Profesor:

Fabián Buffa

Proteínas:
Propiedades y
caracterización

Medina, Marcela
Vega, Maira
Scarpello, Anabella
Mac Gregor, Emilia
Sagastibelza, Anahí
Espinosa, Magalí

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Objetivos generales
Determinar las propiedades físicas y químicas de la ovoalbúmina.
Identificación de algunos aminoácidos presentes en la proteína.
Aplicación y reconocimiento de técnicas que posibiliten la realización de los objetivos previstos.

Fundamentación
Las proteínas son un grupo de biomoléculas caracterizadas por su gran variedad de estructuras y
enorme diversidad de funciones biológicas. Las proteínas de cada ser vivo, animal o vegetal, son
específicas ya que están codificadas por su genoma. A pesar de que desempeñan la misma función, las
proteínas presentan diversas variaciones estructurales en las diferentes especies. y únicamente pueden
diferenciarse en proteínas simples, constituidas únicamente por aminoácidos y proteínas complejas que
contienen material adicional como carbohidratos, lípidos o ácidos nucleicos. Las proteínas pueden
variar sus características de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en el que se hallen
disueltas. Cuando una proteína se disuelve en agua, las fuerzas hidrofílicas, electroestáticas y los
puentes de hidrógeno, participan positivamente, aportando un mayor grado de solubilidad. Sin
embargo factores físicos como el calor, radiaciones, variaciones en los valores de PH y la presencia de
solventes que afectan estas interacciones, pueden producir serias alteraciones en la solubilidad.
Algunas veces pueden ocurrir cambios en la estructura nativa de la proteína y se considera que en estas
condiciones la proteína se ha desnaturalizado. En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la
desnaturalizada tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de aminoácidos
que la componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la misma estructura
desnaturalizada. L a desnaturalización se puede producir por cambios de presión y temperatura,
variaciones del PH, determinadas radiaciones electromagnéticas, agentes físicos, así como los cambios
en concentración salina o determinadas sustancias químicas. En algunos casos, si las condiciones se
restablecen, una proteína desnaturalizada puede volver a su anterior plegamiento o conformación,
proceso que se denomina renaturalización. En algunos casos la desnaturalización conduce la pérdida
total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita como coagulo. La formación de agregados
fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible
(coagulación).

Así como por diversos factores se modifican las propiedades de las proteínas, también pueden
identificarse algunos aminoácidos que la conforman. Tal es el caso, por ejemplo, con la reacción
Xantoproteíca, que se debe a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo,
cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. Si esta reacción ocurre significa que
estamos en presencia de Tir, Trp y Fen, que son aquellos aminoácidos portadores de grupos bencílicos.
También se puede reconocer la presencia de aminoácidos azufrados, donde se dá la formación de un
precipitado negruzco del azufre de los aminoácidos mediante la acción de una base, que, al reaccionar
con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo. Por último también se puede
reconocer triptófano en la reacción indol del triptófano con el ácido acético glacial, en presencia de
H2SO4 concentrado da lugar a la aparición de un anillo coloreado en la interface.

La reacción de biuret la producen los péptidos y las proteínas pero no los aminoácidos porque se debe
a la presencia del enlace peptídico que se destruye al liberarse los aminoácidos. El cobre, en un medio
fuertemente alcalino, se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta cuya
intensidad de color depende de la concentración de proteínas.
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El punto isoeléctrico (pl) o PH isoeléctrico (phi), es aquel PH para el cual la molécula tiene carga neta
cero, es decir, puede tener grupos cargados (ionizados) pero la suma de todas las cargas positivas
iguala a la de las negativas. El pl es una propiedad constante de cada aminoácido, y por lo tanto,
determina un punto isoeléctrico específico para cada estructura proteíca, el cual se puede obtener a
través de técnicas como la que realizaremos en la formación de metaproteina (nombre que recibe la
albúmina en su punto isoeléctrico).

Resumen de las técnicas

Preparación de la solución de albúmina (SA):

• En erlenmeyer: 30 ml de clara de huevo + 5 partes de H2O= 250 ml de SA

• En tubo de ensayo: 2 ml de clara de huevo

Filtración con gasa.

Análisis de la coagulación (desnaturalización):

• Calentamos a baño maría los 2 ml del tubo de ensayo y medimos la T de coagulación

(clara blanca) con un termómetro.

• Agentes coagulantes:

1° tubo de ensayo: 2 ml de SA + 4 ml de etanol

2° tubo de ensayo: 2 ml de SA + 5 gotas de HCl (c)

3° tubo de ensayo: 2 ml de SA + 5 gotas de HNO3 (c)

4° tubo de ensayo: 2 ml de SA + 5 gotas de NaOH (c) 40%

El tubo 2 y 3 van debajo de la campana

Precipitación de proteínas mediante cationes (formación de proteinatos de Cu):

1° tubo de ensayo: 5 ml de SA

2° tubo de ensayo: 5 ml de H2O

3° tubo de ensayo: 5 ml de SA + 5 gotas de HCl al 10%

4° tubo de ensayo: 5 ml de H2O + 5 gotas de HCl 10%

5° tubo de ensayo: 5 ml de SA + 5 gotas de NaOH 10%

6° tubo de ensayo: 5 ml de H2O + 5 gotas de NaOH 10%

Luego agregarle a todos 2 ml de CuSO4 al 10%

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Precipitación de proteinatos con aniones:

1° tubo de ensayo: 5 ml de SA

2° tubo de ensayo: 5 ml de SA + HCl 10%

3° tubo de ensayo: 5 ml de SA y NaOH 10%

Luego agregarle a todos 2 gotas de Fe(CN)6

Formación de metaproteína:

Tubo de ensayo: 10 ml de SA + 10 ml de HCl 0,1 M

Calentar a baño maría durante 10 minutos. Retirar del baño maría y agregar gota a gota NaOH hasta
obtener el color blanquecino correspondiente al pl de la proteína. Una vez obtenido medir el PH con un
pehachímetro.

Luego dividir la metaproteína en 4 tubos de ensayo. Al tubo 1 y 2 ponerlo en ebullición a baño maría
durante 10 minutos obteniendo la proteína desnaturalizada. Luego agregarle, fuera del baño maría, al
primer tubo HCl y al segundo tubo NaOH. Al 3° tubo, sin calentar, agregarle NaOH 0,1 M hasta
obtener la forma aniónica de la proteína, y en el 4° tubo de ensayo, también sin calentar, agregarle HCl
hasta obtener la forma catiónica.

Reacción de Biuret:

Tubo de ensayo: 2 ml de SA + 2 ml de NaOH al 10% + 5 gotas de CuSO4 al 1%

Reacción Xantoproteíca:

Tubo de ensayo: 4 ml de SA + 1 ml de HNO3 (c) (coagulación inmediata)

Luego calentar a baño maría hasta disolver parcialmente el coágulo. Enfriar a TA y neutralizar con 2
ml de NaOH al 40%

Reconocimiento de azufre:

Tubo de ensayo: 3 ml de SA + 10 gotas de NaOH 40%

Luego calentar a baño maría en ebullición durante 5 minutos. Retirar del calor, enfrias a TA y
agregarle 5 gotas de Ac2Pb al 2% o Pb(NO3)2

Reconocimiento del Trp:

(Realizar debajo de la campana)

Tubo de ensayo: 3 ml de SA + 2 ml de AcH (glacial) (c)

Luego agregarle por las paredes del tubo 3 ml de H2SO4 (c) (NO AGITAR)

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Resultados y discusión:

1° ensayo:

a) Análisis de la coagulación: La temperatura de desnaturalización de la proteína nos dio 59°C. El

procedimiento que se utilizó fue el calentamiento de los 2 ml de clara de huevo apartados de la SA en
un tubo de ensayo a baño maría e introduciendo el termómetro para anotar la T justa en la que aparece
un punto blanco en el fondo del tubo. No se trata de un cambio de estado sino de rupturas de enlace,
por lo tanto la T no queda fija durante la desnaturalización, sino que va cambiando. Es por esto que se
toma la T en el momento preciso en que se forma un punto blanco en el fondo del tubo.

b) Agentes coagulantes: En los primeros 3 tubos se observó que la solución se tornó blanquecina,
comprobando de esta manera la desnaturalización de la proteína, que no se observo en el cuarto tubo.
En el caso del primer tubo, el agregado de etanol provocó que la proteína, que en el caso de la
albúmina es globular, se desenrolle y se forme enlaces que unen unas cadenas con otras; este cambio
de estructura dá a la albúmina la característica de un precipitado blanquecino. En el caso del cuarto
tubo con hidróxido de sodio, la proteína no se vio afectada a la modificación del PH.

2° ensayo:

Precipitación de proteínas mediante cationes (formación de proteinatos de Cu, coloración azul)):

Los tubos 2, 4 y 6 son los llamados testigos donde no se agrega proteína. El tubo 1 (PH= neutro), se
forma menos proteinato que en medio básico. En el tubo 5 se forma un proteinato más sólido (PH=
básico), y en el tubo 3 no se forma proteinato, no hay precipitación (PH=ácido).

Por empezar, la precipitación de proteinato se da con la unión de cobre a cargas negativas:

Cu+2 + OH- > Cu(OH)2 (precipita)

Para que esto suceda el ph debe ser alcalino. En ph ácido, los grupos básicos de la proteína se van a
protonar y no hay precipitación. El proteinato de cobre es una molécula de alto peso molecular, por lo
que no se solubiliza en agua, de ahí se debe la formación de precipitado. Los tubos testigos son
necesarios para determinar que el efecto observado en cada caso es realmente debido a la precipitación
del hidróxido cúprico.

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3° ensayo:

Precipitación de proteinato con aniones: En este caso, apareció un precipitado en el segundo tubo
de ensayo donde la proteína se encuentra en medio ácido. De esta manera el anión ferricianuro puede
asociarse a los protones del ácido, por lo que el peso molecular aumenta precipitándose la proteína. En
el resto de los tubos solo se observo el teñido de la solución color amarillo.

4° ensayo:

Formación de metaproteína: En el siguiente ensayo, cuando se le agregó hidróxido de sodio a la

solución, se midió el ph en el momento justo que aparecía una especie de suspensión blanca en la
solución, lo que indicaba la presencia de la metaproteína. El resultado del ph en su pl dio: .... Esto se
explica mediante la formación del ión dipolar, agregándole base de a poco a la solución ácida, pasando
de la forma catiónica al ión dipolar y por último a la forma aniónica. Tanto la especie catiónica como
la aniónica son más solubles en soluciones acuosas porque tienen cargas eléctricas (distintas de 0) que
interactúan con los polos del agua y por ello se disuelven. Por otro lado el ión dipolar, es menos
soluble en agua porque tiene carga eléctrica 0, lo que causa que los aminoácidos de la proteína
interactúen más con otros aminoácidos generando moléculas más grandes y aumentando así su masa
molar de manera que estas precipiten en solución acuosa. La proteína en su forma catiónica se observa
una solución blanca oscura y en su forma aniónica es transparente e incolora.

En el último paso cuando dividimos la metaproteína en 4 tubos, en los tubos 1 y 2 que se llevaron a
baño maría se observó la desnaturalización de la metaproteína (glóbulos blancos en el fondo) que al
agregarle tanto hidróxido de sodio o ácido clorhídrico no se disolvió el coágulo. La elevación de la T
provocó la desnaturalización, causando el aumento de la energía cinética que provoca la ruptura de
enlaces débiles y desorganiza la estructura de la proteína haciendo que esta precipite. Era de esperarse
que el coágulo no se disolviera con el agregado de ácido o base ya que el proceso de desnaturalización
no es reversible frente a los cambios de T. Por último tanto al tubo 3 y 4 se le agrego al primero base y
al segundo ácido hasta llegar a las formas aniónica y catiónica, respectivamente.

5° ensayo:
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Reacción de biuret (complejo colorado): En este ensayo se observó la presencia de proteínas,
específicamente se detecta la presencia de enlaces peptídicos. Esto significa el tiñe de la solución de
color violeta que es el color que adopta el cobre cuando está rodeado de nitrógenos (el cobre por sí
solo es azul). El catión cobre (+2) se une a los pares de electrones libres de los nitrógenos de los
grupos aminos de la unión peptídica. Son necesarias al menos dos uniones peptídicas para que tenga
lugar la reacción.

6° ensayo:

Reacción Xantoproteíca (complejo amarillo): Esta reacción se lleva a cabo para el reconocimiento
de los aminoácidos: Tir, Trp y Fen. Para este ensayo primero de debe desnaturalizar la proteína con
ácido nítrico, donde la solución se torna amarillenta por la presencia de tirosina y tríptofano. Luego se
calienta el coágulo hasta disolverlo parcialmente. Una vez enfriado a TA se le agrega la base fuerte
que hace que el color se torne mas anaranjado, lo que da como resultado la presencia de un color
anaranjado (cuanto más naranja se torna la solución, más Tir, Trp y Fen hay presentes). Esta reacción
dá positiva en estos tres aminoácidos porque son los únicos que portan grupos aromáticos.

7° ensayo:

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Reconocimiento de azúfre (color pardo, marrón oscuro): Esta reacción se lleva a cabo para
identificar metionina y cisteína que son los aminoácidos que contienen azúfre. Se le agrega base y
calor (T alta) para separar el azúfre de los aminoácidos y luego fuera del calor se le agrega acetato de
plomo que reacciona formando sulfuro de plomo. Si esta reacción da positiva se ve un precipitado
color marron oscuro o negro.

8° ensayo:

Reconocimiento de Triptofano: ..........................