UNIVERSIDAD DE C

GUANAJUATO

Cuantificación,
separación, purificación y
electroforesis de Proteínas
y Actividad Encimatica

LABORATORIO DE ESTRUCTURA DE
BIOMOLECULAS Y CINETICA ENZIMATICA
DOCENTE: LUIS FELIPE PADILLA VACA

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 OBJETIVO
Realizar pruebas de caracterización, cuantificación y purificación de proteínas, así como
evaluar la actividad enzimática bajo diversas condiciones.

INTRODUCCIÓN
HISTORIA DE LAS PROTEÍNAS
El papel central de las proteínas en los organismos vivos no se aprecia plenamente hasta
1926, cuando James B. Sumner mostró que la enzima ureasa es una proteína. La obtuvo a
partir de una semilla de un tipo de judía gigante que se sabía contenía actividad capaz de
degradar urea.

La primera secuencia de proteínas se descubrió por Frederick Sanger en 1949, quien ganó
el Premio Nobel por este logro en 1958. Demostró que la insulina y todas las proteínas en
general son uniones de largas cadenas formadas por secuencias - sucesiones lineales - de
aminoácidos. La naturaleza de las proteínas había suscitado un intenso debate en la
comunidad científica durante las décadas precedentes, por lo que afirmar que estaban
formadas por secuencias generó un impacto considerable. Y solo seis años después, en
1955, Sanger sorprendió al mundo publicando la secuencia completa de la insulina.

Las primeras estructuras de proteínas resueltas son la hemoglobina y la mioglobina, por Max
Perutz y Sir John Cowdery Kendrew, respectivamente, en 1958. Mediante la introducción de
átomos de metales pesados con elevada densidad electrónica con intensa capacidad de
refracción en las moléculas de las proteínas globulares, se obtuvieron estructuras
tridimensionales de diversas proteínas de este tipo hasta una resolución de 6 Å, incluso de 2
Å. La primera información importante se debió a los estudios que realizaron Kendrew y sus
colaboradores sobre la mioglobina de cachalote. La mioglobina es una proteína globular
relativamente pequeña que contiene una sola cadena polipeptídica, constituida por 153
restos aminoácidos.

CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Las proteínas se dividen en dos clases principales basándose en su composición: proteínas
simples y proteínas conjugadas.

Las proteínas simples son aquellas que por su hidrolisis producen solamente aminoácidos,
sin ningún otro producto principal, orgánico o inorgánico. Contienen habitualmente 50% de
carbono, 7% de hidrogeno, 23% de oxígeno, 16% de nitrógeno y de 0-3% de azufre.

Las proteínas conjugadas son aquellas que por hidrolisis producen no solamente
aminoácidos, sino también otros compuestos orgánicos o inorgánicos. La porción no
aminoácido de una proteína conjugada se denomina grupo prostético. Las proteínas
conjugadas pueden clasificarse de acuerdo con la naturaleza química de sus grupos
prostéticos. Teniendo así nucleoproteínas y lipoproteínas, las cuales contienen ácido
nucleicos y lípidos, respectivamente, así como fosfoproteínas, metaloproteínas y
glucoproteínas.
Según su conformación.

a) Proteínas globulares (esferoproteínas):

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Estas proteínas no forman agregados. Las conformaciones principales del esqueleto
peptídico incluyen la hélice, las láminas y giros. Estas proteínas tienen función metabólica:
catálisis, transporte, regulación, protección…Estas funciones requieren solubilidad en la
sangre y en otros medios acuosos de células y tejidos. Todas las proteínas globulares están
constituidas con un interior y un exterior definidos. En soluciones acuosas, los aminoácidos
hidrofóbicos están
usualmente en el interior de la proteína globular, mientras que los hidrofílicos están en el
exterior, interactuando con el agua.

b) proteínas fibrosas (escleroproteínas):

Estas proteínas son insolubles en agua y forman estructuras alargadas.

Se agregan fuertemente formando fibras o laminas. Usualmente son ricas en aminoácidos

modificados. Ejemplos de estas proteínas son la queratina y el colágeno.

Debido a sus funciones, se pueden clasificar en:

1.Catálisis: Está formado por enzimas proteicas que se encargan de realizar reacciones
químicas de una manera más rápida y eficiente.

2.Reguladoras: Las hormonas son un tipo de proteínas las cuales ayudan a que exista un
equilibrio entre las funciones que realiza el cuerpo. Tal es el caso de la insulina que se
encarga de regular la glucosa que se encuentra en la sangre.

3.Estructural: Este tipo de proteínas tienen la función de dar resistencia y elasticidad que
permite formar tejidos, así como la de dar soporte a otras estructuras.

Este es el caso de la tubulina que se encuentra en el citoesqueleto.

4.Defensiva: Son las encargadas de defender al organismo.

5.Transporte: La función de estas proteínas es llevar sustancias a través de todo el organismo

donde son requeridas. Proteínas como la hemoglobina que lleva el oxígeno por medio de
la sangre.

6.Receptoras: Este tipo de proteínas se encuentran en la membrana celular y llevan a cabo

la función de recibir señales para que la célula pueda realizar su función. La acetilcolina
que recibe señales para producir la contracción.

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 -Catálisis

-Defensiva

DISTRIBUCIÓN EN LA NATURALEZA

Las proteínas se encuentran el protoplasma de todas las plantas y animales. Las proteínas
de diferentes plantas y animales difieren entre sí. Por ejemplo, las proteínas de musculo,
hígado y sangre difieren en composición y propiedades, esto es un reflejo de las diferentes
funciones que tienen en distintas partes del cuerpo. Las plantas pueden sintetizar proteínas
a partir de dióxido de carbono, agua y compuestos inorgánicos nitrogenados. Los animales
no son capaces de sintetizar proteínas a partir de sus elementos y, por lo tanto dependen
de las plantas para el aprovisionamiento de proteínas.

En la naturaleza existen unos 80 aminoácidos diferentes, pero de todos ellos, sólo unos
veinte forman parte de las proteínas. Muchos de estos aminoácidos son polares sin carga y
polares con carga.

Los aminoácidos que un organismo no puede sintetizar y, por tanto, tienen que ser
suministrados con la dieta, se denominan aminoácidos esenciales; y aquellos que el
organismo puede sintetizar se llaman aminoácidos no esenciales. Para la especie humana
son esenciales ocho aminoácidos: treonina, metionina, lisina, valina, triptófano, leucina,
isoleucina y fenilalanina. Puede añadirse la histidina como esencial durante el crecimiento,
pero no para el adulto

Entre los alimentos de origen animal con buena calidad de proteína está el huevo (la
proteína de éste es tan buena que se utiliza como parámetro de comparación con otros
alimentos), pescados, carnes de vacuno, aves, y lácteos. Estas fuentes de proteína además
son de alto valor biológico ya que aportan todos los aminoácidos esenciales.

Con respecto a las fuentes vegetales, tenemos principalmente a las legumbres, cereales,
frutos secos y algunas semillas con un buen aporte de proteínas, aunque con aminoácidos

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limitantes. Las únicas fuentes vegetales que existen y tienen una proteína completa (con
todos los aminoácidos esenciales) son la quínoa, la soya.

IMPORTANCIA BIOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS

Las funciones biológicas de las proteínas son muy variadas:
Algunas proteínas transportan sustancias, por ejemplo, la hemoglobina de los glóbulos rojos
en los vertebrados lleva el oxígeno desde los pulmones a todas las partes del organismo,
mientras que en los invertebrados el transporte de oxígeno lo realiza otro tipo de proteínas,
las hemocianinas.

HEMOCIANINA
HEMOGLOBINA

Las proteínas también son necesarias para construir los tejidos y así formar los huesos, los
tendones y la piel. En los músculos hay dos proteínas, la actina y la miosina, que son
indispensables para la contracción muscular.

Numerosas proteínas desempeñan funciones muy importantes para el organismo. Así,

por ejemplo, muchas hormonas son proteínas y controlan diferentes procesos, como el
crecimiento o la cantidad de glucosa en sangre; las enzimas son también proteínas y
regulan la velocidad con que se producen las reacciones químicas en las células.

Algunas proteínas participan en la coagulación de la sangre de los vertebrados; otras,

como los anticuerpos, tienen una función de defensa muy importante y nos ayudan a

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luchar contra los microorganismos. Las proteínas también pueden ser utilizadas como
fuente de energía, aunque en menor proporción que los hidratos de carbono o las grasas.

IMPORTANCIA BIOMEDICA DE LAS PROTEINAS

Deficiencia de las proteínas

La deficiencia crítica de proteína es causa de enfermedad y muerte. Puede conducir a la
anemia, por lo que afecta el transporte de los gases respiratorios por la sangre y como
consecuencias la respiración aerobia y con ello la obtención de energía metabólica
necesaria en los procesos anabólicos,
esto incide en el desarrollo de la actividad nerviosa superior, lo que provoca cierto grado
de retraso mental. También la deficiencia de proteínas puede ocasionar debilidad
muscular, de la función inmune, se afecta la regulación de las funciones y la catálisis
biológicas necesaria en las reacciones del metabolismo celular, lo que se expresa
finalmente en retardo del crecimiento y desarrollo y en el mal funcionamiento del
organismo como un todo.
Exceso del consumo de proteínas
El exceso de proteínas es digerido y se convierte en azúcares o ácidos grasos. La función
hepática retira el nitrógeno de los aminoácidos y se incorpora a la urea que es excretada
por los riñones, afectando la función renal, esto provoca, además
disfunción hepática debido al incremento de residuos tóxicos, lo que puede ocasionar
también reacciones alérgicas. Por otra parte, el consumo excesivo de proteínas en la dieta
causa la pérdida progresiva de calcio corporal, lo que conduce a la fragilidad de los huesos
y la pérdida de masa ósea a largo plazo.

Enfermedades asociadas con defectos en proteínas estructurales

Se han identificado más de 150 mutaciones patogénicas en el ADNmt localizadas en los
genes codificantes de proteínas del sistema OXPHOS. Por ejemplo;

Síndrome de Marfan: Es una enfermedad rara del tejido conectivo, que afecta a distintas
estructuras, incluyendo esqueleto, pulmones, ojos, corazón y vasos sanguíneos. Se
caracteriza por un aumento inusual de la longitud de los miembros.

Esta enfermedad se asocia al gen FBN1 del cromosoma 15. El FBN1 que codifica una
proteína llamada fibrilina, que es esencial para la formación de fibras elásticas del tejido
conectivo es el responsable del ensamblaje de las redes de microfibrillas que, junto con la
elastina, forman parte de la matriz extracelular de los tejidos. Sin el soporte estructural de las
fibras elásticas, muchos tejidos presentan una debilidad que puede conducir a distintas
consecuencias como rotura de paredes arteriales, formación de aneurismas,
megalocórnea, aracnodactilia, etc.

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 IMPORTANCI A INDUSTRIAL DE LAS PROTEÍNAS

Aunque muchos metabolitos se obtienen a partir de microorganismos no modificados por

ingeniería genética, la incorporación de esta metodología permitió optimizar la eficiencia
del proceso de producción y/o la calidad de los productos. Por un lado, fue posible
modificar el control de vías metabólicas, por ejemplo, para la sobreproducción de
aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, etc., y por otro, permitió fabricar proteínas bajo
la forma de proteínas recombinantes. Las ventajas que presenta la producción de una
proteína como proteína recombinante son varias:

1.- Permite obtener proteínas humanas, o de cualquier origen, en organismos fácilmente

cultivables.
2.- Se obtienen grandes cantidades del producto, de una forma más fácil y sobre todo
reproducible, en comparación con el obtenido por extracción a partir de su fuente natural
(en el caso de la insulina, se obtenía a partir de páncreas de animales).

3.- Se obtienen productos libres de patógenos y otros riesgos potenciales. Esto es

particularmente importante en el caso de los productos farmacéuticos, ya que de esta
manera se evita el contagio de enfermedades como el SIDA y la hepatitis B o C por empleo
de hormonas o factores derivados de sangre u órganos humanos. Por ejemplo, los factores
de coagulación o la hormona de crecimiento pueden administrarse libres de
contaminación como proteínas recombinantes, en lugar de proteínas purificadas de sangre
e hipófisis humanas, respectivamente.

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4.- Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza, como los anticuerpos de
cadena simple, útiles en el diagnóstico y tratamiento de algunas enfermedades.

Para producir proteínas recombinantes se usan principalmente bacterias, hongos y células

de mamífero genéticamente modificadas. Sin embargo, hay sistemas alternativos que
podrían abaratar mucho los costos de producción, como las plantas y los animales
transgénicos, pero los métodos y sus productos están aún en etapas de desarrollo o
evaluación.

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Estabilidad
Las proteínas en su estado nativo son estables y se puede definirse como la diferencia de la
energía libre en éste estado como en su estado desnaturalizado o desplegado, sin
embargo no son estructuras rígidas sino que son flexibles. Basta con la ruptura de algunos
enlaces no covalentes se puede modificar su conformación.

Solubilidad
Se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y débiles estén presentes si se aumenta
la temperatura y el pH, se pierde la solubilidad.

Capacidad electrolítica
Las proteínas tienen una capacidad electrolítica debido a su carga neta y se puede
determinar mediante electroforesis; técnica analítica en la cual si las proteínas se trasladan
al polo positivo es porque su molécula tiene carga negativa y viceversa.

Especificidad
Es la propiedad más característica de las proteínas. Se muestra a diversos niveles, siendo los
más importantes la especificidad de función y la especificidad de especie.

Amortiguador de pH
Actúan como amortiguadores de pH debido a su carácter anfótero, es decir, pueden
comportarse como ácidos (donando electrones) o como bases (aceptados electrones). Si
el pH es menor al punto isoeléctrico del aminoácido captará protones cargándose
positivamente.

Desnaturalización
Consiste en la rotura de los enlaces que mantienen el estado nativo de la molécula,
perdiéndose las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Los enlaces peptídicos
permanecen, por lo que la proteína conserva su estructura primaria y pasa a adoptar una
forma filamentosa. La conformación nativa es la conformación más estable de una
proteína plegada, y tiene la menor energía libre a partir de los enlaces no covalentes entre
los aminoácidos y cualquier grupo prostético, y entre la proteína y
su entorno. La desnaturalización puede estar provocada por cambios en el pH o en
la temperatura, o bien por el tratamiento con sustancias desnaturalizantes, como la urea.
Las proteínas desnaturalizadas también pierden su actividad biológica. Además, la proteína
desnaturalizada suele precipitar, ya que las atracciones entre los grupos hidrofóbicos, que
en la proteína nativa estarían encerrados en el interior de la molécula los hacen
agruparse entre sí. En determinadas condiciones, la desnaturalización puede ser
reversible.

Fuerza iónica

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Al colocar una proteína en una solución con una concentración excesiva de sales, la
proteína precipita, de manera que se produce una concentración por salado, ya que la
sal secuestra la capa de agua más próxima a la proteína, provocando así que esta
precipite. En ocasiones una concentración de sales baja puede favorecer la solubilidad de
la proteína.

METODOS DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS

Reacción de Biuret
Esta compuesto por hidróxido de potasio, sulfato cúprico y tartrato de sodio y potasio. El
hidróxido de sodio se utiliza para alcalinizar el medio, ya que esta condición es
indispensable para que se de la reacción.
Las sustancias que reaccionan con las proteínas es el sulfato cúprico, mientras que el
tartrato de sodio tiene como función no permitir la formación de hidróxido de cobre, el
cual tiende a precipitar e interfiere en la reacción.

Reacción de Xantroproteica
La prueba resulta positiva en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos
con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de
tirosina.
Esta reacción se puede considerar como una SEA de los residuos de tirosina de las
proteínas por el ácido nítrico

Reacción ninhidrina
El grupo alfa-amino de los aminoácidos forman complejos coloreados con las ninhidrinas:
Violeta azuloso en la mayoría de os aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo
para la prolina e hidroxipolina.

Reacción de Millón
El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de mercurio a
pH ácido, formando complejos color rojo amarillo con el anillo fenólico de la tirosina y las
proteínas que la contienen.

MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

Cromatografía de intercambio iónico.

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la
fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble
lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que
pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa
con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que
contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten
con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.
FUNDAMENTO El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las
moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que
dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La

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separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la
primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que
originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con buffers de
diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con el
material por los sitios de unión.
R + A - es un intercambiador aniónico en la forma A - y B - representa a los aniones en la
disolución.

PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS

Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos.
La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir,
hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que están cargadas positiva o
negativamente. Por lo tanto, si una proteína es estable a valores de pH por encima del
punto isoeléctrico, se debe utilizar un intercambiador anicónico. Si es estable a valores de
pH situados por debajo del punto isoeléctrico, debe utilizarse un intercambiador catonice.
INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas que unen
aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de
aniones. Los intercambiadores débilmente básicos más corrientes son los grupos aminos
alifáticos o aromáticos.

INTERCAMBIADOR CATIÓNICO: Los intercambiadores catónicos son portadores de grupos

con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo típico que se utiliza
en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se
dice que el intercambiador se encuentra en forma ácida y puede, por ejemplo,
intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca+2. El grupo ácido sulfónico es un
intercambiador de cationes fuertemente ácido. Otros grupos de utilización corriente son el
carbonilo e hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos débilmente ácidos.

Los polianiones y policationes se unen a los intercambiadores de aniones y de cationes. Sin

embargo, las proteínas y los polielectrolitos (polímeros poliionicos) que son portadores de
cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los
de aniones, dependiendo de su carga neta. La afinidad con la que un polielectrolito
concreto se une a un cambiador ionico determinado depende de las identidades y de las
concentraciones de los demás iones presentes en la disolución, debido a la competencia
entre los diversos iones por los sitios de unión sobre el intercambiador iónico. Las afinidades
de unión de los polielectrolitos portadores de grupos ácidos-base dependen también, en
gran medida, del PH ya que sus cargas netas varían con dicho valor.

La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso más corriente son el
dextrano, la celulosa, poliacrilamida, copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los que
el divinilbenceno contiene los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de
poliestireno. La elección entre intercambiadores fuertes o débiles está basada en el efecto
del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografía una sustancia
débilmente ácida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionización, se requiere un
intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos. No obstante, si la sustancia
es lábil, es preferible la utilización de intercambiadores débiles. Los intercambiadores débiles
son también excelentes para la separación de moléculas con una carga elevada de
aquellas con poca carga, debido a que los iones débilmente cargados no se unen, por lo
general, al intercambiador. Permiten, asimismo, una mayor resolución de las sustancias si las
diferencias de carga son muy pequeñas.

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 SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR.
La cromatografía es una técnica que permite la separación de moléculas diferentes
presentes en una misma muestra. El método está basado en la circulación de una fase móvil
(que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a través de una fase estacionaria.
Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos
presentes en la mezcla resultará su separación. La cromatografía de exclusión molecular (a
menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más
sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de
cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se
fabrican con este fín y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados
(sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles
(fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (particulas) de un material esponjoso
hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado.

Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una
columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de
los poros de las particulas, sólo podran moverse en su camino, a través de la fase
estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán
retrasadas en su descenso. En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las
partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor
sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden
decreciente de tamaño molecular.

Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las particulas de menor masa molecular.
De ahí que las particulas de mayor peso molecular salgan primero.
Diferentes comportamientos dentro de la columna.

Cromatografía de afinidad.
De entre todas las técnicas cromatográficas, la Cromatografía de Afinidad (AFC) ofrece la
mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y purificación de biomoléculas.
Esta técnica se basa en interacciones bioespecíficas gracias a las cuales la columna de
AFC absorbe únicamente de la muestra los componentes que presentan afinidad con los
ligandos acoplados al soporte cromatográfico. Cuando el compuesto retenido es eluido,
se consiguen niveles de pureza extraordinarios, gracias a la elevada selectividad de estas
interacciones de afinidad.

Toso ofrece una amplia gama de columnas analíticas y preparativas, así como relleno, con
una amplia variedad de ligandos específicos y grupos funcionales químicamente activos.

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Toda la gama toma como base el relleno polimérico TSKgel G5000PW, de 1000 A de tamaño
de poro. Esto permite abordar la purificación de biomoléculas de hasta 5.000.000 Da.
Además, estas resinas poliméricas son química y físicamente estables, siendo resistentes a
los ataques microbianos, dimensionalmente estables frente a los cambios de pH y
compatibles con muchos disolventes orgánicos. Además, en muchos casos, la resina es
autoclavable y permite su lavado con soluciones de 0.5M NaOH.

Electroforesis de proteínas y tipos de soportes.

Electroforesis: Cuando una mezcla de moléculas ionizadas es colocadas en un campo
eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga
opuesta, así, las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo
negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo
positivo).

Fue empleado por primera vez por A.Tiselius en 1937.

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales: la
fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone y
por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano
debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión.
La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor
temperatura mayor difusión.

Tipos de soportes:
a. Papel: En desuso

b. Acetato de celulosa: Ventajas: presenta poca adsorción, necesita cantidades pequeñas

de muestra, porosidad uniforme, transparente, sin contaminantes y resultados precisos.
Inconvenientes: débil resolución y electroosmosis. Se ha quedado obsoleta.

c. Gel de agarosa: Es un polisacarido, cuyas disoluciones poseen la propiedad de

permanecer liquidas por encima de 50º C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel
está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en
gran cantidad de medio líquido. El tamaño de poro no opone impedimento al paso de las
moléculas (soporte no restrictivo tipo I).

d. Gel de poliacrilamida (PAGE):

•Es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis, ya que es con el que mejor se
logra separaciones electroforéticas.
•Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma
rápida y reproducible.
•Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente
no iónicos y que permite buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado.
•Tiene la ventaja que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada el tamaño del poro.
•El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas (soportes restrictivos tipo II),
ya que el tamaño del poro es similar al de las proteínas, de tal modo que existe un efecto
de tamizado molecular y la separación electroforética depende de la densidad de carga
de las moléculas y de su tamaño.

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e. SDS-PAGE:
•Se fundamenta en eliminar las cargas de las proteínas por tratamiento con SDS
(sodiododecilsulfato) que las desnaturaliza y se fijan a el, tomando carga neta negativa.
•La migración de los derivados proteína-SDS hacia el ánodo es inversamente proporcional
al logaritmo de su PM. La relación carga/masa es aproximadamente igual para todas las
proteínas de la muestra, por lo que el tamaño de esta es un factor determinante de la
separación.
•La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y monitorizar las
proteínas durante un proceso de purificación y para la determinación del PM de las
diferentes subunidades proteicas.
•La electroforesis convencional ha sido y continúa siendo de gran utilidad; sin embargo,
este tipo de separación electroforética es lenta, la boriosa, poca reproducibilidad, difícil de
automatizar, y además no proporciona resultados cuantitativos precisos.

OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS Y COMPONENTES CELULARES PARA SU CUANTIFICACIÓN Y/O

CARACTERIZACIÓN
Fraccionamiento Celular
La separación de los compartimientos celulares es un paso importante para estudiar una
estructura intracelular, proteína u orgánulo específico, o para investigar posibles
asociaciones entre estas estructuras macromoleculares. El fraccionamiento subcelular
utiliza una o más propiedades de cada compartimento, tales como la densidad de
flotación, densidad de carga superficial, forma y tamaño, y se basa principalmente en la
centrifugación diferencial en medios de alta viscosidad a 4°C. Los medios utilizados para la
centrifugación diferencial son principalmente sacarosa, manitol, glicerol, Ficoll 400 (un
polímero de sacarosa), Percoll (sílica coloidal) y iodixanol (OptiPrep). La sacarosa es
ampliamente utilizada porque es económica. Pero todos tienen sus ventajas y limitaciones,
las cuales son analizadas en detalle por Harford y Bonifacino, 2011. Principalmente estos
métodos serán analizados aquí, con preferencia a aquellos métodos que son fácilmente
accesibles para la mayoría de los laboratorios y que consumen menos tiempo, ya que una
recuperación rápida es vital. La cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de
afinidad, electroforesis o perturbación selectiva de cambio de densidad también pueden
ser utilizados. Variaciones en las condiciones de los protocolos disponibles dependen de los
orgánulos, tejidos o tipos celulares y equipos utilizados, y es altamente recomendable leer
las referencias citadas para obtener los detalles completos de cada procedimiento. Al final,
la pureza y el rendimiento del fraccionamiento deben ser evaluados mediante la detección
de distintos marcadores en cada fracción recolectada durante todo el procedimiento. A
continuación, se presentan los métodos utilizados más comúnmente para el aislamiento de

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orgánulos. La utilización de hígado de rata ha sido analizada en detalle y puede
encontrarse fácilmente en la literatura; por tanto, el foco de esta parte de este resumen se
encuentra en otros sistemas modelo.

Aislamiento de citoplasma, nucleoplasma y cromatina.

Fracciones citoplásmicas, nucleoplásmicas y cromatínicas pueden ser preparadas

fácilmente a partir de un precipitado de células cultivadas. Las células son resuspendidas
en un tampóntampón que contiene sacarosa 0.34 M, glicerol 10% y baja concentración de
un detergente suave (Triton X-100 0,1%) así como K+ y Mg+2 (los cuales evitan que el núcleo
se rompa) y los núcleos son precipitados mediante una centrifugación a baja velocidad
mientras que el sobrenadante se mantiene como la fracción citoplásmica. A continuación,
los núcleos son lisados en un tampóntampón que contiene los agentes quelantes EDTA y
EGTA, y la fracción insoluble cromatínica es precipitada mediante una centrifugación a
baja velocidad mientras que el sobrenadante es la fracción nucleoplásmica.

Algunos investigadores utilizan una preparación " rápida y sucia" de cromatina con sus
proteínas asociadas del citoplasma/nucleoplasma. Esto se consigue simplemente lisando
las células en un tampóntampón que contiene Triton X-100 al 1%. En este tampónbuffer, la
cromatina y algunas estructuras citoesqueléticas son insolubles y pueden recuperarse por
centrifugación. El precipitado puede resuspenderse en el tampóntampón de elección, por
ejemplo, tampónLaemmli buffer para SDS-PAGE.

Representación esquemática del fraccionamiento subcelular a partir de células cultivadas

de Mendez y Stillman.

Aislamiento de mitocondria por centrifugación diferencial.

Los precipitados de células, crecidas como monocapa o en suspensión, son

homogeneizados en un tampóntampón que contiene MgCl2 y KCl. Luego, se añade
sacarosa hasta 0,25 M y los núcleos se precipitan por centrifugación a baja velocidad (1000
g). Una segunda centrifugación del sobrenadante a 5000 g precipitará las mitocondrias. El
precipitado se resuspende en un medio conteniendo sacarosa y Mg+2 y sometido a
algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador de Dounce. Un último paso de
centrifugado a 5000 g enriquecerá las mitocondrias, las cuales pueden resuspenderse en
tampóntampón Tris con sacarosa 0,25 M o en el tampóntampónde preferencia para los
análisis subsiguientes.

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Las células de levadura son tratadas con zymolasa para romper la dura membrana exterior
y producir esferoblastos, los cuales son lavados en tampónun tampón con sorbitol. El
precipitado se resuspende en tampóntampón de homogeneización con manitol al 0,6 M y
las células son lisadas mediante algunos ciclos de homogeneización en un homogeneizador
de Dounce. Los núcleos son eliminados mediante centrifugación de baja velocidad,
mientras que el sobrenadante que contiene el citoplasma es centrifugado en un rotor de
ángulo fijo a 6500 g para precipitar las mitocondrias.

Ventajas y desventajas de las reacciones de cuantificación

Ventajas: El resultado no depende del numero de determinados presentes en las

proteinasas.
Desventajas: El resultado no depende del numero de determinados presentes en las
proteínas.

PURIFICACION DE PROTEINAS

Aislamiento de peroxisomas.

Smith et al utilizaron un sobrenadante posnuclear obtenido mediante una centrifugación a

2.000 g, que fue luego recentrifugada a 20.000 g por 20 minutos. El precipitado, que
contenía mitocondrias y peroxisomas, fue resuspendido en tampóntampón MS (sorbitol 0,65
%, MES 5 mM, pH 5,5) y fue colocado encima de un gradiente de Nycodenz (17%, 25%, 35%,
50%) en tampóntamón MS. Tras una centrifugación a 116.000 g por 2 h, los peroxisomas se
encontraban en las fracciones 2 a 8.

15
Una mayor separación de las proteínas asociadas a membranas de peroxisomas fue
lograda por el método Fujiki (1982) y Nuttley et al 1990, citado en [4]. El precipitado de la
centrifugación a 20.000 g previamente mencionada fue resuspendido en 10 volúmenes de
tampóntampón Ti8 (Tris 10mM, pH 8.0 y PINS (1 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 2 μg leupeptina/ml,
2 μg aprotinina/ml, y 0.4 μg pepstatina A/ml)) y separada a 200.000 g por 1 h. El precipitado,
con las membranas peroxisomales, fue nuevamente resuspendido en tampón Ti8 y con la
adición de carbonato de sodio 0,1 M y una subsiguiente centrifugación a 200.000 g por 1 h,
las membranas peroxisomales fueron separadas de las proteínas con las que se
encontraban asociadas, pero no de las proteínas integrales de membrana.

Aislamiento de lisosomas (de líneas celulares cultivadas).

Los lisosomas, mitocondrias y peroxisomas poseen densidades muy similares en gradientes

de sacarosa; por tanto es preferible evitar este método. En Percoll, son más densos y dicho
método resulta en lisosomas con muy poca o nada de contaminación de otros orgánulos.

Las células lavadas son homogeneizadas con 5 ciclos en un homogeneizador en 3 ml de

tampón con sacarosa 0,25 M. Una centrifugación de 10 minutos a 800 g precipitará los
núcleos intactos y restos celulares y el sobrenadante puede alamacenarse en hielo. El
precipitado nuclear puede resuspenderse en 0,5 ml del mismo tampón, recentrifugado
como antes y el sobrenadante se junta con el sobrenadante de la primera centrifugación.
A esta solución se le añade la solución de stock de Percoll (que contiene sacarosa 0,25 %)
y albúmina sérica bovina (ASB) a una concentración final de 20 % (nota: esto puede
incrementarse a 27- 35 %) y 0,4 % respectivamente (volumen final 4,5 ml), y se centrifuga por
30 minutos a 36.000 g (nota: esto puede variar de 15.000 g por 60 min a 62.500 g por 40 min).
Utilizando un recolector de gradiente, el gradiente es recolectado en fracciones de 0,4 ml
y los lisosomas usualmente se encuentran cerca del fondo del gradiente. Para solubilizar
mejor los lisosomas e incrementar la recuperación, se añade NP-40 a una concentración
final de 0,5 %, previo al centrifugado a 100.000 g por 1-2 h. Pero si se necesitan lor orgánulos
intactos, por ej. para ensayos metabólicos, se debe evitar el NP-40.

Aislamiento de melanosomas.

Kushimoto et al y Basrur et al utilizaron un gradiente discontinuo de sacarosa en tampón

HEPES. Más específicamente, el lisado celular se resuspendió en sacarosa 2 M y se colocó
sobre un gradiente discontinuo de sacarosa (1.0, 1.2, 1,4; 1,5; 1,.6; 1,8; 2,0 M). Tras una
centrifugación a 100.000 g por 1 h, los melanosomas de estadio temprano (estadio I y II) se
recuperaron en la zona aproximada de sacarosa 1,0-1,2 M. Esta fracción enriquecida se
purificó aún más en una fracción rica en proteínas y una fracción rica en tirosinasa por
electroforesis de flujo libre (EFL) en un aparato Octopus-PZE FFE a 2 ml/h. La EFL se llevó a
cabo a 1000-1100 V y ≈110-125 mA utilizando sacarosa 0,25 M en trietanolamina, pH 7,4, con
un flujo de elución de 3-4 ml/min. Este procedimiento produjo muestras altamente
enriquecidas en melanosomas para análisis de proteómica los cuales identificaron >60
proteínas de melanosoma.

Los mismos investigadores desarrollaron otro protocolo que proporciona fracciones

melanosomales de alta pureza. El lisado celular en sacarosa 2 M fue colocado en el fondo
de un gradiente discontinuo de sacarosa. Tras una centrifugación a 100.000 g durante 1 h,
los melanosomas de estadio temprano, quefueron recuperados en la zona de sacarosa
aproximadamente 1 M, se colocaron posteriormente en el medio de un gradiente
extendido de sacarosa 0,8, 1,0, y 1,2 M y centrifugados nuevamente de la misma manera.
Este paso adicional eliminó por completo la "contaminación" de mitocondrias.

16
Los melanosomas tardíos (estadio III y IV) también fueron recuperados de la capa de
sacarosa 1,8 M, ya al contener una mayor cantidad de melanina son más pesados.

Purificación de exosomas.

Welton et al han purificado exosomas a partir del medio de cultivo de la línea celular HT1376.
Tras eliminar las células mediante una centrifugación suave (400 g por 10 minutos) y los restos
celulares (2000 g por 15 minutos y luego 10.000 g por 30 minutos), el sobrenadante fue
sometido a centrifugación de alta velocidad (100.000 g por 2 h) colocándolo encima de
una capa de sacarosa en óxido de deuterio (D2O o agua pesada). Tras lavar con PBS, el
precipitado contenía los exosomas.

Hogan et al han aislado exosomas a partir de orina con el siguiente método [9]. La muestra
de orina se limpió en un primer paso mediante una centrifugación a 15.000 g y pasada a
través de un filtro de nylon de 8 μm antes de ser centrifugada nuevamente a 150.000 g por
1 h. El precipitado contenía vesículas tipo exosoma y la proteína de Tamm-Horsfall (PTH o
uromodulina), la principal proteína en orina. Para eliminar la PTH, la muestra fue colocada
sobre un gradiente discontinuo de sacarosa (5-30 %) en D2O con pH 6.0. Tras centrifugar a
200.000 g por 24 h, el colchón fue recolectado en 14 fracciones iguales. Cada fracción fue
diluida entre 5 y 10 veces en PBS y recentrifugada a 15.000 g por 1 h y se recuperaron los
precipitados con los exosomas puros.

Extracción de histonas.

Las histonas son las proteínas más básicas del ambiente intracelular. Esta es la principal
característica utilizada para enriquecer histonas a partir de células o extractos de Xenopus
laevis. Resuspendiendo los núcleos intactos y purificados (tal como discutido anteriormente)
en ácido sulfúrico 0,2 M (H2SO4), e incubándolos con rotación a 4 °C, la mayoría de las
proteínas celulares precipitan mientras que las histonas permanecen solubles y son
recuperadas por centrifugación a 16.000 g por 15 minutos. Alternativamente, las histonas
cromatinizadas pueden ser extraídas por incubación en NaCl 2,5 M.

Purificación de membranas de Golgi (a partir de hígado de ratón).

Un método para el aislamiento de membranas de Golgi fue el utilizado por Chen et al. Un
homogenado de tejido de hígado preparado en un tampón que contenía sacarosa al 0,5
M se colocó encima de sacarosa 0,86 M y éste fue cubierto con sacarosa 0,25 M. Tras una
centrifugación a 103.800 g por 60 minutos, las membranas fueron recuperadas en la
interfase 0,5-1,3 M y ajustadas a sacarosa 0,5 M.

Aislamiento de centrosomas.

Los centrosomas pueden ser aislados a partir de células epiteliales adherentes, pero no en
grandes cantidades. Andersen et al utilizaron más de 2 mil millones de células (2x109). Los
núcleos son aislados por lisis hipotónica y los centrosomas son recuperados tras dos pasos
de centrifugación. Primero, por centrifugación en un colchón de sacarosa al 50 % y
posteriormente, por centrifugación en un gradiente de sacarosa 40 %, 50 % y 70%.

Moritz et al aislaron centrosomas de embriones de Drosophila de la siguiente manera: un

homogenado (en tampón BRB80 + KCl 100 mM y sacarosa 14 %) de embriones de 3,5 horas
se centrifugó a 1.500 g por 10 minutos y se eliminaron los lípidos . El sobrenadante se utilizó
para aislar los centrosomas tras añadir Triton X-100 0,1-0,5 % y sacarosa 50%

17
(concentraciones finales), colocándolo en un gradiente de sacarosa (4 mL de 55 % y 3 mL
de 70 %) y centrifugando a 100.000 g por 90 minutos. La mayoría de los centrosomas se
acumularon encima del colchón de 70 %.

Aislamiento de pseudopodias.

Las células migratorias forman una extensión en uno de sus lados, la cual se adherirá a un
nuevo sitio y luego tirará el resto del cuerpo celular hacia este nuevo sitio. Esta extensión se
denomina pseudópodo. Klemke y colegas han desarrollado un método para aislar
pseudópodos de los cuerpos celulares en respuesta a agentes quimiotácticos. Esto se logra
utilizando cámaras de migración Transwell ("entre pocillos") en platos de 6 o 24 pocillos. En
resumen, se dejan adherir las células al lado superior del filtro, el cual posee pequeños poros
de 3 micrones, que son lo suficientemente pequeños como para que la célula completa no
pueda pasar. Pero los pseudópodos formados pueden pasar y se adherirán al lado inferior
del filtro cuando las células detecten el agente quimiotáctico que ha sido colocado en el
compartimento inferior. Posteriormente, las células son fijadas y los pseudópodos o los
cuerpos celulares son recolectados por lisis en el tampón de elección.

Fraccionamiento de citosol, núcleos, RE liso y rugoso, membrana plasmática, mitocondrias.

Song et al han realizado fraccionamiento subcelular a partir de hígados de ratón, pero este
método puede utilizarse también para otros tejidos, con algunas modificaciones. El
esquema en la figura 2 resume todo el procedimiento. Resumiendo, el homogenado de
hígado se centrifugó a 1.000 g por 10 minutos para separar el precipitado (P1) y la fracción
soluble (S1).

Proteasas
Las proteasa son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Usan una
moléculade agua para hacerlo y por lo tanto se clasifican como hidrolasas.
Propiedades
Es una enzima secretada por el páncreas que participa en la degradación de las proteínas
o peptonas, resultantes de la acción de la pepsina gástrica. La proteasa se secreta en
forma de proenzima y es activada por el jugo intestinal. Se administra junto con las otras
proenzimas pancreáticas (amilasa, lipasa) cuando existe disminución de las secreciones
pancreáticas.

Deficiencia de proteasa
Si tienes una deficiencia de proteasa, tu salud podría verse afectada en gran medida. Una
falta de proteasa puede provocar una acumulación alcalina en el torrente sanguíneo,
dando lugar a síntomas tales como ansiedad. Las proteasas también se utilizan para digerir
organismos como bacterias y hongos. Las personas que tienen deficiencia son más
susceptibles a las infecciones por hongos, bacterias y virus, ya que el cuerpo no tiene esa
primera línea para romperlos. La falta de proteasas también puede dar lugar a problemas
tales como enfermedades de deficiencia de calcio e hipoglucemia. Las proteínas son
necesarias para llevar calcio al torrente sanguíneo, y si el cuerpo lo procesa
incorrectamente, no recibirá la cantidad adecuada para prevenir enfermedades como la
osteoporosis o la artritis. Dado que la proteína también se convierte en glucosa, si no se
convierte correctamente, el nivel de azúcar en la sangre del cuerpo se reducirá a niveles
peligrosos. Para las personas que son deficientes en proteasas, la terapia de enzimas está
disponible para ayudar a mantener niveles saludables.
Funciones.

18
Las proteasas actúan rompiendo los enlaces peptídicos de las proteínas para liberar los
aminoácidos. Pueden romper todas las proteínas a menos que sean parte de una célula
viva. Hay diferentes tipos de proteasas para el tipo de enlace peptídico que necesita ser
analizado. Por ejemplo, hay proteasas fúngicas, pepsina y papaína, las cuales realizan
diferentes funciones. Sin embargo, algunos organismos, como los virus, se cubren con un
escudo de proteínas, lo que obliga al cuerpo a utilizar grandes cantidades de proteasas
para atacar el escudo antes de que su sistema inmunológico pueda matar el virus.
Frutas que contienen enzimas de proteasa.
Las enzimas proteasas descomponen o cambian la composición de las proteínas o
péptidos. Además de ser importantes para el proceso de la digestión y el metabolismo, se
cree que algunas enzimas proteasas mejoran la inflamación y fortalecen el sistema
inmunológico, de acuerdo a World's Healthiest Foods. Aunque las enzimas proteasas se
pueden tomar en forma de suplemento y pueden ser añadidas a ciertos alimentos, también
se encuentran naturalmente en ciertas frutas.
• Papaya: Esta fruta exótica fue llamado una vez el "fruto de los ángeles" por Cristóbal
Colón, de acuerdo a World's Healthiest Foods. Se trata de una fuente muy potente de la
enzima papaína de proteasa, así como una enzima similar llamada chmyopapain. Estas
enzimas tienen un mecanismo anti-inflamatorio y también puede desempeñar un papel en
la cicatrización de quemaduras, señala World's Healthiest Foods. Aunque la papaína se
cree que es útil para aliviar algunos de estos problemas de salud, no se sabe que sea una
cura médica para ninguna condición.
• Piña: La piña es una fuente excelente del compuesto de bromelina que contiene
proteasa y se cree que ayuda en la digestión, así como en la reducción de la coagulación
sanguínea y la inflamación, informa World's Healthiest Foods. Además, la bromelina puede
tener la capacidad de reducir el crecimiento de ciertos tipos de tumores. La bromelina se
extrae con frecuencia desde el núcleo o tallo de la piña para su uso en suplementos.
• Kiwi: El kiwi contiene actinidina, una enzima proteolítica con actividad similar a la
papaína. La actinidina representa la mitad del contenido de proteínas solubles del kiwi. En
algunos casos, la actinidina puede ser un alérgeno y es a veces relacionada con una
reacción de hipersensibilidad pocos minutos después de comer kiwi. El zumo de fruta de
kiwi se utiliza a veces como un ablandador de carne, debido en parte a la actividad
proteolítica de la actinidina.
Inhibidores de proteasa
La proteasa es un enzima que el VIH necesita para completar su proceso de autocopia de
sí mismo (replicación) dando lugar a nuevos virus capaces de infectar otras células. En su
proceso de replicación el VIH produce cadenas largas de proteínas que necesitan
fragmentarse (cortarse) en trozos más pequeños que forman las proteínas y enzimas que
ayudan a construir las nuevas copias del virus. La fragmentación de las cadenas más largas
está producida por la proteasa y sus inhibidores impiden que la fragmentación tenga lugar
con lo que las proteínas que se forman dan lugar a copias defectuosas del VIH que, si bien
puede destruir la célula que infectó, ya no pueden infectar más células.
Por sí solos los inhibidores de la proteasa (IP) no eliminan completamente el VIH del
organismo. Sin embargo, con este tipo de medicamentos, se ha observado que pueden
reducir la cantidad del VIH hasta en un 99% aunque algunos sigan latentes dentro de las
células infectadas. Al producir nuevos virus defectuosos se lograría que al menos la
infección por el VIH no se propagase dentro del organismo con la misma rapidez que lo
hace en la actualidad y teóricamente se podría llegar a una 'cronificación' de la infección
del VIH ya que, al haber menos virus, menos células CD4 se infectarían y la persona
infectada podría combatir mejor las infecciones y vivir durante más tiempo.
Su empleo en combinación con otros antirretrovirales ha demostrado que los inhibidores de
la proteasa pueden
• Reducir la cantidad del VIH en sangre (medido por carga viral).
• Aumentar el número de linfocitos CD4, aún cuando sean muy bajos.

19
• Prolongar el tiempo de aparición de la primera enfermedad definitoria de SIDA o
muerte.
• Ayudar a que se desarrollen menos infecciones oportunistas.
• Posiblemente reducir el riesgo de transmisión del virus.
• Posiblemente preservar la función del sistema inmunitario.
Otros inhibidores de la proteasa están siendo evaluados clínicamente en infectados por el
VIH y otros están evaluándose en el laboratorio. En un momento inicial se pensó que los
inhibidores de la proteasa parecían tener menos efectos secundarios y ser menos tóxicos
que otros medicamentos aprobados contra el VIH como los inhibidores de la transcriptasa
inversa.

Se realizaron tres pruebas de caracterización de proteínas. La prueba de Millón la cual solo

será positiva en presencia de tirosina, la de Hopkins Cole positiva para triptófano y la
prueba de Ninhidrina positiva a grupos amino libres.

En la prueba de Millón las pruebas eran positivas si la coloración de la solución cambiaba a

rosado o naranja, en la siguiente tabla se aprecia las muestreas que fueron utilizadas para
la caracterización y cuál fue el resultado obtenido.

Muestra Resultado
Control positivo 1 Tirosina Positivo
Control positivo 2 Triptófano Negativo
Control negativo 1 Cisteína Positivo
Control Peptona Positivo
Muestra problema 1 Gelatina Positivo
Muestra problema 2 Albumina Positivo

Con la caracterización de Hopkins Cole la reacción será positiva si se forma un anillo violeta-
rojizo en la interfaz, a continuación, se describirán los resultados a esta prueba.

Muestra Resultado
Control positivo 1 Triptófano Positivo
Control positivo 2 Tirosina Negativo
Control negativo 1 Cisteína Positivo
Control Peptona Positivo
Muestra problema 1 fenilalalina Positivo
Muestra problema 2 Albumina Positivo

Por ultimo se realiza la caracterización de ninhidrina, la cual era positiva si aparecía una
coloración azul o rojiza, la cual se debía a los grupos amino libres.

Muestra Resultado
Control Tirosina Positivo
Control Triptófano Positivo
Control Peptona Positivo
Muestra problema 1 Gelatina Positivo
Muestra problema 2 Albumina Positivo

20
Después de la caracterización de proteínas se procedió a realizar la cuantificación de
proteínas, por el método de Bradford. Se realizo una curva de calibración usando una
muestra estándar de albumina para así poder cuantificar la cantidad la cantidad de
proteínas presente en esta.

Pozo Albumina (1mg/mL) Absorbancia (490 nm)

1 0 0
2 1 0.047
3 2 0.056
4 4 0.382
5 8 0.555
6 12 0.58

La tabla muestra los niveles de absorbancia obtenida a diferentes concentraciones de

albumina. De estos valores se obtuvo la siguiente grafica, así como la ecuación de la recta.

Chart Title
0.8
0.7 y = 0.0539x + 0.0273
0.6 R² = 0.8725
AXIS TITLE

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
AXIS TITLE

Series1 Linear (Series1)

Se utilizo una muestra problema, de la cual se tomaron tres diferentes volúmenes; 1, 6 y 12

1mg/mL se trato con el reactivo de Bradford para obetner los valores de absorbancia que
se pueden apreciar en la siguiente tabla.

Pozo Albumina (1mg/mL) Absorbancia (490 nm)

1 1 -0.056
2 6 0.333
3 12 0.739

Con la ecuación de la recta, se sustituyeron los valores de absorbancia obtenidos de la

muestra problema, para así conocer su concentración:

Y= 0.0539 X+ 0.0273

Donde:
21
 𝑦 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑥 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑚𝑔/𝑚𝐿) 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

Despejando x:

𝒚 − 𝟎. 𝟎𝟐𝟕𝟑
𝒙=
𝟎. 𝟎𝟓𝟑𝟗

Para un volumen de 1 μL de muestra problema, la absorbancia es -0.056

−0.056 − 0.0273
𝑥=
0.0539

𝒙 = −𝟏. 𝟓𝟒𝟓𝟓

Para un volumen de 6 μL de muestra problema, La absorbancia es 0.333

0.333 − 0.0273
𝑥=
0.0539

𝒙 = 𝟓. 𝟔𝟕𝟏𝟔

Para un volumen de 12 μL de muestra problema, la absorbancia es 0.739

0.739 − 0.0346
𝑥=
0.0539

𝒙 = 𝟏𝟑. 𝟎𝟔𝟗

Se obtuvieron los siguientes valores de concentración de proteína de la muestra problema;

puesto que se utilizaron diferentes volúmenes, se calculó la cantidad de proteína en cada
miligramo. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.

μg de proteína en la μL de la μg/mL de proteína

muestra problema. solución de la presente en la muestra
muestra problema.
problema

2.3125 1 -1.5455

9.9882 6 5.6716

16.687 12 13.069

22
 Media= 5.7371 𝛍𝐠/𝛍𝐥

De una muestra problema se purificaron las proteínas presentes mediante cromatografía

de intercambio catiónico. Ya que se utilizó la resina S. Se obtuvieron 30 fracciones de 1ml
cada una, y se midió la absorbancia mediante un método espectrofotométrico. Las
absorbancias obtenidas fueron las siguientes:

Fracción Absorbancia (280nm)

1 0

2 0

3 -0,001

4 0,008

5 0,036

6 0,064

7 0,052

8 0,067

9 0,064

10 0,042

11 0,033

12 0,033

13 0,035

14 0,018

15 -0,011

16 0,009

17 0,006

18 -0,004

19 0,014

20 -0,003

21 0,015

22 0,002

23 0,026

24 0,03

23
 25 0,051

26 0,041

27 0,03

28 -0,007

29 0,09

30 0,113

purificacion de proteinas por cromatografia de intercambio ionico.

0.12

0.1
absorbancia a 280 n

0.08

0.06

0.04

0.02

0
0 5 10 15 20 25 30 35
-0.02
Nùmero de fracciòn

Solución 0 mM de sal Solución 200 mM de sal Solución 500 mM de sal

Se cargaron 250 μl de muestra, por lo tanto, tomando en cuenta la cantidad de proteína

presente en 1 ml de muestra (5.7371 μg), la cantidad de proteína que se cargó fue la
siguiente.

5.7371 μg → 1 μL
𝑥 → 250 μL

1434.3 𝝁𝒈 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 250 μL de muestra

Al terminar las 10 primeras fracciones, se adiciona a la columna Cloruro de sodio 200mM.

Para conocer la masa de las proteínas presentes en cada fracción se suman todas las
absorbancias y se comparan con la sumatoria de las absorbancias totales, que se
consideran el 100%.

Para los 10 ml (proteínas que no se fijaron a la resina)

2.653 𝝁𝒈 → 100%
= 35.13 %
0.932 𝝁𝒈 → 𝑋
24
Para las proteínas entre 10ml y 20 ml (interaccionaron medianamente con la resina)

2.653 𝝁𝒈 → 100%
= 27.52%
0.730 𝝁𝒈 → 𝑋

Para las proteínas entre 20 ml y 30 ml (interaccionaron fuertemente con la resina)

2.653 𝝁𝒈 → 100%
= 37.35%
0.991 → 𝑋

Se sustituyen los porcentajes de proteína sabiendo que el 100% corresponde a 1.033 μg de

proteína en la muestra problema que se cargaron en la columna

De 0-10 ml
1434.3 → 100%
= 503.9 μ𝑔
𝑋 → 35.13%

De 10-20 ml

1434.3 → 100%
= 394.7 μ𝑔
𝑋 → 27.52%

De 20-30 ml

1434.3 → 100%
= 535.7 μ𝑔
𝑋 → 37.35%

Los valores obtenidos en los cálculos anteriores se pueden observar en la siguiente tabla.

Volumen Sumatoria de absorbancias Masa (μg)

0-10 ml 0.932 503.9

10-20 ml 0.730 394.7

20-30 ml 0.991 535.7

Total 30 ml 2.653 1434.3

Se observan diferentes picos en la gráfica. Los picos número uno y dos en la gráfica,
corresponde a las proteínas que no interaccionaron con la resina, el porcentaje de
proteínas en estos picos fueron del 35.13 %, lo que indica que la resina es medianamente
adecuada para la separación.

Entre los volúmenes de 10 y 20ml, tenemos tres picos que corresponden a un 27.52 % de la
muestra total. En esta parte del desarrollo experimental se agregaron 8.5ml de
amortiguador de elusión I (que, al ser una cromatografía de intercambio catiónico, le
corresponde Acetato de amonio 50mM, NaCl 200mM a pH5), el cual ayudo a “despegar”

25
a las proteínas de menor carga positiva, dejando aún a la mayoría de las proteínas con la
carga positiva de mayor magnitud interaccionando con la resina.

El ultimo porcentaje de la muestra que es un 37.35 %, corresponde a las proteínas de mayor

carga positiva, las cuales se separaron de la resina High S con ayuda de 8.5ml del
amortiguador de elusión II (Acetato de amonio 50mM, NaCl 500mM a pH5). Este porcentaje
esta representado con los puntos 4 y 5, entre los volúmenes de 20 y 30ml.

Una vez realizada la purificacion se procedio a realizar la purificación se procedio a realizar

la separacion por electroforesis en gel de poliacrilamida, El gel de poliacrilamida fue
previamente elaborado, por lo que se cargaron las muestras inmediatamente para su
posterior corrida a 80V y 20mA. Los volúmenes de muestra cargados fueron los siguientes:
2µL, 6µL, 8µL, 10µL y 12µL; además de se cargaron previamente un marcador de PM. Dichos
resutados los podemos apreciar a continuacion

a
b

c
d

En base a la imagen obtenido los cuatro geles de electroforesis se optaron por elegir aquel
gel cuyas bandas sean más definidas y que no presente manchas de un barrido de la
proteína, cuales son el caso de la placa D. Otro factor para revisar en los geles es volumen
de carga añadido ya que en el gel A se aprecia claramente una mala carga, puesto que
al tener un volumen bajo de proteína la columna es casi imperceptible para tener una
buena lectura, en caso contrario el Gel C tiene una sobre carga de volumen puesto que se
ven manchas muy gruesas y de un color muy intenso al fondo de la columna que impide
visualizar correctamente las bandas.

26
Se opto por elegir el gel B puesto que este es el que cumple las mejores características para
poder tener una buena lectura para poder realizar las mejores mediciones y cálculos.

Gel B
Gel B

Distancia
de PM KDa Log PM R.F
elución
Marcador 1,1 225 2,35218252 0,22916667

Marcador 2,3 150 2,17609126 0,47916667

Marcador 2,9 76 1,88081359 0,60416667

Marcador 3,5 52 1,71600334 0,72916667

Marcador 4 24 1,38021124 0,83333333

Marcador 4,5 17 1,23044892 0,9375

E3 2,9 69,3881673 1,84128542 0,60416667

E3 4 28,8325686 1,45988333 0,83333333

E3 2,2 121,337721 2,08399583 0,45833333

Se midió la actividad enzimática de la tripsina observando el efecto de la concentración

de enzima, pH, concentración de sustrato y temperatura, esto se logro mediante métodos
espectrofotométricos a diferentes tiempos. A continuación, se expresarán los resultados
obtenidos.

A determinada temperatura la enzima disminuye su efecto puesto que sufre cambios

conformacionales en su estructura perdiendo la actividad enzimática.

27
A determinado pH la proteína sufre cambios conformacionales perdiendo así su actividad
enzimática.

28
 Efecto de pH sobre actividad enzimática
3

2.5

2
Absorbancia (nm)

1.5
Tiempo 75
Tiempo 60
Tiempo 45
Tiempo 30
1
Tiempo 15

0.5

0
5 8 10

-0.5
pH

La cantidad de inhibidor disminuye la actividad enzimática mientras esta aumente pues su

principal función es que no se lleve a cabo la unión sustrato enzima.

29
Se midió la actividad enzimática de la tripsina observando el efecto de la concentración de
enzima, pH, concentración de sustrato y temperatura, esto se logro mediante métodos
espectrofotométricos a diferentes tiempos. A continuacion se expresaran los resultados
obtenidos.

30
 Efecto de la concentración de sustrato
sobre la actividad enzimática
2.5

2
Absorbancia (405 nm)

tiempo 0
1.5 tiempo 15
tiempo 30
1
tiempo 45
0.5 tiempo 60
tiempo 75
0
0 5 10 15 20
Concentración de sustrato (𝜇𝑔/𝜇𝐿)

Para observar el efecto que presenta la concentración de sustrato, se graficaron las

absorbancias vs las diferentes concentraciones de sustrato a los diferentes tiempos, como
se analiza a continuación.

[sustrato] tiempo 0 tiempo 15 tiempo 30 tiempo 45 tiempo 60 tiempo75

8 0.412 0.612 0.739 0.731 0.822 0.822
12 0.484 0.87 1.113 1.258 1.356 1.356
16 0.688 1.184 1.493 1.65 1.742 1.742
20 0.74 1.328 1.667 1.899 2.065 2.065

Para realizar los cálculos, se utiliza la del tiempo 45 minutos para lo que se necesita calcular
la concentración de sustrato presente, pues a percepción del equipo es la que más se parece
a la curva de.

31
 Efecto de la concentración de
sustrato sobre la actividad enzimática
Absorbancia (405 nm)
2

1.5

0.5

0
0 5 10 15 20 25
Concentración de sustrato (𝜇𝑔/𝜇𝐿)

𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 ecuación 1

Donde
C1= Concentración inicial de sustrato (BApNA 0.01M)
V1= Volumen de sustrato añadido inicialmente
C2= Concentración final de sustrato.
V2= Volumen final (200 μL)
Se despeja la C2 de la ecuación 1 para saber la concentración final del sustrato.

𝐶1 𝑉1
= 𝐶2
𝑉2

Para poder determinar la actividad de la enzima, se necesita conocer las velocidades

iniciales por lo cual se utiliza el coeficiente de extinción molar.
𝐴
=
𝐶𝐿

Donde
 = coeficiente de extinción molar. (3700/M•cm a 475 nm)
 A= Absorbancia.
 C= concentración de sustrato
 L=Longitud que atraviesa la celda (0.5 cm)

Se necesita conocer la concentración, entonces se despeja de la ecuación 1 y se sustituyen

los valores de absorbancia obtenidos previamente.

32
 A
=𝐶
𝐿

Sustituyendo los diferentes valores de absorbancia en la ecuación se obtienen los

siguientes resultados.

Absorbancia Concentración de Moles de producto

sustrato M generado/litro  V
0 0 0
0.731 4x10-4 0.0003951
1.258 6x10-4 0.0006800
1.65 8x10-4 0.0008919
1.899 1x10-3 0.001026

Una vez realizado esto se puede graficar la concentración de sustrato vs velocidad

Cinetica Enzimatica (Michaeles-Mentel)

0.0012
Moles de producto generado/litro  V

y = 0.0003x - 0.0002
0.001 R² = 0.9623

0.0008

0.0006

0.0004

0.0002

0
0 1 2 3 4 5 6
Concentración de sustrato M

Para conocer la velocidad máxima de reacción y Km, se construye el gráfico de Lineweaver-

Burk con los inversos a la gráfica interior.

1/[S] 1/V
0 0
2500 2531.00
1666.67 1470.59
1250 1121.2
1000 974.65

33
 Cinetica Enzimatica (Hannes-Wolf)
3000

1/ Moles de producto generado/litro 

2500 y = 0.9923x - 53.913
R² = 0.9892
2000

1500

1000
V

500

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
-500
1/Concentración de sustrato M

Gracias a la recta, se agrega una línea de tendencia y se obtiene la ecuación de esta misma.

y = 0.9923x - 53.913

Para obtener el valor de 1/Vmáx, se sustituye en la ecuación el valor de X=0.

Y=1/Vmáx

𝑦 = 0.9923(0) − 53.913

𝑦 = 53.913

1/Vmáx= 53.913

Vmáx= 1/52.913

Vmáx= 1.855 x 10-2 mol/litro

Posteriormente se procede a realizar el cálculo para conocer el valor de Km, en donde se

sustituye en la ecuación de la recta Y=0 y se despeja x.

X= -1/Km

𝑦 = 0.9923 x − 53.913

0 = 0.9923 x − 53.913

53.913
= 54.33
0.9923

34
 -1/Km=54.33

−1
= 𝐾𝑚
54.33

Km = 1.84 x 10-2 M

Análisis y discusión:

En la prueba de Millon, en la cual debe presentarse un precipitado rojizo

indicando la presencia de un aminoácido con una cadena lateral fenólica
(Tyr). Las únicas muestras que no presentaron este precipitado o una
suspensión un poco rosada fue la tripsina. Las otras soluciones dieron un
resultado positivo, pero estas reacciones no dan correctamente de manera
experimental pus varios factores interfieren con esta.

Las pruebas de caracterización arrojaron resultados poco acordes con el

fundamento teórico de cada una de ellas. Iniciando con el análisis de la
prueba de ninhindirna, la cual se añade a grupos amino libre, todas las
pruebas dieron positivas pues se presentó una coloración azul o rojizo.

La prueba de Hopkins-Cole se observó que la única proteína que no se

observo positiva fue la tirosina, pues no presentó un anillo violeta-rojizo,
mientras que las demás al ser positivas indican que tiene presencia de
tripftofano.

En la práctica de cuantificación de proteínas se utilizó la prueba del azul de

Comassie G250 (Bradford) para después hacer lecturas de absorbancia.
Previamente a la tinción de las proteínas, fue necesario hacer una curva de
calibración con una solución estándar de albumina, leyendo las
absorbancias de esta a diferentes concentraciones. La curva no es muy
buena ya que el valor de R2 nos indica que la “línea” está poco cercana a
ser recta, esto debido a valores un poco fuera de lugar considerados como
de mal pipeteo.

Con la curva de calibración, podemos considerar que nuestra ecuación de

la recta es fiable para calcular la concentración de proteínas en nuestra
muestra problema. La concentración obtenida fue de 5.7371 µg/ µL.
La purificación de proteínas se realizó con una cromatografía de
intercambio catiónico obteniéndose como resultado que el porcentaje de
concentración de nuestra muestra analizada (35.13 %) es debida a proteínas
con carga negativa, las cuales no pudieron adherirse a la resina y bajaron

35
sin ningún problema. Al agregar nuestro Buffer de elusión I se despegaron las
proteínas de menor carga positiva obteniendo un porcentaje de 27.52%.
Para finalizar se vertió a la columna el buffer de elusión II, el cual ayudo a
despegar de la resina las proteínas de mayor carga positiva con un
porcentaje del 37.35%.

Estos porcentajes son considerando que se cargaron 1.033g de proteína en

500ml de muestra.
También se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida, los resultados
demuestran que ha menor peso molecular, mayor será la velocidad con la
que corran las proteínas. Esto es posible comprobar ya que en el gel utilizado
para calcular el PM con ayuda de Marcadores de PM (Bio-Rad), la banda
más baja tenía proteínas con un PM de 28,8325686 KDa, y la más alta un PM
de 121,337721 KDa.

Como prueba final se realizó un análisis de los factores que influyen en la

actividad enzimática; los factores analizados fueron: Concentración de
sustrato, concentración de enzima, temperatura, y pH.

En primer lugar, podemos observar que a mayor concentración de sustrato

[S], mayor es la actividad enzimática, teniendo como velocidad máxima
1.855 x 10-2 mol/L.

En cuanto al efecto de los otros factores, podemos ver que la concentración

de la enzima también hace que la actividad enzimática incremente,
aunque se debe considerar que existe una velocidad máxima. Refiriéndonos
al efecto del pH y la temperatura, podemos decir que existen valores de
estos donde la enzima alcanza su máximo nivel de actividad; hablamos de
pH y temperatura óptimos. El pH óptimo se vio en el valor 8 y la temperatura
óptima a --°C.

En conclusión, ha mayor concentración de sustrato, la Tripsina (que fue la

enzima utilizada para el análisis) tiene una mayor actividad con una
velocidad máxima de 1.855 x 10-2 mol/L, así como a mayor concentración
de esta. Actúa máximo a pH 8 y a --°C.

Cuestionario
1. Investigar el fundamento de cada una de las reacciones involucrada en la
identificación de proteínas. (9)

2. Describe el fundamento químico de los métodos usados (14 y 15)

3. Describe las ventajas y desventajas en la cuantificación de proteínas de
diferentes métodos actuales para determinar la concentración de
proteínas. (15)

36
 4. Describe en que el fraccionamiento celular y la centrifugación diferencial
señalando que fracciones celulares se obtiene en cada paso. (13 y 14)
5. Explica en que consiste la cromatografía de intercambio iónico, la
cromatografía de exclusión y la cromatografía de afinidad. (9)
6. ¿Qué otros tipos d geles se utilizan para separar proteínas? ¿En qué consiste?
(11)

BIBLIOGRAFÍA
 https://alimentosproteinas.com/proteinas

 http://saludbio.com/articulo/las-prote%C3%ADnas-su-origen-y-

composici%C3%B3n

 http://www.libros.uchile.cl/files/presses/1/monographs/442/submission/proo

f/files/assets/common/downloads/publication.pdf

 https://www.pochteca.com.mx/caseinatos/

 https://etseib.upc.edu/ca/futurs-estudiants/vine-a-coneixer-

nos/tallers/documents/dossier-enzims.pdf

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