12.5 8,8
Asparagina -2,1 11.3 9,2
Argmnina -4.4 16,7 12,3
* Datos citados en ref. (20).

DLI. El próximo paso para localizar la estructura helicoidal que atraviesa la membrana consiste en definir una "ventana" con un

JI número determinado de aminoácidos. Este número se ha tomado como veinte porque correspónde al grosor de la bicapa. Más
importante aún, es el determinar el número de segmentos proteicos que atraviesan la membrana, los cuales son obtenidos a partir
de los indice de hidropíá calculados usando esta ventana. Esto permite obtener modelos que se acercan mucho a las estructuras
de proteínas que se han obtenido mediante rayos X o usando el microscopio electrónico (ver más adelante). Una inserción favo-

'
rable se visualiza como un pico cuando el índice de hidropada se gráfica en función del número del aminoácido en el terminal NH2
I:. del segmento considerado en la ventana. Este método predice correctamente el número de hélices a en varias proteínas de mem-
branas al determinar la estructura de esta proteína mediante otras técnicas.
u El anclaje que otorga una hélice a es muy fuerte y se ha calculado que la energía necesaria para remover una hélice a com-

'u puesta por 23-25 amino ácidos es de 100-120 kJ/mol. Dependiendo de su tamaño y de la contribución relativa de sus regiones hidro-
fílicas, las proteínas intrínsecas pueden presentar una proporción bastante baja de aminoácidos no polares. En general, las proteínas
que poseen varios segmentos transmembranarios poseen una proporción mayor de aminoácidos no polares, aunque existen ejem-
plos, como los receptores de rianodina y de inositol 1 .4,5-trisfosfato, que a pesar de poseer numerosos segmentos transmembra-
narios tienen una enorme zona hidrofilica que contribuye con una gran proporción de amino ácidos polares a la masa total de la
proteína. Las proteínas que poseen varios segmentos transmembranarios pueden además admitir en ellos la presencia de residuos
hidrofilicos, ya que estos pueden estabilizarse a través de interacciones con residuos hidrofílicos de hélices vecinas. Ejemplos de ello
lo constituyen los transportadores y los canales jónicos.

'u
 (SI)
1.4.2. Proteínas periféricas o extrínsecas

Al enunciar el modelo de mosaico fluido, Singer y Nicolson describieron el papel de las proteínas periféricas con las siguien-
Por lo tanto,
a lo estructura e integridad de las membranas biológicas.
tes palabras: Se supone que sólo las proteínas integrales son criticas pro-
de las proteínas periféricas aunque interesantes en sí mismas pueden no ser directamente relevantes al
las propiedades e interacciones
blema central de la estructura de la membrana. Esta visión ha cambiado en forma drástica en los últimos años. Existen numerosas evi-
dencias que indican que las proteínas periféricas juegan un papel central en determinar la estabilidad de las membranas biológicas.
Participan, además, a través del citoesqueleto en el control de la movilidad de las proteínas integrales.

Por definición, las proteínas periféricas pueden extraerse de las membranas usando tratamientos suaves, tales como aumento
de la fuerza jónica, cambios de pH, adición de detergentes en concentraciones bajas (menores que la concentración micelar micela
crítica, c.m.c.), o agentes caotrópicos como por ejemplo urea. Estas proteínas son primordialmente de naturaleza hidrofílica, por lo
tanto estables en soluciones acuosas, y no presentan uniones covalentes al material lipidico.

Comúnmente las proteínas periféricas se encuentran interactuando con segmentos hidrofilicos de las proteínas integrales a
través de interacciones iónicas. Por esta razón son fácilmente extraídas por métodos que afectan las interacciones iónicas. Ejemplos
típicos de este grupo son el citocromo C (presente en las membranas mitocondriales), la espectrina (presente en el glóbulo rojo)
y enzimas como la gliceroaldehido 3-fosfato deshidrogenasa de membranas de eritrocitos. Generalmente estas proteínas se ubican
al lado citoplasmátic0 de la membrana en donde participan en actividades metabólicas especificas, y constituyen la fracción minori-

taria de las proteínas de membranas.

1.4.3. Dinámica de proteínas de membranas

Una descripción detallada de las proteínas de membrana no sólo requiere que se determine su orientación.SinO que además
se muestre como están distribuidas en la superficie y se caractericen sus movimientos traslacionales y rotacionales en la bicapa.

1.4.3a. Lateralidad, localización y difusión lateral de las proteínas de membranas (4,7)

El estudio de la topología de las proteínas de membranas ha aportado información clave para entender algunos mecanismos
celulares como la biogenésis de membrana, recambio de proteínas de membrana, la internalización de receptores y su regulación.
Es posible determinar la lateralidad de una proteína de membrana usando técnicas de marcaje de superficie con anticuerpos o con
agentes farmacológicos radiactivos. Por ejemplo, una manera simple de hacerlo es usando un anticuerpo específico de una proteí-
na de membrana y medir su capacidad de unión a una preparación de células aisladas o de vesículas selladas. Luego se rompen las
células o las vesículas en presencia de detergente y se mide la unión ahora mirando también las presuntas moléculas de la proteína

que estaban localizadas hacia la cara interna de la membrana.

Las proteínas integrales se desplazan individualmente o asociadas a otras en la membrana. En principio, estas proteínas pue-
den moverse con cierta libertad por difusión lateral dependiendo de si establecen interacciones con las proteínas citoplasmáticas y
del citoesqueleto, de la densidad de empaquetamiento de proteínas en la membrana y de la fluidez de la bicapa. Haciendo uso de
microscopia electrónica es posible determinar si una proteína de membrana se encuentra distribuida uniformemente o muestra
algún otro tipo de separación lateral o de disposición particular en la membrana. Se pueden encontrar las proteínas de membrana
distribuidas individualmente en forma espaciada en la superficie, o formando pequeños núcleos (o parches) de 4-6 moléculas deno-
minados en inglés "patch" o agrupadas estructurando en la superficie un conjunto de moléculas que da origen a lo que se conoce

con el nombre de "sombreros" (caps).

1.4.3b. Movimientos rotacionales de proteínas de membranas (8,9,30,58)

El modelo del mosaico fluido visualiza tanto a los lipidos como las proteínas efectuando movimientos traslacionales y rotacio-

nales en el plano de la bicapa.

En el caso de las proteínas de membrana la difusión rotacional se demostró primero para la rodopsina, el pigmento visual de
las membranas discoidales de las retina. Para ello, se utilizó la presencia del cromóforo endógeno II -cis-retinal, presente tanto en
rodopsina como en bacteriorodopsina, y se estudió su rotación difusional midiendo el decaimiento en el tiempo del dicroismo indu-
cido por un flash de luz polarizada. A partir de estas medidas se calculó que la rodopsina presenta un tiempo de correlación rota-
consistente con un alto grado de movilidad rotacional. Sin embargo, este mismo tipo de
cional de 20 ps en la membrana nativa ,
1 estudio reveló que la bacteriorodopsina en la membrana púrpura del Halobacterio posee un tiempo de correlación rotacional 1 DOC
veces mayor que la rodopsina. Estos resultados indican que algunas proteínas de membrana tienen movilidad muy restringida y sin

1 embargo son funcionalmente activas.

Para otras proteínas de membrana, que no poseen cromóforos endógenos, ha sido posible estudiar sus movimientos rotado-
1 nales mediante la introducción de sondas (cromóforos o sondas paramagnéticas que contienen el grupo nitróxido) unidas covalen-
teniente y en forma rígida a la proteína. Estas determinaciones han demostrado que las proteínas intrínsecas de las membranas bio-
lógicas poseen diferentes características dinámicas, desde proteínas que se mueven libremente, tales como la Ca 2 -ATPasa de retí-
1 culo sarcoplásmico y la rodopsina, que presentan coeficientes de difusión rotacional de lO a 20 jis a 22 'C en una fase lipidica flui-
da, hasta proteínas rígidas, como la bacteriorodopsina, que forma organizaciones cuasi-cristalinas. Casos intermedios los constitu-

1 yen proteínas de membrana que están ancladas por proteínas del citoesqueleto, lo que restringe total o parcialmente sus movi-
mientos rotacionales y de desplazamiento lateral. En el caso de la Ca 2 -ATPasa de retículo sarcoplásmico, una serie de estudios
indican que es necesario el movimiento rotacional de la proteína para expresar su función. Tal es así, que en membranas que con-

1 tienen esta enzima reconstituida con fosfolipidos sintéticos, se observa total inhibición del movimiento de difusión rotacional de la
proteína, y de su actividad enzimática, a temperaturas en que los lipidos están en la fase gel.

1 1.4.4. Criofractura de membranas y microscopía electrónica (7, 18,60,62)

Durante los últimos 20 años se han logrado considerables avances en el estudio de la estructura y visualización de las proteínas

IÓ de membrana gracias a dos importantes técnicas en microscopia electrónica: la criofractura y el marcaje inmunocitoquímico aso-
ciado a esta última.

1 Las observaciones al microscopio electrónico de muestras hidratadas congeladas datan de fines de los años 60 con las traba-
¡os pioneros de Fernández Morán, pero fueron sin duda los aportes de Bob Glaeser y Ken Taylor en Berkeley y de NigI lJnwin en

1 Cambridge los que permitieron el desarrollo de la metodología de la crio-electromicroscopia tal como la conocemos hoy. La idea
básica de esta técnica consiste en enfriar rápidamente la muestra a temperaturas extremadamente bajas (temperatura del nitróge-
no liquido), perturbando lo menos posible la estructura de la membrana. La muestra congelada se fractura en vacío con un cuchi-

1 llo en forma de martillo muy pequeño. Como resultado se obtiene un separación de la bicapa en la interfase hidrofóbica. Los cris-
tales de hielo se eliminan por subhmación a temperaturas menores de lOO °C. Posteriormente esta membrana fracturada se pre-
-

para para microscopia electrónica, sombreando con polvo mineral. La película de polvo mineral depositada sobre las superficies

1 expuestas hace una réplica la que es analizada al microscopio electrónico.

'u

Figura 1.26.
Criofractura de uniones de membranas de lentes obtenidos de bovi-
nos. Aumento I00.000X. Foto gentileza del Dr. Guido Zampighi,
UCLA.

'u
'u
'U
 La fotografía de criofractura de membrana (Fig. 1.26) muestra dos caras: una superficie lisa que presenta partículas (P) y otra que
presenta las concavidades dejadas por estas partículas (E). Las partículas (proteínas aisladas o agrupadas) y las depresiones cóncavas (gene-
radas por el espacio dejado por las proteínas que fracturaron con la cara complementaría) son fáciles de distinguir pues están distribuidas
al azar en una superficie totalmente lisa que corresponde al marco lipidico formado por los ácidos grasos. Si en sistemas reconstituidos
con un sólo tipo de lípido el congelamiento se realiza partiendo de temperaturas sobre la temperatura de transición de los lípidos (los lípi-
dos se encuentra el estado liquido-cristalino a estas temperaturas) más lisa será la superficie de ambas caras obtenidas con la criofractUra.
Aplicando este método a vesículas formadas sólo por fosfolípidos (liposomas) se observan dos superficies totalmente lisas. Si se forman
los liposomas en presencia de proteínas solubilizadas de membrana, es posible ver su incorporación en la bicapa. Estas proteínas presen-
tan similares características estructurales a las observadas en las membranas biológicas. Esta es una de las evidencias mas claras que indi-
can que las membranas biológicas utilizan como estructura básica la bicapa lipidica, la cual es idéntica a la que se forma en los liposOmas.

1.4.5. Estructura tridimensional de proteínas de membranas (14,16,22,23,29,33,34,43,44,60)

Hasta hace sólo algunos años pensar que se pudiera resolver la estructura de una proteína de membrana utilizando la técnica
imposible de lograr. Sin embargo, en 1984-1986 aparecierón en la literatura las des-
de difracción de Rayos X parecía un sueño omplejos de proteínas de membrana: los cen-
de las estructuras tridimensionales, con una alta resolución
(3Á), de tres c
de reacción fotosintéticos de la RhodopseudomOnas viridis y del Rhodobacter sphaeroides y la porina. una proteína que forma un
tros
poro en la pared celular de bacterias. Este sorprendente progreso fue posible por los trabajos pioneros de Hartmut Nlichel en Ale-
su aporte en este campo, y de Michael R. Garavito en los Estados Unidos, quienes fue-
manía, Premio Nobel de Química 1988 por
ron los primeros en lograr un cristal de tres dimensiones posible de analizar por difracción de rayos X. Todavía este método es el
Á. Su aplicación exige como pre-
único que permite determinar la estructura de una macromolécula a una resolución mayor que 3
aproximadamente de 0,5 pm de longitud.
requisito la obtención de cristales en tres dimensiones bien ordenados y de un tamaño

Otro método importante para obtener información sobre la estructura de las proteínas de membrana ha sido la utilización de
la difracción de electrones. Este procedimiento, diseñado por Nigel Unwin utiliza el microscopio electrónico convencional con algu-
nas modificaciones. La resolución de esta técnica es menor que la de difracción de rayos X. pero haciendo uso del análisis de imá-
genes por computación' obtenidas a distintos ángulos de inclinación Richard Headerson y Nigel Unwin (29) han logrado llegar a una
resolución de 0,7 nm en el caso de la bacteriorodopSifla. Es importante destacar que para esta técnica no es necesario obtener cris-
tales en tres dimensiones, perfectamente ordenados y de gran tamaño, como los necesarios para la difracción de rayos X, ya que
para este método se preparan otro tipo de cristales, mal denominados en dos dimensiones, los que aparentemente son mas fáciles
- prác-
de obtener. En algunos casos, por la alta concentración de la proteína en la membrana, es posible analizarla directamente pues
ticamente se encuentran las proteínas ya cristalizadas en dos dimensiones. El ejemplo mas ilustrativo de esta situación correspon-

de al caso de la bacteriorodOpsifla de las membranas púrpuras del Ho!obacterio.

•
Figura 1.27.
-Estructura de diversas proteinaS de
membrana. (a) Centro de reacción
fotosintético de RhodopseudOm0b05
viridis, el cual se encuentra formado
- por 4 subunidades distintas deno-
minadas H, L. M y C. (b) Receptor
nicotiniCO de acet11c011n3 esta pro-
teína está formada por 5 subunida-
modelo de¡
des (2 a B,Y.)(t)
-' complejo porina. proteína formado'
ra de poros de la pared celular de
(c ) ( d) (e) Eschencllia col¡; es un trimero cuyas
(a) (b)
subunidades son idénticas- (d) Bac-

teriorodopsina, un complejo formado por 3 subunidades idénticas, donde cada una de ellas posee 7 segmentos transmembranar105 formando
estructura secundaria de a-hélice. Cada monómero tiene unido una molécula de retinol, cofactor del pigmento sensible a la luz. Su estructura fue
usando la técnica al microscopio electrónico y procesando las imágenes de los cristales en 2-O. (e) Hemoaglutiflifla del virus de la
resuelta A presenta un dominio hidrófobo en un solo segmento transmembranarios con estructura secundaria tipo a-hélice.
a 7que
influenza,

Al margen de estos importantes avances, nuestro conocimiento de la estructura detallada de las proteínas de membrana se
encuentra muy rezagado con respecto al conocimiento que tenemos de las estructuras de las proteínas solubles. La mayoría de las-
as son complejos formados por múltiples subunidades compuestas por 2 a 15 polipépti
proteínas de membrana bien caracterizad la figura 1.27 y corresponden
esquemáticamente en
dos diferentes o idénticos. Los ejemplos más conocidos son los que se ilustran
a modelos de estructura en tres dimensiones: El modelo (a) representa el centro de reacción fotosintético de RhodoPseud0m0n05
a viridis, el cual se encuentra formado por 4 subunidades distintas denominadas H, L, M y C. Las subunidades L y M atraviesan la mem-
brana, presentando cada una de ellas 5 segmentos transmembranarios que poseen estructura secundaria de a-hélice. Entre estas
1: dos subunidades se encuentran localizados los pigmentos fotosintéticos y los átomo de hierro formando así el cuerpo principal del
complejo. La subunidad H se encuentra anclada a la membrana por un solo segmento inserto en la bicapa, el cual también presen-
ta estructura secundaria de a-hélice. Por último está la subunidad C, que corresponde a una molécula de citocromo que contiene
u unido 4 grupos hem y que cumple con la definición de una proteína extrínseca de membrana. Esta subunidad no se encuentra en
contacto con la bicapa, pero si está formando parte del complejo interaccionando con los segmentos hidrofilicos de las subunida-

u des L y M ubicados en la parte externa de la membrana hacia el lado intersticial. Esta estructura fue resuelta por difracción de rayos
X con una resolución de 0.3 nm razón por la cual se dispone de toda la información detallada de su estructura. El modelo (b) de la
figura 1.27 corresponde al receptor nicotínico de acetilcolina; esta proteína está formada por 5 subunidades (2 a, 13, .y y ), las 5 tie-
nen segmentos transmembranarios entre los cuales se forma un canal regulado por potencial eléctrico. La estructura tridimensio-
1 nal de esta proteína fue resuelta por Brisson y Unwin con una resolución de 2 nm usando la técnica de difracción de electrones. El
modelo del complejo Porina se encuentra representado en (c). Esta proteína formadora de poros de la pared celular de Escherichia

1 coli es un trimero cuyas subunidades son idénticas. Las tres subunidades se encuentran totalmente inmersas en la bicapa presen-
tando una pequeñísima porción polar en la superficie. La porina es una de las proteínas mas hidrófobas que se han purificado. La
estructura secundaria que atraviesa ¡a bicapa es del tipo 13 plegada antiparalela con una orientación perpendicular al plano de la mem-

a brana. Esta proteína es la única de todas las estudiadas que presenta esta estructura secundaria en sus segmentos transmembrana-
rios y debido a esta característica es considerada en la literatura como un caso particular, aunque como ya se mencionó, la porina
¡unto al complejo del centro de reacción fotosintético de la Rhodopseudomonas viridis fueron los primeros ejemplos de cristales

1. resueltos en tres dimensiones. La proteína (d) de la figura 1.27 representa a la bacteriorodopsina, un complejo formado por 3 subu-
nidades idénticas, donde cada una de ellas posee 7 segmentos transmembranarios formando estructura secundaria de a-hélice. Cada
monómero tiene unido una molécula de retinol, cofactor del pigmento sensible a la luz. Su estructura fue resuelta a 0.7 nm usan-

1 do la técnica al microscopio electrónico y procesando las imágenes de los cristales en dos dimensiones. Por último tenemos el ejem-
plo de la hemoaglutinina del virus de la Influenza (e), que presenta un dominio hidrófobo en un solo segmento transmembranario
también con estructura secundaria tipo a-hélice. La actividad biológica de esta proteína se localiza en la porción hidrofilica la ¿ual

1 es posible separar de la membrana por hidrólisis enzimática. Esta porción ha sido cristalizada y resuelta por difracción de rayos X.
La proteína funcional está formada por un trímero, pero por claridad en este esquema se ilustra sólo un monómero.

1 Agradecimientos: Los autores agradecen al Dr. Ramón Latorre por su generosa contribución a este capitulo.

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u
1
A PÉNDICE 1.1.

Ii
EFECTO HIDRÓFOBO.

1 PROPIEDADES DE LOS DETERGENTES Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAS

4.1.1.1. EL EFECTO HIDRÓFOBO (4)

La energía de interacción de las partes hidra filicas y hidrófobas de una molécula anfipática con el solvente son independientes.

En este apéndice tratamos de obtener la energía libre de transferencia requerida para transferir un soluto no polar (hidrófo-
bo) desde el agua a un solvente orgánico. El objetivo final de esta disgresión fisicoquímica es obtener una noción de cuál o cuáles
son las fuerzas que hacen que los solutos hidrófobos sean inmiscibles con el agua. Es esta inmiscibilidad la que permite que las molé-
culas de lípidos adopten una determinada orientación con respecto de la fase acuosa haciendo posible la formación de la membra-
na celular.

'u
La energía libre de una solución queda definida por su potencial químico. En nuestro caso, el potencial químico del agua, b1,
cambia a medida que un soluto se introduce en ella de acuerdo a la expresión:

= l.twO + RTlnX + RTlny , (1)

donde jíw0 es el potencial químico estándar, X,,., es la concentración del soluto expresada en unidades de fracción molar y y, es el
coeficiente de actividad cuando la concentración del soluto es X. En la ecuación (1) todas las interacciones entre el soluto y el
agua (solvente) están en J1° y el exceso de potencial químico que surge como consecuencia de las interacciones entre soluto-
soluto está contenido en RTlnX. Por otra parte, en el caso de soluciones muy diluidas —caso en cuestión, ya que la solubilidad
de las moléculas hidrofóbas en agua es muy baja— y = 1 y el último término de la ecuación l es despreciable.

De la misma manera podemos usar una ecuación similar a (l) para una solución de compuestos no-polares en solventes no
polares; por ejemplo e hidrocarburos (hc) en hidrocarburos.
'a
= bIh,0 + RTlnXh + RTlny hc (2)

En el caso de disolver un hidrocarburo en otro hidrocarburo, el exceso de potencial químico generado por las interacciones
entre moléculas de soluto es muy pequeño, por lo tanto el término RTlnXhC = O y l.thc = h,0- Las ecuaciones (1) y (2) nos hacen
ver que las diferencias entre las propiedades de un soluto en determinado solvente residen en la diferencia entre los potenciales
químico estándar: t° -
Esta es la energía necesaria para transferir un hidrocarburo desde el agua al hidrocarburo y se deno-
:1
mina energía de transferencia. La energía de transferencia puede obtenerse saturando el agua con el hidrocarburo ya que cuan-
do las dos fases alcanzan el equilibrio se debe cumplir que ji,. = lthc- Por lo tanto, de las ecuaciones (1) y (2), tomando en cuenta
las aproximaciones hechas, se tiene:
1
lIw - JO = RTln X,, (3)

X,,., se obtiene midiendo la solubilidad del hidrocarburo en el agua en condiciones de saturación. Tanford (4) realizó un estudio sis-
.1
temático de las energías de transferencia de alcanos con cadenas de hidrocarburos de diferente longitud encontrando que estas,
cuando se grafican en función del número de atarnos de carbono, n, de la cadena de hidrocarburos se distribuyen en una línea recta
a
dada por:

l—th,-
-
= -2436 - 884n (4)
a
En la ecuación (4) la energía de transferencia esta dada en cal/mol. a
La energía de transferencia para ácidos orgánicos del tipo RCOOH está dada por:
= 4260
-
825n - (5) 1
y para alcoholes del tipo ROH se tiene

11w0 = 833- 821n (6)

a
P-hc° -

El hecho que sólo el intercepto se vea afectado al pasar de alcanos a alcoholes (o ácidos orgánicos) nos indica que las contri-
buciones de las partes hidrofilicas y hidrófobas de una molécula anfipática a la energía de interacción con el solvente son práctica-
a
mente independientes. -

Lo anterior nos dice que literalmente las partes no polares de las moléculas orgánicas serán expulsadas del agua. Este efecto
1
aíso acuoso es el que llamamos efecto hidrófobo. En el caso de un fosfolípido con dos cadenas de hidrocar-
de expulsión del par.
buros de 16 carbones cada una, la energía de transferencia desde el agua a un hidrocarburo es 32 x (-820) = -26.240 cal/mol = -26
kcal/mol. Es principalmente el efecto hidrófobo el que hace que las bica pos se formen espontáneamente.
1
Origen del rechazo del aguo por las sustancias hidrófobas 1
A la energía de transferencia contribuyen procesos entálpicos y entrópicos. Una manera de separar las contribuciones indivi-
duales de la entalpia (H) y de la entropía (5) a la energía libre es ver el efecto de la temperatura sobre esta última. La relación entre 1
estos tres parámetros termodinámicos es:

14c0
0'
l 0 _Hhc oH woT(Shc oSwj (7) a
dividiendo la ecuación (7) por T y derivando con respecto a 1 IT se obtiene la entalpía de transferencia
1
ÍS
1 d((l.thCoj1Wo)rr)/d(lm= L
''tic
oLl o (8)

u Por lo tanto las contribuciones de la entalpia y la entropía a la energía libre de transferencia se pueden obtener al determinar
el efecto de la temperatura sobre esta última. La energía de transferencia para el etano desde el benzeno al agua es de 3,6 kcal/mol,
que correspponde a una contribución entálpica de -2,2 kcal-mol y a una contribución entrópica de -20 cal/'K.mol. Estos resultados

1 son sorprendentes ya que nos dicen que la transferencia de un hidrocarburo al agua es favorecida energéticamente y que el hecho
que la energía de transferencia sea grande y positiva se debe a un gran cambio de entropía durante el proceso de transferencia. El
signo de este cambio indica que hay un aumento en el orden de la fase acuosa cuando introducimos en ella a una molécula hidró-

u foba. La visión estructural que se tiene de esta reducción en la entropía cuando una molécula hidrófoba se disuelve en agua, corres-
ponde a una ordenación de las moléculas de agua en redes que a su vez forman cavidades capaces de "enjaular" a los solutos no-
polares. Esto reduce el efecto hidrófobo a un problema de superficies de contacto: la energía libre del efecto hidrófobo es directa-

1 mente proporcional al área de la molécula hidrófoba.

r A.l.l.2. PROPIEDADES DE LOS DETERGENTES (1,3,5)

1
Los detergentes son indispensables para extraer las proteínas integrales de la bicapa de lípidos, mantenerlas en solución acuo-
sa y poder así continuar con los procesos de aislamiento y purificación, razón por la cual es necesario examinar las propiedades fisi-
coquímicas que presentan estos compuestos en solución acuosa, para así entender como ellos solubilizan las proteínas y al mismo
tiempo tener algún criterio para elegir cual de ellos utilizar.

1. Los detergentes son pequeñas moléculas anfifíhcas que generalmente presentan una masa molecular entre 200 a 650 dakons

1 (Tabla A. 1. 1). Están formados por una porción polar, o cabeza hidrofilica, y por otra no polar correspondiente a una cola hidrófo-
ba, generalmente una cadena hidrocarbonada alifática (8-12 átomos de carbono) o con grupos aromáticos. Por ser anfifílicos, son
solubles en agua y sin importar si están en alta o baja concentración siempre existen monómeros en solución. En la interfase aire-

1 agua los monómeros tienden a orientarse con su cabeza polar hacia el agua y su cola hidrófoba dirigida hacia el aire; debido a esto
es que cambian las propiedades de superficie de los líquidos polares, como la tensión superficial, razón por la cual también se les
denomina agentes sur-factantes.

u Si se agrega una gota de agua a una pequeña cantidad de detergente sólido, este se disuelve completamente para formar una
solución isotrópica y homogénea que contiene monómeros del detergente ymicelas. La solubilidad de estos surfactantes depende

1 de la concentración y la temperatura. A temperaturas bajo su punto de transición dejan de ser anfifilicos y no se solubilizan enagua.
Charles Tanford (4) definió a las micelas como agregados de monómeros del detergente de tamaño pequeño y de forma entre elip-
soide y esférica. En ellas la porción hidrófoba de las moléculas del detergente se encuentra orientada hacia el centro de la micela y

1 las cabezas polares se ubican en la superficie. Las micelas no deben considerarse como estructuras estáticas, ya que de hecho las
formadas por detergentes cuya porción hidrófoba está compuesta por cadenas hidrocarbonadas están en peFmanente intercambio
con los monómeros en solución. Las micelas se forman cuando la concentración del detergente en la solución alcanza un nivel cri-
tico, la concentración micelar crítica, c.m.c., que es característica de cada detergente. A concentraciones mayores que la c.m.c. las
moléculas del detergente en solución se encuentran como monómeros y formando micelas en un equilibrio dinámico. Bajo la c.m.c.
el detergente se encuentra como monómero; generalmente a estas concentraciones el detergente no es capaz de mantener las
proteínas integrales en solución. La c.m.c. de un detergente es por lo tanto un parámetro importante a considerar en la solubiliza-
ción de proteínas integrales de membranas. Usando detergentes a los cuales se les puede aumentar la cadena alifática, mantenien-
do su grupo polar sin modificar, se ha demostrado que la c.m.c. disminuye por cada grupo CH2 agregado. Existen tablas con los
valores de c.m.c. para la mayoría de los detergentes. Esta información es importante debido al hecho que detergentes que presen-
tan c.m.c. mayores de 3-5 mM son mas fáciles de dializar, lo que permite disminuir la concentración del detergente en el sobrena-
dante donde se tiene la proteína solubilizada. Los monómeros son dializables a través de membranas de diálisis comunes, las mice-

1 las no lo son. Las soluciones formadas con detergentes que presentan baja c.m.c. pueden demorarse semanas en equilibrarse en pro-
cesos de diálisis convencionales. En general estos detergentes no son recomendables en los casos en que se se utiliza un bioensayo
para seguir la purificación, por ejemplo en la incorporación de proteínas en bicapas planas donde la alta concentración del deter-
gente rompería la bicapa. -

La concentración micelar crítica de los detergentes no-iónicos y zwitteriónicos (ver más adelante la clasificación de detergen-
tes) no depende significativamente de la temperatura en los rangos que se utilizan -en bioquímica de membrana. Tampoco el aumen-
to de fuerza iónica o de agentes estabilizantes como el polietilenglicol (PEG) producen gran efecto en la c.m.c. de estos tipos de
detergentes. Sin embargo, el aumento de fuerza iónica disminuye drásticamente la c.m.c. de los detergentes iónicos.

'u
'
tr
_..-J•-.t

u
 Otro parámetro importante relacionado con las micelas es el número de agregación, el cual corresponde al número de monó-
meros que la forman; de este número depende en gran medida el tamaño de ella. El diámetro de la mayoría de las micelas varía
entre 4 a 6 nm. Por ejemplo, micelas formadas por octilglucósido, el mas pequeño de los detergentes no-lónicos, presenta un diá-
metro micelar de 4 nm, en cambio las formadas por Tritón X- lOO (el más grande) presentan un diámetro de 4.8 nm. Estos valores
son similares al grosor de la bicapa en las membranas biológicas. Las micelas de octilglucósido y Tritón X- 100 presentan números
140 monómeros respectivamente. Generalmente junto a la c.m.c. de los detergentes viene indicado el
de agregación de 75-86 y
número de agregación.

MICELAS MIXTAS.
Es importante hacer notar que después de solubilizar con detergente, la proteína de membrana per- 1
manece en solución protegida por un "cinturón" de moléculas de detergente. Estas moléculas interactuan con los segmentos hidró-
fobos de la proteína a través de sus colas hidrófobas, de manera tal que los segmentos transmembranosos de la proteína que esta-
ban embebidos en la bicapa, ahora están aislados por estas moléculas anfifílicas sólo dejando al descubierto las porciones hidrofili-
cas de la proteína (Fig. A. 1 .1.1). Durante la solubilización la concentración del detergente debe ser lo suficientemente alta para que
u
solo una molécula de proteína esté presente por micela. En general se sugiere que la concentración del detergente debe ser por lo

menos el doble de la c.m.c.

u
-----
u
1
1
SI
Figura A.I.l.l.
Esquema de un corte transversal de una micela mixta detergente-fosfolipidOs-
proteína: (hp) segmentos hidrofóbos presentes en la molécula de la proteína. (p)
zonas polares hidrosolubles de la protefna disponibles para interacciones iónicas
del tipo proteina-proteina. (c) zona polar de la proteina cubierta por la cabezas
polares de las moléculas de detergente. (pm) zona polar en la superficie micelar.
Las colas hidrófobas aparecen indicadas como (hm). Las moléculas con cabezas
1
polares rectangulares corresponden a las moléculas de fosfolipidos atrapadas en
el cinturón micelar del detergente.
1
o
4-
u
•
•
1 1
1'
- --

1
Esta organización de una molécula de proteína rodeada en sus segmentos hidrófobos por moléculas de detergente es lo que
se conoce como una micela mixta de detergente-proteína. Las micelas mixtas de este tipo se comportan en solución en forma.simi-
lar a las proteínas globulares solubles y pueden purificarse por los mismos métodos bioquímicos. De hecho los cristales tridimen-
sionales de proteínas de membranas que han sido analizadas por difracción de rayos X, se obtuvieron a partir de micelas mixtas con
•1
octilgiucósido. Estos cristales crecieron a partir de interacciones de las zonas polares hidrosolubles de la proteína, las cuales que- 1
daron al descubierto en la micela mixta.

CLASIFICACIÓN DE DETERGENTES. Existen tres grandes grupos de detergentes según la naturaleza química de la

porción polar de la molécula: detergentes iónicos, no-iónicos y zwitteriónicos (Tabla A.¡.¡.¡). a: Detergentes no-iónicos.
La
u
porción polar de estos detergentes no posee carga y por lo tanto corresponde a una cabeza que siendo hidrofílica presenta una
polaridad intermedia. Ejemplos típicos son los ésteres de monosacáridos y disacáridos como el octilglucósido. En general todos los 1
n-alquilo glucopiranósidos, n-alquilo maltósidos, n-alquilo tiopiranósidos y también los poliésteres lineales como el Triton X-100.
Varios de los detergentes disponibles comercialmente han sido generados para uso industrial y por eso muchos de ellos no pre-
sentan un alto grado de pureza. El ejemplo más conocido es el Triton X-100 el cual corresponde a una mezcla de moléculas simi- 1
lares de detergente. Es importante considerar la pureza de un detergente cuando se desea cristalizar una proteína de membrana.

Los detergentes no-jónicos han demostrado ser en general no denaturantes, y con el uso de ellos, los grupos de Michel y Garavi-
to (véase ref.(2)) lograron obtener los primeros cristales tridimensionales de proteínas de membrana para ser analizadas por difracción
1
de rayos X. Pero quizás la característica más importante a destacar de estos detergentes, es que en presencia de ellos se pueden usar
todos los métodos bioquimicos basados en el principio de separación por intercambio jónico, cosa extremadamente importante pues 1
W MM 1
 1 existen gran cantidad de procedimientos de purificación con estas características, tómese como muestra todos los relacionados con cri
matografia líquida, incluidos los de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). b. Detergentes zwitteriónjcos.

u La porción pol
de estos detergentes está formada por un enlace covalente de naturaleza polar como lo son enlaces formados por N-O o S-O. Tambk
forman parte de este grupo los detergentes que en esta porción polar presentan átomos polarizados unidos por un enlace covalente per

1
además presentan carga neta que los transforma en zwitteriónicos a bajo pH. Quizás los más conocidos en la literatura son el CHAPS
un derivado de este, el CHAPSO, los que presentan una c.m.c. alta por lo cual son fácilmente dializables. Ambos han sido usados exjtc
samente en la solubilización de una gran cantidad de receptores presentes en diferentes membranas biológicas. A excepción de CHAF

u
y CHAPSO, los detergentes de este grupo son considerados más denaturantes y disruptores de la membrana que los no-iónicos. Por s
carácter zwitteriónico y en condiciones de pH adecuadas, es posible en presencia de ellos utilizar todos los métodos bioquímicos d
intercambio iónico para purificar las proteínas. c. Detergentes iónicos. La porción polar de estos detergentes presenta grupos quím

1 cos cargados ya sea positiva o negativamente. A este grupo pertenecen los detergentes que presentan la mayor polaridad dentro de esta
moléculas anfifihicas. Son en general denaturantes, pues tienden a unirse fuertemente a las proteínas introduciéndoles gran cantidad d
grupos cargados. Debido a la gran polaridad de su porción hidrofilica son altamente disociativos de la estructura de la membrana por 1.

u cual son muy eficientes en la extracción de proteínas integrales extremadamente hidrófobas. El tamaño de sus micelas es dependiente d.
a fuerza iónica. Por ejemplo colato y deoxicolato, que son detergentes de este tipo, precipitan a pH cercanos a su punto isoeléctrico po
lo cual su uso está restringido a pH sobre 7 y 7,5. El lauril sulfato de sodio (SDS) es otro ejemplo típico de este grupo y de gran utilidas

1 en electroforesis de poliacrilamida. En este procedimiento bioquímico se hace uso de sus propiedades disociantes, denaturantes y ó
neutralizador de cargas permitiendo neutralizar las cargas de las proteínas solubilizadas y de esta manera separarlas por tamaño al pasar
las a través de tamices de poliacrilamida. En general los detergentes iónicos no son recomendables en aislamientos de proteínas dondi

1. se pretende continuar con estudios posteriores de funcionalidad. En presencia de estos detergentes no es posible utilizar los método:
bioquímicos basados en el intercambio jónico, pues las micelas mixtas detergente-proteínas formadas por ellos presentan una carca eléc-
trica uniforme. Además interfieren con los grupos intercambiadores de las matrices de las resinas neutralizándolas.

1 TABLA A. 1.1.1.

u Tipo de detergente
ANIONICOS (sales sádicas)
Ác. Cólico
c.m.c. (nM) N. de Agregación Peso Molecular (daltons)

14.0 2-4

u
430.6
Ác. 1-Decanosulfónico 32,6 -
2443
Ác. Deoxicolato 5,0 4-10 4146
Ác. Glicocólico 13,0 2,1 487.6
Ác. Glicodeoxicolato 2.0 2,0

1
- . 471,6
Lauril sulfato (SDS) 8.3 62,0 288,5
Ác. Taurocólico 10-15 4,0 5377

CATIÓNCOS (sales de bromuro)

Dodecil-trinietjl amonio 14.0 - 3084
Hexadeciltrimetil amonio 0.026 169 364.5
Tetradecilrimetil amonio 0,28 - 336.4

ZWITTERIÓNICOS

III' CHAPS
CHAPSO
8
8
- lO
II
614,9
630.9
Lisofosfatidilcolina 0.92 18 355.4321.7

NO-IÓNICOS
Nonidet P-40 0,29 - 602.8
Triton X- 100 0.24 140 624.9
n-octil a-D-glucopiranósido 10.0 - 292.4
n-octil B-D-glucopiranósido 25.0 27 292,4
Dgitonina
IL n-decil 13-D_glucopiranósido
-

2.2
60
-
1229.3
320.4

Resumiendo, la elección dé un detergente para solubilizar y purificar una proteína integral de membrana debe estar determi-
nada por un estudio previo detallado de lo que se busca, pensando especialmente en cada etapa. La estabilidad de la proteína es
'u fundamental y en algunas situaciones valdrá la pena sacrificar el rendimiento, extrayendo menos proteína de la membrana a cambio
de usar un detergente menos denaturante. Dentro de lo posible se debe elegir uno con una c.m.c. alta de tal manera que podamos
disminuir su concentración por diálisis. Por último que no interfiera con los métodos elegidos para la purificación. El que cumpla
con todas estas características es el detergente ideal.

II
e
kh
A.1.1.3. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PROTEINAS DE MEMBRANA

En general el procedimiento básico para aislar una proteína de membrana se puede resumir en cinco etapas: (1) aislamiento
de membranas; (2) solubilización de las membranas; (3) aplicación de los métodos de purificación de proteínas; (4) dilución y/o inter-
cambio de detergentes; (5) concentración de la proteína en solución.

La elección del material del cual se aisla la proteína de membrana ha sido el factor determinante en el logro de su purificación. En
todos los casos exitosos la proteína a purificar se encuentra en gran cantidad, siendo en algunos casos extremos el único componen-
1
te proteico de la membrana. Mientras más simple sea la composición de proteínas en la membrana, y más enriquecida esté en la pro-
teína a estudiar, mayores son las posibilidades de éxito en la purificación. Ejemplos típicos presentes en la literatura son: el centro de
reacción fotosintética presente en la membrana plasmática de las bacterias púrpuras Riiodopseudomonas
vindis, el receptor nicotínico de
1
la membrana de la placa eléctrica en el Torpedo, la Ca2*ATPasa de la membrana del retículo sarcoplásmico, la rodopsina de la mem-
brana de los discos del segmento externo de los bastones y la bacteriorodopsina presente en la membrana púrpura del
Halobacterio. 1
Al intentar purificar una proteína de membrana se debe hacer un esfuerzo importante en obtener una buena preparación de
membrana, la cual debe presentar las características anteriormente mencionadas. Esto implica realizar un buen aislamiento de mem- 1
brana a través de los métodos bioquímicós clásicos de fraccionamiento celular. Otro factor determinante ha sido contar con un méto-
do altamente específico para seguir la proteína en las distintas etapas de purificación. Para esto las drogas marcadas radiactivamente
(agonistas, antagonistas activadores, inhibidores, moduladores, etc..) son las sondas ideales, pues permiten a través de ensayos de 1
unión, detectar la fracción enriquecidas en la proteína a aislar. También contar con un ensayo funcional de la proteína ayuda enorme-
mente, ya que otorga información adicional acerca de las características denaturantes del procedimiento utilizado en la purificación
factor extremadamente importante pues las proteínas integrales de membrana por su carácter hidrófobo tienden a formar agregados
en soluciones acuosas o a adoptar conformaciones estructurales que no permiten su estudio funcional.
.1
Solubihzoción
1
Las membranas aisladas se solubilizan incubándolas en presencia de detergente; éste produce una disgregación de los compo-
nentes de la membrana terminando en su ruptura, proceso que depende del tipo de detergente usado y de su concentración. Los
1
lípidos y las proteínas de membrana forman en solución acuosa micelas mixtas de distintos tipos: fosfolípido-detergente proteína-
detergente y fosfolipidodetergente-prOteína. Estas micelas mixtas son las que se aislan en la purificación. El número de moléculas
de fosfolipidos atrapadas en las micelas mixtas depende fundamentalmente de la naturaleza química y dela concentración del deter-
1
gente elegido. A mayor razón detergente/proteína y a mayor concentración de detergente, por ejemplo 20 veces la concentración
micelar crítica (c.m.c.), menor es la posibilidad de encontrar fosfolípidos atrapados en las micelas detergente-proteína. Los trata-
mientos con detergentes potentes como los iónicos o las solubilizaciones por tiempos prolongados con detergentes suaves, tien-
u,
den a remover los lípidos de las proteínas de membrana (delipidar) produciendo a veces su desestabilización y la pérdida de sus

características funcionales en los bioensayos. u

en un
Existen dos protocolos para la solubilización de proteínas de membrana: 1) Solubilización completa desde la membrana
solo paso a altas concentraciones de detergente. Este procedimiento es el adecuado cuando la proteína que se desea estudiar se
encuentra en abundancia o es una de las predominantes en la preparación de membrana. 2) Extracción selectiva de una proteína
particular o grupo de proteínas por solubilización parcial. Este procedimiento utiliza las ventajas del ambiente lipídico y de la acce- SI
sibilidad que se tiene de los distintos componentes de la membrana, ya que unos son más solubles que otros según el tipo de deter-
gente usado. De esta manera se solubiliza selectivamente algunas proteínas dejando en la membrana la proteína que se quiere ais-
u
u
lar, obteniendo así una preparación de membrana enriquecida. Esto es recomendable en los casos en que la proteína a estudiar se
encuentra en menor abundancia, de tal manera de obtener un enriquecimiento. en la preparación de membrana, para continuar en
una segunda etapa con una solubilización total.

En los dos protocolos es necesario tener un control cuidadoso de las condiciones de solubilización (concentración del deter-
gente, razón detergente/proteína, temperatura, tiempo de solubilización, fuerza iónica, etc.). En general la elección de estos proce-
u
dimientos se fundamenta en la experiencia y en la mayoría de los casos ambos protocolos son complementarios.
u
Métodos de purificación

Una vez que se tiene la proteína de membrana solubilizada, es decir estable en solución acuosa, es posible aplicar los métodos u
bioquímicos descritos en la literatura para purificarla. Las proteínas de membrana han sido purificadas utilizando toda la gama de
métodos bioquímicos desarrollados para las proteínas hidrosolubles tales como: -

u
u
u
u
(1) Precipitación selectiva, utilizando sales minerales (KO) o agentes precipitantes como el polietilenglicol.
(2) Separaciones utilizando gradientes de densidades.
(3) Cromatografía líquida de intercambio iónico.

u
(4) Cromatografía líquida por filtración en geles.
(5) Separación en geles de poliacrilamida en presencia de detergente.
(6) Electroenfoque en geles de poliacrilamida.
(7) Cromatografía líquida por afinidad.
(8) Ultrafiltración utilizando filtros yio matrices sintéticas.
1 (9) Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).

u En esta última técnica se incluyen todas las mencionadas anteriormente para cromatografía líquida, pues básicamente los prin-
cipios de separación usados son los mismos, pero desarrollados con mayor rapidez y con una significativo aumento en la resolución

u y eficiencia.

u R EFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

u. 1.Helius, A., McCaslin, D. R., Fríes, E., y Tanford, C. (1981). Properties of detergents. Methods EnzymoL, 56: 734-729.
2. Michel, H. (1 99 1) General and Practica¡ aspects of membrane protein crystallization. In crystallization of membrane proteins., edi-
tor, H. Michel, pag. 73, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.

1 3. Salto. S. y Tsuchiya, T. (1984). Characteristics of n-octyl-a-D-tioglucopyranoside, a new non-ionic detergent useful for membra-
ne biochemistry. Biochem. J. 222: 829-835.
4. Tanford, C. 1980. The Hydrophobic Effect 2nd edn. John Wiley & Sons, New York. USA. 200pp.
¡ S. Zulauf, M. (1991). Detergent Phenomena in membrane protein crystallization, en Crystallization of membrane proteins., editor,

u H. Michel, Pag. 53. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.

1
u A PÉNDICE 1.2.

u. CALORIMETRIA DIFERENCIAL DE BARRIDO'

El principio central de este método termodinámico consiste en calentar simultáneamente en un instrumento de calorimetría
diferencial de barrido una celda con la solución de muestra y otra con la solución de referencia a una velocidad programada, y medir
la diferencia de temperatura entre ellas mediante un circuito control que usa una termopila. Este circuito control suministra calor
extra a una de las celdas si entre ellas se produce una diferencia de temperatura. Inicialmente la temperatura de ambas celdas aumen-
ta linealmente con el tiempo, y la diferencia de temperatura entre ellas es cero. Si en la muestra se produce un proceso endotér-
mico, tal como una transición de fase (lípidos) o denaturación (proteína), es necesario calentar más la muestra para mantener la
diferencia de temperatura entre muestra y referencia igual a cero. Si en la muestra se produce un proceso exotérmico, se produ-
ce la situación inversa. Este calentamiento diferencial se registra en función ya sea del tiempo o de la temperatura. A presión cons-
tante, el calor diferencial corresponde a la entalpía del proceso endotérmico. Del registro es posible obtener los valores de tem-
u. peratura de transición y entalpia de transición del proceso.

Iç Si definimos N como la potencia eléctrica total alimentada a cada celda para aumentar su temperatura en dT en un tiempo dt,
y recordando la definición de capacidad calórica a presión constante, c, como el calor que es necesario suministrar a un sistema
para subir su temperatura en 1 °C, entonces

NcdT/dt (1)

Iii
donde T es temperatura y t es tiempo. Despejando se tiene que el valor de la capacidad calórica de la celda es:

crNdtldT (2)

De estas definiciones podemos expresar la diferencia entre la capacidad calórica de muestra y referencia como Cdi,.

cdl, = cmuest. - cre, = (Nmuest - Nre ) dtldT = Ndlf dtidT (3)

En un instrumento ideal Cdif es cero cuando no tiene lugar una transición endotérmica o exotérmica de un estado a otro. Si
ocurre un transición tanto cdif como Nd! son distintos de cero hasta que se completa la transición.

Supongamos que tenemos una transición cooperativa entre un estado A y un estado 8 1

A
u
Definimos la constante de equilibrio 1< como

K=BIA=eI(l-e) (4) u
donde O es el grado de transición entre A y 8. De esta ecuación sigue que
.1
1
O=K/(l+K) (5)

Para el caso de una transición de fase con una temperatura de transición Tm, la ecuación de van't Hoff define la dependencia
de K con la temperatura T como:

K(T) = K(T,) exp -( AH H IR [IIT -lIT,}) (6)

u
donde HV H corresponde a la entalpia de transición de van't Hoff del proceso. De estas ecuaciones se puede calcular la depen-
dencia de temperatura de cdlf si definimos Cdjf en función de la entalpia de transición molar que se determina calorimétrica-
u
u
mente de los registros experimentales, como:

Cdjf = ¿Hca08/dT) (7)

'
Como la ecuación de van t Hoff nos da la dependencia de K en función de T. y K se relaciona con O, es posible obtener 8 en
función de T; (y por lo tanto, d9IdT) reemplazando 1< por 8 en la ecuación de van't Hoff. Reemplazando el valor obtenido de dO/dT,
u
resulta la ecuación que expresa Cdif en función de T:

Cdjf = (døldT) = AH i ({ 1 + exp[-LSHVH/R( ItT - 1 SI

x exp[-HH/R( ItT - 1 tT)] L\HVH /RT2) (8) u
AH 0, ni de la entalpia de van't Hoff, LHV H
En esta ecuación, no se conocen ni los valores de la entalpia molar de transición
Para encontrar sus valores el primer paso es determinar el calor total asociado a la transición, Aht, lo que se hace midiendo el área
bajo la curva que se genera cuando se mide Ndff versus tiempo, o Cdif versus temperatura, en el intervalo en que tanto N«o cdif
u
difieren de cero.

final T final
u
t

t inicio
dt cdif dT
inicio
(k9)
u
AH,,, si se conoce la concentración de la muestra y el peso
A partir del valor obtenido de M se puede calcular el valor de
molecular de la especie que experimenta la transición. Para una transición cooperativa entre un estado A y uno B, la entalpía de
u
transición AH ,, es mucho menor que LSHV H., por lo cual la razón entre ambas es mucho mayor que uno. En cambio, para un equi-
,
librio completamente no cooperativo esta razón es efectivamente igual a 1. Luego es necesario conocer el valor de AHVH para
u
u
 determinar la cooperatividad del proceso. Para determinar el valor de /HV. H . se utiliza la ecuación que describe la dependencia
d9/dT con T, reemplazando T por T., lo que produce:

(dø/dT)Tm = ¿\HvH /4R(Tm)2 (lO)

de donde

A H, H, = 4R()2 (de/dT)T (II)

De esta ecuación se desprende que la pendiente de la curva experimental de transición a T = Tm, que corresponde al valor d
cdI(HC1,, a T = Tn,, nos da el valor de De este modo, de un experimento calorimétrico es posible obtener los valores d
ambas entalpias de transición, y de la razón entre ellas, el grado de cooperatividad del proceso.

Existe una relación aproximada entre el parámetro experimental definido como AT 112, que corresponde a la diferencia de tem
peratura en que se producen valores de CO iguales a un medio del valor máximo (ver Figura A. 1.2.1), que se aproxima a los valo
res reales con un 10% de error:

LSH V H = 6.9 (T,,)2MT112. (12)

Ib

14
-

12
•noV
/ k ca l

10
Figura A.l.2.l.

-
1aT12 Curva calorimétrica teórica para una transición
endotérmica entre dos estados, calculada con los
d,

siguientes valores: T0, = 3 14K, ¿\H91 = 8.7 kcal/mol

HV H = 1500 kcal/mol. Figura modificada de ref. 1.
4

39 40 41 42 43

Temperatura °C

Recordando' que ¿\G = AH T AS, además de poder determinar los valores de la entalpia de la transición es posible calcular
-

los valores de la enrropia de la transición, ya que a T = Tm, LSG = 0.

AS= AHIT, (13)

Figura A. 1.2.2.
OPPE OSPE DAPE Registros calorimétricos de fosfatidiletanolaminas (PE)
con distintos largos de cadenas, concentración: 1
mg/ml

Sn-! srj-2

ULI Clave: DLPE

DNIPE
12:0
14:0
2:0
14:0
DSPE 18:0 18:0
DAPE 20: 0 20: 0

ii. Figura modificada de ref. 1.

jL 38.8 48.0 50.0 00.0

Temperatura °C
78.8 00.0 90.8

wi
 Al estudiar mediante el método de calorimetría diferencial de barrido las transiciones de gel a liquido-
APLICACIONES. (Fig. A.1.2.2).
cristalino de fosfatidiletanolaminas saturadas, se encontró que al aumentar el largo de las cadenas aumentaba tanto T
st

como la entropía, AS, y la entalpia de transición, AH

del proceso. Corno se formuló en el texto, a igual composición de ácidos gra- 1
para fosfatidilcolinas son menores que para las fosfatidiletanolaminas (Tabla A.1.2.1). En el caso de fosfolipidos
sos saturados las 'r5 TI
cargados, como el ácido fosfatidico, un cambio de pH a un valor en que aumenta la carga de la cabeza polar incide en una menor

(Tabla A.l.2.l).
1
TABLA A. 1.2.1.
Tt (OC) óH (kcallmol) ¿S (callmol °K)
1
so-! sn-2

Fosfatidilcolina
14:0
16:0
14:0
16:0
24,0
41,5
6.5
8,7
10,9
21.9
27,7
23.3
u
18:0 54,3
18:0

u
2,3 37,6
20:0 64,1
20:0 14,9 43.1
22:0 72,5
22:0
FosfatidiletanOlamifla 14.2
30.5 4,3

E
12:0 12:0
6.6 20.4
4:0 49,9
4:0 8.6 25.5
6:0 63,9
16:0 0.5 30.4
18:0 72.5
8:0 2,2 34.5
20:0 81.1
20:0
Ácido fosfatidico
12:0 - 12:0 (pH6)
5,7
11,1
'7,5
•1
14:0 (pH6) 52,2

u
14:0 7,9 23.4
16:0 (pH6) 65.0
6:0 4.1 13.9
14:0(pH12) 22,4
14:0 5.7 17,8
I6:0(ph12) 43.1
16:0
* Sólo se presentan datos para la transición principal. Datos tomados de ref. 1.
u
se encuentra que la T es mayor si en la posi-
En el caso de fosfolipidos con distintas cadenas saturadas en posición sn-I y sn-2,
ción sn-2 se encuentra la cadena más larga (Tabla A. 1.2.2), lo que podría estar relacionado con el empacamiento de las cadenas en u
la bicapa, ya que la cadena en la posición sn-2 tiene un recorrido de mayor longitud.

La adición de colesterol a una bicapa de fosfolípido puro causa un ensanchamiento de la transición, la que a concentraciones u
mayores de colesterol desaparece completamente (Fig. A. 1.2.3).

o
u
•1
0
o
o lkcal K-' . MOV'
u
0 I
o
'o
u
o
Figura A. 1.2.3.
Registros calorimétricos de mezclas de dimiristoil-
1
a
fosfaudiletanolaminalCOlesterol. A: O mol%; B, 5 mol %; C. lO
o
u
a,
'0
mol %: 0, 20 mol %: E, 30 mol %; E, 40 mol % de colesterol.
Figura modificada de ref. 1
u
o

-
a,
u
x
tu
1
1
• 1 ,

30 40

Temperatura aC
50 60 70
1
u TABLA A.12.2.

u Sn-,
Fos!atidilcolina*
6:0
sn-2

12:0
Tt' (CC)

9,6
¿ H* (kcal/moi)

3,4
¿S (callmol K)

120
16:0 14.0 28,0
1 16:0
16:0
16:0
18:0
41,5
48.8
6.4
8.7
10.3
12,0
21,3

u
27,7
16:0 20:0 51,4 11.6 31.3
16:0 22:0 52.1 12.0 35.8
Fosfatdiletanolamina
16:0 16:0 63,9 8,6 25,5
16:0 18:0 69.4 9.6 28.0
.1 16:0 20:0 72.4 11.9 344

u
Datos tornados de ref. 1: *
sólo se dan valores para la transición principal de las fosfatidilcolinas.

u p EFERENCIAs BIBLIOGRÁFICAS

u. A.2. 1.1. Blume. A. (1988). Applications of calorimetry to lipid model membranes, en Physical Properties of Biological Membra-

u
nes and their Functional ImpIications. Editor C. Hidalgo, Plenurn Press, N. York, USA, pp. 71-121.

u
u
u A PÉNDICE 1.3.

RESONANCIA PARAMAGNÉTICA DEL ELECTRÓN

1 Existen tanto núcleos como electrones no pareados que tienen momentos magnéticos distintos de cero, lo que los clasifica
como elementos paramagnéticos. Sólo los elementos paramagnéticos interactúan con los campos magnéticos, dando origen a espec-
li tros de absorción que dependen de la naturaleza del elemento paramagnético. Entre los núcleos paramagnéticos presentes en sis-
temas biológicos están los protones (l H), el 14N, el 191` y el 31p; además se encuentran los isótopos relativamente poco abundantes
(0.2 a 1%) de los elementos más comunes, tales como 2H (deuterio), 13C, 1 SN, y 33 S. Los metales de transición y los radicales libres,
a su vez, presentan electrones no pareados lo que les confiere un carácter paramagnético.

Se define la energía E para un momento magnético 11 en un campo magnético H como el producto escalar entre ambos vectores:

' E -pi .H (1)

Si se orienta el campo magnético H sólo en la dirección z, tal que las componentes de H en las direcciones x e y sean igual a
cero, entonces

1U1 H (0, 0, H5) ; j.t (,

1i, )

y = -. H2 (2)

Para los núcleos, que poseen un spin nuclear 1, se tiene que el momento magnético nuclear li, está dado por:

1k Pnn 13n' (3)

1
 En esta ecuación, los términos corresponden a:

1: spín nuclear, que tiene valores cuánticos.

gn = 5,5855 para un protón libre
la constante de Planck y c la velocidad de la luz.
l3 = eh/47tMc en que M es la masa de un protón, h
1
Para los electrones el momento magnético está dado por:

l.te = -g8S (4) a

En que los términos son:

Si se tiene un campo mag-

a
5: spín del electrón, que en un electrón no pareado puede adoptar sólo dos valores cuánticos, ± ±
2
nético H orientado en z los valores de s son ±
2
1
Por lo tanto:

=± ± g 3, con lo cual la energía del electrón en el campo orientado esta dada por:
a
2
E± ±gBH
2
(5)
•1
Los valores de 13 son las unidades naturales del momento magnético del electrón, que posee una masa
ponden a las constantes de proporcionalidad respectivamente.
m, y los de g corres-
1
13 = eh/ 4itmc y g = 2,0023 para un electrón libre. 1
1836

a
De la definición de 13 se desprende que para un electrón el valor de 13 es mucho mayor que para un núcleo, ya que 13
l3. Como veremos, el entorno del electrón afecta el valor de g.

Para cualquier sistema que absorbe energía de una radiación para pasar de un nivel basal a un0
Condición de Resonancia.
de mayor energía, en que AE corresponde a la diferencia de energía entre ambos nivelés, la condición de resonancia está dada por ¡
la ecuación:

Ehv (6) a
donde y es la frecuencia de la radiación incidente

Resonancia
del núcleo: En el caso de elementos paramagnéticos el spín nuclear 1 tiene valores cuánticos. Por lo tanto, en
± 1/2 g R y E = ± 1I2g f3 H
•,I
un campo magnético orientado en z, silos valores de 1 son ± 1/2, entonces p, =
1
Si 1 tiene más valores, hay más valores de E.

En el caso de los núcleos, la intensidad del campo H puede variar debido al efecto pantalla de los electrones que rodean al a
núcleo, y se produce un corrimiento químico de la línea de absorción.

Resonancia Paramagnética del electrón:

Para un electrón que interactúa con un campo magnético orientado en z, en a
que los dos valores posibles de E son:

E = -l/2g8H1 E = 1/2gl3H (7) a

se tiene que la diferencia de energía. ¿SE, entre el nivel basa¡ y el de mayor energía esta dada por:
1
AE = gI3H = hv (8)

a
E Por lo tanto la condición de resonancia para un electrón libre se obtiene a un valor dado de H y de y. Sin embargo, el entor-
no del electrón afecta el valor de g con lo que la condición de resonancia se puede encontrar a distintos valores de H, como vere-
u mos más adelante

Para los electrones la condición de resonancia se encuentra a dos valores posibles de H y de V. La más utilizada se obtiene

u a H = 3200 gauss, y = 9 x109 I-1, aunque también se produce absorción a H = 12500 gauss y y = 35 x 10 H

Experimentalmente, se varia H (Se aumenta la intensidad del campo) a una frecuencia de microondas y constante hasta encon-

u trar la condición de resonancia.

, ,
Interacción hiperfina. El momento magnético p interactúa con H y con los p de los núcleos vecinos (si los hay), de tal

u , ,
modo que si p es paralelo a H, se suman, y si p es antiparalelo a H, se restan. Si se suman, se alcanza la condición de resonancia
para el electrón a un valor menor de H, y si se restan, a un valor mayor (Figura A.l.3.l).

u H

1
II
1
u H
Figura A. 1.3. 1.
Interacción hiperfina de un electrón con spin S, con dos
diferentes orientaciones de un spín nuclear 1. Modificada
deref. 1.

AborciÓn
hl

ii
/1

Se define una constante A como constante de partición o de separación hiperfina, que refleja la separación de los niveles de
energía a los cuales se produce la condición de resonancia.

En un espectro de ESR

AE = hv = gl3H0 (9)

Donde H. es la intensidad del campo donde está el centro de la línea de absorción y y es la frecuencia de microondas usada.
En el caso de existir interacción hiperfina, la condición de resonancia es AE = hv ± 1/2 Amj, donde m1 son los valores posibles del
spin nuclear.

Nitróxidos: Los nitróxidos son radicales libres estables que se han utilizado como marcadores de spin debido a que tienen un

'u
electrón no pareado que interactúa con el núcleo de nitrógeno. Los espectros que originan los nitróxidos son sensibles a las condi-
ciones del medio. El núcleo del N 1 tiene tres valores para l (-1, 0. + 1). Por lo tanto, debido a interacción hiperfina entre el núcleo
y el electrón no pareado se producen 3 lineas de absorción para el nitróxido. Más aún, el electrón no pareado se localiza esencial-
mente en el orbital pit del núcleo de nitrógeno, lo que les confiere a los nitróxidos una anisotropía intrínseca.

1 Vi
 j)t --
a
—:- -rn
Y- 4)

Hila Figura A. 1.3.2.

Anisotropía espectral de una sonda de spin (tert-
butil nitróxido) orientada en un cristal huésped. Se

Huy
indican los ejes principales de la molécula de
nitróxido. Los espectros corresponden a las
primeras derivadas de los espectros de absorción.
1
Figura reproducida, con modificaciones, de reí. 1.

u
- HIiz

u
g = 2.0036
20G,
•I
Anisotropía Espectral. En el caso de los nitróxidos, que poseen anisotropía intrínsica, la orientación de la molécula, que
define la orientación del electrón con respecto al campo- magnético, influye en los valores de g y en los de A. Si se considera un cris-
1
tal con un nitróxido orientado, es posible ponerlo paralelo o perpendicular al campo H (Figura A. 1.3.2.) y registrar los espectros
resultantes. Si se orienta el cristal de modo que el eje z de la molécula sea paralelo al campo, se encuentra que A,, = 32 Gauss; si
es perpendicular, A = A, = 6 Gauss. Los valores de g correspondientes son:
1
gzz = 2,0'027 gxx = 2.0089 g = 2.006 1.
1
Estos valores se deben a la estructura del nitróxido y representan los casos límites.
1
Figura A. 1.3.3.

Absorción
En la parte (A) se ilustra un dia-
grama esquemático de los espec-
tros de absorción, y de sus prime-
u
ras derivadas, para sondas de spin
de nitróxidos orientadas al azar en
•I
2A
II
todas las direcciones del espacio
(al
(a) y para un espectro de disper-
sión de lípido conteniendo un
nitróxido en una bicapa (b).
En la parte (B) de la figura, se ilus-
u
tran espectros experimentales que

(a)
muestran los distintos tipos de
movimientos de un nitróxido en:
(a) una solución congelada. en que
u
(b)
la sonda de spin tiene todas las
orientaciones espaciales y ningún
movimiento y sólo es posible
1
determinar la separación de los
extremos: (b) una dispersión de
lípidos en solución acuosa (bicapa.
con simetría axial que permite
u
k1 determinar A11 y Al), y (c) una solu-
ción no viscosa, en la cual la sonda
puede moverse libremente, lo que
origina un espectro isotrópico.
u
u
200
'oc Modificada de ref. 1.
(a)
1 Si se tiene un sólido amorfo, se tendrían todas las situaciones intermedias (Fig. A. 1.3.3). En general, si se tiene simetría
axial los valores de A y de g experimentales dependerán de la orientación promedio, con un ángulo e respecto al campo, d

1' modo que:

g2e = g2 cos28+ g 21 sen29 (lO)

1 A20 = A2,1 cos20 + A2, sen20 (II)

Para el caso isotrópico, tal como el que presenta una molécula pequeña en un medio no viscoso, en que los rápidos movi-

1 mientos moleculares causan una pérdida de la anisotropia, se tiene que:

u A0 = 1/3 (Aa

g0 = 113 (g
+

+
Ayy + A)

gxx + g)
(1 2)

(13)

u Para el caso en que existe simetría axial (bicapas de lipidos)

A.Al,
1
gzz = g, 9XX = g)7 = g

u. De donde:

u A0 = 1/3 (A11

go = 1/3 (g
+

+
2A1)

2 g)
(14)

(15)

i Se define al parámetro de orden S, en el caso que exista simetría axial, como:

S = 1/2 (3 <cos2 8> -1) (16)

1 -

si O = O, S =

1 Los espectros de nitróxidos son sensibles a la polaridad del medio. Para corregir por este factor, se define el valor del pará-
metro de orden en función de los valores experimentales de Al, yA1 (ver figura A. 1.3.4):

i S = a0 (Al, A,)/ a1 (A
- - A) (17)

.4 - 66
Figura A. 1.3.4.
La parte superior de la figura
ilustra la orientación de los
A32G EJ. longitudinal
eles del nitróxido unido coya-
lente al carbono 12 del ácido
OH esteárico. La parte inferior
N .1 ilustra el movimiento aniso-
trópico de un nitróxido unido
covalentemente a un ácido
graso de un lipído en una
t. membrana. El eje z principal
del nitróxido (A = 32 gauss)
está orientado a lo largo del
eje de la molécula de ácido
graso. El ele paralelo se consi-
dera normal a la superficie de

u .; la bicapa. Los movimientos en

torno a este eje dan origen a
las separaciones hiperfinas Al¡
y Al-Modificada de ref. 1.

1L1
ELA
donde a0 = 113 (A55 + A, + A 1)

a1 = 1I3 (Al, + 2A1).

de 32 gauss y 6 gauss. respectivamente

Si reemplazamos por los valores de A55, A, y A55

Al) / (Al, + 2A1) (18)

S = 1,69 (Al, -

Si se tiene el caso limite del cristal orientado con un nitróxido incorporado con el eje z paralelo a H, entonces

A5 Al, =32G y A=A» =A1=6G.

Si reemplazamos estos valores en la ecuación, obtenemos un valor de S = 1, correspondiente a máxima orientación.

Si se tiene el caso isotrópicO. entonces.

Al, =A1 y = O.

La tabla A. 1.3.1. ilustra cómo varia el valor de 5 a medida que exploramos desde la superficie al centro de una bicapa de lípi-
dos, e ilustra claramente la gradiente de flexibilidad que existe en bicapas. En la tabla se puede también apreciar como disminuye
el valor de la constante de separación hiperfina desde la superficie al seno de la bicapa, en que el ambiente en torno a la sonda se

hace más hidrófobo.

spín. de fosfotidilcolina en dispersiones

y constantes de separación hiperfino (A) poro sondas de
TABLA A.11.3.1. Parámetros de orden
acuosas de fas fatidilcolina de huevo.
A Gauss
Parámetro de orden, S
Posición del Nitróxido
15.0
0,547
C5 .4.9
0,468
C7 14,1
0,343
dO = 135
<0.3
C12
ue se indica del ácido palmitico, que a su vez está en la posición sn-2 de la molécula de los-
* El grupo nitróxido se encuentra unido al carbono q
fatidilcolina. Datos tomados de referencia 1

R EFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

A.3.1.1. Knowles, P.F., Marsh. D. y Rattle. H.W.E (1 976) Magnetic Resonance of Biomolecules. John Wiley & Sons. London, England.