Nuevos desafíos en biotecnología de microalgas

Federico Valverdea, *, Francisco J. Romero-Camperoa, b, Rosa Leónc, Miguel G. Guerreroa, Aurelio

Serranoa, *

2016Abstract
Los protistas fotosintéticos, también llamados microalgas, se han estudiado sistemáticamente durante más
de un siglo. Sin embargo, solo las aplicaciones biotecnológicas recientemente ampliadas han fomentado
una nueva ola de investigación sobre sus potencialidades como recursos sostenibles de energía renovable,
así como valiosos productos industriales y agroalimentarios. En el reciente VII Congreso Europeo de
Protistología celebrado en Sevilla, se presentaron tres ejemplos destacados de diferentes estrategias de
investigación sobre microalgas con implicaciones biotecnológicas, que sugirieron que los enfoques
integradores producirán avances muy significativos en este campo en el futuro próximo. En cualquier
caso, la investigación intensa y la aplicación de la biología de sistemas y las técnicas de ingeniería
genética son absolutamente esenciales para alcanzar el potencial completo de las microalgas como
fábricas de células de productos biológicos y, por lo tanto, podrían contribuir significativamente a
resolver los problemas de la bio sostenibilidad y la escasez de energía.

Introducción
biología Energía y su producción sostenible es uno de los recursos más importantes
para la humanidad. La luz solar es, con mucho, la mayor aportación de energía a la
Tierra, y la fotosíntesis es el principal proceso biológico que canaliza la energía solar
hacia la biosfera. Las microalgas eucariotas son un grupo taxonómicamente amplio y
heterogéneo de protistas fototróficos de creciente interés biotecnológico debido a sus
mayores eficiencias fotofiséticas en relación con las plantas terrestres
(microalgoeconomía hasta el 25% de la productividad fotosintética global), tasas
elevadas de crecimiento y amplias capacidades metabólicas

(Raven y Falkowski 1999). En particular, la microalfa verde (Chlorophyta) comparte la

misma maquinaria fotosintética que las plantas superiores, de acuerdo con sus
relaciones filogenéticas cercanas. Las microalgas como Chlorophyceae y
Bacillariophyceae utilizan la energía de la luz solar y un conjunto simple de
abundantes recursos (dióxido de carbono, agua y minerales) generar una gran
cantidad potencial de productos valiosos de interés tecnológico. Estos productos
pueden aplicarse, ya sea directamente o después de la transformación, en procesos
industriales, farmacéuticos y agroalimentarios; ejemplos son carotenoides, aceites,
polisacáridos, pigmentos, bioetanol, hidrógeno, biomasa microalgal (Cadoret et al.,
2012; Finazzi et al., 2010; León et al., 2008). De hecho, algunas especies de
microalgas acumulan cantidades importantes de estos compuestos en condiciones
ambientales específicas, por lo que este biotecnológicamente relevante

característica fenotípica es susceptible de optimización por genética

enfoques de ingeniería (Cadoret et al., 2012; León et al.
2008).
Esta revisión resume las contribuciones presentadas por
tres biotecnólogos de microalgas en el simposio Nuevo
Desafíos en la biotecnología de microalgas celebrada durante el VII
Congreso Europeo de Protistología, que se organizó para
la primera vez como reunión conjunta en asociación con la
Sociedad de Protistas (VII ECOP - ISOP Joint
Reunión) en Sevilla, España, del 5 al 10 de septiembre de 2015. El uso
de microalgas como fuentes sostenibles de petróleo para biocombustibles será
evaluado y discutido en la primera sección, dado que algunos
de estos protistas fototróficos se acumulan intrínsecamente
niveles de aceite (hasta más del 80% del peso seco). Significativo
avances recientes en el desarrollo de la manipulación genética
herramientas, destinadas a mejorar las características biotecnológicas de
microalgas como fuentes de recursos renovables, se presentan
en la segunda contribución. Finalmente, la aplicación de computacional
modelado como una estrategia de biología de sistemas para mejorar
comprender las redes metabólicas y de señalización celular de microalgas
sin duda contribuirá a descubrir nuevas propiedades con
implicaciones biotecnológicas relevantes, como se presenta en
la tercera contribución. En cualquier caso, está claro que intenso
la investigación y la aplicación de la ingeniería genética son absolutamente
esencial para alcanzar todo el potencial de las microalgas
como fábricas de células y, por lo tanto, contribuirá significativamente
para resolver los problemas de biosostenibilidad y energía
escasez.

Biocombustible de microalgas?

Las microalgas son un grupo polifilético y un gran grupo de

diversidad biológica. Las propiedades típicas de las plantas superiores son
combinado en microalgas con biotecnológicamente viable
atributos de las células microbianas. Estas y otras propiedades de
microalgas (como su plasticidad metabólica, tolerancia a
condiciones ambientales extremas y susceptibilidad a la genética
ingeniería), son valiosos para la bioindustria. Estas fotosintéticas
los microorganismos son una fuente de compuestos con
valor comercial, como carotenoides, ficobiliproteínas,
ácidos grasos poliinsaturados, polisacáridos y una variedad de
compuestos bioactivos para la agricultura y la alimentación, alimentación,
farmacéutica,
industria cosmética y química. Las microalgas pueden
también ser útil en la recuperación de aguas residuales y en la reducción
de dióxido de carbono.
Las microalgas se han propuesto como una fuente alternativa para
biocombustible renovable, capaz de satisfacer la demanda mundial de
combustibles para el transporte. Aunque el concepto de "microalgas para
biocombustibles"
fue sugerido por primera vez en la década de 1940, recientemente recibió nuevos
atracción y apoyo. Un artículo seminal de Yusuf Chisti publicado
en 2007 (Chisti 2007) ha sido particularmente eficaz en
llamando la atención de investigadores e inversores. De este modo,
muchos grupos de investigación se sintieron atraídos por el campo, juntos
con empresas comerciales establecidas a partir de entonces. Conforme
a los datos disponibles en Web of ScienceTM de Thomson Reuters
número de artículos publicados por año sobre "biocombustible a partir de microalgas"
ha crecido exponencialmente, de menos de 5 antes de 2007
a más de 390 en 2014.
La atención en microalgas por razones biotecnológicas tiene
también se benefició del hecho de que la producción en masa de líquido
los biocombustibles a partir de biomasa vegetal son cada vez más cuestionados.
El dilema de la "comida contra el combustible" y las limitaciones
en tierras fértiles disponibles para la creciente población mundial son
razones para reconsiderar la producción de biocombustibles de las plantas de cultivo
(Searchinger et al. 2015). Las microalgas representan una alternativa
para desembarcar plantas, ya que las culturas podrían desarrollarse en cultivos no
cultivables
tierra, empleando aguas salobres, salinas o incluso aguas residuales, así
como dióxido de carbono de los gases de combustión como fuente de carbono. Valores
para la productividad de combustible esperada de alrededor de 20,000 L por hectárea
y el año parece razonable para la cultura al aire libre de microalgas
(Moody et al., 2014), aunque algunas proyecciones sustancialmente más altas
se argumentan con frecuencia en la literatura. Sin embargo, la mayoría
de los valores proyectados se originan de extrapolaciones brutas,
tanto en el área como en el tiempo, a partir de ensayos a corto plazo en instalaciones
de pequeño tamaño,
si no directamente de experimentos de laboratorio. Análogo
consideraciones se aplican a las evaluaciones publicadas del ciclo de vida y
a las evaluaciones de los precios de producción de biomasa o biocombustible
de microalgas. La escalada de estos procesos ofrece una
tema muy desafiante para la investigación aplicada.
Hasta ahora, la escasez de conocimiento científico y técnico,
así como una experiencia práctica limitada, determina un alto
precio de la biomasa de microalgas y su biocombustible. los
el menor costo de producción en la producción comercial de algas parece
aproximadamente US $ 4-5 por kg de biomasa de algas. Importante I + D
los esfuerzos se están dirigiendo al desarrollo de
procesos viables capaces de generar masivamente biocombustibles de microalgas
a precios que pueden competir con los de combustibles establecidos
(Sing et al. 2013). El paso de producción tiene que ser considerablemente
mejorado, pero también cosecha, secado y extracción de biomasa
del precursor de biocombustible y su conversión en el producto final
todavía necesita una optimización sustancial.
La selección de las cepas de microalgas más apropiadas es
una cuestión clave (Fig. 1). No solo el contenido del biocombustible
precursor (azúcares fermentables o ácidos grasos) debería
ser considerado, sino más bien la capacidad de producción, buscando
para la combinación óptima de nivel de producto y biomasa
productividad. El enfoque de cultura continua es el más
metodología apropiada para la detección de microalgas para
el propósito de la producción de biocombustibles, ya que permite la determinación
de productividad real para un precursor de biocombustible en particular
(Del Río et al. 2015). También es crucial en la selección de
cepa es la capacidad de desarrollarse al aire libre como un cultivo de monoalgas
durante todo el año. Se ponen muchas expectativas en
el potencial de la ingeniería genética para la generación de
cepas con una productividad superior de ácidos grasos o fermentables
carbohidratos, pero un mayor desarrollo de la novela
las técnicas para la manipulación eficiente de microalgas todavía
necesario.
La producción de biocombustibles se basa principalmente en las políticas y su
rentabilidad
ha sido cuestionado, incluso a precios de petróleo por encima de US $
100 / barril (bbl). Precio promedio actual del crudoUS $ 50 / bbl, y se espera que
aumente hasta alrededor de US $
90 / bbl para 2025 (Grupo del Banco Mundial 2015). Dentro de este marco
no parece que los biocombustibles convencionales tengan un fácil
forma de desarrollarse en el futuro cercano, peor aún cuando se considera
los de microalgas. En tal escenario y en orden
para competir con el petróleo a precios actuales, el precio de producción
para la biomasa de microalgas que contiene un 25% de aceite debería estar alrededor
US $ 0.1 / kg. A dichos precios, biomasa de microalgas rica en proteínas
competiría favorablemente con otras fuentes de proteínas, como
soja (precio actual, US $ 0,4 / kg).
La pregunta por lo tanto es, ¿tiene sentido usar
biomasa de microalgas para combustible o más bien como alimento / alimento?

Desarrollo de nuevas herramientas moleculares para ingeniería genética de microalgas

eucariotas En los últimos años, ha habido un interés creciente en la ingeniería genética
de microalgas, como una herramienta potencial para la producción económicamente
viable de materiales a granel y para mejorar la productividad de los compuestos de alta
adición (Wijffels y Barbosa 2010). Sin embargo, la manipulación genética de rutina se
ha limitado a algunas especies hasta hace poco. La falta de promotores adecuados y
otras secuencias reguladoras son, además de baja eficiencia e inestabilidad de la
expresión de transgenes, las principales dificultades que impiden la transformación
nuclear de nuevas cepas de microalgas (León y Fernández 2007). Ya que baja
expresión de genes exógenos está obstaculizando la eficiencia ingeniería de vías
metabólicas y el uso de microalgas como plataformas para la producción de proteínas
recombinantes, es necesario para desarrollar nuevas herramientas, que garanticen la
estabilidad y altos niveles de expresión de los transgenes. Aquí, proponemos un nuevo
método para expresar transgenes en microalgas: co-transformación con dos promoter
naked genes, un gen seleccionable resistente a antibióticos y el gen de nuestro interés
(Fig. 2). Estos genes se insertan aleatoriamente en el genoma nuclear para que su
transcripción se basa en su inserción adecuada en una región adyacente a un endógeno
promotor genómico o en marco con un gen nativo.
Este enfoque es especialmente apropiado para transformar microalgas
especies para las cuales no hay promotores endógenos o específicos
plásmidos de expresión han sido diseñados. El hecho de que
los transgenes se expresan bajo el control de endógenos
promotores reduce el riesgo de silenciar eventos y su
integración en el entorno genómico del promotor
garantiza la presencia de potenciadores, factores de transcripción
u otras regiones reguladoras esenciales para la expresión adecuada
del transgen Una co-transformación sin promotor
enfoque se ha utilizado con éxito para expresar las flóculos de levadura
en Chlamydomonas reinhardtii para obtener
cepas de microalgas transgénicas con mayor auto-floculación
habilidad que el control de los no transformados (Díaz-Santos
et al. 2015). La floculación es muy importante desde la ingeniería
punto de vista si consideramos que la cosecha de microalgas
puede representar el 30% del costo total de la producción de biomasa de algas
(Salim et al., 2012). Sin embargo, la clonación de floculinas
ha estado limitado por su toxicidad a las bacterias causada por su
longitud excesiva y gran cantidad de repeticiones en tándem en su
dominio central La co-transformación sin promotor evita el
necesidad de clonación porque grandes cantidades de ADN de la
El gen deseado se puede obtener directamente por amplificación o por
síntesis artificial e insertada en el genoma del huésped
tensión.
Hemos diseñado también un plásmido para la traducción
fusión del gen de interés con un antibiótico resistente seleccionable
gen, donde la proteína de interés y la proteína
confiriendo resistencia al antibiótico, fusionado por un autocierre
péptido (De Felipe et al., 2006), se procesan a partir de
la misma poliproteína. Detección de transformantes con aumento
cantidades del antibiótico selectivo proporciona un simple
método para seleccionar clones con el nivel de expresión más alto
del gen marcador seleccionable y, en consecuencia, del gen
de interés; además, manteniendo los transformantes bajo
las condiciones selectivas mejoran la estabilidad de los transgenes.
Aunque todavía es necesario mucho trabajo, estas nuevas moléculas
herramientas permitirán la mejora de la expresión transgénica
en núcleos de microalgas y la modificación genética de nuevos
Un estudio sobre la hélice-lazo-hélice básica
familia del factor de transcripción en
Chlamydomonas reinhardtii utilizando el gen
red de coexpresión ChlamyNET
El prototipo fotosintético Chlamydomonas reinhardtii es
el organismo modelo más importante para el verde unicelular
algas (Hanikenne 2003; Harris 2001; Matsuo e Ishiura
2011; Slaveykova et al. 2016). Recientemente, Chlamydomonas tiene
atrajo la atención debido a sus posibles aplicaciones biotecnológicas
(Kruse y Hankamer 2010; Sivakumar et al., 2010).
Para caracterizar diferentes cepas de Chlamydomonas
y su respuesta a diferentes condiciones, una cantidad masiva
de los datos 'ómicos' se ha producido (Castruita et al., 2011;
Gonzalez-Ballester et al. 2010; Miller et al. 2010; Urzica et al.
2012). Para integrar estos datos y generar sistémica
y caracterizaciones globales, un primer enfoque basado en
se ha tomado la biología de sistemas (Dal'Molin et al., 2011;
Lopez et al. 2011; Romero-Campero et al. 2013; Zheng et al.
2014). En este estudio, usamos ChlamyNET (Romero-Campero
et al. 2016), una red de coexpresión de genes que integra
Datos de RNA-seq, para analizar la hélice-bucle-hélice básica (bHLH)
factor de transcripción (TF) en Chlamydomonas. Específicamente,
usando ChlamyNET, hemos determinado lo biológico
procesos potencialmente regulados por bHLH TF y el ADN
secuencias reconocidas por ellos.
La familia de plantas de factor de transcripción bHLH se caracteriza
por la presencia de un dominio proteico conservado
que consiste en dos hélices conectadas por un bucle e identificadas
en la base de datos de la familia Protein (Pfam) con el ID PF00010.
Análisis genómicos recientes han identificado ocho TF bHLH en
el genoma de Chlamydomonas (Pérez-Rodríguez et al., 2010).
Siete de estos factores de transcripción exhiben genes significativos
patrones de coexpresión y se pueden identificar en ChlamyNET
utilizando su utilidad de búsqueda y el bHLH Pfam id PF0
racimos (Fig. 3B). El grupo más grande incluye el bHLH
genes Cre14.g620850, Cre01.g011150, g4643 y g4645
y está ubicado en el núcleo de ChlamyNET. bHLHs son coexpresados
con un número significativamente alto de genes, que
hace que los genes concentradores en la red desempeñen papeles clave en
la robustez del transcriptoma y el procesamiento de la información.
Para determinar los procesos biológicos potenciales
regulado por bHLH TF en Chlamydomonas, realizamos
un análisis de enriquecimiento del término Gene Ontology (GO) sobre
genes coexpresados con ellos usando ChlamyNET. Nosotros identificamos
transporte transmembrana y metabolismo de carbohidratos
como los dos procesos biológicos más importantes potencialmente
regulado por los bHLH TF en Chlamydomonas (Fig. 3C). por
ejemplo, los genes Cre02.g110800 y Cre13.g569850 que
codificar para transportadores de nitrato y amonio respectivamente
son altamente co-expresados con el bHLH TF Cre01.g011150.
Este bHLH TF también está altamente coexpresado con genes que codifican
para las proteínas implicadas en el metabolismo del nitrógeno tales
como las reductasas de nitrito y nitrato, Cre09.g410750 y
Cre09.g410950, respectivamente. Al mismo tiempo, los genes
Cre08.g384750 y g3160 que codifican para una alfa-amilasa
y una isoamilasa, respectivamente, están altamente coexpresadas con
el bHLH TF Cre14.g620850.
Para determinar secuencias de ADN potencialmente reconocidas
por los TF bHLH en Chlamydomonas analizamos,
utilizando ChlamyNET, las secuencias promotoras de los genes coexpresaron
con ellos. Este análisis reveló que el E-box
secuencia y una de su variante reconocida por el PIF5 TF en
Arabidopsis thaliana apareció en realidad en los promotores de
muchos genes altamente coexpresados con bHLH TF (Fig. 3D).
Estas secuencias de ADN están presentes, por ejemplo, en los promotores
de los genes Cre02.g110800 y Cre13.g569850 que
codificar para transportadores de nitrato y amonio respectivamente
y en el promotor del gen Cre08.g384750 que codifica
para una alfa-amilasa.
Resumiendo, el análisis con ChlamyNET sugiere
que la familia de bHLH TF desempeña un papel clave en la regulación

procesos biológicos relevantes en la fisiología de Chlamydomonas

como el transporte transmembrana y nitrógeno / carbono
metabolismo. Esta regulación parece ser ejercida a través de
reconocimiento de E-boxes y secuencias de ADN similares ubicadas
en el promotor de genes diana potenciales. Estas predicciones in silico
debe tomarse como una hipótesis que necesita en vivo
y validación in vitro.
Perspectivas
Para hacer frente a las altas expectativas creadas en el
campo biotecnológico de microalgas, una serie de desafíos
tendrá que abordarse en el futuro cercano. En esta revisión,
han mostrado una pequeña muestra de estas soluciones; otro importante
aspectos relacionados con la manipulación genética de algas y
mejora de la producción de biomasa experimental de laboratorio
se necesitarán ensayos en grandes instalaciones industriales.
Como nuevos nichos ecológicos son prospectados y nuevos masivos
se emplean técnicas de big data, el número de contabilizados
protistas fotosintéticos está aumentando. Hoy conocemos unos 50,000
especies de microalgas, pero las estimaciones sugieren más de 500,000
especies se extienden sobre los hábitats adecuados en la Tierra (Cadoret
et al. 2012). Para aumentar el número de aislamientos y
aumentar las posibilidades de obtener nuevas microalgas interesantes
biotipos con nuevas características mejoradas para la producción de
biocombustibles
o con intercambios metabólicos raros, la investigación en
la filogenómica ciertamente crecerá en los años siguientes.
Esta área de estudio seguramente traerá sorpresas y se abrirá
nuevos campos de investigación aplicada, como las brumas que cubren el
gran importancia ecológica de este grupo heterogéneo de
los protistas serán develados
Los recientes esfuerzos en la secuenciación masiva de microalgas
genomas han abierto nuevas posibilidades de objetivo
manipulación y edición de biotecnología interesante
rasgos genéticos. Técnicas de edición de genoma de vanguardia en
microalgas verdes y diatomeas como meganucleasas, TALE
nucleasas y sistemas CRISPR / Cas9 (Daboussi et al., 2013;
Jinkerson y Jonikas 2015) permitirán la optimización de
características específicas, pero también implementará
nuevos rasgos aplicados en sistemas de microalgas existentes para cumplir
necesidades industriales no resueltas.
Para satisfacer las grandes expectativas creadas en torno a la microalga
planteado anteriormente, sino también para crear una serie de
actores académicos e industriales capaces de cumplir con los emergentes
desafíos de la industria basada en microalgas y la investigación de
el futuro.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a todos los investigadores cuyos trabajos
se han utilizado para esta revisión, así como para aquellos otros que
no fueron citados debido al espacio limitado. Parte de este trabajo fue
apoyado por becas de investigación del European LIFE + 2010
CO2ALGAEFIX y español (BFU2010-15622, BIO-2011-
28847-C00, BIO-2014-52425-P) y Regional de Andalucía
(P09-CVI-5053; grupos PAIDI BIO-131, BIO-261, BIO-
281) Gobiernos, parcialmente financiados por la UE FEDER
programa. La ayuda de Andalucia Tech, CeiA3, CEICam-
Los campus de Excelencia Universitaria Bio y CEIMAR también
admitido.