BIOCATÁLISIS

TEMA: POLARIDAD CROMATOGRAFÍA

GRUPO: BIOC_04_01

EQUIPO 3

Integrantes Firma

● Cruz Olazo Carlos Alberto ______

● Cruz Vera Chelsea ______
● Daniel Aragón Edilberta ______
● Escudero Ramírez Said Audiel ______
● Trejo Contreras Alicia ______
● Waldo ….. Brandon ______

FECHA: 12-FEBRERO-2019
INTRODUCCIÓN

La purificación de enzimas es un proceso que permite aislar la enzima deseada de una mezcla
compleja, eliminando una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas,
ácidos nucleicos, toxinas y restos celulares. La purificación de enzimas es necesaria para la
caracterización de la función, estructura e interacciones de la proteína de interés.
Durante una purificación se requiere de: recuperar la mayor cantidad de proteína, la mayor
actividad catalítica y lograr el mayor grado de pureza (Introduction to Affinity
Chromatography).

El material inicial es generalmente un tejido biológico (plantas o animales) o un cultivo

microbiano, existen varios pasos en el proceso de purificación; puede liberar a la proteína de
la matriz que lo confina, separar las partes proteica y no proteica de la mezcla, y finalmente
separar la proteína deseada de todas las demás. Este último paso puede ser el aspecto más
laborioso de la purificación de proteínas, donde se pueden emplear diferentes métodos de
purificación. Al término de la aplicación de cada método se toma en cuenta la purificación
enzimática.
Cuando una purificación enzimática llega a una etapa donde posteriores pasos no tienen un
incremento en la actividad específica, se realizan métodos analíticos para saber la
homogeneidad y pureza de la preparación obtenida. Puede utilizarse electroforesis,
ultracentrifugación, focalización isoeléctrica entre otras, para así obtener un único pico
proteico que es indicativo de homogeneidad (Introducción to Affinity Chromatography).
Juzgar si un método es el adecuado para la purificación se realizan cálculos del rendimiento
en el que se considera las unidades enzimáticas totales de la etapa inicial a un 100% para así
calcular el rendimiento de cada etapa y del grado de purificación que alcance parte del valor
de actividad específica que se alcanza en cada paso. (Janson, Jan-Christer, 2011)

Los métodos a elegir dependen de la fuente biológica y de la concentración de la enzima, eso

se basa en las diversas propiedades fisicoquímicas de las proteínas, la consideración más
importante en el desarrollo de un esquema para purificar, es la aplicación que se pretende dar
a esa proteína, tanto la cantidad como la calidad deben ser suficientes para el análisis
experimental, para ello existen distintos métodos como: solubilidad (sales para separar
elementos proteicos), carga (cromatografía de intercambio iónico), polaridad (cromatografía
de intercambio hidrofóbico), tamaño molecular(cromatografía por filtración gel) y
especificidad (cromatografía de afinidad). Se debe tener en cuenta el comportamiento de la
proteína, ya que se requiere del correcto plegamiento de la misma para poder estudiarla.
Durante la purificación y almacenamiento de la proteína, pueden ocurrir muchos procesos que
afecten su calidad: desnaturalización, agregación, degradación y pérdida de función. Un
planeamiento cuidadoso que permita purificar la proteína tan rápido como sea posible y bajo
las condiciones que más promueven la estabilidad de la proteína maximizará las chances de
realizar una purificación exitosa. (Janson, Jan-Christer, 2011)
DESARROLLO

Polaridad (Cromatografía de interacción hidrofóbica)

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es una de las principales técnicas
utilizadas para la separación y purificación de proteínas en procesos biotecnológicos. En HIC,
las proteínas se unen reversiblemente a ligandos hidrofóbicos que se encuentran
inmovilizados en el soporte cromatográfico, debido a la presencia de una elevada
concentración de sal. La elución se logra disminuyendo la fuerza iónica en la fase móvil,
formando un gradiente decreciente en el caso de las proteínas debido a la relevancia
biotecnológica de HIC, se han hecho esfuerzos para determinar de qué forma las
características y las condiciones de operación del sistema afectan el perfil de elución y el
tiempo de retención de estas. Se ha logrado establecer que las principales variables de proceso
son el tipo y la concentración máxima de sal utilizada para formar el gradiente de elución y el
tipo de matriz cromatográfica, mientras que de las propiedades de las proteínas, la más
importante sería la hidrofobicidad. Se han desarrollado diferentes modelos para describir y
predecir el tiempo de retención de proteínas en HIC, basados tanto en las propiedades de las
proteínas como también en las características del sistema cromatográfico.

Es uno de los métodos de purificación de macromoléculas biológicas más utilizado,

especialmente para proteínas que se consideran terapéuticas (Handbook GEb, 2006).
Las interacciones hidrofóbicas son las fuerzas no covalentes más importantes que pueden
estar relacionadas con diferentes procesos, como la estabilización de la estructura de las
proteínas, la unión de enzimas a un sustrato y el replegamiento de proteínas. Este tipo de
interacción aparece cuando compuestos no polares son colocados dentro de un ambiente
acuoso (Handbook GEa, 2004).
La matriz o fase estacionaria en HIC presenta pequeños grupos no-polares unidos a
estructuras de polímeros hidrofílicos. Por lo tanto, existen varios tipos de fases estacionarias
en HIC que pueden diferir en la naturaleza química del ligando, las superficie o concentración
del ligando sobre el soporte, la naturaleza química y el tamaño de partícula del soporte base.

CONCLUSIÓN

La aplicación del método de polaridad (cromatogafia de interaccion hidrofobica) y otros

métodos han sido de gran utilidad para la purificación de proteínas, sin embargo aún hay
algunos isómeros conformacionales que es muy complicado aislar, hasta la fecha es un tema
de estudio donde el biotecnologo debe profundizar más acerca de los métodos empleados para
la purificación e ingeniar nuevas estrategias para mejorar las técnicas de purificación en
cuanto a la resolución óptima.
BIBLIOGRAFÍA:
Janson, Jan-Christer. “Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and
Applications”. 3a Edición. Vol 54. Editorial Wiley. EUA, 2011.

“Introduction to Affinity Chromatography” Obtenido 9 de Febrero en el sitio web de

laboratorios Bio-Rad: http://www.biorad.com/es-mx/applications

Handbook GEb. (2006). Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography:

Principles and Methods. GE Healthcare. Uppsala Sweden.

Handbook GEa. (2004). Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing: Principles and
Methods. GE Healthcare. Uppsala Sweden.